BR102018005065A2 - Método para produzir um l-aminoácido - Google Patents

Abstract

um método para produzir um l-aminoácido, tal como, ácido l-glutâmico é provido. um l-aminoácido é produzido através do cultivo de uma bactéria que tem uma capacidade de produção de l-aminoácido que foi modificada de modo que a atividade de um carreador de absorção de frutose não pts e a atividade de frutoquinase sejam aumentadas em um meio que contém frutose, e através da coleta do l-aminoácido do meio ou células da bactéria.

Description

“MÉTODO PARA PRODUZIR UM L-AMINOÁCIDO”

CAMPO DA TÉCNICA [001] A presente invenção refere-se a um método para produzir um

L-aminoácido, tal como, ácido L-glutâmico através de fermentação com o uso de uma bactéria. Os L-aminoácidos são industrialmente úteis como matériasprimas de temperos e assim por diante.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA [002] Os L-aminoácidos são industrialmente produzidos, por exemplo, por fermentação com o uso de micro-organismos, tais como, bactéria que tem uma capacidade de produção de L-aminoácido (Documento de não patente 1). Como tais micro-organismos, por exemplo, cepas isoladas das cepas naturais e mutantes dos mesmos foram usadas. Além disso, uma capacidade de produção de L-aminoácido de micro-organismos pode ser intensificada com o uso de técnicas de DNA recombinante. Por exemplo, como meio para aprimorar uma capacidade de produção de ácido L-glutâmico de bactérias, é conhecido o aprimoramento da atividade de fosfoquetolase (Documento de patente 1) e a utilização de gene yggB mutante (Documento de patente 2).

[003] As bactérias podem absorver vários sacarídeos de fora das células para utilizar os mesmos como fontes de carbono. Exemplos de sistemas de absorção de sacarídeo de bactérias incluem Sistema de Fosfotransferase (PTS) que envolve fosforilação de sacarídeos, e não PTS, que não envolve fosforilação de sacarídeos. Por exemplo, Corynebacterium glutamicum tem uma proteína FruA que é um carreador de absorção de frutose PTS, embora o mesmo não tenha qualquer carreador de absorção de frutose não PTS. A frutose é absorvida nas células através da proteína FruA, enquanto é fosforilada para frutose-1-fosfato. Enquanto isso, exemplos de carreadores de absorção de frutose não PTS incluem uma proteína FucP. A proteína FucP é conhecida como uma L-fucose permease que é um carreador

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2/114 de absorção de fucose, enquanto o mesmo tem também atividade de absorção de frutose (Documento de não patente 2). A frutose é absorvida nas células através da proteína FucP sem ser fosforilada. A frutose presente nas células pode ser, por exemplo, fosforilada para frutose-6-fosfato por frutoquinase e depois utilizada (Documento de não patente 3).

REFERÊNCIAS À TÉCNICA ANTERIOR

DOCUMENTO DE PATENTE [004] Documento de patente 1: W02006/016705 [005] Documento de patente 2: W02006/070944

DOCUMENTOS DE NÃO PATENTE [006] Documento de não patente 1: Akashi, K. et al., Amino Acid

Fermentation. Japan Scientific Societies Press, páginas 195 a 215, 1986.

[007] Documento de não patente 2: Komberg H, e Lourenco C., A route for fructose utilization by Escherichia coli involving the fucose regulon. Proc Natl Acad Sei EUA. 19 de dezembro de 2006; 103(51):19.496 a 19.499. [008] Documento de não patente 3: Caescu CL et al.,

Bifidobacterium longum requires a fruetokinase (Frk; ATP:D-fructose 6phosphotransferase, EC 2.7.1.4) for fructose catabolism. J Bacteriol. Outubro de 2004; 186(19):6.515 a 6.525.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

OBJETIVO A SER ALCANÇADO PELA INVENÇÃO [009] Um objetivo da presente invenção é desenvolver uma técnica nova para aprimorar uma capacidade de produção de L-aminoácido de uma bactéria e, desse modo, prover um método para produzir de modo eficiente um L-aminoácido.

MEIOS PARA ALCANÇAR O OBJETIVO [0010] A fim de alcançar o objetivo mencionado anteriormente, os inventores da presente invenção conduziram várias pesquisas. Como resultado, os mesmos constataram que uma capacidade de produção de L

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3/114 aminoácido de uma bactéria quando usa frutose como uma fonte de carbono pode ser intensificada modificando-se a bactéria de modo que a expressão de um gene de codificação de um carreador de absorção de frutose não PTS e de um gene de codificação de frutoquinase sejam aumentadas e realizaram a presente invenção.

[0011] Portanto, a presente invenção pode ser incorporada, por exemplo, conforme a seguir.

[1] Um método para produzir um L-aminoácido, sendo que o método compreende:

cultivar uma bactéria que tem uma capacidade de produção de L-aminoácido em um meio que contém frutose para acumular um Laminoácido no meio e/ou células da bactéria; e coletar o L-aminoácido do meio e/ou das células, em que a bactéria foi modificada de modo que a atividade de um carreador de absorção de frutose não PTS e a atividade de frutoquinase sejam aumentadas em comparação com uma cepa não modificada.

[2] O método mencionado acima, em que o carreador de absorção de frutose não PTS é uma proteína codificado por genefucP.

[3] O método mencionado acima, em que a frutoquinase é uma proteína codificada por gene frk.

[4] O método mencionado acima, em que o gene JucP gene é um gene de codificação de uma proteína definida em (a), (b) ou (c) mencionados abaixo:

(a) uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 ou 29;

(b) uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 ou 29, mas que inclui substituição, deleção, inserção e/ou adição de 1 a 10 resíduos de aminoácido, e que tem atividade de absorção de frutose não PTS;

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4/114 (c) uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos que mostra uma identidade de 90% ou mais com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 ou 29, e que tem atividade de absorção de frutose não PTS.

[5] O método mencionado acima, em que o gene frk é um gene de codificação de uma proteína definida em (a), (b) ou (c) mencionados abaixo:

(a) uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, 33 ou 35;

(b) uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, 33 ou 35, mas que inclui substituição, deleção, inserção e/ou adição de 1 a 10 resíduos de aminoácido, e que tem atividade de frutoquinase;

(c) uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos que mostra uma identidade de 90% ou mais com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, 33 ou 35, e que tem atividade de frutoquinase.

[6] O método mencionado acima, em que a atividade do carreador de absorção de frutose não PTS e a atividade de frutoquinase são aumentadas com o aumento da expressão de um gene de codificação do carreador de absorção de frutose não PTS e um gene de codificação da frutoquinase.

[7] O método mencionado acima, em que a expressão de cada um dos genes é aumentada com o aumento do número de cópias de cada gene e/ou com a modificação de uma sequência de controle de expressão de cada gene.

[8] O método mencionado acima, em que a bactéria foi adicionalmente modificada de modo que a atividade de fosfoquetolase seja aumentada em comparação com uma cepa não modificada.

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5/114 [9] O método mencionado acima, em que a fosfoquetolase consiste em D-xilulose-5-fosfato fosfoquetolase e/ou frutose-6-fosfato fosfoquetolase.

[10] O método mencionado acima, em que a atividade da fosfoquetolase é aumentada com o aumento da expressão de um gene de codificação da fosfoquetolase.

[11] O método mencionado acima, em que a bactéria é uma bactéria corineforme ou uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae.

[12] O método mencionado acima, em que a bactéria é uma bactéria que pertence aos gêneros Corynebacterium.

[13] O método mencionado acima, em que a bactéria é Corynebacterium glutamicum.

[14] O método mencionado acima, em que a bactéria é uma bactéria que pertence aos gêneros Pantoea ou Escherichia.

[15] O método mencionado acima, em que a bactéria é Pantoea ananatis ou Escherichia coli.

[16] O método mencionado acima, em que o L-aminoácido é um L-aminoácido da família glutamato.

[17] O método mencionado acima, em que o L-aminoácido da família glutamato consiste em um ou mais L-aminoácidos selecionados a partir de ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-arginina, L-citrulina e L-omitina.

[18] O método mencionado acima, em que o L-aminoácido da família glutamato é ácido L-glutâmico.

[19] O método mencionado acima, em que o ácido Lglutâmico é L-glutamato de monoamônio ou L-glutamato monossódico.

[20] O método mencionado acima, em que a bactéria foi adicionalmente modificada de modo que a atividade de a-cetoglutarato

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6/114 desidrogenase e/ou sucinato desidrogenase seja reduzida em comparação com uma cepa não modificada.

[21] O método mencionado acima, em que a bactéria é uma bactéria corineforme, e em que a bactéria foi adicionalmente modificada de modo a portar um gene yggB mutante.

[22] O método mencionado acima, em que o gene yggB mutante é um gene yggB que tem uma mutação que aprimora a capacidade de produção de ácido L-glutâmico da bactéria corineforme.

[23] O método mencionado acima, em que o gene yggB mutante é um gene yggB que tem uma mutação definida em (1), (2) ou (3) mencionados abaixo:

(1) uma mutação na região que codifica os resíduos de aminoácido nas posições 419 a 533 de uma proteína YggB do tipo selvagem, (2) uma mutação na região de codificação de uma região transmembranar de uma proteína YggB do tipo selvagem, e (3) uma combinação das mesmas.

[24] O método mencionado acima, em que a proteína YggB do tipo selvagem é uma proteína definida em (a), (b) ou (c) mencionados abaixo:

(a) uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10;

(b) uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, mas que inclui substituição, deleção, inserção e/ou adição de 1 a 10 resíduos de aminoácido, e que tem uma propriedade de que uma expressão aumentada da mesma na bactéria corineforme provê uma capacidade intensificada de produção de ácido L-glutâmico da bactéria corineforme;

(c) uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos que mostra uma identidade de 90% ou mais com a sequência de

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7/114 aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e que tem uma propriedade de que uma expressão aumentada da mesma na bactéria corineforme provê uma capacidade intensificada de produção de ácido L-glutâmico da bactéria corineforme.

[25] O método mencionado acima, em que o meio contém adicionalmente uma fonte de carbono além da frutose.

[26] O método mencionado acima, em que a fonte de carbono é glicose.

[0012] De acordo com a presente invenção, uma capacidade de produção de L-aminoácido de uma bactéria com o uso da frutose como uma fonte de carbono pode ser intensificada, e um L-aminoácido pode ser eficientemente produzido.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0013] [FIGURA 1] Um diagrama que mostra resultados de cultura de produção de ácido glutâmico em um meio que contém frutose como uma fonte de carbono que usa uma cepa de C. glutamicum que tem uma expressão intensificada de g&a&jucP-frk.

[0014] [FIGURA 2] Um diagrama que mostra resultados de cultura de produção de ácido glutâmico em um meio que contém glicose e frutose como fontes de carbono que usa uma cepa C. glutamicum que tem uma expressão intensificada de genes fucP-frk.

MODOS PARA REALIZAR A INVENÇÃO [0015] Doravante no presente documento, a presente invenção será explicada em detalhes.

[0016] O método da presente invenção é um método para produzir um

L-aminoácido que compreende cultivar uma bactéria que tem uma capacidade de produção de L-aminoácido em um meio que contém frutose para acumular um L-aminoácido no meio e/ou células da bactéria, e coletar o L-aminoácido do meio e/ou células da bactéria, em que a bactéria foi modificada de modo

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8/114 que a atividade de um carreador de absorção de frutose não PTS e a atividade de frutoquinase são aumentadas. A bactéria usada para esse método também é denominada “bactéria da presente invenção”.

<1> BACTÉRIA DA PRESENTE INVENÇÃO [0017] A bactéria da presente invenção é uma bactéria que tem uma capacidade de produção de L-aminoácido, que foi modificada de modo que a atividade de um carreador de absorção de frutose não PTS e a atividade de frutoquinase sejam aumentadas.

<1-1> BACTÉRIA QUE TEM CAPACIDADE DE PRODUÇÃO DE LAMINOÁCIDO [0018] Na presente invenção, o termo “bactéria que tem uma capacidade de produção de L-aminoácido” se refere a uma bactéria que tem uma capacidade para gerar e acumular um L-aminoácido objetivo em um meio e/ou células da bactéria em tal grau que o L-aminoácido pode ser coletado, quando a bactéria é cultivada no meio, tal como, um meio que contém frutose. A bactéria que tem uma capacidade de produção de Laminoácido pode ser uma bactéria que tem capacidade para acumular um Laminoácido objetivo em um meio e/ou células da bactéria em uma quantidade maior que aquela obtenível com uma cepa não modificada. O termo “cepa não modificada” se refere a uma cepa de controle que não foi modificada de modo que a atividade de um carreador de absorção de frutose não PTS ou a atividade de frutoquinase sejam aumentadas. Isto é, exemplos da cepa não modificada incluem uma cepa de tipo selvagem e cepa parental. A bactéria que tem uma capacidade de produção de L-aminoácido pode ser uma bactéria que tem capacidade para acumular um L-aminoácido objetivo em um meio em uma quantidade preferencialmente de 0,5 g/1 ou mais, mais preferencialmente, 1,0 g/1 ou mais.

[0019] Exemplos do L-aminoácido incluem aminoácidos básicos, tais como, L-lisina, L-omitina, L-arginina, L-histidina, e L-citrulina; aminoácidos

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9/114 alifáticos, tais como, L-isoleucina, L-alanina, L-valina, L-leucina e glicina; aminoácidos que são ácidos hidroxi-monoaminocarboxílicos, tais como, Ltreonina e L-serina; aminoácidos cíclicos, tais como, L-prolina; aminoácidos aromáticos, tais como, L-fenilalanina, L-tirosina e L-triptofano; aminoácidos que contêm enxofre, tais como, L-cisteína, L-cistina e L-metionina; aminoácidos ácidos, tais como, ácido L-glutâmico e ácido L-aspártico; e aminoácidos que têm um grupo amida na cadeia lateral, tais como, Lglutamina e L-asparagina. Exemplos particulares do L-aminoácido incluem Laminoácido da família glutamato. O termo “L-aminoácido da família glutamato” se refere coletivamente ao ácido L-glutâmico e L-aminoácidos que são bios sintetizados através de ácido L-glutâmico como um intermediário. Exemplos dos L-aminoácidos que são biossintetizados através de ácido L-glutâmico como um intermediário incluem L-glutamina, L-prolina, L-arginina, L-citrulina e L-omitina. A bactéria da presente invenção pode ter uma capacidade para produzir um único tipo de L-aminoácido, ou dois ou mais tipos de L-aminoácidos.

[0020] Na presente invenção, o termo “aminoácido” se refere a um Laminoácido, exceto se declarado de outro modo. Na presente invenção, o termo “L-aminoácido” se refere a um L-aminoácido em uma forma livre, um sal do mesmo, ou uma mistura dos mesmos, exceto se declarado de outro modo. Exemplos de sal serão descritos posteriormente.

[0021] Exemplos da bactéria incluem bactérias que pertencem à família Enterobacteriaceae e bactérias corineformes.

[0022] Exemplos de bactérias que pertencem à família

Enterobacteriaceae incluem bactérias que pertencem aos gêneros Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Morganella ou similares. Especificamente, bactérias classificadas na família Enterobacteriaceae de acordo com a taxonomia usada no banco de dados do NCBI (Centro Nacional

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10/114 de Informação Biotecnológica) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/ Browser/wwwtax.cgi?id=91347) podem ser usadas.

[0023] As bactérias Escherichia não são particularmente limitadas e, exemplos das mesmas incluem aquelas classificadas no gênero Escherichia de acordo com a taxonomia conhecida por aqueles indivíduos versados na técnica no campo da microbiologia. Exemplos das bactérias Escherichia incluem, por exemplo, aquelas descritas no trabalho de Neidhardt et al. (Backmann B.J., 1996, Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, páginas 2.460 a 2.488, Tabela 1, Em F.D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Segunda Edição, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.). Exemplos das bactérias Escherichia incluem, por exemplo, Escherichia coli. Exemplos específicos de Escherichia coli incluem, por exemplo, cepas K-12 de Escherichia coli, tais como, cepa W3110 (ATCC 27325) e cepa MG1655 (ATCC 47076); cepa K5 de Escherichia coli (ATCC 23506); cepas B de Escherichia coli, tais como, cepa BL21 (DE3) e cepas derivadas das mesmas.

[0024] As bactérias Enterobacter não são bactérias particularmente limitadas e, exemplos incluem aquelas classificadas no gênero Enterobacter de acordo com a taxonomia conhecida pelos indivíduos versados no campo da microbiologia. Exemplos da bactéria Enterobacter incluem, por exemplo, Enterobacter agglomerans e Enterobacter aerogenes. Exemplos específicos de Enterobacter agglomerans incluem, por exemplo, a cepa 12287 ATCC de Enterobacter agglomerans. Exemplos específicos de Enterobacter aerogenes incluem, por exemplo, a cepa 13048 ATCC de Enterobacter aerogenes, cepa 12010 NBRC (Biotechnol. Bioeng., 27 de março de 2007;98(2):340 a 348) e cepa AJ110637 (FERM BP-10955). Exemplos das bactérias Enterobacter incluem também, por exemplo, as cepas descritas no Pedido de Patente Europeu aberto à inspeção pública (EP-A) N° 0952221. Adicionalmente,

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Enterobacter agglomerans incluem também algumas cepas classificadas como Pantoea agglomerans.

[0025] As bactérias Pantoea não são particularmente limitadas e, exemplos incluem aquelas classificadas no gênero Pantoea de acordo com a taxonomia conhecida por aqueles indivíduos versados no campo da microbiologia. Exemplos das bactérias Pantoea incluem, por exemplo, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii, Pantoea agglomerans e Pantoea citrea. Exemplos específicos de Pantoea ananatis incluem, por exemplo, a cepa Pantoea ananatis LMG20103, cepa AJ13355 (FERM BP-6614), cepa AJ13356 (FERM BP-6615), cepa AJ13601 (FERM BP-7207), cepa SC17 (FERM BP-11091), cepa SC17(0) (VKPM B-9246) e cepa SC17sucA (FERM BP-8646). Algumas das bactérias Enterobacter e Erwinia foram reclassificadas no gênero Pantoea (Int. J. Syst. Bacteriol., 39, 337 a 345 (1989); Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162 a 173 (1993)). Por exemplo, algumas cepas de Enterobacter agglomerans foram recentemente reclassificadas em Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii ou similares com base na análise de sequência de nucleotídeos de 16S rRNA etc. (Int. J. Syst. Bacteriol., 39, 337 a 345 (1989)). Na presente invenção, as bactérias Pantoea incluem aquelas reclassificadas no gênero Pantoea conforme descrito acima.

[0026] Exemplos das bactérias Erwinia incluem Erwinia amylovora e

Erwinia carotovora. Exemplos das bactérias Klebsiella incluem Klebsiella planticola.

[0027] Exemplos das bactérias corineformes incluem bactérias que pertencem aos gêneros Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium ou similares.

[0028] Exemplos específicos das bactérias corineformes incluem as seguintes espécies.

Corynebacterium acetoacidaphilum

Corynebacterium acetoglutamicum

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Corynebacterium alkanolyticum

Corynebacterium callunae

Corynebacterium crenatum

Corynebacterium glutamicum

Corynebacterium lilium

Corynebacterium melassecola

Corynebacterium thermoamino genes (Corynebacterium efficiens)

Corynebacterium herculis

Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum)

Brevibacteriumflavum (Corynebacterium glutamicum)

Brevibacterium immariophilum

Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum)

Brevibacterium roseum

Brevibacterium saccharolyticum

Brevibacterium thiogenitalis

Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis)

Brevibacterium album

Brevibacterium cerinum

Microbacterium ammoniaphilum [0029] Exemplos específicos das bactérias corineformes incluem as seguintes cepas.

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870

Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806

Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511

Corynebacterium callunae ATCC 15991

Corynebacterium crenatum AS 1.542

Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032,

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ATCC 13060, ATCC 13869, FERM BP-734

Corynebacterium lilium ATCC 15990

Corynebacterium melassecola ATCC 17965

Corynebacterium efficiens (Corynebacterium thermoaminogenes) AJ12340 (FERM BP-1539)

Corynebacterium herculis ATCC 13868

Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 14020

Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) ATCC

13826, ATCC 14067, AJ12418 (FERM BP-2205)

Brevibacterium immariophilum ATCC 14068

Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13869

Brevibacterium roseum ATCC 13825

Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066 Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240 Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872

Brevibacterium album ATCC 15111

Brevibacterium cerinum ATCC 15112

Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354 [0030] As bactérias Corynebacterium incluem bactérias que foram previamente classificadas no gênero Brevibacterium, mas estão presentemente unidas no gênero Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991)). Adicionalmente, Corynebacterium stationis inclui bactérias que foram previamente classificadas como Corynebacterium ammoniagenes, mas são presentemente reclassificadas em Corynebacterium stationis com base na análise de sequência de nucleotídeos de 16S rRNA etc. (Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60, 874 a 879 (2010)).

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14/114 [0031] Essas cepas estão disponíveis a partir, por exemplo, da

American Type Culture Collection (Endereço: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos da América). Isto é, os números de registro são dados às respectivas cepas, e as cepas podem ser ordenadas com o uso desses números de registro (consultar http://www.atcc.org/). Os números de registro das cepas são listados no catálogo da American Type Culture Collection. Essas cepas podem ser obtidas também a partir, por exemplo, dos depósitos em que as cepas foram depositadas.

[0032] A bactéria da presente invenção pode ser uma bactéria que tem inerentemente uma capacidade de produção de L-aminoácido, ou pode ser uma bactéria modificada de modo que a mesma tenha uma capacidade de produção de L-aminoácido. A bactéria que tem uma capacidade de produção de L-aminoácido pode ser obtida com a transmissão de uma capacidade de produção de L-aminoácido para tal bactéria conforme mencionado acima, ou com o aprimoramento de uma capacidade de produção de L-aminoácido de tal bactéria conforme mencionado acima.

[0033] Para transmitir ou aprimorar uma capacidade de produção de

L-aminoácido, os métodos convencionalmente empregados no cultivo de cepas de produção de aminoácido de bactérias corineformes, bactérias Escherichia e assim por diante (consultar “Amino Acid Fermentation”, Gakkai Shuppan Center (Ltd.), 1- Edição, publicado em 30 de maio de 1986, páginas 77 a 100) podem ser usadas. Exemplos de tais métodos incluem, por exemplo, adquirir uma cepa de mutante auxotrófica, adquirir uma cepa resistente a análogo de L-aminoácido, adquirir uma cepa de mutante de regulação metabólica e construir uma cepa recombinante em que a atividade de uma enzima biossintética de L-aminoácido é intensificada. No cultivo de bactérias de produção de L-aminoácido, uma das propriedades descritas acima, tais como, auxotrofia, resistência a análogo e regulação metabólica

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15/114 pode ser transmitida sozinha, ou duas ou três ou mais de tais propriedades podem ser transmitidas em combinação. Além disso, no cultivo de bactérias de produção de L-aminoácido, a atividade de uma dentre as enzimas biossintéticas de L-aminoácido pode ser intensificada sozinhas, ou as atividades de dois ou três ou mais de tais enzimas podem ser aprimoradas em combinação. Adicionalmente, transmitir propriedade (ou propriedades) tais como, auxotrofia, resistência a análogo e mutação de regulação metabólica pode ser combinado com o aprimoramento da atividade (ou atividades) de enzima (ou enzimas) biossintética.

[0034] Uma cepa mutante auxotrófica, cepa resistente a análogo ou cepa mutante de regulação metabólica que tem uma capacidade de produção de L-aminoácido pode ser obtida com a submissão de uma cepa parental ou cepa do tipo selvagem a um tratamento de mutagênese usual e, depois, com a seleção de uma cepa que exibe autotrofia, resistência a análogo ou uma mutação de regulação metabólica, e que tem uma capacidade de produção de L-aminoácido a partir das cepas mutantes obtidas. Exemplos do tratamento de mutagênese usual incluem irradiação de raios X ou ultravioleta e um tratamento com um agente de mutação, tal como, N-metil-N'-nitro-Nnitrosoguanidina (MNNG), metanosulfonato de etila (EMS) e metanosulfonato de metila (MMS).

[0035] Uma capacidade de produção de L-aminoácido pode ser também transmitida ou intensificada com o aprimoramento da atividade de uma enzima envolvida em biossíntese de um L-aminoácido objetivo. Uma atividade de enzima pode ser intensificada, por exemplo, por uma modificação de uma bactéria de modo que a expressão de um gene de codificação da enzima seja intensificada. Métodos para aprimorar expressão genética são descritos no documento WOOO/18935, EP1010755A e assim por diante. Os procedimentos detalhados para aprimorar atividade de enzima serão descritos posteriormente.

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16/114 [0036] Adicionalmente, uma capacidade de produção de Laminoácido pode ser também transmitida ou intensificada com a redução da atividade de uma enzima que catalisa uma reação que se ramifica da trajetória biossintética de um L-aminoácido objetivo para gerar um composto além do L-aminoácido objetivo. A “enzima que catalisa uma reação que se ramifica da trajetória biossintética de um L-aminoácido objetivo para gerar um composto além do L-aminoácido objetivo” citado no presente documento inclui uma enzima envolvida na decomposição do aminoácido objetivo. O método para reduzir uma atividade de enzima será descrito posteriormente.

[0037] Doravante no presente documento, as bactérias de produção de

L-aminoácido e métodos para transmitir ou aprimorar uma capacidade de produção de L-aminoácido serão especificamente exemplificadas. Todas as propriedades das bactérias de produção de L-aminoácido e modificações para transmitir ou aprimorar uma capacidade de produção de L-aminoácido podem ser usadas independentemente ou em qualquer combinação apropriada.

<BACTÉRIAS DE PRODUÇÃO DE ÁCIDO L-GLUTÂMICO> [0038] Exemplos de métodos para transmitir ou aprimorar a capacidade de produção de ácido L-glutâmico incluem, por exemplo, um método de modificação de uma bactéria de modo que a bactéria tenha uma atividade ou atividades aumentadas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas a partir das enzimas de biossíntese de ácido L-glutâmico. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, glutamato desidrogenase (gdhA), glutamina sintetase (gZnA), glutamato sintase (gltBD), isocitrato desidrogenase (icdA), aconitato hidratase (acnA, acnB), citrato sintase (gltA), metilcitrato sintase (prpC), piruvato carboxilase (pyc), piruvato desidrogenase (aceEF, IpdA), piruvato quinase (pykA, pykF), fosfoenolpiruvato sintase (ppsA), enolase (eno), fosfogliceromutase (pgmA, pgml), fosfoglicerato quinase (pgk), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gapA), triose fosfato isomerase (tpiA), frutose bisfosfato aldolase (fbp),

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17/114 glicose fosfato isomerase (pgi), 6-fosfogluconato desidratase (edd), 2-ceto-3desoxi-6-fosfogluconato aldolase (edá) e trans-hidrogenase. São mostrados em parênteses depois dos nomes das enzimas exemplos de genes que codificam as enzimas (o mesmo deve se aplicar às mesmas ocasiões

A doravante no presente documento). E preferível aprimorar a atividade ou atividades aumentadas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas a partir, por exemplo, de glutamato desidrogenase, citrato sintase, fosfoenol piruvato carboxilase e metilcitrato sintase, dentre outras enzimas.

[0039] Exemplos de cepas que pertencem à família

Enterobacteriaceae e modificadas de modo que a expressão do gene citrato sintase, gene fosfoenolpiruvato carboxilase e/ou gene glutamato desidrogenase são aumentados incluindo aqueles revelados nos documentos EP1078989A, EP955368A e EP952221A. Adicionalmente, exemplos de cepas que pertencem à família Enterobacteriaceae e modificadas de modo que a expressão de um gene da trajetória Entner-Doudoroff (edd, edd) seja aumentada incluem aqueles revelados no documento EP1352966B. Exemplos de bactérias corineformes modificadas de modo que a expressão do gene glutamato sintetase (gltBD) seja aumentada incluem aqueles revelados no documento WO99/07853.

[0040] Exemplos de métodos para transmitir ou aprimorar a capacidade de produção de ácido L-glutâmico incluem também, por exemplo, um método de modificação de uma bactéria de modo que a bactéria tenha uma atividade ou atividades aumentadas reduzidas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas a partir das enzimas que catalisam uma reação que se ramifica a partir da trajetória de biossíntese de ácido L-glutâmico para gerar um composto além do ácido L-glutâmico. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, isocitrato liase (aceA), acetoglutarato desidrogenase (sucA, odhA), acetolactato sintase (ilvl), formato acetiltransferase (pfl), lactato desidrogenase (Idh), álcool desidrogenase (adh),

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18/114 glutamato decarboxilase (gadAB) e sucinato desidrogenase (sdhABCD). E preferível reduzir ou excluir, por exemplo, a atividade de a-cetoglutarato desidrogenase, dentre essas enzimas.

[0041] Bactérias Escherichia que têm uma atividade de acetoglutarato desidrogenase reduzida ou são deficientes na atividade de acetoglutarato desidrogenase, e métodos para obter as mesmas são descritos nas Patentes n- U.S. 5.378.616 e 5.573.945. Adicionalmente, métodos para reduzir ou excluir a atividade de α-cetoglutarato desidrogenase de bactérias Enterobacteriaceae, tais como, bactérias Pantoea, bactérias Enterobacter, bactérias Klebsiella E bactérias Erwinia são reveladas nas Patentes n- U.S. 6.197.559, 6.682.912, 6.331.419 e 8.129.151 e documento n*

W02008/075483. Exemplos específicos de bactérias Escherichia que têm uma a atividade de α-cetoglutarato desidrogenase reduzida ou são deficientes na atividade de α-cetoglutarato desidrogenase incluem as cepas a seguir.

E. coli W3110sucA::Km^r

E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)

E. colikjn^ (FERM BP-3854)

E. coli AJ 12949 (FERM BP-4881) [0042] E. coli W3110sucA::Km^r é uma cepa obtida pela interrupção do gene sucA de codificação de α-cetoglutarato desidrogenase de E. coli W3110. Essa cepa é completamente deficiente na atividade de a-cetoglutarato desidrogenase.

[0043] As bactérias corineformes em que a atividade de acetoglutarato desidrogenase é reduzida ou eliminada, e métodos para obter as mesmas são revelados no documento n° W02008/075483. Exemplos específicos de bactérias corineformes em que a atividade de a-cetoglutarato desidrogenase é reduzida ou eliminada incluem, por exemplo, as cepas a seguir.

Cepa L30-2 de Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium

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19/114 lactofermentum) (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N- JP 2006340603)

Cepa AS de Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) (WO95/34672)

Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ12821 (FERM BP-4172, Patente no FR 9401748)

Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum)

AJ12822 (FERM BP-4173, Patente N- FR 9401748)

Corynebacterium glutamicum AJ12823 (FERM BP-4174, Patente N-FR 9401748) [0044] Exemplos de bactérias de produção de ácido L-glutâmico e cepas parentais para derivar as mesmas incluem também bactérias Pantoea, tais como, a cepa Pantoea ananatis AJ13355 (FERM BP-6614), cepa SC17 de Pantoea ananatis (FERM BP-11091) e cepa SC17(0) de Pantoea ananatis (VKPM B-9246). A cepa AJ13355 é uma cepa isolada de solo em Iwata-shi, Shizuoka-ken, Japão como uma cepa que pode proliferar em um meio de pH baixo que contém ácido L-glutâmico e uma fonte de carbono. A cepa SC 17 é uma cepa selecionada como uma cepa mutante de baixa produção de fleuma da cepa AJ13355 (Patente n° U.S. 6.596.517). A cepa SC17 foi depositada na agência administrativa independente, Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Industrial Avançada, Depósito de Organismo de Patente Internacional (atualmente agência administrativa independente, Instituto Nacional de Tecnologia e Avaliação, Depósito de Organismo de Patente Internacional, n° 120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 2920818, Japão) em 4 de fevereiro de 2009, e atribuído um número de acesso de FERM BP-11091. A cepa AJ13355 foi depositada no Instituto Nacional de Biociência e Tecnologia Humana, Agência de Tecnologia e Ciência Industrial (atualmente, agência administrativa independente, Instituto Nacional de Tecnologia e Avaliação, Depósito de Organismo de Patente Internacional,

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20/114 #120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japão) em 19 de fevereiro de 1998 e atribuído um número de acesso de FERM P-16644. Depois, o depósito foi convertido em um depósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste em 11 de janeiro de 1999, e atribuído o n7 de acesso de FERM BP-6614.

[0045] Adicionalmente, exemplos de bactérias de produção de ácido

L-glutâmico e cepas parentais para derivar as mesmas incluem também bactérias Pantoea que têm uma atividade de α-cetoglutarato desidrogenase reduzida ou são deficientes na atividade de α-cetoglutarato desidrogenase. Exemplos de tais cepas incluem a cepa AJ13356 (Patente n^G U.S. 6.331.419), que é uma cepa deficiente de gene de subunidade (sucA) El de acetoglutarato desidrogenase da cepa AJ13355 e da cepa SC17sucA (Patente nU.S. 6.596.517), que é uma cepa deficiente de gene sucA da cepa SC17. A cepa AJ13356 foi depositada no Instituto Nacional de Biociência e Tecnologia Humana, Agência de Tecnologia e Ciência Industrial (atualmente, agência administrativa independente, Instituto Nacional de Tecnologia e Avaliação, Depósito de Organismo de Patente Internacional, #120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japão) em 19 de fevereiro de 1998, e atribuída um número de acesso de FERM P-16645. Depois, o depósito foi convertido em um depósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste em 11 de janeiro de 1999, e atribuído um número de acesso de FERM BP-6616. A cepa SC17sucA foi atribuída com um número privado de AJ417 e depositada na agência administrativa independente, Instituto Nacional de Tecnologia e Ciência Avançada, Depósito de Organismo de Patente Internacional (atualmente, agência administrativa independente, Instituto Nacional de Tecnologia e Avaliação, Depósito de Organismo de Patente Internacional, #120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazushi, Chiba-ken, 292-0818, Japão) em 26 de fevereiro de 2004, sob um número de acesso de FERM BP-8646.

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21/114 [0046] A cepa AJ13355 foi identificada como Enterobacter agglomerans quando a mesma foi isolada, mas foi recentemente reclassificada como Pantoea ananatis com base no sequenciamento de nucleotídeo de 16S rRNA e assim por diante. Portanto, embora as cepas AJ13355 e AJ13356 estejam depositadas no depósito mencionado anteriormente como Enterobacter agglomerans, as mesmas são denominadas Pantoea ananatis no presente relatório descritivo.

[0047] Exemplos de bactérias de produção de ácido L-glutâmico e cepas parentais para derivar as mesmas incluem também cepas mutante auxotróficas. Exemplos específicos de cepas mutante auxotróficas incluem, por exemplo, E. coli VL334thrC⁺ (VKPM B-8961, EP1172433). E. coli VL334 (VKPM B-1641) é uma cepa auxotrófica de L-isoleucina e L-treonina que tem mutações nos genes thrC e ilvA (Patente n- U.S. 4.278.765). E. coli VL334thrC⁺ é uma bactéria de produção de ácido L-glutâmico auxotrófica de L-isoleucina obtida com a introdução de um alelo do tipo selvagem do gene thrC na cepa VL334. O alelo do tipo selvagem do gene thrC foi introduzido pelo método de transdução geral que usa um bacteriófago PI cultivado nas células de cepa (VKPM B-7) K-12 de E. coli.

[0048] Exemplos de bactérias de produção de ácido L-glutâmico e cepas parentais para derivar as mesmas incluem também cepas que têm resistência a um análogo de ácido aspártico. Tais cepas podem ser também deficientes na atividade de α-cetoglutarato desidrogenase. Exemplos específicos de cepas que têm resistência a um análogo de ácido aspártico e são deficientes na atividade de α-cetoglutarato desidrogenase incluem, por exemplo, E. coli AJ13199 (FERM BP-5807, Patente n- U.S. 5.908.768), E. coli FFRM P-12379, que adicionalmente têm uma capacidade de decomposição de ácido L-glutâmico reduzida (Patente n- U.S. 5.393.671), e. coli AJ13138 (FERM BP-5565, Patente n° U.S. 6.110.714).

[0049] Exemplos de métodos para transmitir ou aprimorar a

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22/114 capacidade de produção de ácido L-glutâmico incluem também, por exemplo, um método de aprimoramento da expressão de um gene de secreção de ácido L-glutâmico, tal como, gene yhfK (W02005/085419) ou gene ybjL (W02008/133161).

[0050] Adicionalmente, exemplos de métodos para transmitir ou aprimorar a capacidade de produção de ácido L-glutâmico ou em bactérias corineformes incluem também métodos de transmissão de resistência a um análogo de ácido orgânico, inibidor respiratório, ou similar, e métodos de transmissão de sensibilidade a um inibidor de síntese de parede celular. Exemplos específicos de tais métodos incluem, por exemplo, o método de transmissão de resistência a ácido monofluoroacético (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) n- JP 50-113209), em que o método de transmissão de resistência à adenina ou resistência à timina (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N- JP 57-065198), em que o método de atenuar urease (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N- JP 52-038088), em que o método de transmissão de resistência à ácido malônico (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N² JP 52-038088), em que o método de transmissão de resistência a benzopironas ou naftoquinonas (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N° JP 56-1889), em que o método de transmissão de HOQNO resistência (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N° JP 56-140895), em que o método de transmissão de resistência a ácido α-cetomalônico (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N° JP 57-2689), em que o método de transmissão de resistência à guanidina (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N° JP 56-35981), em que o método de transmissão de sensibilidade à penicilina (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N° JP 4-88994) e assim por diante.

[0051] Exemplos específicos de tais bactérias resistente ou sensíveis incluem as cepas a seguir.

Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum)

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23/114

AJ3949 (FERM BP-2632, Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N- JP 50-113209)

Corynebacterium glutamicum AJ11628 (FERM P-5736, Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N- JP 57-065198)

Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum)

AJ11355 (FERM P-5007, Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N- JP 561889)

Corynebacterium glutamicum AJ11368 (FERM P-5020, Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N- JP 56-1889)

Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11217 (FERM P-4318, Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N^s JP 572869)

Corynebacterium glutamicum AJ11218 (FERM P-4319, Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N- JP 57-2869)

Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum)

AJ11564 (FERM BP-5472, Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N- JP 56-140895)

Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11439 (FERM BP-5136, Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N- JP 56-35981)

Corynebacterium glutamicum H7684 (FERM BP-3004, Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N- JP 04-88994)

Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ11426 (FERM P-5123, Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N° JP 56-048890)

Corynebacterium glutamicum AJ11440 (FERM P-5137, Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N° JP 56-048890)

Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ11796 (FERM P-6402, Patente aberta à inspeção pública

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24/114 (Kokai)N-JP 58-158192) [0052] Adicionalmente, exemplos de métodos para transmitir ou aprimorar a capacidade de produção de ácido L-glutâmico para ou em bactérias corineformes incluem também um método de aprimoramento da expressão de gene yggB e um método de introdução de um gene yggB mutante que tem uma mutação na região de codificação (W02006/070944). Isto é, a bactéria da presente invenção pode ter sido modificada de modo que a expressão do gene yggB seja aumentada, ou pode ter sido modificada de modo a portar (ter) um gene yggB mutante.

[0053] O gene yggB é um gene de codificação de um canal mecanossensível. Exemplos do gene yggB incluem genes yggB de bactérias corineformes. Exemplos específicos dos genes yggB de bactérias corineformes incluem, por exemplo, genes yggB de Corynebacterium glutamicum ATCC 13869, Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium glutamicum ATCC14967 e Corynebacterium melassecola ATCC 17965 (W02006/070944). O gene yggB de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 corresponde à sequência complementar à sequência dos números de nucleotídeo 1.336.091 a 1.337.692 na sequência de genoma registrada como N° de Acesso ao Genbank NC_003450 no banco de dados de NCBI, e é chamado também de NCgll221. A proteína YggB codificada pelo gene yggB de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 é registrada como N de Acesso ao GenBank NP_600492. Adicionalmente, a sequência de nucleotídeos do gene yggB de Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869) e a sequência de aminoácidos da proteína YggB codificada pelo gene são mostradas nas SEQ ID NOS: 9 e 10, respectivamente.

[0054] Na presente invenção, um gene yggB que tem a “mutação específica” descrita posteriormente também é chamada de “gene yggB mutante” e, portanto, uma proteína codificada também é chamada de “proteína YggB mutante”. Adicionalmente, na presente invenção, um gene

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25/114 yggB que não tem a “mutação específica” descrita posteriormente também é denominada “gene yggB do tipo selvagem” e, portanto, uma proteína codificada também é denominada “proteína YggB do tipo selvagem”. Incidentalmente, para a proteína YggB, a mudança da sequência de aminoácidos causada pela “mutação específica” no gene yggB também é denominado “mutação específica”. O termo “do tipo selvagem” citado no presente documento é usado por conveniência para distinguir o gene yggB “do tipo selvagem” ou proteína YggB do gene yggB “mutante”, e o gene yggB “do tipo selvagem” ou proteína YggB não é limitado àqueles obtidos como substâncias naturais, contanto que o mesmo não tenha a “mutação específica”. Exemplos da proteína YggB do tipo selvagem incluem as proteínas YggB exemplificadas acima, tal como, proteína YggB que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Exemplos da proteína YggB do tipo selvagem incluem também variantes conservadas (variantes em que a função original da mesma é mantida) das proteínas YggB exemplificadas acima, contanto que as variantes conservadoras não tenham a “mutação específica”. A “função original” em relação à proteína YggB pode ser, por exemplo, uma função como um canal mecanossensível ou uma propriedade de que uma expressão aumentada da mesma em uma bactéria corineforme provê uma capacidade intensificada de produção de ácido L-glutâmico da bactéria corineforme.

[0055] A “mutação específica” não é particularmente limitada, contanto que a mesma mude a sequência de aminoácidos da proteína YggB tal como aquelas descritas acima para, desse modo, aprimorar uma capacidade de produção de ácido L-glutâmico de uma bactéria corineforme. Exemplos da “mutação específica” incluem mutação no lado de terminal Cea mutação em uma região transmembranar. A “mutação específica” pode ser também uma combinação das mesmas.

(1) MUTAÇÃO NO LADO DO TERMINAL C

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26/114 [0056] A mutação no lado do terminal C é uma mutação introduzida na região do gene yggB do tipo selvagem que codifica os resíduos de aminoácido das posições 419 a 533 da proteína YggB do tipo selvagem. A mutação no lado de terminal C pode ser introduzida em um ou mais locais na região. O tipo de mudança da sequência de aminoácidos induzida pela mutação no lado de terminal C não é particularmente limitado. A mutação no lado de terminal C pode ser uma mutação que causa substituição de aminoácido (mutação de sentido errado), inserção de resíduo de aminoácido, deleção de resíduo de aminoácido, introdução de códon de parada (mutação sem sentido), mutação no quadro de leitura ou uma combinação das mesmas. A mutação no lado de terminal C é preferencialmente, por exemplo, uma mutação para inserir uma sequência de nucleotídeos, tal como, uma sequência de inserção (doravante no presente documento denominada “IS”) ou transposon.

(1-1) INSERÇÃO DE SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS [0057] Exemplos da mutação no lado de terminal C incluem, por exemplo, uma mutação que insere uma sequência de nucleotídeos no local de codificação do resíduo de valina na posição 419 da proteína YggB do tipo selvagem (mutação tipo 2A-1). A mutação tipo 2A-1 pode ser, por exemplo, uma mutação que causa deleção ou substituição para uma parte ou todas dos resíduos de aminoácido das posições 419 a 533 da proteína YggB do tipo selvagem. Exemplos específicos do gene yggB mutante que têm a mutação tipo 2A-1 incluem, por exemplo, o gene yggB que inclui IS inserida no próximo “G” na posição 1255 na SEQ ID NO: 9 e, portanto, que codifica uma proteína YggB mutante que tem um comprimento completo de 423 resíduos de amino, o que é mais curto do que a proteína YggB do tipo selvagem original (SEQ ID NO: 10). A sequência de nucleotídeos desse gene yggB mutante (V419::IS) e a sequência de aminoácidos da proteína YggB mutante codificada pelo gene são mostradas na SEQ ID NOS: 11 e 12,

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27/114 respectivamente. Na SEQ ID NO: 11, as posições 1 a 1269 correspondem aos CDS para essa proteína YggB mutante (V419::IS). Exemplos específicos da bactéria de produção de ácido L-glutâmico que tem o gene yggB mutante (V419::IS) incluem, por exemplo, a cepa 2256AsucAAldhA yggB* de C. glutamicum (WO2014/185430).

(1-2) SUBSTITUIÇÃO PARA RESÍDUOS DE PROLINA [0058] Exemplos da mutação no lado de terminal C incluem também, por exemplo, uma mutação que substitui um resíduo de prolina presente nas posições 419 a 533 da proteína YggB do tipo selvagem por outro resíduo de aminoácido. Exemplos de tal resíduo de prolina incluem os resíduos de prolina nas posições 424, 437, 453, 457, 462, 469, 484, 489, 497, 515, 529 e 533 da proteína YggB do tipo selvagem. E especificamente preferível substituir o resíduo (ou resíduos) de prolina da posição (ou posições) 424 e/ou 437 por outro resíduo (ou resíduos) de aminoácido. O “outro aminoácido” não é particularmente limitado contanto que p mesmo seja um aminoácido de ocorrência natural em vez de prolina. Exemplos do “outro aminoácido” incluem Lys, Glu, Thr, Vai, Leu, Ile, Ser, Asp, Asn, Gin, Arg, Cys, Met, Phe, Trp, Tyr, Gly, Ala e His. Por exemplo, o resíduo de prolina na posição 424 pode ser substituído preferencialmente por um resíduo de aminoácido hidrofóbico (Ala, Gly, Vai, Leu ou Ile), mais preferencialmente, um resíduo de aminoácido de cadeia ramificada (Leu, Vai ou Ile). Adicionalmente, por exemplo, o resíduo de prolina na posição 437 pode ser substituído por um resíduo de um aminoácido que tem grupo hidroxila na cadeia lateral (Thr, Ser ou Tyr), mais preferencialmente, por um resíduo Ser.

(2) MUTAÇÃO NA REGIÃO TRANSMEMBRANAR [0059] A proteína YggB é estimada ter cinco regiões transmembranares. As regiões transmembranares correspondem aos resíduos de aminoácido das posições 1 a 23 (primeira região transmembranar), as posições 25 a 47 (segunda região transmembranar), as posições 62 a 84

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28/114 (terceira região transmembranar), as posições 86 a 108 (quarta região transmembranar) e as posições 110 a 132 (quinta região transmembranar) da proteína YggB do tipo selvagem. A mutação em uma região transmembranar é uma mutação nas regiões de codificação dessas regiões transmembranares do gene yggB do tipo selvagem. A mutação na região transmembranar pode ser introduzida em um ou mais locais nas regiões. A mutação na região transmembranar é preferencialmente uma mutação que induz a substituição, deleção, adição, inserção ou inversão de um ou diversos resíduos de aminoácido, mas não inclui qualquer mutação de quadro de leitura ou mutação sem sentido. O número indicado pelo termo “um ou diversos” é preferencialmente 1 a 20, mais preferencialmente, 1 a 10, ainda mais preferencialmente, 1 a 5, particularmente com mais preferência 1 a 3. Exemplos da mutação em uma região transmembranar incluem uma mutação que insere um ou diversos resíduos de aminoácido, tal como, Cys-Ser-Leu, entre o resíduo de leucina na posição 14 o resíduos de triptofano na posição 15; uma mutação que substitui o resíduos de alanina na posição 100 por outro resíduos de aminoácido, tal como, um resíduo de um aminoácido que tem grupo hidroxila na cadeia lateral (isto é, Thr, Ser ou Tyr), preferencialmente um resíduo Thr; uma mutação que substitui o resíduo de alanina na posição 111 por outro resíduo de aminoácido, tal como um resíduo Vai ou um resíduo de um aminoácido que tem grupo hidroxila na cadeia lateral (isto é, Thr, Ser ou Tyr), preferencialmente um resíduo Vak ou resíduo de Thr; na proteína YggB do tipo selvagem.

[0060] Na presente invenção, um “resíduo de “aminoácido na posição

X da proteína YggB do tipo selvagem” significa que o resíduo de aminoácido que corresponde àquele da posição X na SEQ ID NO: 10, exceto se for declarado de outro modo. A “posição X” em uma sequência de aminoácidos é a posição X-ésima contada a partir do terminal N da sequência de aminoácidos, e o resíduo de aminoácido do terminal N é o resíduo de

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29/114 aminoácido da posição 1. Isto é, as posições mencionadas anteriormente de resíduos de aminoácido indicam posições relativas, e as posições absolutas dos mesmos podem mudar devido à deleção, inserção, adição ou similar de um resíduo ou resíduos de aminoácido. Por exemplo, o “resíduo de “aminoácido na posição 419 da proteína YggB do tipo selvagem” significa que o resíduo de aminoácido que corresponde àquele da posição 419 na SEQ ID NO: 10, e quando um resíduo de aminoácido for excluído em uma posição no lado de terminal N da posição 419, o 418- resíduo de aminoácido do terminal N é “o resíduo de aminoácido na posição 419 da proteína YggB do tipo selvagem”. Adicionalmente, quando um resíduo de aminoácido é inserido em uma posição no lado de terminal N da posição 419, o 420^a resíduo de aminoácido do terminal N é “o resíduo de aminoácido na posição 419 da proteína YggB do tipo selvagem”. Especificamente, por exemplo, resíduos de aminoácido das posições 419 a 529 da proteína YggB de Corynebacterium glutamicum ATCC14967 correspondem a resíduos de aminoácido das posições 419 a 533 da proteína YggB do tipo selvagem.

[0061] Qual resíduo de aminoácido é “o resíduo de aminoácido que corresponde àquele da posição X na SEQ ID NO: 10” na sequência de aminoácidos de uma proteína YggB arbitrária pode ser determinado por alinhamento entre a sequência de aminoácidos da proteína YggB arbitrária e a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. O alinhamento pode ser realizado, por exemplo, com o uso de software de análises genética. Exemplos específicos de tal software incluem DNASIS produzido por Hitachi Solutions, GENETYX produzido por Genetyx, e assim por diante (Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24 (1) 72 a 96, 1991; Barton GJ et al., Journal of Molecular Biology, 198 (2), 327 a 337,1987).

[0062] Um gene mutante yggB pode ser obtido com a modificação do gene yggB do tipo selvagem de modo a ter a “mutação específica” mencionada anteriormente. A modificação de DNA pode ser realizada por um

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30/114 método conhecido. Por exemplo, um objetivo de mutação pode ser introduzido em um local objetivo de DNA pelo método de mutação específica de local. Exemplos específicos do método específico de mutação de local incluem, por exemplo, um método de que usa PCR (Higuchi, R., 61, em PCR Technology, Erlich, H.A. Eds., Stockton Press, 1989; Carter P., Meth. In Enzymol., 154, 382, 1987), e um método que usa um fago (Kramer, W. e Frits, H.J., Meth. In Enzymol., 154, 350, 1987; Kunkel, T.A. et al., Meth. In Enzymol., 154, 367, 1987). Adicionalmente, um gene yggB mutante pode ser também obtido por síntese química.

[0063] Tal modificação de uma bactéria de modo que a bactéria tenha um gene yggB mutante pode ser alcançada com a introdução do gene yggB mutante na bactéria. Tal modificação de uma bactéria de modo que a bactéria tenha um gene yggB mutante pode ser também alcançada com a introdução de uma mutação no gene yggB da bactéria através de mutação natural ou um tratamento com um agente mutagênico.

[0064] Os métodos para transmitir ou aprimorar capacidade de produção de ácido L-glutâmico podem ser também eficazes para transmitir ou aprimorar uma capacidade para produzir L-aminoácidos que são biossintetizados através de ácido L-glutâmico como um intermediário, tal como, L-glutamina, L-prolina, L-arginina, L-citrulina e L-omitina. Portanto, uma bactéria que tem uma capacidade para produzir qualquer um desses Laminoácidos que são biossintetizados através de ácido L-glutâmico pode ter, conforme exigido, tal propriedade que uma bactéria de produção de ácido Lglutâmico tem conforme mencionado acima. Por exemplo, uma bactéria que tem uma capacidade para produzir quaisquer um desses L-aminoácidos que são biossintetizados através de ácido L-glutâmico pode ter sido modificada de modo que a atividade de α-cetoglutarato desidrogenase e/ou sucinato desidrogenase seja reduzida.

<BACTÉRIAS DE PRODUÇÃO DE L-GLUTAMINA>

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31/114 [0065] Exemplos do método para transmitir ou aprimorar a capacidade de produção de L-glutamina incluem, por exemplo, um método de modificação de uma bactéria de modo que a atividade ou atividades aumentadas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas a partir das enzimas de biossíntese de L-glutamina sejam aprimoradas. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, glutamato desidrogenase (gdhA) e glutamina sintetase (glnA). A atividade de glutamina sintetase pode ser também intensificada pela interrupção do gene de glutamina adenililtransferase (glnE) ou interrupção do gene de proteína de controle PII (glnB) (EP1229121).

[0066] Exemplos do método para transmitir ou aprimorar a capacidade de produção de L-glutamina incluem também, por exemplo, um método de modificação de uma bactéria de modo que a atividade ou atividades aumentadas de um ou mais tipos de enzimas que catalisam uma reação que se ramifica a partir da trajetória de biossíntese de L-glutamina para gerar um composto além da L-glutamina sejam reduzidas. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a glutaminase.

[0067] Exemplos específicos de bactérias de produção de L-glutamina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem, por exemplo, bactérias corineformes em que a atividade ou atividades aumentadas de glutamato desidrogenase (gdhA) e/ou glutamina sintetase (glnA) (EP1229121, EP1424398) são aprimoradas, e bactérias corineformes em que a atividade de glutaminase (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N° JP 2004-187684) é reduzida. Exemplos de bactérias de produção de L-glutamina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem uma cepa que pertence aos gêneros Escherichia e que tem uma glutamina sintetase mutante em que o resíduo de tirosina da posição 397 de glutamina sintetase foi substituído por outro resíduo de aminoácido (US2003/0148474A).

[0068] Exemplos dos métodos para transmitir ou aprimorar a

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32/114 capacidade de produção de L-glutamina para ou nas bactérias corineformes incluem também o método de transmissão de resistência a 6-diazo-5-oxonorleucina (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N° JP 3-232497), o método de transmissão de resistência a análogo de purina e resistência ao sulfóxido de metionina (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N- JP 61202694) e o método de transmissão de resistência a ácido a-cetomalônico (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N° JP 56-151495). Exemplos específicos de bactérias corineformes que têm capacidade para produção de L-glutamina incluem, por exemplo, as cepas a seguir.

Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavuni) AJ11573 (FERM P-5492, Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N^s JP 56151495)

Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavuni) AJ11576 (FERM BP-10381, Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N° JP 56-151495)

Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ12212 (FERM P-8123, Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N- JP 61202694) <BACTÉRIAS DE PRODUÇÃO DE L-PROLINA>

[0069] Exemplos de métodos para transmitir ou aprimorar a capacidade de produção de L-prolina incluem, por exemplo, um método de modificação de uma bactéria de modo que a bactéria tenha uma atividade ou atividades aumentadas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas a partir das enzimas de biossíntese de L-prolina. Exemplos de tais enzimas incluem glutamato-5-quinase (proB), γ-glutamilfosfato redutase e pirolina-5carboxilato redutase (putA). Para aprimorar a atividade de tal enzima, por exemplo, o gene proB de codificação de uma glutamato quinase dessensibilizado para inibição de retroalimentação por L-prolina (Patente N° DE 3127361) pode ser preferencialmente usado.

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33/114 [0070] Exemplos de métodos para transmitir ou aprimorar a capacidade de produção de L-prolina incluem também, por exemplo, um método de modificação de uma bactéria de modo que a bactéria tenha uma atividade reduzida de uma enzima envolvida na decomposição de L-prolina. Exemplos de tal enzima incluem prolina desidrogenase e omitina aminotransferase.

[0071] Exemplos específicos de bactérias de produção de L-prolina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem, por exemplo, E. coli NRRL B-12403 e NRRL B-12404 (Patente N° GB 2075056), E. coli VKPM B-8012 (Pedido de Patente N- RU 2000124295), cepas mutantes de plasmídeo de E. coli descritas na Patente N^e DE 3127361, cepas mutantes de plasmídeo de E. coli descritas por Bloom F.R. et al. (The 15th Miami winter symposium, 1983, página 34), cepa 702 de E. coli (VKPM B-8011) que é uma cepa resistente a 3,4-de-hidroxiprolina e azetidina-2-carboxilato e cepa 702ilvA E. coli (VKPM B-8012) que é uma cepa deficiente do gene ilvA da cepa 702 (EP1172433).

<B ACTÉRIAS DE PRODUÇÃO DE L-TREONINA>

[0072] Exemplos de métodos para transmitir ou aprimorar a capacidade de produção de L-treonina incluem, por exemplo, um método de modificação de uma bactéria de modo que a bactéria tenha uma atividade ou atividades aumentadas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas a partir das enzimas de biossíntese de L-treonina. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a aspartoquinase ΙΠ (lysC), aspartato semialdeído desidrogenase (asd), aspartoquinase I (thrA), homoserina quinase (thrB), treonina sintase (thrC) e aspartato aminotransferase (aspartato transaminase) (aspC). Dentre essas enzimas, é preferível aprimorar atividade ou atividades aumentadas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas a partir de aspartoquinase III, aspartato semialdeído desidrogenase, aspartoquinase I, homoserina quinase, aspartato aminotransferase e treonina

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34/114 sintase. Quaisquer dos genes que codificam as enzimas de biossíntese de Ltreonina podem ser introduzidos em uma bactéria que tem uma capacidade reduzida de decompor treonina. Exemplos de tal cepa em que a decomposição de treonina é suprimida incluem, por exemplo, a cepa TDH6 de E. coli que é deficiente na atividade de treonina desidrogenase (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N° JP 2001-346578).

[0073] As atividades das enzimas de biossíntese de L-treonina são inibidas pelo produto final, L-treonina. Portanto, para construir cepas de produção de L-treonina, é preferível que os genes das enzimas de biossíntese de L-treonina sejam modificados de modo que as enzimas sejam dessensibilizadas para inibição de retroalimentação por L-treonina. Os genes thrA, thrB e thrC constituem o operão de treonina que forma uma estrutura de atenuador. A expressão do operão de treonina é inibida por isoleucina e treonina no caldo de cultura e também suprimida por atenuação. Portanto, a expressão da operão de treonina pode ser intensificada com a remoção da sequência líder ou do atenuador na região de atenuação (Lynn, S.P., Burton, W.S., Donohue, T.J., Gould, R.M., Gumport, R.L, e Gardner, J.F., J. Mol. Biol. 194:59 a 69 (1987); WO02/26993; W02005/049808 e

W02003/097839).

[0074] O promotor nativo do operão de treonina está presente a montante do operão de treonina, e pode ser substituído por um promotor não nativo (WO98/04715). Além disso, o operão de treonina pode ser construído de modo que os genes de biossíntese de treonina sejam expressos sob controle do repressor e promotor de λ-fago (EP0593792B). Adicionalmente, uma bactéria modificada de modo que a mesma seja dessensibilizada em relação à inibição de retroalimentação por L-treonina pode ser também obtida com a seleção de uma cepa resistente ao ácido a-amino-P-hidroxi-isovalérico (AHV) que é um análogo de L-treonina.

[0075] É preferível que a quantidade de expressão do operão de

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35/114 treonina que é modificada de modo a ser dessensibilizada em relação à inibição de retroalimentação por L-treonina conforme descrito acima seja aumentada em um hospedeiro com o aumento do número de cópias do mesmo ou com a ligação do mesmo a um promotor potente. O número de cópia pode ser aumentado introduzindo-se um plasmídeo que contém o operão de treonina em um hospedeiro. O número de cópia pode ser também aumentado com a transferência do operão de treonina para o genoma de um hospedeiro que usa um transposon, Mu-fago ou similar.

[0076] Exemplos de métodos para transmitir ou aprimorar a capacidade de produção de L-treonina incluem também, por exemplo, um método de transmissão de resistência à L-treonina para um hospedeiro, e um método de transmissão de resistência à L-homoserina a um hospedeiro. Tal resistência pode ser transmitida, por exemplo, com o aprimoramento da expressão de um gene que transmite resistência à L-treonina ou um gene que transmite resistência à L-homoserina. Exemplos dos genes que transmitem a resistência mencionada acima incluem os genes rhtA (Res. Microbiol. 154:123 a 135 (2003)), gene rhtB (EP0994190A), gene rhtC (EP1013765A), gene yfiK e gene yeaS (EP1016710A). Em relação aos métodos para transmitir resistência à L-treonina a um hospedeiro, aqueles descritos nos documentos η- EP0994190A e W090/04636 podem ser indicados.

[0077] Exemplos específicos de bactérias de produção de L-treonina e cepas parentais para derivam as mesmas incluem, por exemplo, E. coli TDH6/pVIC40 (VKPM B-3996, Patente n° U.S. 5.175.107 e 5.705.371), E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081, Patente n° U.S. 5.631.157), E. coli NRRL21593 (Patente n° U.S. 5.939.307), E. coli FERM BP-3756 (Patente n° U.S. 5.474.918), E. coli FERM BP-3519 e FERM BP-3520 (Patente n° U.S. 5.376.538), E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (na Rússia), 14, 947956 (1978)), E. coli VL643 e VL2055 (EP1149911A) e. coli VKPM B-5318 (EP0593792B).

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36/114 [0078] A cepa VKPM B-3996 é uma cepa obtida com a introdução do plasmídeo pVIC40 na cepa TDH-6. A cepa TDH-6 tem capacidade de assimilação de sacarose e é deficiente no gene thrC e o gene ilvA da mesma tem uma mutação vazante. A cepa TDH-6 tem também uma mutação no gene rhtA que transmite resistência à concentração alta de treonina ou homoserina. O plasmídeo pVIC40 é um plasmídeo obtido com a inserção do operão thrA*BC que contém um gene thrA mutante de codificação de uma aspartoquinase-homoserina desidrogenase I resistente à inibição de retroalimentação por treonina e os genes thrBC do tipo selvagem em um vetor derivado de RSF1010 (Patente ri’ U.S. 5.705.371). Esse gene thrA mutante codifica uma aspartoquinase-homoserina desidrogenase I que é substancialmente dessensibilizada em relação à inibição de retroalimentação por treonina. A cepa B-3996 foi depositada em 19 de novembro de 1987 no All-Union Scientific Center of Antibiotics (Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscou, Rússia) com o número de acesso RIA 1867. Essa cepa foi depositada também na Coleção Nacional Russa de Micro-organismos Industriais (VKPM, FGUP GosNII Genetika, 1 Dorozhny proezd., 1 Moscou 117545, Rússia) em 7 de abril de 1987 com o número de acesso VKPM B-3996.

[0079] A cepa VKPM B-5318 é prototrófica em relação à isoleucina e porta o plasmídeo pPRT614 que corresponde ao plasmídeo pVIC40 do qual a região reguladora do operão de treonina é substituída pelo promotor PR e repressor Cl de fago λ sensível à temperatura. A cepa VKPM B-5318 foi depositada na Coleção Nacional Russa de Micro-organismos Industriais (VKPM, FGUP GosNII Genetika, 1 Dorozhny proezd., 1 Moscou 117545, Rússia) em 3 de maio de 1990 com o número de acesso de VKPM B-5318.

[0080] O gene thrA que codifica aspartoquinase-homoserina desidrogenase I de E. coli foi elucidado (números de nucleotídeo 337 a 2.799, acesso ao GenBank NC_000913.2, gi: 49175990). O gene thrA está localizado entre os genes thrL e thrB no cromossomo de E. coli K-12. O gene

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37/114 thrB que codifica homoserina quinase de Escherichia coli foi elucidado (números de nucleotídeo 2.801 a 3.733, acesso ao GenBank NC_000913.2, gi: 49175990). O gene thrB está localizado entre os genes thrA e thrC no cromossomo K-12 de E. coli. O gene thrC que codifica treonina sintase de E. coli foi elucidado (números de nucleotídeos 3.734 a 5.020, acesso ao GenBank NC_000913.2, gi: 49175990). O gene thrC está localizado entre o gene thrB e o quadro de leitura aberta yaaX no cromossomo K-12 de E. coli. O operão thrA*BC que contém um gene thrA mutante que codifica uma aspartoquinase-homoserina desidrogenase I resistente à inibição de retroalimentação por treonina e os genes thrBC do tipo selvagem podem ser obtidos a partir do plasmídeo bem conhecido pVIC40 que está presente na cepa de E. coli de produção de treonina VKPM B-3996 (Patente n- U.S. 5.705.371).

[0081] O gene rhtA de E. coli está localizado a 18 min no cromossomo de E. coli perto do operão glnHPQ que codifica componentes do sistema de transporte de glutamina. O gene rhtA é idêntico ao ORF1 (gene ybiF, números de nucleotídeos 764 a 1.651, número de acesso ao GenBank AAA218541, gi:440181) e se localiza entre os genes pexB e ompX. A unidade que expressa uma proteína codificada pelo ORF1 foi designada gene rhtA (rht: resistência à homoserina e treonina). Foi revelado também que a mutação rhtA23 que transmite resistência à alta concentração de treonina ou homoserina é uma substituição de A por G na posição -1 em relação ao códon inicial ATG (RESUMOS do 17- Congresso Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular em conjunto com Encontro Anual da Sociedade Americana de Bioquímica e Biologia Molecular, São Francisco, Califórnia agosto 24 a 29, 1997, resumo N² 457; documento η² EP1013765A).

[0082] O gene asd de E. coli já foi elucidado (números de nucleotídeos 3.572.511 a 3.571.408, acesso ao GenBank NC_000913.1, gi: 16131307), e pode ser obtido por PCR (White, T.J., et al., Trends Genet,

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5:185 a 189, 1989) com a utilização de iniciadores preparados com base na sequência de nucleotídeos do gene. Os genes asd de outros micro-organismos podem ser também obtidos de um modo similar.

[0083] O gene aspC de E. coli também já foi elucidado (números de nucleotídeos 983.742 a 984.932, acesso ao GenBank NC_000913.1, gi: 16128895), e pode ser obtido por PCR com a utilização de iniciadores preparados com base na sequência de nucleotídeos do gene. Os genes aspC de outros micro-organismos podem ser também obtidos de um modo similar.

[0084] Adicionalmente, exemplos de bactérias corineformes que tem capacidade de produção de L-treonina incluem, por exemplo, Corynebacterium acetoacidophilum AJ12318 (FERM BP-1172, Patente n^fi U.S. 5.188.949).

<BACTÉRIAS DE PRODUÇÃO DE L-LISINA>

[0085] Exemplos de métodos para transmitir ou aprimorar capacidade de produção de L-lisina incluem, por exemplo, um método de modificação de uma bactéria de modo que a bactéria tenha uma atividade ou atividades aumentadas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas a partir das enzimas de biossíntese de L-lisina. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a di-hidrodipicolinato sintase (dapA), aspartoquinase III (lysC), di-hidrodipicolinato redutase (dapB), diaminopimelato decarboxilase (lysA), diaminopimelato desidrogenase (ddh) (Patente n° U.S. 6.040.160), fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), aspartato semialdeído desidrogenase (asd), aspartato aminotransferase (aspartato transaminase) (aspC), diaminopimelato epimerase (dapF), tetrahidrodipicolinato sucinilase (dapD), sucinil diaminopimelato deacilase (dapE) e aspartase (aspA) (EP1253195A). É preferível aprimorar a atividade ou atividades aumentadas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas a partir, por exemplo, de di-hidrodipicolinato redutase, diaminopimelato decarboxilase, diaminopimelato desidrogenase, fosfoenolpiruvato carboxilase,

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39/114 aspartato aminotransferase, diaminopimelato epimerase, aspartato semialdeído desidrogenase, tetra-hidrodipicolinato sucinilase e sucinil diaminopimelato deacilase, dentre essas enzimas. Adicionalmente, bactérias de produção de L-lisina e cepas parentais para derivar as mesmas podem expressar um nível aumentado do gene envolvido na eficiência de energia (cyó) (EP1170376A), do gene de codificação de nicotinamida nucleotídeo trans-hidrogenase (pntAB) (Patente n° U.S. 5.830.716), do gene ybjE (W02005/073390) ou combinações dos mesmos. Visto que aspartoquinase ΠΙ (lysC) é submetida à inibição de retroalimentação por L-lisina, um gene lysC mutante de codificação de uma aspartoquinase ΠΙ dessensibilizada em relação à inibição de retroalimentação por L-lisina (Patente n- U.S. 5.932.453) pode ser usado para aprimorar a atividade dessa enzima. Exemplos da aspartoquinase III dessensibilizada em relação à inibição de retroalimentação por L-lisina incluem aspartoquinase III derivada de Escherichia coli e que tem uma ou mais mutações selecionadas a partir de uma mutação para substituir o resíduo de metionina na posição 318 por um resíduo de isoleucina; uma mutação para substituir o resíduo de glicina na posição 323por um resíduo de ácido aspártico e uma mutação para substituir o resíduo de treonina na posição 352 por um resíduo de isoleucina (Patente n^G U.S. 5.661.012 e 6.040.160). Adicionalmente, visto que di-hidrodipicolinato sintase (dapA) é submetida à inibição de retroalimentação por L-lisina, um gene dapA mutante de codificação de uma di-hidrodipicolinato sintase dessensibilizada em relação à inibição de retroalimentação por L-lisina pode ser usado para aprimorar a atividade dessa enzima. Exemplos da dihidrodipicolinato sintase dessensibilizada em relação à inibição de retroalimentação por L-lisina incluem di-hidrodipicolinato sintase derivada de Escherichia coli e que tem uma mutação para substituir o resíduo de histidina na posição 118 por um resíduo de tirosina (Patente n° U.S. 6.040.160).

[0086] Exemplos de métodos para transmitir ou aprimorar a

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40/114 capacidade de produção de L-lisina incluem também, por exemplo, um método de modificação de uma bactéria de modo que a bactéria tenha uma atividade ou atividades aumentadas reduzidas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas a partir das enzimas que catalisam uma reação que se ramifica a partir da trajetória biossintética de L-lisina para gerar um composto diferente de L-lisina. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a homoserina desidrogenase, lisina decarboxilase (Patente n- U.S.

5.827.698) e enzima málica (W02005/010175).

[0087] Adicionalmente, exemplos de métodos para transmitir ou aprimorar a capacidade de produção de L-lisina para ou nas bactérias corineformes incluem também um método de modificação das bactérias de modo que a atividade de um sistema de excreção de lisina (lysE) seja aumentada (WO97/23597). O gene lysE de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 corresponde à sequência complementar à sequência dos números de nucleotídeos 1.329.712 a 1.330.413 na sequência de genoma registrada como N- de Acesso ao Genbank NC_006958 (VERSION NC_006958.1 GI:62388892) no banco de dados de NCBI. A proteína LysE de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 é registrada como acesso ao GenBankN-YP_225551 (YP_225551.1 GL62390149).

[0088] Exemplos de bactérias de produção de L-lisina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem também cepas mutantes que têm resistência a um análogo de L-lisina. Os análogos de L-lisina inibem o crescimento de bactérias, tais como, bactérias da família Enterobacteriaceae e bactérias corineformes, mas essa inibição é completa ou parcialmente liberada quando L-lisina está presente no meio. Exemplos desses análogos de L-lisina incluem, mas não são particularmente limitados a, oxalisina, lisina hidroxamato, S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC), γ-metilisina e aclorocaprolactama. Cepas mutantes que têm resistência a esses análogos de lisina podem ser obtidas com a sujeição de uma bactéria a um tratamento de

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41/114 mutagênese artificial convencional.

[0089] Exemplos específicos de bactérias de produção de L-lisina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem E. coli AJ11442 (FERM BP1543, NRRL B-12185, Patente ri’ U.S. 4.346.170) e E. coli VL611. Nessas cepas, aspartoquinase é dessensibilizada em relação à inibição de retroalimentação por L-lisina.

[0090] Exemplos específicos de bactérias de produção de L-lisina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem também a cepa WC196 de E. coli. A cepa WC196 foi cultivada com a transmissão de resistência a AEC para a cepa W3110 cepa que foi derivada de E. coli K-12 (Patente n^ü U.S.

5.827.698). A cepa WC196 foi designada AJ13069 de E. coli e depositada no Instituto Nacional de Biociência e Tecnologia Humana, Agência de Ciência e Tecnologia Industrial (atualmente, agência administrativa independente, Instituo Nacional de Tecnologia e Avaliação, Depósito de Organismo de Patente Internacional, #120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japão) em 6 de dezembro de 1994 e atribuída um número de acesso de FERM P-14690. Depois, o depósito foi convertido para um depósito internacional sob provisões do Tratado de Budapeste em 29 de setembro de 1995 e atribuída um número de acesso de FERM BP-5252 (Patente n° U.S.

5.827.698).

[0091] Exemplos preferenciais de bactérias de produção de L-lisina incluem WC196AcadAAldc de E. coli e WC196AcadAAldc/pCABD2 de E. coli (W02010/061890). A WC196AcadAAldc de E. coli é uma cepa construída a partir da cepa WC196 com a interrupção dos genes cadA e IdcC que codificam lisina decarboxilase. A cepa WC196AcadAAldc/pCABD2 foi construída com a introdução do plasmídeo pCABD2 que contém genes de enzima de biossíntese de lisina (Patente ri’ U.S. 6.040.160) na cepa WC196AcadAAldc. A cepa WC196AcadAAldc, designada AJ110692, foi depositada na agência administrativa independente, Instituto Nacional de

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Ciência e Tecnologia Industrial Avançada, Depósito de Organismo de Patente Internacional (atualmente, agência administrativa independente, Instituo Nacional de Tecnologia e Avaliação, Depósito de Organismo de Patente Internacional, #120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 2920818, Japão) em 7 de outubro de 2008 como um depósito internacional e atribuída um número de acesso de FERM BP-11027. O plasmídeo pCABD2 contém um gene dapA mutante derivado de Escherichia coli e que codifica uma di-hidrodipicolinato sintase (DDPS) que tem uma mutação para dessensibilização para inibição de retroalimentação por L-lisina (H118Y), um gene lysC mutante derivado de Escherichia coli e que codifica aspartoquinase III que tem uma mutação para a dessensibilização para inibição de retroalimentação por L-lisina (T352I), o gene dapB derivado de Escherichia coli e que codifica di-hidrodipicolinato redutase e o gene ddh derivado de Brevibacterium lactofermentum e que codifica diaminopimelato desidrogenase.

[0092] Exemplos preferenciais de bactérias de produção de L-lisina incluem também E. coli AJIK01 (NITE BP-01520). A cepa AJIK01 foi designada AJ111046 de E. coli e depositada na agência administrativa independente, Instituo Nacional de Tecnologia e Avaliação, Depósito de Organismo de Patente Internacional (#122, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazushi, Chiba-ken, 292-0818, Japão) em 29 de janeiro de 2013. Depois, a mesma foi convertida para um depósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste em 15 de maio de 2014 e atribuída um número de acesso de NITE BP-01520.

[0093] Exemplos de bactérias corineformes que têm capacidade de produção de L-lisina incluem, por exemplo, as cepas mutantes resistentes a AEC (Corynebacterium glutamicum (cepa Brevibacterium lactofermentum AJ11082) (NRRL B-11470) etc., Publicação de Patente (Kokoku) N° JP 561914, 56-1915, 57-14157, 57-14158, 57-30474, 58-10075, 59-4993, 61

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35840, 62-24074, 62-36673, 5-11958, 7-112437 e 7-112438); cepas mutantes que necessitam de um aminoácido, tais como, L-homoserina para seu crescimento (Publicação de Patente N- JP 48-28078 e 56-6499); cepas mutantes que mostram resistência aAEC e que necessitam adicionalmente de um aminoácido, tais como, L-leucina, L-homoserina, L-prolina, L-serina, Larginina, L-alanina e L-valina (Patente n- U.S. 3.708.395 e 3.825.472); cepas mutantes que mostram resistência a DL-a-amino-e-caprolactama, a-aminolaurilactama, análogo de ácido aspártico, fármaco de sulfa, quinoide e Nlauroileucina; cepas mutantes que mostram resistência a um inibidor de oxaloacetato decarboxilase ou um inibidor de enzima de cadeia respiratória (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N- JP 50-53588, 50-31093, 52102498, 53-9394, 53-86089, 55-9783, 55-9759, 56-32995, 56-39778, Publicação de Patente n° JP 53-43591 e 53-1833); cepas mutantes que necessitam de inositol ou ácido acético (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N- JP 55-9784 e 56-8692); cepas mutantes que são suscetíveis a ácido fluoropirúviso ou uma temperatura de 34°C ou mais (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N- JP 55-9783 e 53-86090); e cepas mutantes que mostram resistência ao etileno glicol (Patente n- U.S. 4.411.997).

<BACTÉRIAS DE PRODUÇÃO DE L-ARGININA>

[0094] Exemplos de métodos para transmitir ou aprimorar a capacidade de produção de L-arginina incluem, por exemplo, um método de modificação de uma bactéria de modo que a bactéria tenha uma atividade ou atividades aumentadas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas a partir das enzimas de biossíntese de L-arginina. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitadas a, N-acetilglutamato sintase (argA), Nacetilglutamato quinase (argB), N-acetilglutamil fosfato redutase (argC), acetilomitina transaminase (argD), acetilomitina deacetilase (argE), omitina carbamoil transferase (argF, argl), argininosucinato sintetase (argG), argininosucinato liase (argH), omitina acetil transferase (argJ) e carbamoil

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44/114 fosfato sintetase (carAB). Como o gene N-acetilglutamato sintase (argAj, por exemplo, um gene de codificação de uma N-acetilglutamato sintase mutante dessensibilizada em relação à inibição de retroalimentação por L-arginina por substituição para os resíduos de aminoácido que correspondem às posições 15 a 19 da enzima do tipo selvagem (EP1170361A) pode preferencialmente ser usado.

[0095] Exemplos específicos de bactérias de produção de L-arginina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem, por exemplo, a cepa E. coli 237 (VKPM B-7925, US2002/058315A1), cepas derivadas das mesmas introduzidas com o gene argA de codificação de uma N-acetil glutamato sintase mutante (Pedido de Patente N² RU 2001112869, EP1170361Al), cepa 382 de E. coli derivada da cepa 237 e que tem uma capacidade de assimilação de ácido acético intensificada (VKPM B-7926, EP1170358A1) e cepa 382ilvA+ de E. coli, que é uma cepa obtida da cepa 382 com a introdução do gene ilvA do tipo selvagem da cepa K-12 de E. coli K-12 à mesma. A cepa 237 E. coli foi depositada na Coleção Nacional Russa de Micro-organismos Industriais (VKPM, FGUP GosNH Genetika, 1 Dorozhny proezd., 1 Moscou 117545, Rússia) em 10 de abril de 2000 com um número de acesso de VKPM B-7925 e o depósito foi convertido para um depósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste em 18 de maio de 2001. A cepa 382 de E. coli 382 foi depositada na Coleção Nacional Russa de Micro-organismos Industriais (VKPM, FGUP GosNH Genetika, 1 Dorozhny proezd., 1 Moscou 117545, Rússia) em 10 de abril de 2000 com o número de acesso de VKPM B-7926.

[0096] Exemplos de bactérias de produção de L-arginina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem também cepas que têm resistência a análogos de aminoácido e assim por diante. Exemplos de tais cepas incluem cepas mutante de E. coli que têm resistência a α-metilmetionina, pfluorofenilalanina, D-arginina, arginina hidroxamato, S-(2-aminoetil)-cisteína,

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45/114 α-metilserina, β-2-tienilalanina ou sulfaguanidina (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N- 56-106598).

[0097] Exemplos de bactérias de produção de L-arginina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem também tais bactérias corineformes como uma cepa deficiente em ArgR que é um repressor de arginina (US20020045223A) e uma cepa em que a atividade de glutamina sintetase é aumentada (US2005-0014236A).

[0098] Exemplos de bactérias de produção de L-arginina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem também cepas mutantes de bactérias corineformes, as cepas mutantes que têm resistência a um análogo de aminoácido ou similares. Exemplos de tais cepas incluem, por exemplo, cepas que têm resistência a 2-tiazolealanina e que exibem adicionalmente auxotrofia para L-histidina, L-prolina, L-treonina, L-isoleucina, L-metionina ou L-triptofano (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N° JP 54-44096); cepas resistentes ao ácido cetomalônico, ácido fluoromalônico ou ácido monofluoroacético (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N- JP 5718989); cepas resistentes a argininol (Publicação de Patente N- JP 62-24075); cepas resistentes a X-guanidina (X representa uma cadeia alifática ou um derivado da mesma, Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N- JP 2186995); e cepas resistentes a arginina hidroxamato e 6-azauracil (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N- JP 57-150381). Exemplos específicos de bactérias corineformes que têm capacidade de produção de L-arginina incluem as cepas a seguir.

Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavurn) AJ11169 (FERM BP-6892)

Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ12092 (FERM BP-6906)

Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavurn) AJ11336 (FERM BP-6893)

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Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11345 (FERM BP-6894)

Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ12430 (FERM BP-2228) <BACTÉRIAS DE PRODUÇÃO DE L-CITRULINA E BACTÉRIAS DE PRODUÇÃO DE L-ORN1TINA>

[0099] L-citrulina e L-omitina são intermediários da trajetória biossintética da L-arginina. Portanto, exemplos de métodos para transmitir ou aprimorar uma capacidade para produzir L-citrulina e/ou L-omitina incluem, por exemplo, um método de modificação de uma bactéria de modo que a bactéria tenha uma atividade ou atividades aumentadas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas a partir das enzimas de biossíntese de L-arginina. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, N-acetilglutamato sintase (argA), N-acetilglutamato quinase (argB), Nacetilglutamil fosfato redutase (argC), acetilomitina transaminase (argD), acetilomitina deacetilase (argE), omitina carbamoil transferase (argF, argl), omitina acetil transferase (argJ) e carbamoil fosfato sintetase (carAB) para Lcitrulina. Adicionalmente, Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, N-acetilglutamato sintase (argA), Nacetilglutamato quinase (argB), N-acetilglutamil fosfato redutase (argC), acetilomitina transaminase (argD), acetilomitina deacetilase (argE) e omitina acetil transferase (argJ) para L-omitina.

[00100] Uma bactéria de produção de L-citrulina pode ser facilmente obtida a partir, por exemplo, de uma bactéria de L-arginina, tal como, a cepa 382 de E. coli (VKPM B-7926) com a diminuição da atividade de argininosucinato sintetase codificada pelo gene argG. Além disso, uma bactéria de produção de L-omitina pode ser facilmente obtida a partir, por exemplo, de uma bactéria de L-arginina, tal como, a cepa 382 de E. coli 382 (VKPM B-7926) com a diminuição da atividade de omitina carbamoil

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47/114 transferase codificada pelos genes argF e argl.

[00101] Exemplos específicos de bactérias de produção de L-citrulina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem, por exemplo, cepas que pertencem aos gêneros Escherichia, tal como, as cepas 237/pMADSll, 237/pMADS12 e 237/pMADS13 de E. coli que têm uma N-acetilglutamato sintase mutante (Patente N- RU 2.215.783, Patente n- U.S. 6.790.647 e EP1170361B1), cepas 333 de E. coli (VKPM B-8084) e 374 (VKPM B-8086) que têm carbamoil fosfato sintetase resistente à inibição de retroalimentação (Patente N- RU 2.264.459), e cepas de E. coli que têm uma atividade de acetoglutarato sintase aumentada e que tem uma atividade de ferredoxina NADP⁺ redutase, piruvato sintase e/ou α-cetoglutarato desidrogenase aumentada (EP2133417A).

<BACTÉRIAS DE PRODUÇÃO DE L-HISTIDINA>

[00102] Exemplos de métodos para transmitir ou aprimorar a capacidade de produção de L-histidina incluem, por exemplo, um método de modificação de uma bactéria de modo que a bactéria tenha uma atividade ou atividades aumentadas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas a partir das enzimas de biossíntese de L-histidina. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a ATP fosforibosiltransferase (hisG), fosforibosil AMP ciclo-hidrolase (hisl), fosforibosil-ATP pirofosfo-hidrolase (hisl), fosforibosilformimino-5-aminoimidazol carboxamida ribotida isomerase (hisA), amidotransferase (hisH), histidinol fosfato aminotransferase (hisC), histidinol fosfatase (hisB) e histidinol desidrogenase (hisD).

[00103] Dentre essas enzimas, as enzimas de biossíntese de L-histidina codificadas por hisG e hisBHAFI são conhecidas por serem inibidas por Lhistidina. Portanto, a capacidade para produzir L-histidina pode ser transmitida ou intensificada, por exemplo, com a introdução de uma mutação para conferir resistência à inibição de retroalimentação no gene de codificação de ATP fosforibosiltransferase (hisG) (Patente N- RU 2.003.677 e 2.119.536).

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48/114 [00104] Exemplos específicos de bactérias de produção de L-histidina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem, por exemplo, cepas que pertencem aos gêneros Escherichia, tal como, a cepa 24 de E. coli (VKPM B5945, RU2003677), E. coli NRRL B-12116 a B-12121 (Patente n² U.S. 4.388.405), E. coli H-9342 (FERM BP-6675) e H-9343 (FERM BP-6676, Patente n² U.S. 6.344.347), E. coli H-9341 (FERM BP-6674, EP1085087), E. coli AI80/pFM201 (Patente n° U.S. 6.258.554), E. coli FERM P-5038 e FERM P-5048 que foram introduzidas com um vetor que carrega um DNA que codifica uma enzima de biossíntese de L-histidina (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N- JP 56-005099), cepas de E. coli introduzidas com um gene para transporte de aminoácido (EP1016710A) e cepa 80 de E. coli que foi transmitida com resistência a sulfaguanidina, DL-l,2,4-triazol-3alanina e estreptomicina (VKPM B-7270, Patente n- RU 2119536).

<BACTÉRIAS DE PRODUÇÃO DE L-CISTEÍNA>

[00105] Exemplos de métodos para transmitir ou aprimorar a capacidade de produção de L-cisteína incluem, por exemplo, um método de modificação de uma bactéria de modo que a bactéria tenha uma atividade ou atividades aumentadas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas a partir das enzimas de biossíntese de L-cisteína. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, serina acetiltransferase (cysE) e 3fosfoglicerato desidrogenase (serA). A atividade de serina acetiltransferase pode ser intensificada, por exemplo, com a introdução de um gene cysE mutante de codificação de uma serina acetiltransferase mutante resistente à inibição de retroalimentação por cisteína em uma bactéria. Tal serina acetiltransferase mutante é revelada, por exemplo, na Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N² JP 11-155571 e US2005-0112731A. Adicionalmente, a atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase pode ser intensificada, por exemplo, com a introdução de um gene serA mutante de codificação de uma 3-fosfoglicerato desidrogenase mutante resistente à

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49/114 inibição de retroalimentação por serina em uma bactéria. Tal 3-fosfoglicerato desidrogenase mutante é revelado, por exemplo, na Patente n² U.S. 6.180.373. [00106] Adicionalmente, exemplos de métodos para transmitir ou aprimorar a capacidade de produção de L-cisteína incluem também, por exemplo, um método de modificação de uma bactéria de modo que a bactéria tenha uma atividade ou atividades aumentadas reduzidas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas a partir das enzimas que catalisam uma reação que se ramifica da trajetória de biossíntese de L-cisteína para gerar um composto diferente de L-cisteína. Exemplos de tais enzimas incluem, por exemplo, enzimas envolvidas na decomposição de L-cisteína. Exemplos das enzimas envolvidas na decomposição de L-cisteína incluem, mas não são particularmente limitados a cistationina-p-liase (metC, Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N² JP 11-155571; Chandra et al., Biochemistry, 21 (1982) 3.064 a 3.069), triptofanase (tnaA, Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N² JP 2003-169668; Austin Newton et al., J. Biol. Chem., 240 (1965) 1.211 a 1.218), O-acetilserina sulfidrilase B (cysM, Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N² JP 2005-245311), o produto de gene malY (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N² JP 2005-245311), o produto de gene d0191 de Pantoea ananatis (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N² JP 2009232844) e cisteína desulfidrase (aecD, Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N² 2002-233384.

[00107] Adicionalmente, exemplos de métodos para transmitir ou aprimorar a capacidade de produção de L-cisteína incluem também, por exemplo, um método de aprimorar o sistema de excreção de L-cisteína, e um método de aprimorar o sistema de transporte de sulfato/tiosulfato. Exemplos de proteínas do sistema de excreção de L-cisteína incluem a proteína codificada pelo gene ydeD (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N² JP 2002-233384), a proteína codificada pelo gene yfiK (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N² JP 2004-49237), as proteínas codificadas pelos genes

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50/114 emrAB, emrKY, yojIH, acrEF, bcr, e cusA (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N² JP 2005-287333), e a proteína codificada pelo gene yeaS (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N² JP 2010-187552). Exemplos das proteínas do sistema de transporte de sulfato/tiosulfato incluem as proteínas codificadas pelo aglomerado de genes cysPTWAM.

[00108] Exemplos específicos de bactérias de produção de L-cisteína e cepas parentais para derivar as mesmas incluem, por exemplo, E. coli JM15 transformada com diferentes alelos cysE que codificam serina acetiltransferases resistentes à retroalimentação (Patente n² U.S. 6.218.168, Pedido de patente n² RU 2003121601), E. coli W3110 que tem um gene de codificação superexpresso de uma proteína adequada para secreção de uma substância citotóxica (Patente n² U.S. 5.972.663), cepas de E. coli que têm uma atividade de cisteína desulfo-hidrase reduzida (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N² JP 11-155571) e. coli W3110 que tem uma atividade aumentada de um regulador transcricional positivo para regulão de cisteína codificado pelo gene cysB (WO01/27307Al).

[00109] Adicionalmente, exemplos de bactérias corineformes que têm capacidade de produção de L-cisteína incluem bactérias corineformes que têm serina acetiltransferase dessensibilizada em relação à inibição de retroalimentação por L-cisteína para, desse modo, mostrar atividade de serina acetiltransferase intracelular intensificada (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N² JP 2002-233384).

<BACTÉRIAS DE PRODUÇÃO DE L-SERINA>

[00110] Exemplos de métodos para transmitir ou aprimorar a capacidade de produção de L-serina incluem, por exemplo, um método de modificação de uma bactéria de modo que a bactéria tenha uma atividade ou atividades aumentadas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas a partir das enzimas de biossíntese de L-serina. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a 3-fosfoglicerato desidrogenase

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51/114 (serA), fosfoserina transaminase (serC) e fosfoserina fosfatase (serB) (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N~ JP 11-253187). A atividade de 3fosfoglicerato desidrogenase pode ser aumentada, por exemplo, com a introdução de um gene serA mutante de codificação de uma 3-fosfoglicerato desidrogenase mutante resistente à inibição de retroalimentação por L-serina em uma bactéria. A 3-fosfoglicerato desidrogenase mutante é revelada, por exemplo, na Patente n² U.S. 6.180.373.

[00111] Exemplos de bactérias de produção de L-serina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem, por exemplo, bactérias corineformes resistentes à azaserina ou p-(2-tienil)-DL-alanina e deficiente em capacidade de decomposição de L-serina (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N² JP 10-248588). Exemplos específicos de tais bactérias corineformes incluem, por exemplo, Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ13324 (FERM P-16128) que é resistente à azaserina e deficiente na capacidade de decomposição de L-serina e Corynebacterium glutamicum {Brevibacterium flavum) AJ13325 (FERM P16129), que é resistente a P-(2-tienil)-DL-alanina e deficiente na capacidade de decomposição de L-serina (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N² JP 10-248588).

<BACTÉRIAS DE PRODUÇÃO DE L-METIONINA>

[00112] Exemplos de bactérias de produção de L-metionina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem cepas auxotróficas de L-treonina e cepas mutantes resistentes à norleucina (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N² JP 2000-139471). Exemplos de bactérias de produção de Lmetionina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem também uma cepa que contém uma homoserina transsuccinilase mutante resistente à inibição de retroalimentação por L-metionina (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N² JP 2000-139471, US2009-0029424A). Visto que Lmetionina é biossintetizada através de L-cisteína como um intermediário, a

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52/114 capacidade de produção de L-metionina pode ser também intensificada com o aprimoramento da capacidade de produção de L-cisteína (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N° JP 2000-139471, US2008-0311632A).

[00113] Exemplos específicos de bactérias de produção de L-metionina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem, por exemplo, E. coli AJ11539 (NRRL B-12399), E. coli AJ11540 (NRRL B-12400), E. coli AJ11541 (NRRL B-12401), E. coli AJ11542 (NRRL B-12402, Patente N- GB 2075055), a cepa 218 de E. coli (VKPM B-8125, Patente N° RU 2209248) e a cepa 73 (VKPM B-8126, Patente N- RU 2215782) que são resistentes a norleucina, que é um análogo de L-metionina e E. coli AJ13425 (FERMP16808, Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N- JP 2000-139471). A cepa AJ13425 é uma cepa auxotrófica de L-treonina derivada do E. coli W3110, em que o repressor de metionina é excluído, a atividade de Sadenosilmetionina sintetase intracelular é atenuada, e a atividade de homoserina transsuccinilase intracelular, atividade de cistationina γ-sintase e atividade de aspartoquinase-homoserina desidrogenase II são aprimoradas.

<BACTÉRIAS DE PRODUÇÃO DE L-LEUCINA>

[00114] Exemplos de métodos para transmitir ou aprimorar capacidade de produção de L-leucina incluem, por exemplo, um método de modificação de uma bactéria de modo que a bactéria tenha uma atividade ou atividades aumentadas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas a partir das enzimas de biossíntese de L-leucina. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados às enzimas codificadas pelos genes do operão de leuABCD. Adicionalmente, para aprimorar a atividade de tal enzima, por exemplo, o gene leuA mutante de codificação de uma isopropil maleato sintase dessensibilizada em relação à inibição de retroalimentação pela Lleucina (Patente n- U.S. 6.403.342) pode ser preferencialmente usado.

[00115] Exemplos específicos de bactérias de produção de L-leucina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem, por exemplo, cepas que

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53/114 pertencem aos gêneros Escherichia, tais como, cepas de E. coli resistentes à leucina (por exemplo, a cepa 57 (VKPM B-7386, patente n^a U.S. 6.124.121)), cepas de E. coli resistentes a um análogo de leucina, tal como, β-2tienilalanina, 3-hidroxileucina, 4-azaleucina e 5,5,5-trifluoroleucina (Publicação de Patente (Kokoku) N^a JP 62-34397 e Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N^a JP 8-70879), cepas de E. coli obtidas por uma técnica de engenharia genética descrita no documento n^a WO96/06926 e E. coli H-9068 (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N^a JP 8-70879).

[00116] Exemplos de bactérias corineformes que têm capacidade de produção de L-leucina incluem, por exemplo, Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ3718 (FERM P-2516) que é resistente a 2-tiazol alanina e β-hidroxileucina e auxotrófica para isoleucina e metionina.

<BACTÉRIAS DE PRODUÇÃO DE L-ISOLEUCINA>

[00117] Exemplos de métodos para transmitir ou aprimorar a capacidade de produção de L-isoleucina incluem, por exemplo, um método de modificação de uma bactéria de modo que a bactéria tenha atividade ou atividades aumentadas de um ou mais enzimas selecionadas a partir das enzimas de biossíntese de L-isoleucina. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a treonina deaminase e ácido acetohidroxi sintase (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N^a JP 2-458, EP0356739A, Patente n^a U.S. 5.998.178).

[00118] Exemplos específicos de bactérias de produção de L-isoleucina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem, por exemplo, bactérias Escherichia, tais como, cepas mutantes que têm resistência a 6dimetilaminopurina (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N^a JP 5304969), cepas mutantes que têm resistência a um análogo de isoleucina, tal como, tiaisoleucina e isoleucina hidroxamato, e cepas mutantes que têm resistência a tal análogo de isoleucina e adicionalmente que têm resistência a DL-etionina e/ou arginina hidroxamato (Patente aberta à inspeção pública

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54/114 (Kokai) N-JP 5-130882).

[00119] Exemplos de bactérias corineformes que têm capacidade de produção de L-isoleucina incluem, por exemplo, a bactéria corineforme em que gene bmE de codificação de uma proteína de excreção de aminoácido de cadeia ramificada é amplificada (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) NJP 2001-169788), a bactéria corineforme para a qual capacidade de produção de L-isoleucina é transmitida por fusão de protoplasto com uma bactéria de produção de L-lisina (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N- JP 6274293), a bactéria corineforme em que homoserina desidrogenase é intensificada (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N- JP 62-91193), a cepa resistente a treonina hidroxamato (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N- JP 62-195293), a cepa resistente ao ácido α-cetomalônico (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N- JP 61-15695), a cepa resistente a metilisina (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N° JP 61-15696) e Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavuni) AJ12149 (FERM BP759, Patente n² U.S. 4.656.135).

<BACTÉRIAS DE PRODUÇÃO DE L-VALINA>

[00120] Exemplos de métodos para transmitir ou aprimorar a capacidade de produção de L-valina incluem, por exemplo, um método de modificação de uma bactéria de modo que a bactéria tenha uma atividade ou atividades aumentadas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas a partir das enzimas de biossíntese de L-valina. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados às enzimas codificadas pelos genes do operão ilvGMEDA e as enzimas codificadas pelo operão ilvBNC. O gene ilvBN codifica ácido aceto-hidroxi sintase e o gene ilvC codifica isomeroredutase (WO00/50624). Expressões do operão ilvGMEDA e do operão ilvBNC são suprimidas (atenuadas) por L-valina, L-isoleucina e/ou Lleucina. Portanto, para aprimorar a atividade de tal enzima, é preferível que a supressão de expressão pela L-valina produzida seja liberada com a remoção

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55/114 ou com a modificação de uma região necessária para a atenuação. Adicionalmente, a treonina deaminase codificada pelo gene ilvA é uma enzima que catalisa a reação de desaminação de ácido 2-cetobutírico que resulta em L-treonina que é a etapa de limitação de taxa do sistema de biossíntese de L-isoleucina. Portanto, para a produção de L-valina, é preferível que o gene ilvA seja, por exemplo, interrompido e, desse modo, a atividade de treonina deaminase seja diminuída.

[00121] Exemplos de métodos para transmitir ou aprimorar a capacidade de produção de L-valina incluem também, por exemplo, um método de modificação de uma bactéria de modo que a bactéria tenha uma atividade ou atividades reduzidas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas a partir das enzimas que catalisam uma reação que se ramifica a partir da trajetória de biossíntese de L-valina para gerar um composto além da L-valina. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a treonina desidratase envolvida na síntese de L-leucina e as enzimas envolvidas na síntese de ácido D-pantotênico (WO00/50624).

[00122] Exemplos específicos de bactérias de produção de L-valina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem, por exemplo, cepas de E. coli modificadas de modo a superexpressar o operão ilvGMEDA (Patente nU.S. 5.998.178).

[00123] Exemplos de bactérias de produção de L-valina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem também cepas mutantes que têm uma mutação na amino-acil t-RNA sintetase (Patente n° U.S. 5.658.766). Exemplos de tais cepas incluem, por exemplo, E. coli VL1970, que tem uma mutação no gene ileS de codificação de isoleucina t-RNA sintetase. E. coli VL1970 foi depositada na Coleção Nacional Russa de Micro-organismos Industriais (VKPM, FGUP GosNII Genetika, 1 Dorozhny Proezd, 1 Moscou 117545, Rússia) em 24 de junho de 1988 com o número de acesso de VKPM B-4411. Exemplos de bactérias de produção de L-valina e cepas parentais

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56/114 para derivar as mesmas incluem também cepas mutantes que necessitam de ácido lipoico para o crescimento e/ou que são desprovidas de H⁺-ATPase (WO96/06926).

[00124] Exemplos de bactérias de produção de L-valina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem também cepas resistentes a um análogo de aminoácido ou similar. Exemplos de tais cepas incluem, por exemplo, as cepas de bactéria corineforme que são auxotróficas para Lisoleucina e L-metionina, e resistentes a D-ribose, purina ribonucleosídeo ou pirimidina ribonucleosídeo e têm uma capacidade para produzir L-valina (FERM P-1841, FERM P-29) (Publicação de Patente N° JP 53-025034), cepas de bactéria corineforme resistentes a policetídeos (FERM P-1763, FERM P1764) (Publicação de Patente N° JP 06-065314) e cepas de bactéria corineforme resistentes à L-valina em um meio que contém ácido acético como a única fonte de carbono e sensível aos análogos de ácido pirúvico (ácido fluoropurúvico etc.) em um meio que contém glicose como a única fonte de carbono (FERM BP-3006, BP-3007) (Patente N- JP 3006929).

<BACTÉRIAS DE PRODUÇÃO DE L-ALANINA>

[00125] Exemplos de bactérias de produção de L-alanina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem as bactérias corineformes deficientes da H⁺-ATPase (Appl. Microbiol. Biotechnol., novembro de 2001, 57(4):534 a 540) e bactérias corineformes em que a atividade de aspartato βdecarboxilase é intensificada (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N° JP 07-163383).

<BACTÉRIAS DE PRODUÇÃO DE L-TRIPTOFANO, BACTÉRIAS DE PRODUÇÃO DE L-FENILALANINA E BACTÉRIAS DE PRODUÇÃO DE L-TIROSINA>

[00126] Exemplos de métodos para transmitir ou aprimorar a capacidade de produção de L-triptofano, a capacidade de produção de Lfenilalanina e/ou a capacidade de produção de L-tirosina incluem, por

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57/114 exemplo, um método de modificação de uma bactéria de modo que a bactéria tenha uma atividade ou atividades aumentadas de um ou mais enzimas selecionadas a partir das enzimas de biossíntese de L-triptofano, Lfenilalanina e/ou L-tirosina.

[00127] Exemplos de enzimas comuns aos sistemas de biossíntese aminoácidos aromáticos incluem, mas não são particularmente limitados a 3desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato sintase (aroG), 3-de-hidroquinato sintase (aroB), chiquimato desidrogenase (aroE), chiquimato quinase (aroL), 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (aroA) e corismato sintase (aroC) (EP763127B). As expressões dos genes que codificam essas enzimas são controladas pelo repressor de tirosina (tyrR), e as atividades dessas enzimas pode ser intensificada excluindo-se o gene tyrR (EP763127B).

[00128] Exemplos das enzimas de biossíntese de L-triptofano incluem, mas não são particularmente limitados à antranilato sintase (trpE), triptofano sintase (trpAB) e fosfoglicerato desidrogenase (serA). Por exemplo, com a introdução de um DNA que contém o operão de triptofano, a capacidade de produção de L-triptofano pode ser transmitida ou intensificada. Triptofano sintase consiste nas subunidades α e β codificadas pelos genes trpA e trpB, respectivamente. Visto que a antranilato sintase é submetida à inibição de retroalimentação por L-triptofano, um gene de codificação dessa enzima introduzida com uma mutação para dessensibilização à inibição de retroalimentação pode ser usado para aprimorar a atividade daquela enzima. Visto que a fosfoglicerato desidrogenase é submetida à inibição de retroalimentação por L-serina, um gene de codificação dessa enzima introduzida com uma mutação para dessensibilização para inibição de retroalimentação pode ser usado para aprimorar a atividade daquela enzima. Adicionalmente, com o aumento da expressão do operão (ace operão) que consiste do gene maleato sintase (aceB), gene isocitrato liase (aceÁ) e gene isocitrato desidrogenase quinase/fosfatase (aceK), capacidade de produção de

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L-triptofano pode ser transmitida ou intensificada (W02005/103275).

[00129] Exemplos das enzimas de biossíntese de L-fenilalanina incluem, mas não são particularmente limitados a corismato mutase e prefenato desidratase. A corismato mutase e prefenato desidratase são codificadas pelo gene pheA como uma enzima bifuncional. Visto que a corismato mutase e prefenato desidratase são submetidas à inibição de retroalimentação por L-fenilalanina, os genes que codificam essas enzimas introduzidas com uma mutação para dessensibilização à inibição de retroalimentação podem ser usados para aprimorar as atividades dessas enzimas.

[00130] Exemplos das enzimas de biossíntese de L-tirosina incluem, mas não são particularmente limitados a corismato mutase e prefenato desidrogenase. A corismato mutase e prefenato desidrogenase são codificadas pelo gene tyrA como uma enzima bifuncional. Visto que a corismato mutase e a prefenato desidrogenase são submetidas à inibição de retroalimentação por L-tirosina, genes que codificam essas enzimas introduzidos com uma mutação para dessensibilização à inibição de retroalimentação podem ser usados para aprimorar as atividades dessas enzimas.

[00131] As bactérias de produção de L-triptofano, L-fenilalanina e/ou L-tirosina podem ser modificadas de modo que a biossíntese de um aminoácido aromático além do aminoácido aromático do objetivo seja reduzida. Adicionalmente, as bactérias de produção de L-triptofano, Lfenilalanina e/ou L-tirosina podem ser modificadas de modo que um sistema de absorção de subproduto seja aprimorado. Exemplos do subproduto incluem aminoácidos aromáticos além do aminoácido aromático do objetivo. Exemplos do gene de codificação de tal sistema de absorção de subproduto incluem, por exemplo, tnaB c mtr, que são genes que codificam o sistema de absorção de L-triptofano, pheP, que é um gene de codificação do sistema de absorção de L-fenilalanina e tyrP, que é um gene de codificação do sistema de

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59/114 absorção de L-tirosina (EP1484410).

[00132] Exemplos específicos de bactérias de produção de L-triptofano e cepas parentais para derivar as mesmas incluem, por exemplo, E. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) e JP6015/pMU91 (DSM10123), que têm um gene trpS mutante de codificação de uma triptofanil-tRNA sintetase parcialmente inativa (Patente n² U.S. 5.756.345), E. coli SV164, que tem um alelo trpE que codifica uma antranilato sintase dessensibilizada em relação à inibição de retroalimentação por triptofano, E. coli SV164 (pGH5), que tem um alelo serA que codifica uma fosfoglicerato desidrogenase dessensibilizada em relação à inibição de retroalimentação por serina e um alelo trpE que codifica uma antranilato sintase dessensibilizada em relação à inibição de retroalimentação por triptofano (Patente n² U.S. 6.180.373), uma cepa introduzida com um operão de triptofano que contém um alelo trpE que codifica uma antranilato sintase dessensibilizada em relação à inibição de retroalimentação por triptofano (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N² JP 57-71397 e 62-244382, Patente n² U.S. 4.371.614), E. coli AGX17(pGX44) (NRRL B-12263) e AGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264), que são deficientes de triptofanase (Patente n² U.S. 4.371.614), E. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps, que tem uma capacidade de produção de fosfoenolpiruvato aumentada (WO97/08333, Patente n² U.S. 6.319.696), e cepas que pertencem aos gêneros Escherichia que tem uma atividade aumentada da proteína codificada pelo gene yedA ou yddG (US20030148473A1 e US2003-0157667A1).

[00133] Exemplos de bactérias corineformes que têm capacidade de produção de L-triptofano incluem, por exemplo, Corynebacterium glutamicum AJ12118 (FERM BP-478, Patente N² JP 1681002), que é resistente à sulfaguanidina, a cepa introduzida com o operão de triptofano (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N² JP 63-240794), e a cepa introduzida com um gene de codificação de chiquimato quinase derivada de

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60/114 uma bactéria corineforme (Patente N- JP 1994749).

[00134] Exemplos específicos de bactérias de produção de Lfenilalanina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem, por exemplo, E. coli AJ12739 (tyrA::TnlO, tyrR) (VKPM B-8197), que é deficiente na corismato mutase-prefenato desidrogenase e o repressor de tirosina (W003/044191), E. coli HW1089 (ATCC 55371), que contém um gene pheA34 mutante de codificação de uma corismato mutase-prefenato desidratase dessensibilizada em relação à inibição de retroalimentação (Patente n° U.S. 5.354.672), E. coli MWEClOl-b (KR8903681), E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 e NRRL B-12147 (Patente n- U.S. 4.407.952). Exemplos específicos de bactérias de produção de Lfenilalanina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem também, por exemplo, E. coli K-12 <W3110(tyrA)/pPHAB> (FERM BP-3566), E. coli K12 <W3110(tyrA)/pPHAD> (FERM BP-12659), E. coli K-12 <W3110(tyrA)/pPHATerm> (FERM BP-12662) e E. coli K-12 AJ12604 <W3110(tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB> (FERM BP-3579) que contêm um gene de codificação de uma corismato mutase-prefenato desidratase dessensibilizada em relação à inibição de retroalimentação (EP488424B1). Exemplos específicos de bactérias de produção de L-fenilalanina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem adicionalmente, por exemplo, cepas que pertencem aos gêneros Escherichia que têm uma atividade aumentada da proteína codificada pelo gene yedA ou o gene yddG (US2003-0148473A, US2003-0157667A, W003/044192).

[00135] Exemplos de bactérias corineformes que têm capacidade de produção de L-fenilalanina incluem, por exemplo, cepas de Corynebacterium glutamicum BPS-13 (FERM BP-1777), K77 (FERM BP-2062) e K78 (FERM BP-2063) (EP331145A, Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N° JP 02303495), cuja atividade de fosfoenolpiruvato carboxilase ou piruvato quinase é reduzida, e a cepa auxotrófica de tirosina (Patente aberta à inspeção pública

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61/114 (Kokai) N° JP 05-049489).

[00136] Exemplos de bactérias corineformes que têm capacidade de produção de L-tirosina incluem, por exemplo, Corynebacterium glutamicum AJ11655 (FERM P-5836, Publicação de Patente ri’ JP 2-6517) e Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ12081 (FERM P-7249, Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N° JP 60-70093).

[00137] Adicionalmente, exemplos de métodos para transmitir ou aprimorar uma capacidade de produção de L-aminoácido incluem, por exemplo, um método de modificação de uma bactéria de modo que a bactéria tenha uma atividade aumentada para secretar um L-aminoácido de uma célula bacteriana. Tal atividade para secretar um L-aminoácido pode ser aumentada, por exemplo, com o aumento da expressão de um gene de codificação de uma proteína responsável pela secreção do L-aminoácido. Exemplos de genes que codificam as proteínas responsáveis pela secreção de vários aminoácidos incluem, por exemplo, gene b2682 (ygaZ), gene b2683 (ygaH), gene bl242 (ychE) e gene b3434 (yhgN) (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N- JP 2002-300874).

[00138] Adicionalmente, exemplos de métodos para transmitir ou aprimorar uma capacidade de produção de L-aminoácido incluem também, por exemplo, um método de modificação de uma bactéria de modo que a bactéria tenha uma atividade ou atividades aumentadas de um ou mais proteínas selecionadas a partir de proteínas envolvidas no glicometabolismo e proteínas envolvidas no metabolismo de energia.

[00139] Exemplos das proteínas envolvidas no glicometabolismo incluem proteínas envolvidas na absorção de sacarídeos e as enzimas de sistema de glicólise. Exemplos de genes que codificam uma proteína envolvida no glico metabolismo incluem gene de glicose-6-fosfato isomerase (pgi, WOO1/02542), gene de piruvato carboxilase (pyc, WO99/18228, EP1092776A), gene de fosfoglucomutase (pgm, W003/04598), gene de

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62/114 frutose bisfosfato aldolase (pfkB, fbp, W003/04664), gene de transaldolase (talB, WO03/008611), gene de fumarase (fum, W001/02545), gene de absorção de sacarose não PTS (csc, EP1149911A) e gene de assimilação de sacarose (operão scrAB, Patente n° U.S. 7.179.623).

[00140] Exemplos de genes que codificam as proteínas envolvidas no metabolismo de energia incluem o gene de trans-hidrogenase (pntAB, Patente n° U.S. 5.830.716) e gene de citocromo oxidase tipo bo (cyoB, EP1070376A). [00141] Adicionalmente, exemplos de métodos para transmitir ou aprimorar uma capacidade para produzir substâncias úteis, tais como, Laminoácidos incluem, por exemplo, um método de modificação de uma bactéria de modo que a atividade de fosfoquetolase seja aumentada (W02006/016705). Portanto, a bactéria da presente invenção pode ter sido modificada de modo que a atividade de fosfoquetolase seja aumentada. Esse método pode ser particularmente eficaz para transmitir ou aprimorar uma capacidade para produzir um L-aminoácido da família glutamato, tal como, ácido L-glutâmico. Exemplos de fosfoquetolase incluem D-xilulose-5-fosfato fosfoquetolase e ffutose-6-fosfato fosfoquetolase. Um dentre a atividade de D-xilulose-5-fosfato fosfoquetolase e atividade de ffutose-6-fosfato fosfoquetolase pode ser intensificada, ou ambas podem ser aprimoradas.

[00142] O termo “atividade de D-xilulose-5-fosfato fosfoquetolase” se refere a uma atividade para converter xilulose-5-fosfato em glicelaldeído-3fosfato e acetil fosfato com o consumo de ácido fosfórico para liberar uma molécula de H2O. Essa atividade pode ser medida pelo método descrito por Goldberg, M. et al. (Methods Enzymol., 9, 515 a 520, 1996) ou pelo método descrito por L. Meile (J. Bacteriol., 183:2.929 a 2.936, 2001). Exemplos de Dxilulose-5-fosfato fosfoquetolase incluem aqueles de bactérias que pertencem aos gêneros Acetobacter, Bifidobacterium, Lactobacillus, Thiobacillus, Streptococcus, Methylococcus, Butyrivibrio e Fibrobacter e levedura que pertence aos gêneros Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Pichia,

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Yarrowia, Hansenula, Kluyveromyces, Saccharomyces, Trichosporon e Wingea. Exemplos específicos de D-xilulose-5-fosfato fosfoquetolase e genes que codificam os mesmos são revelados no documento n° W02006/016705.

[00143] O termo “atividade de frutose-6-fosfato fosfoquetolase” se refere a uma atividade para converter frutose-6-fosfato em eritrose-4-fosfato e acetil fosfato com o consumo de ácido fosfórico para liberar uma molécula de H2O. Essa atividade pode ser medida pelo método descrito por Racker, E. (Methods Enzymol., 5, 276 a 280, 1962) ou o método descrito por L. Meile (J. Bacteriol., 183:2.929 a 2.936, 2001). Exemplos de frutose-6-fosfato fosfoquetolase incluem aqueles de bactérias que pertencem aos gêneros Acetobacter, Bifidobacterium, Chlorobium, Brucella, Methylococcus, e Gardnerella e levedura que pertence aos gêneros Rhodotorula, Candida e Saccharomyces. Exemplos específicos de frutose-6-fosfato fosfoquetolase e genes que codificam os mesmos são revelados no documento nW02006/016705.

[00144] Tanto a atividade de D-xilulose-5-fosfato fosfoquetolase quanto a atividade de ffutose-6-fosfato fosfoquetolase podem ser também retidas por uma única enzima (isto é, D-xilulose-5-fosfato fosfoquetolase/frutose-6-fosfato fosfoquetolase).

[00145] A sequência de nucleotídeos do gene fosfoquetolase (xfp gene) de Bifidobacterium longum JCM1217 e a sequência de aminoácidos da fosfoquetolase codificada pelo gene (proteína Xfp) são mostrados nas SEQ ID NOS: 13 e 14, respectivamente.

[00146] Os genes e proteínas usados para cultivar bactérias de produção de L-aminoácido podem ter, por exemplo, as sequências de nucleotídeos e sequências de nucleotídeos de genes e proteínas conhecidos, tais como, aqueles exemplificados acima, respectivamente. Além disso, os genes e proteínas usados para cultivar bactérias de produção de L-aminoácido podem ser variantes conservadoras de genes e proteínas conhecidos, tais

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64/114 como, aqueles exemplificados acima, respectivamente. Especificamente, por exemplo, os genes usados para cultivar bactérias de produção de Laminoácido podem ser, cada um, gene de codificação de uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos de uma proteína conhecida, mas com a inclusão de substituição, deleção, inserção ou adição de um ou diversos resíduos de aminoácido em uma ou diversas posições, contanto que a função original dos mesmos seja mantida. Para as variantes conservadores de genes e proteínas, as descrições relacionadas a variantes conservadoras do carreador de absorção de frutose não PTS e frutoquinase e genes que codificam as mesmas mencionados posteriormente podem ser aplicados, mutatis mutandis.

<l-2> APRIMORAMENTO DE ATIVIDADE DE CARREADOR DE ABSORÇÃO DE FRUTOSE NÃO PTS E ATIVIDADE DE FRUTOQUINASE [00147] A bactéria da presente invenção foi modificada de modo que a atividade de um carreador de absorção de frutose não PTS e a atividade de frutoquinase sejam aumentadas. A bactéria da presente invenção foi modificada especificamente de modo que a atividade de um carreador de absorção de frutose não PTS e a atividade de frutoquinase sejam aumentadas em comparação com uma cepa não modificada. A bactéria da presente invenção pode ser obtida com uma modificação de uma bactéria que tem uma capacidade de produção de L-aminoácido de modo que a atividade de um carreador de absorção de frutose não PTS e a atividade de frutoquinase sejam aumentadas. A bactéria da presente invenção pode ser também obtida com uma modificação de uma bactéria de modo que a atividade de um carreador de absorção de frutose não PTS e a atividade de frutoquinase sejam aumentadas, e depois com a transmissão ou aprimoramento de uma capacidade de produção de L-aminoácido. A bactéria da presente invenção pode ser também uma bactéria que adquiriu uma capacidade de produção de L-aminoácido por ser modificada de modo que a atividade de um carreador de

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65/114 absorção de frutose não PTS e a atividade de frutoquinase sejam aumentadas. A bactéria da presente invenção pode ter, conforme necessário, tal propriedade que uma bactéria de produção de L-aminoácido possui, conforme mencionado acima, assim como ser modificada de modo que a atividade de um carreador de absorção de frutose não PTS e a atividade de frutoquinase sejam aumentadas. Por exemplo, a bactéria da presente invenção pode ter sido modificada de modo que a atividade de fosfoquetolase seja aumentada. Por exemplo, particularmente, nas bactérias Pantoea, uma combinação de aprimoramento da atividade de um carreador de absorção de frutose não PTS e da atividade de frutoquinase com aprimoramento da atividade de fosfoquetolase, tal como, introdução de gene xfp, pode resultar em um aprimoramento sinérgico na produção de ácido L-glutâmico. As modificações para construir a bactéria da presente invenção podem ser realizadas em uma ordem arbitrária.

[00148] Com a modificação de uma bactéria de modo que a atividade de um carreador de absorção de frutose não PTS e a atividade de frutoquinase sejam aumentadas, uma capacidade de produção de L-aminoácido da bactéria pode ser intensificada e, isto é, a produção de um L-aminoácido com o uso da bactéria pode ser aumentada. Particularmente, com a modificação de uma bactéria de modo que a atividade de um carreador de absorção de frutose não PTS e a atividade de frutoquinase sejam aumentadas, uma capacidade de produção de L-aminoácido da bactéria sob condições de uso de frutose como uma fonte de carbono pode ser intensificada e, isto é, produção de um Laminoácido com o uso da bactéria pode ser aumentada.

[00149] Doravante no presente documento, o carreador de absorção de frutose não PTS e frutoquinase, e genes que codificam os mesmos serão explicados.

[00150] O termo “carreador de absorção de frutose não PTS” se refere a uma proteína que tem atividade de absorção de frutose não PTS. O termo

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66/114 “atividade de absorção de frutose não PTS” se refere a uma atividade para absorver frutose a partir de fora de uma célula até o interior da célula não através do Sistema de Fosfotransferase (PTS). O termo “Sistema de Fosfotransferase (PTS)” se refere a um sistema de absorção de sacarídeo que absorve um sacarídeo ao mesmo tempo que fosforila o mesmo. Por exemplo, a frutose é absorvida através de PTS na forma de frutose-1-fosfato. Isto é, o termo “atividade de absorção de frutose não PTS” pode se referir, especificamente, a uma atividade para absorver frutose de fora de uma célula para dentro da célula sem fosforilar frutose, ou mais especificamente, uma atividade para absorver frutose de fora de uma célula para dentro da célula sem fosforilar a I^a posição de frutose. Um gene de codificação de um carreador de absorção de frutose não PTS também é denominado “gene de carreador de absorção de frutose não PTS”.

[00151] Exemplos do gene de carreador de absorção de frutose não PTS incluem gene fucP. Uma proteína (carreador de absorção de frutose não PTS) codificada por gene fucP também é denominada “proteína FucP”. A proteína FucP é conhecida como uma L-fucose permease, que é um carreador de absorção de fucose, enquanto a mesma tem também atividade de absorção de frutose. A atividade de um carreador de absorção de frutose não PTS pode ser aumentada, por exemplo, com o aumento do gene de expressão de um carreador de absorção de frutose não PTS. Isto é, a expressão “a atividade de um carreador de absorção de frutose não PTS é aumentada” pode significar que, por exemplo, a expressão de um gene de carreador de absorção de frutose não PTS é aumentada. A expressão “a atividade de um carreador de absorção de frutose não PTS é aumentada” pode significar também, especificamente, por exemplo, que a expressão de gene fucP é aumentada.

[00152] O termo “frutoquinase” se refere a uma proteína que tem atividade de frutoquinase. O termo “atividade de frutoquinase” se refere a uma atividade de catalisar a reação de fosforilar 6^a posição de frutose para

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67/114 gerar frutose-6-fosfato (EC 2.7.1.4). Doadores do grupo fosfato, tais como, ATP pode ser usado para a fosforilação de frutose por frutoquinase. Um gene de codificação de frutoquinase também é denominado “gene de frutoquinase”. [00153] Exemplos do gene de frutoquinase incluem gene frk. O gene frk também é denominado gene mak, gene scrK, gene sacK, gene cscK, etc. Uma proteína (frutoquinase) codificada por gene frk também é denominada “proteína Frk”. A atividade de frutoquinase pode ser aumentada, por exemplo, com o aumento da expressão de um gene de frutoquinase. Isto é, a expressão “a atividade de frutoquinase é aumentada” pode significar que, por exemplo, a expressão de um gene de frutoquinase seja aumentada. A expressão “a atividade de frutoquinase é aumentada” pode significar também que, especificamente, por exemplo, a expressão de gene frk é aumentada.

[00154] Exemplos do gene de carreador de absorção de frutose não PTS e do gene de frutoquinase incluem genes de vários organismos, tais como, bactérias que pertencem à família Enterobacteriaceae, bactérias corineformes e bactérias de ácido lático. As sequências de nucleotídeos do gene de carreador de absorção de frutose não PTS e genes de frutoquinase derivadas de vários organismos e das sequências de aminoácidos dos carreadores de absorção de frutose não PTS e frutoquinases codificadas pelas mesmas podem ser obtidos a partir, por exemplo, de bancos de dados, tais como, NCBI. Exemplos específicos de gene fucP incluem, por exemplo, gene fucP de Corynebacterium ammoniagenes e gene fucP de Pantoea ananatis. A sequência de nucleotídeos do gene fucP de C. ammoniagenes ATCC 6872 e a sequência de aminoácidos da proteína codificada pelo gene são mostradas nas SEQ ID NOS: 26 e 27, respectivamente. A sequência de nucleotídeos do gene fucP de P. ananatis AJ13355 e a sequência de aminoácidos da proteína codificada pelo gene são mostradas nas SEQ ID NOS: 28 e 29, respectivamente. Exemplos específicos de gene frk incluem, por exemplo, gene frk de Bifidobacterium longum e genesfrk (mak) e frk (scrK) de Pantoea

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68/114 ananatis. A sequência de nucleotídeos do gene frk de B. longum JCM1217 e a sequência de aminoácidos da proteína codificada pelo gene são mostradas nas SEQ ID NOS: 30 e 31, respectivamente. A sequência de nucleotídeos do gene frk (mak) de P. ananatis AJ13355 e a sequência de aminoácidos da proteína codificada pelo gene são mostradas nas SEQ ID NOS: 32 e 33, respectivamente. A sequência de nucleotídeos do gene frk (scrK) de P. ananatis AJ13355 e a sequência de aminoácidos da proteína codificada pelo gene são mostradas nas SEQ ID NOS: 34 e 35, respectivamente. Isto é, o gene de carreador de absorção de frutose não PTS pode ser, por exemplo, um gene que tem a sequência de nucleotídeos de qualquer dos genes de carreador de absorção de frutose não PTS exemplificados acima, tal como, a sequência de nucleotídeos mostrada como SEQ ID NO: 26 ou 28. Além disso, o carreador de absorção de frutose não PTS pode ser, por exemplo, uma proteína que tem a sequência de aminoácidos de qualquer um dos carreadores de absorção de frutose não PTS exemplificados acima, tal como, a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 27 ou 29. Além disso, o gene de frutoquinase pode ser, por exemplo, um gene que tem a sequência de nucleotídeos de qualquer um dos genes de frutoquinase exemplificados acima, tal como, a sequência de nucleotídeos mostrada como SEQ ID NO: 30, 32 ou 34. Além disso, frutoquinase pode ser, por exemplo, uma proteína que tem a sequência de aminoácidos de qualquer das frutoquinases exemplificadas acima, tal como, a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 31, 33 ou 35. A expressão “um gene ou proteína tem um nucleotídeo ou sequência de aminoácidos” significa que um gene ou proteína compreende o nucleotídeo ou sequência de aminoácidos exceto se for declarado de outro modo e inclui também casos em que um gene ou proteína consiste no nucleotídeo ou sequência de aminoácidos.

[00155] O gene de carreador de absorção de frutose não PTS pode ser uma variante de qualquer um dentre os genes de carreador de absorção de

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69/114 frutose não PTS exemplificados acima (por exemplo, um gene que tem a sequência de nucleotídeos mostrada como SEQ ID NO: 26 ou 28), contanto que a função original do mesmo seja mantida. De modo similar, o carreador de absorção de frutose não PTS pode ser uma variante de qualquer um dos carreadores de absorção de frutose não PTS exemplificados acima (por exemplo, uma proteína que tem a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 27 ou 29), contanto que a função original do mesmo seja mantida. Além disso, o gene de frutoquinase pode ser uma variante de qualquer um dos genes de frutoquinase exemplificados acima (por exemplo, um gene que tem a sequência de nucleotídeos mostrada como SEQ ID NO: 30, 32 ou 34), contanto que a função original do mesmo seja mantida. De modo similar, a frutoquinase pode ser uma variante de qualquer uma dentre as frutoquinases exemplificas acima (por exemplo, uma proteína que tem a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 31, 33 ou 35), contanto que a função original do mesmo seja mantida. Tal variante que mantém a função original do mesmo também é denominada “variante conservadora”. Os termos “gene /ucP” e “gene incluem não apenas os genes fucP e genes frk exemplificados acima, respectivamente, mas incluem também variantes conservadoras dos mesmos. De modo similar, os termos “proteína FucP” e “proteína Frk” incluem não apenas as proteínas FucP e as proteínas Frk exemplificadas acima, respectivamente, mas incluem também variantes conservadoras das mesmas. Exemplos das variantes conservadoras incluem, por exemplo, homólogos e versões artificialmente modificadas dos genes de carreador de absorção de frutose não PTS, genes de frutoquinase, carreadores de absorção de frutose não PTS e frutoquinases exemplificados acima.

[00156] A expressão “a função original é mantida” significa que uma variante de gene ou proteína tem uma função (tal como, atividade ou propriedade) que corresponde à função (tal como, atividade ou propriedade)

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70/114 do gene ou proteína original. A expressão “a função original é mantida” usada para um gene significa que uma variante do gene codifica uma proteína que mantém a função original. Isto é, a expressão “a função original é mantida” usada para o gene de carreador de absorção de frutose não PTS significa que uma variante do gene codifica uma proteína que tem atividade de absorção de frutose não PTS. Adicionalmente, a expressão “a função original é mantida” usada para o carreador de absorção de frutose não PTS significa que uma variante da proteína tem atividade de absorção de frutose não PTS. Além disso, a expressão “a função original é mantida” usada para o gene de frutoquinase significa que uma variante do gene codifica uma proteína que tem atividade de frutoquinase. Adicionalmente, a expressão “a função original é mantida” usada para frutoquinase significa que uma variante da proteína tem atividade de frutoquinase.

[00157] A atividade de absorção de frutose não PTS de uma proteína pode ser medida, por exemplo, com a incubação de células bacterianas que expressam a proteína com frutose e com a medição da absorção dependente de proteína nas células.

[00158] A atividade de frutoquinase de uma proteína pode ser medida, por exemplo, com a incubação da proteína com o substrato (isto é, frutose) na presença de ATP e com a medição da geração dependente de substrato e proteína de frutose-6-fosfato.

[00159] Doravante no presente documento, exemplos das variantes conservadoras serão explicados.

[00160] Homólogos dos genes de carreador de absorção de frutose não PTS ou genes de frutoquinase ou homólogos dos carreadores de absorção de frutose não PTS ou frutoquinases podem ser facilmente obtidos a partir de bancos de dados, por exemplo, por busca BLAST ou busca FASTA que usam qualquer uma das sequências de nucleotídeos dos genes de carreador de absorção de frutose não PTS ou genes de frutoquinase exemplificados acima

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71/114 ou qualquer uma das sequências de aminoácidos dos carreadores de absorção de frutose não PTS ou frutoquinases exemplificados acima como uma sequência de consulta. Adicionalmente, os homólogos dos genes de carreador de absorção de frutose não PTS ou genes de frutoquinase podem ser obtidos, por exemplo, por PCR que usa um cromossomo de vários organismos como o modelo, e oligonucleotídeos preparados com base em qualquer uma das sequências de nucleotídeos desses genes de carreador de absorção de frutose não PTS genes ou genes de frutoquinase conhecidos como iniciadores.

[00161] O gene de carreador de absorção de frutose não PTS ou gene de frutoquinase pode ser um gene de codificação de uma proteína que tem qualquer uma das sequências de aminoácidos mencionadas anteriormente (por exemplo, a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 27 ou 29 para o carreador de absorção de frutose não PTS, ou a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 31, 33 ou 35 for frutoquinase), mas que inclui substituição, deleção, inserção e/ou adição de um ou diversos resíduos de aminoácido em uma ou diversos posições, contanto que a função original seja mantida. Por exemplo, o terminal N e/ou o terminal C da proteína codificada pode ser alongado ou encurtado. Embora o número que se pretende com o termo “um ou diversos” mencionado acima possa diferir dependendo das posições de resíduos de aminoácido na estrutura tridimensional da proteína ou dos tipos de resíduos de aminoácido, especificamente, o mesmo é, por exemplo, 1 a 50, 1 a 40 ou 1 a 30, preferencialmente 1 a 20, mais preferencialmente, 1 a 10, ainda mais preferencialmente, 1 a 5, particularmente com mais preferência 1 a 3.

[00162] A substituição, deleção, inserção e/ou adição mencionada anteriormente de um ou diversos resíduos de aminoácido são/é uma mutação conservadora que mantém a função normal da proteína. Exemplos típicos da mutação conservadora são substituições conservadoras. A substituição conservadora é uma mutação em que a substituição ocorre mutuamente entre

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Phe, Trp e Tyr, se o local de substituição for um aminoácido aromático; entre Leu, Ile e Vai, se a mesma for um aminoácido hidrofóbico; entre Gln e Asn, se a mesma for um aminoácido polar; entre Lys, Arg e His, se a mesma for um aminoácido básico; entre Asp e Glu, se a mesma for um aminoácido ácido; e entre Ser e Thr, se a mesma for um aminoácido que tem um grupo hidroxila. Exemplos de substituições consideradas como substituições conservadoras incluem, especificamente, a substituição de Ser ou Thr por Ala, substituição de Gln, His ou Lys por Arg, substituição de Glu, Gln, Lys, His ou Asp por Asn, substituição de Asn, Glu ou Gln por Asp, substituição de Ser ou Ala por Cys, substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg por Gln, substituição de Gly, Asn, Gln, Lys ou Asp por Glu, substituição de Pro por Gly, substituição de Asn, Lys, Gln, Arg ou Tyr por His, substituição de Leu, Met, Vai ou Phe por Ile, substituição de Ile, Met, Vai ou Phe por Leu, substituição de Asn, Glu, Gln, His ou Arg por Lys, substituição de Ile, Leu, Vai ou Phe por Met, substituição de Trp, Tyr, Met, He ou Leu por Phe, substituição de Thr ou Ala por Ser, substituição de Ser ou Ala por Thr, substituição de Phe ou Tyr por Trp, substituição de His, Phe ou Trp por Tyr e substituição de Met, Ile ou Leu por Vai. Adicionalmente, tal substituição, deleção, inserção ou adição de resíduos de aminoácido conforme mencionado acima inclui uma mutação de ocorrência natural devido à diferença individual ou uma diferença de espécies do organismo do qual o gene é derivado (mutante ou variante).

[00163] O gene de carreador de absorção de frutose não PTS ou gene de frutoquinase pode ser um gene de codificação de uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos que mostra uma homologia, por exemplo, de 50% ou mais, 65% ou mais, ou 80% ou mais, preferencialmente 90% ou mais, mais preferencialmente, 95% ou mais, ainda mais preferencialmente, 97% ou mais, particularmente de preferência 99% ou mais, à sequência total de aminoácidos de qualquer uma das sequências de aminoácidos mencionadas

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73/114 anteriormente, contanto que a função original seja mantida. Nessa descrição, “homologia” significa “identidade”.

[00164] O gene de carreador de absorção de frutose não PTS ou gene de frutoquinase pode ser também um DNA que tem capacidade para hibridizar em condições estringentes com uma sonda que pode ser preparada a partir de qualquer uma das sequências de nucleotídeos mencionadas anteriormente (por exemplo, a sequência de nucleotídeos mostrada como SEQ ID NO: 26 ou 28 para o gene de carreador de absorção de frutose não PTS, ou a sequência de nucleotídeos mostrada como SEQ ID NO: 30, 32 ou 34 para o gene de frutoquinase), tal como, uma sequência complementar a uma sequência parcial ou inteira de qualquer uma das sequências de nucleotídeos mencionadas anteriormente, contanto que a função original seja mantida. O termo “condições estringentes” se refere às condições em que um chamado híbrido específico é formado e um híbrido não específico não é formado. Exemplos das condições estringentes incluem aquelas sob as quais DNAs altamente homólogos hibridizam entre si, por exemplo, DNAs não menos que 50%, 65% ou 80% homólogos, preferencialmente não menos que 90% homólogos, mais preferencialmente, não menos que 95% homólogos, ainda mais preferencialmente, não menos que 97% homólogo, particularmente de preferência não menos do que 99% homólogo, hibridizam entre si e DNAs menos homólogos do que os acima não hibridizam entre si, ou condições de lavagem de hibridização Southem típica, isto é, condições de lavagem uma vez, preferencialmente 2 ou 3 vezes, a uma concentração de sal e temperatura que corresponde a 1 x SSC, 0,1% de SDS a 60 °C, preferencialmente 0,1 x SSC, 0,1% de SDS a 60 °C, mais preferencialmente, 0,1 x SSC, 0,1% de SDS a 68 °C.

[00165] A sonda usada para a hibridização mencionada anteriormente pode ser uma parte de uma sequência que é complementar ao gene conforme descrito acima. Tal sonda pode ser preparada por PCR que usa

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74/114 oligonucleotídeos preparados com base em uma sequência genética conhecida como iniciadores e um fragmento de DNA que contém qualquer um dos genes mencionados anteriormente como um modelo. Como a sonda, por exemplo, um fragmento de DNA que tem um comprimento de cerca de 300 bp pode ser usado. Quando um fragmento de DNA que tem um comprimento de cerca de 300 bp é usado como a sonda, as condições de lavagem da hibridização podem ser, por exemplo, 50 °C, 2 x SSC e 0,1% de SDS.

[00166] Adicionalmente, visto que a degenerescência de códons difere dependendo do hospedeiro, códons arbitrários no gene de carreador de absorção de frutose não PTS ou gene de frutoquinase podem ser substituídos por códons equivalentes respectivos. Isto é, o gene de carreador de absorção de frutose não PTS ou gene de frutoquinase podem ser uma variante de qualquer entre os carreadores de absorção de frutose não PTS ou genes de frutoquinase exemplificados acima devido à degenerescência do código genético. Por exemplo, o gene de carreador de absorção de frutose não PTS ou gene de frutoquinase pode ser um gene modificado de modo que o mesmo tenha códons ideais de acordo com frequências de códon em um hospedeiro a ser usado.

[00167] A porcentagem da identidade de sequência entre duas sequências pode ser determinada, por exemplo, com o uso de um algoritmo matemático. Exemplos não limitantes de tal algoritmo matemático incluem o algoritmo de Myers e Miller (1988) CABIOS 4:11 a 17, o algoritmo de homologia local de Smith et al (1981) Adv. Appl. Math. 2:482, o alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443 a 453, o método para buscar homologia de Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. 85:2.444 a 2448 e uma versão modificada do algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 87:2.264, tal como, aquele descrito em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 90:5.873 a 5.877.

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75/114 [00168] Com o uso de um programa com base em tal algoritmo matemático, a comparação de sequência (isto é, alinhamento) para determinar a identidade de sequência pode ser realizada. O programa pode ser apropriadamente executado por um computador. Exemplos de tal programa incluem, mas não se limitam a, CLUSTAL do programa PC/Gene (disponível junto a Intelligenetics, Mountain View, Calif.), programa ALIGN (Versão 2.0) e GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA de Wisconsin Genetics Software Package, Versão 8 (disponível junto a Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., EUA). O alinhamento que usa esses programas pode ser realizado com o uso, por exemplo, de parâmetros iniciais. O programa CLUSTAL é bem descrito em Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244 (1988), Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153, Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10.881 a 10.890, Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65 e Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307 a 331.

[00169] A fim de obter uma sequência de nucleotídeos homóloga a uma sequência de nucleotídeos-alvo, em particular, por exemplo, busca por nucleotídeo BLAST pode ser realizada com o uso do programa BLASTN com pontuação de 100 e comprimento de palavra de 12. A fim de obter uma sequência de aminoácidos homóloga a uma proteína, em particular, por exemplo, busca por proteína BLAST pode ser realizada com o uso do programa BLASTX com pontuação de 50 e comprimento de palavra de 3. Consultar http://www.ncbi.nlm.nih.gov para a busca por nucleotídeo BLAST e busca por proteína BLAST. Adicionalmente, Gapped BLAST (BLAST 2.0) pode ser usado a fim de obter um alinhamento que inclui intervalo (ou intervalos) para o propósito de comparação. Adicionalmente, PSI-BLAST pode ser usado a fim de realizar busca repetitiva para detectar relações distantes entre sequências. Consultar Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3.389 para Gapped BLAST e PSI-BLAST. Com o uso de BLAST, Gapped BLAST ou PSI-BLAST, parâmetros iniciais de cada programa (por

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76/114 exemplo, BLASTN para sequências de nucleotídeos e BLASTX para sequências de aminoácidos) podem ser usados. O alinhamento pode ser também manualmente realizado.

[00170] A identidade de sequência entre duas sequências é calculada como a razão de resíduos que combinam nas duas sequências com o alinhamento das duas sequências de modo a encaixar de modo máximo entre si.

[00171] As descrições mencionadas anteriormente relacionadas às variantes conservadoras dos genes e proteínas podem ser aplicadas mutatis mutandis a variantes de proteínas arbitrárias tais como, enzimas de sistema de biossíntese de L-aminoácido e genes que codificam as mesmas.

<l-3> MÉTODOS PARA AUMENTAR A ATIVIDADE DE PROTEÍNA [00172] Doravante no presente documento, os métodos para aumentar a atividade de uma proteína, tal como, o carreador de absorção de frutose não PTS e frutoquinase serão explicados.

[00173] A expressão “a atividade de uma proteína é aumentada” significa que a atividade da proteína é aumentada em comparação com uma cepa não modificada. Especificamente, a expressão “a atividade de a proteína é aumentada” significa que a atividade da proteína por célula é aumentada em comparação com aquela de uma cepa não modificada. O termo “cepa não modificada” usado no presente documento se refere a uma cepa de controle que não foi modificada de modo que a atividade de uma proteína do objetivo seja aumentada. Exemplos da cepa não modificada incluem uma cepa do tipo selvagem e cepa parental. Exemplos específicos da cepa não modificada incluem os respectivos tipos de cepas das espécies de bactérias. Exemplos específicos da cepa não modificada incluem também cepas exemplificadas acima em relação à descrição de bactérias. Isto é, em uma modalidade, a atividade de uma proteína pode ser aumentada em comparação com um tipo de cepa, isto é, o tipo de cepa das espécies ao qual a bactéria da presente

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77/114 invenção pertence. Em outra modalidade, a atividade de uma proteína pode ser também aumentada em comparação com a cepa 13032 ATCC de C. glutamicum. Em outra modalidade, a atividade de uma proteína pode ser também aumentada em comparação com a cepa 2256 de C. glutamicum (ATCC 13869). Em outra modalidade, a atividade de uma proteína pode ser também aumentada em comparação com a cepa MG1655 K-12 de E. coli. A declaração de que “a atividade de uma proteína é aumentada” pode ser também expressa como “a atividade de uma proteína é intensificada”. Mais especificamente, a expressão “a atividade de uma proteína é aumentada” pode significar que o número de moléculas da proteína por célula é aumentado e/ou a função de cada molécula da proteína é aumentada em comparação com aquela de uma cepa não modificada. Isto é, o termo “atividade” na expressão “a atividade de uma proteína é aumentada” não se limita à atividade catalítica da proteína, mas pode significar também a quantidade de transcrição de um gene (isto é, a quantidade de mRNA) que codifica a proteína, ou a quantidade de tradução do gene (isto é, a quantidade da proteína). Adicionalmente, a declaração de que “a atividade de uma proteína é aumentada” inclui não apenas uma declaração de que a atividade de uma proteína do objetivo é aumentada em uma cepa inerentemente que tem a atividade da proteína do objetivo, mas também uma declaração de que a atividade de uma proteína do objetivo é transmitida para uma cepa que não tem inerentemente a atividade da proteína do objetivo. Adicionalmente, contanto que a atividade da proteína seja eventualmente aumentada, a atividade de uma proteína do objetivo inerentemente contida em um hospedeiro pode ser atenuada e/ou eliminada e, depois um tipo apropriado da proteína do objetivo pode ser transmitido para o hospedeiro.

[00174] O grau do aumento na atividade de uma proteína não é particularmente limitado, contanto que a atividade da proteína seja aumentada em comparação com uma cepa não modificada. A atividade da proteína pode

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78/114 ser aumentada, por exemplo, 1,5 vezes ou mais, 2 vezes ou mais ou 3 vezes ou mais em relação àquela de uma cepa não modificada. Adicionalmente, quando a cepa não modificada não tem a atividade da proteína do objetivo, é suficiente que a proteína seja produzida como um resultado da introdução do gene de codificação da proteína e, por exemplo, a proteína pode ser produzida até certa extensão em que a atividade da mesma possa ser medida.

[00175] A modificação para aumentar a atividade de uma proteína pode ser alcançada, por exemplo, com o aumento da expressão de um gene de codificação da proteína. A expressão “a expressão de um gene é aumentada” significa que a expressão do gene é aumentada em comparação com uma cepa não modificada, tal como, uma cepa do tipo selvagem e cepa parental. Especificamente, a expressão “a expressão de um gene é aumentada” significa que a quantidade de expressão do gene por célula é aumentada em comparação com aquela de uma cepa não modificada. Mais especificamente, a expressão “a expressão de um gene é aumentada” pode significar que a quantidade de transcrição do gene (isto é, a quantidade de mRNA) é aumentada e/ou a quantidade de tradução do gene (isto é, a quantidade da proteína expressa a partir do gene) é aumentada. A declaração de que “a expressão de um gene é aumentada” pode ser também denominada “a expressão de um gene é intensificada”. A expressão de um gene pode ser aumentada, por exemplo, para 1,5 vezes ou mais, 2 vezes ou mais ou 3 vezes ou mais daquela de uma cepa não modificada. Adicionalmente, a declaração de que “a expressão de um gene é aumentada” inclui não apenas uma declaração de que a quantidade de expressão de um gene do objetivo é aumentada em uma cepa que expressa inerentemente o gene do objetivo, mas também uma declaração de que o gene é introduzido em uma cepa que não expressa inerentemente o gene do objetivo e expresso no mesmo. Isto é, a frase “a expressão de um gene é aumentada” pode significar também, por exemplo, que um gene do objetivo é introduzido em uma cepa que não possui

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79/114 o gene e é expresso no mesmo.

[00176] A expressão de um gene pode ser aumentada, por exemplo, com o aumento do número de cópia do gene.

[00177] O número de cópia de um gene pode ser aumentado com a introdução do gene no cromossomo de um hospedeiro. Um gene pode ser introduzido em um cromossomo, por exemplo, com o uso de recombinação homóloga (Miller, J.H., Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory). Exemplos do método de transferência genética que utiliza recombinação homóloga incluem, por exemplo, um método de usar um DNA linear, tal como, Integração conduzida por vermelho (Datsenko, K.A., e Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 97:6.640 a 6.645 (2000)), um método de uso de um plasmídeo que contém uma origem de replicação sensível à temperatura, um método de uso de um plasmídeo com capacidade para transferência conjugativa, um método de usa de um vetor de suicídio que não tem uma origem de replicação que funciona em um hospedeiro e um método de transdução que usa um fago. Apenas uma cópia ou duas ou mais cópias de um gene podem ser introduzidas. Por exemplo, com a realização de recombinação homóloga que usa uma sequência que está presente em múltiplas cópias em um cromossomo como um alvo, múltiplas cópias de um gene podem ser introduzidas no cromossomo. Exemplos de tal sequência que está presente em múltiplas cópias em um cromossomo incluem DNAs repetitivos e repetições invertidas localizadas em ambas as extremidades de um transposon. Altemativamente, a recombinação homóloga pode ser realiza com o uso de uma sequência apropriada em um cromossomo, tal como, um gene desnecessário para a produção de uma substância do objetivo como um alvo. Adicionalmente, um gene pode ser também aleatoriamente introduzido em um cromossomo com o uso de um transposon ou Mini-Mu (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N° JP 2-109985, Patente ri’ U.S. 5.882.888, EP805867B1).

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80/114 [00178] A introdução de um gene-alvo em um cromossomo pode ser confirmada por hibridização Southem que usa uma sonda que tem uma sequência complementar ao gene inteiro ou uma parte do mesmo, PCR que usa iniciadores preparados com base na sequência do gene ou similares.

[00179] Adicionalmente, o número de cópia de um gene pode ser também aumentado com a introdução de um vetor que contém o gene em um hospedeiro. Por exemplo, o número de cópia de um gene-alvo pode ser aumentado com a ligação de um fragmento de DNA que contém o gene-alvo com um vetor que funciona em um hospedeiro para construir um vetor de expressão do gene e transformar o hospedeiro com o vetor de expressão. O fragmento de DNA que contém o gene-alvo pode ser obtido, por exemplo, por PCR que usa o DNA genômico de um micro-organismo que tem o gene-alvo como o modelo. Como o vetor, um vetor autonomamente replicável na célula do hospedeiro pode ser usado. O vetor é preferencialmente um vetor de múltiplas cópias. Adicionalmente, o vetor tem preferencialmente um marcador, tal como, um gene de resistência a antibiótico para seleção de transformante. Adicionalmente, o vetor pode ter um promotor e/ou terminador para expressar o gene introduzido. O vetor pode ser, por exemplo, um vetor derivado de um plasmídeo bacteriano, um vetor derivado de um plasmídeo de levedura, um vetor derivado de um bacteriófago, cosmídeo, fagemídeo ou similar. Exemplos específicos de vetor autonomamente replicável em bactérias Enterobacteriaceae , tal como, Escherichia coli incluem, por exemplo, pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pBR322, pSTV29 (todos esses estão disponíveis junto a Takara Bio), pACYC184, pMW219 (NIPPON GENE), pTrc99A (Pharmacia), vetores em série pPROK (Clontech), pKK233-2 (Clontech), vetores em série pET (Novagen), vetores em série pQE (QIAGEN), pCold TF DNA (Takara Bio), vetores em série pACYC e o vetor de espectro de hospedeiro amplo RSF1010. Exemplos específicos de vetor autonomamente replicável em bactérias corineformes

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81/114 incluem, por exemplo, pHM1519 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)); pAM330 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)); plasmídeos obtidos com o aprimoramento desses e que têm um gene de resistência a fármaco; plasmídeo pCRY30 (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N° JP 3-210184); plasmídeos pCRY21, pCRY2KE, pCRY2KX, pCRY31, pCRY3KE e pCRY3KX (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N° JP 272876 e Patente ri’ U.S. 5.185.262); plasmídeos pCRY2 e pCRY3 (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N° JP 1-191686); pAJ655, pAJ611 e pAJ1844 (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N° JP 58-192900); pCGl (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N^u JP 57-134500); pCG2 (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N- JP 58-35197); pCG4 e pCGll (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N° JP 57-183799); pVK7 (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N° JP 10-215883); pVK9 (US2006-0141588); pVC7 (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N° JP 9-070291); pVS7 (WO2013/069634).

[00180] Quando um gene é introduzido, é suficiente que o gene seja expressivamente transportado por um hospedeiro. Especificamente, é suficiente que o gene seja transportado por um hospedeiro de modo que o mesmo seja expresso sob controle por um promotor que funciona no hospedeiro. O promotor não é particularmente limitado, contanto que o mesmo funcione no hospedeiro. O termo “promotor que funciona em um hospedeiro” se refere a um promotor que mostra uma atividade de promotor no hospedeiro. O promotor pode ser um promotor derivado do hospedeiro, ou um promotor heterogêneo. O promotor pode ser o promotor nativo do gene a ser introduzido, ou um promotor de outro gene. Como o promotor, por exemplo, tal como, um promotor mais forte conforme mencionado posteriormente também pode ser usado.

[00181] Um terminador para terminação de transcrição genética pode ser localizado a jusante do gene. O terminador não é particularmente limitado

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82/114 contanto que o mesmo funcione no hospedeiro. O terminador pode ser um terminador derivado do hospedeiro, ou um terminador heterogêneo. O terminador pode ser o terminador nativo do gene a ser introduzido, ou um terminador de outro gene. Exemplos específicos do terminador incluem, por exemplo, terminador T7, terminador T4, terminador de fago fd, terminador tet e terminador trpA.

[00182] Vetores, promotores e terminadores disponíveis em vários micro-organismos são revelados em detalhe em “Fundamental Microbiology Vol. 8, Genetic Engineering, KYORITSU SHUPPAN CO., LTD, 1987” e esses podem ser usados.

[00183] Adicionalmente, quando dois ou mais genes são introduzidos, é suficiente que cada gene seja expressamente transportado pelo hospedeiro. Por exemplo, todos os genes podem ser transportados por um único vetor de expressão ou um cromossomo. Adicionalmente, os genes podem ser carregados separadamente por dois ou mais vetores de expressão, ou carregados separadamente por um nico ou dois ou mais vetores de expressão e um cromossomo. Um operão constituído por dois ou mais genes pode ser também introduzido. O caso de “introduzir dois ou mais genes” incluem, por exemplo, casos de introduzir respectivos genes que codificam dois ou mais tipos de proteínas (tal como, enzimas), introduzir respectivos genes que codificam dois ou mais subunidades que constituem um único complexo de proteína (tal como, complexo de enzima) e uma combinação dos casos anteriores.

[00184] O gene a ser introduzido não é particularmente limitado, contanto que o mesmo codifique uma proteína que funciona no hospedeiro. O gene a ser introduzido pode ser um gene derivado do hospedeiro ou pode ser um gene heterógeno. O gene a ser introduzido pode ser obtido, por exemplo, por PCR que usa iniciadores projetados com base na sequência de nucleotídeos do gene, e com o uso do DNA genômico de um organismo que

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83/114 tem o gene, um plasmídeo que carrega o gene ou similar como um modelo. O gene a ser introduzido pode ser também totalmente sintetizado, por exemplo, com base na sequência de nucleotídeos do gene (Gene, 60(1), 115 a 127 (1987)). O gene obtido pode ser usado como é, ou depois de ser modificado conforme exigido. Isto é, um gene pode ser modificado para obter uma variante do mesmo. Um gene pode ser modificado por uma técnica conhecida. Por exemplo, uma mutação do objetivo pode ser introduzida em um local de DNA do objetivo pelo método específico de mutação de local. Isto é, a região de codificação de um gene pode ser modificada pelo método específico de mutação de local de modo que um local específico da proteína codificada inclua substituição, deleção, inserção e/ou adição de resíduos de aminoácido. Exemplos do método específico de mutação de local incluem o método de utilização de PCR (Higuchi, R., 61, in PCR Technology, Erlich, H.A. Eds., Stockton Press (1989); Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)) e o método de utilização de fago (Kramer, W. e Frits, H.J., Meth. In Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T.A. et al., Meth. In Enzymol., 154, 367 (1987)). Altemativamente, uma variante de um gene pode ser totalmente sintetizada. [00185] Incidentalmente, quando uma proteína funciona como um complexo que consiste em uma pluralidade de subunidades, uma parte ou toda a pluralidade de subunidades pode ser modificada, contanto que a atividade da proteína é eventualmente aumentada. Isto é, por exemplo, quando a atividade de uma proteína é aumentada com o aumento da expressão de um gene, a expressão de uma parte ou toda a pluralidade de genes que codificam as subunidades pode ser intensificada. Geralmente, é preferível aprimorar a expressão de toda a pluralidade de genes que codificam as subunidades. Adicionalmente, as subunidades que constituem o complexo podem ser derivadas de um único tipo de organismo ou dois ou mais tipos de organismos, contanto que o complexo tenha uma função da proteína do objetivo. Isto é, por exemplo, genes do mesmo organismo que codificam uma

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84/114 pluralidade de subunidades podem ser introduzidos em um hospedeiro ou genes de diferentes organismos que codificam uma pluralidade de subunidades pode ser introduzida em um hospedeiro.

[00186] Adicionalmente, a expressão de um gene pode ser aumentada com o aprimoramento da eficiência de transcrição do gene. Adicionalmente, a expressão de um gene pode ser também aumentada com o aprimoramento da eficiência de tradução do gene. A eficiência de transcrição do gene e a eficiência de transcrição e tradução do gene pode ser intensificada, por exemplo, pela modificação de uma sequência de controle de expressão do gene. O termo “sequência de controle de expressão” coletivamente se refere a locais que afetam a expressão de um gene. Exemplos da sequência de controle de expressão incluem, por exemplo, promotor, sequência de Shine-Dalgamo (SD) (também denominada como local de ligação de ribossomo (RBS)) e região de espaçador entre RBS e o códon inicial. As sequências de controle de expressão podem ser identificadas com o uso de um vetor de busca de promotor ou software de análise genética, tal como, GENETYX. Essas sequências de controle de expressão podem ser modificadas, por exemplo, por um método de uso de um vetor sensível à temperatura ou o método de integração conduzido por vermelho (W02005/010175).

[00187] A eficiência de transcrição de um gene pode ser intensificada, por exemplo, com a substituição do promotor do gene em um cromossomo com um promotor mais forte. O termo “promotor mais forte” se refere a um promotor que provê uma transcrição intensificada de um gene comparado com um promotor do gene do tipo selvagem inerentemente existente. Exemplos de promotores mais forte incluem, por exemplo, os promotores de expressão alta conhecidos, tais como, promotor T7, promotor trp, promotor lac, promotor thr, promotor tac, promotor trc, promotor tet, promotor araBAD, promotor rpoH, promotor msrA, promotor Pml (derivado do gênero Bifidobacterium), promotor PR e promotor PL. Exemplos de promotores mais

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85/114 fortes úteis em bactérias corineformes incluem, por exemplo, o promotor P546 artificialmente modificado (Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674 a 679 (2000)), promotores pta, aceA, aceB, adh e amyE induzíveis em bactérias corineformes com ácido acético, etanol, ácido pirúvico ou similares, promotores cspB, SOD e tuf (EF-Tu) que são promotores potentes com capacidade de prover uma grande quantidade de expressão em bactérias corineformes (Joumal of Biotechnology, 104 (2003) 311 a 323; Appl. Environ. Microbiol., dezembro de 2005; 71 (12):8.587 a 8.596), assim como promotor lac, promotor tac e promotor trc. Adicionalmente, como o promotor mais forte, um tipo altamente ativo de um promotor existente pode ser também obtido com o uso de vários genes repórteres. Por exemplo, tomando as regiões -35 e -10 em uma região de promotor mais próximas da sequência consenso, a atividade do promotor pode ser intensificada (WO00/18935). Exemplos de promotor do tipo altamente ativo incluem vários promotores tipo tac (Katashkina JI et al., Pedido de Patente N² RU 2006134574) e promotor pnlp8 (WO2010/027045). Métodos para avaliar a força de promotores e exemplos de promotores fortes são descritos no documento de Goldstein et al. (Prokaryotic Promoters in Biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105 a 128 (1995)) e assim por diante.

[00188] A eficiência de tradução de um gene pode ser intensificada, por exemplo, com a substituição da sequência de Shine-Dalgamo (SD) (também denominada local de ligação de ribossomo (RBS)) para o gene em um cromossomo com uma sequência de SD mais forte. A “sequência de SD mais forte” significa uma sequência de SD que provê uma tradução intensificada de mRNA em comparação com a sequência de SD do tipo selvagem do gene. Exemplos de sequências de SD mais forte incluem, por exemplo, RBS do gene 10 derivado do fago T7 (Olins P.O. et al, Gene, 1988, 73, 227 a 235). Adicionalmente, é conhecido que substituição, inserção ou deleção de diversos nucleotídeos em uma região de espaçador entre RBS e o

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86/114 códon inicial, especialmente em uma sequência imediatamente a montante do códon inicial (5-UTR) afete significativamente a estabilidade e eficiência de tradução de mRNA e, portanto, a eficiência de tradução de um gene pode ser também intensificada com uma modificação das mesmas.

[00189] A eficiência de tradução de um gene pode ser também intensificada, por exemplo, com a modificação códons. Por exemplo, a eficiência de tradução do gene pode ser intensificada com a substituição de um códon raro presente no gene com um códon sinônimo mais frequentemente usado. Isto é, o gene a ser introduzido pode ser modificado, por exemplo, de modo a conter códons ideais de acordo com as frequências de códons observadas em um hospedeiro a ser usado. Códons podem ser substituídos, por exemplo, pelo método específico de mutação de local. Altemativamente, um fragmento de gene em que os códons do objetivo são substituídos pode ser totalmente sintetizado. Frequências de códons em vários organismos são revelados em “Codon Usage Database” (http://www.kazusa.or.jp/c0don; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)).

[00190] Adicionalmente, a expressão de um gene pode ser também aumentada com a amplificação de um regulador que aumenta a expressão do gene, ou excluir ou atenuar um regulador que reduz a expressão do gene.

[00191] Tais métodos para aumentar a expressão genética conforme mencionado acima podem ser usados independentemente ou em uma combinação arbitrária.

[00192] Adicionalmente, a modificação que aumenta a atividade de uma proteína pode ser também alcançada, por exemplo, com o aprimoramento da atividade específica da enzima. O aprimoramento da atividade específica também inclui dessensibilização para inibição de retroalimentação. Isto é, quando a proteína é submetida à inibição de retroalimentação por um metabólito, a atividade da proteína pode ser aumentada fazendo com que a

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87/114 bactéria porte um gene de codificação de uma proteína mutante que foi dessensibilizada à inibição de retroalimentação. Na presente invenção, o termo “des sensibilização à inibição de retroalimentação” inclui completa eliminação da inibição de retroalimentação e atenuação da inibição de retroalimentação, exceto se for declarado de outro modo. Além disso, uma declaração de “ser dessensibilizada em relação à inibição de retroalimentação”, isto é, uma declaração de que a inibição de retroalimentação é eliminada ou atenuada, pode ser denominada “tolerante à inibição de retroalimentação”. Uma proteína que mostra uma atividade específica intensificada pode ser obtida, por exemplo, buscando-se vários organismos. Adicionalmente, um tipo altamente ativo de uma proteína existente pode ser também obtido com a introdução de uma mutação na proteína existente. A mutação a ser introduzida pode ser, por exemplo, substituição, deleção, inserção ou adição de um ou diversos resíduos de aminoácido em uma ou diversas posições da proteína. A mutação pode ser introduzida, por exemplo, por tal método específico de mutação de local conforme mencionado acima. A mutação pode ser também introduzida, por exemplo, por um tratamento de mutagênese. Exemplos do tratamento de mutagênese incluem irradiação de raios-X, irradiação de ultravioleta e um tratamento com um agente de mutação, tal como, N-metil-N’-nitro-Nnitrosoguanidina (MNNG), etil metanosulfonato (EMS) e metil metanosulfonato (MMS). Adicionalmente, uma mutação aleatória pode ser induzida tratando-se diretamente DNA in vitro com hidroxilamina. O aprimoramento da atividade específica pode ser independentemente usado, ou pode ser usado em uma combinação arbitrária com tais métodos para aprimorar a expressão genética conforme mencionado acima.

[00193] O método para a transformação não é particularmente limitado e métodos convencionalmente conhecidos podem ser usados. Pode ser usado, por exemplo, um método de tratar células receptoras com cloreto de cálcio de

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88/114 modo a aumentar a permeabilidade das mesmas a DNA que foi relatada para a cepa K-12 de Escherichia coli (Mandei, M. e Higa, A., J. Mol. Biol., 1970, 53, 159 a 162), e um método de preparar células competente a partir de células que estão na fase de crescimento, seguido pela transformação com DNA, que tem foi relatada para Bacillus subtilis (Duncan, C.H., Wilson, G.A. e Young, F.E., Gene, 1977, 1:153 a 167). Altemativamente, pode ser usado também um método de transformar células receptoras de DNA em protoplastos ou esferoplastos que pode facilmente absorver DNA recombinante, seguido pela introdução de um DNA recombinante nas células receptoras de DNA que é conhecida por ser aplicável a Bacillus subtilis, actinomicetos e leveduras (Chang, S. e Choen, S.N., 1979, Mol. Gen. Genet., 168:111 a 115; Bibb, M.J., Ward, J.M. e Hopwood, O.A., 1978, Nature, 274:398 a 400; Hinnen, A., Hicks, J.B. e Fink, G.R., 1978, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 75:1.929 a 1.933). Adicionalmente, o método de pulso elétrico relatou bactérias corineformes (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) NJP 2-207791) pode ser também usado.

[00194] Um aumento na atividade de uma proteína pode ser confirmado com a medição da atividade da proteína.

[00195] Um aumento na atividade de uma proteína pode ser também confirmado com a confirmação de um aumento na expressão de um gene de codificação da proteína. Um aumento na expressão de um gene pode ser confirmado pela confirmação de um aumento na quantidade de transcrição do gene, ou com a confirmação de um aumento na quantidade de uma proteína expressa do gene.

[00196] Um aumento da quantidade de transcrição de um gene pode ser confirmado com a comparação da quantidade de mRNA transcrito do gene com aquela de uma cepa não modificada tal como, uma cepa do tipo selvagem ou cepa parental. Exemplos do método para avaliar a quantidade de mRNA incluem hibridização Northern, RT-PCR, micromatriz, seq-RNA e assim por

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89/114 diante (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/Terceira Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (EUA), 2001). A quantidade de mRNA pode aumentar, por exemplo, em 1,5 vezes ou mais, 2 vezes ou mais ou 3 vezes ou mais do que uma cepa não modificada.

[00197] Um aumento na quantidade de uma proteína pode ser confirmado por Western blotting que usa anticorpos (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (EUA), 2001). A quantidade da proteína (tal como, o número de moléculas da proteína por célula) pode aumentar, por exemplo, 1,5 vezes ou mais, 2 vezes ou mais ou 3 vezes ou mais em relação àquela de uma cepa não modificada.

[00198] Os métodos mencionados anteriormente para aumentar a atividade de uma proteína podem ser usados para aprimoramento das atividades de proteínas arbitrárias, tais como, enzimas de biossíntese de Laminoácido e aprimoramento da expressão de genes arbitrários, tais como, genes que codificam aquelas proteínas arbitrárias, além do aprimoramento de atividade de carreador de absorção de frutose não PTS e atividade de frutoquinase.

<l-4> MÉTODO PARA REDUZIR A ATIVIDADE DE PROTEÍNA [00199] Doravante no presente documento, os métodos para reduzir a atividade de uma proteína serão explicados.

[00200] A expressão “a atividade de uma proteína é reduzida” significa que a atividade da proteína é reduzida em comparação com uma cepa não modificada. Especificamente, a expressão “a atividade de uma proteína é reduzida” significa que a atividade da proteína por célula é reduzida em comparação com aquela de uma cepa não modificada. O termo “cepa não modificada” usado no presente documento se refere a uma cepa de controle que não foi modificada de modo que a atividade de uma proteína do objetivo é reduzida. Exemplos da cepa não modificada incluem uma cepa do tipo

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90/114 selvagem e cepa parental. Exemplos específicos da cepa não modificada incluem os respectivos tipos de cepas das espécies de bactérias. Exemplos específicos da cepa não modificada incluem também cepas exemplificadas acima em relação à descrição de bactérias. Isto é, em uma modalidade, a atividade de uma proteína pode ser reduzida em comparação com um tipo de cepa, isto é, o tipo de cepa das espécies às quais a bactéria da presente invenção pertence. Em outra modalidade, a atividade de uma proteína pode ser também reduzida em comparação com a cepa 13032 ATCC de C. glutamicum. Em outra modalidade, a atividade de uma proteína pode ser também reduzida em comparação com a cepa 2256 de C. glutamicum (ATCC 13869). Em outra modalidade, a atividade de uma proteína pode ser também reduzida em comparação com a cepa MG1655 K-12 de E. coli. A declaração de que “a atividade de uma proteína é reduzida” também inclui uma declaração de que a atividade da proteína desapareceu completamente. Mais especificamente, a expressão “a atividade de uma proteína é reduzida” pode significar que o número de moléculas da proteína por célula é reduzido e/ou a função de cada molécula da proteína é reduzida em comparação com aquela de uma cepa não modificada. Isto é, o termo “atividade” na expressão “a atividade de uma proteína é reduzida” não é limitado à atividade catalítica da proteína, mas pode significar também que a quantidade de transcrição de um gene (isto é, a quantidade de mRNA) que codifica a proteína ou a quantidade de tradução do gene (isto é, a quantidade da proteína). A declaração de que “o número de moléculas da proteína por célula é reduzido” também inclui uma declaração de que a proteína não existe. A declaração de que “a função de cada molécula da proteína é reduzida” também inclui uma declaração de que a função de cada molécula de proteína desapareceu completamente. O grau da redução na atividade de uma proteína não é particularmente limitado, contanto que a atividade seja reduzida em comparação com aquele de uma cepa não modificada. A atividade de uma proteína pode ser reduzida, por

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91/114 exemplo, em 50% ou menos, 20% ou menos, 10% ou menos, 5% ou menos ou 0% daquela de uma cepa não modificada.

[00201] A modificação para reduzir a atividade de uma proteína pode ser alcançada, por exemplo, com a redução da expressão de um gene de codificação da proteína. A expressão “a expressão de um gene é reduzida” significa que a expressão do gene é reduzida em comparação com uma cepa não modificada, tal como, uma cepa do tipo selvagem e cepa parental. Especificamente, a expressão “a expressão de um gene é reduzida” significa que a expressão do gene por célula é reduzida em comparação com aquela de uma cepa não modificada. Mais especificamente, a expressão “a expressão de um gene é reduzida” pode significar que a quantidade de transcrição do gene (isto é, a quantidade de mRNA) é reduzida e/ou a quantidade de tradução do gene (isto é, a quantidade da proteína expressa a partir do gene) é reduzida. A declaração de que “a expressão de um gene é reduzida” também inclui uma declaração de que o gene não é expresso. A declaração de que “a expressão de um gene é reduzida” também é denominada “a expressão de um gene é atenuada”. A expressão de um gene pode ser reduzida, por exemplo, 50% ou menos, 20% ou menos, 10% ou menos, 5% ou menos, ou 0% daquela de uma cepa não modificada.

[00202] A redução na expressão genética pode ser devida, por exemplo, a uma redução na eficiência de transcrição, uma redução na eficiência de tradução ou uma combinação das mesmas. A expressão de um gene pode ser reduzida com uma modificação de uma sequência de controle de expressão do gene, tal como, um promotor, Shine-Dalgamo (SD) sequência (também denominado local de ligação de ribossomo (RBS)) e região de espaçador entre RBS e o códon inicial do gene. Quando uma sequência de controle de expressão é modificada, preferencialmente, um ou mais nucleotídeos, mais preferencialmente, dois ou mais nucleotídeos, particularmente de preferência, três ou mais nucleotídeos, da sequência de

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92/114 controle de expressão são modificadas. Por exemplo, a eficiência de transcrição de um gene pode ser reduzida, por exemplo, com a substituição do promotor do gene em um cromossomo com um promotor mais fraco. O termo “promotor mais fraco” significa um promotor que provê uma transcrição atenuada de um gene em comparação com um promotor do gene do tipo selvagem inerentemente existente. Exemplos de promotores mais fracos incluem, por exemplo, promotores induzíveis. Isto é, um promotor induzível pode funcionar como um promotor mais fraco em uma condição não induzida, tal como, na ausência do indutor correspondente. Adicionalmente, uma parte ou toda uma sequência de controle de expressão pode ser excluída. A expressão de um gene pode ser também reduzida, por exemplo, por uma manipulação de um fator responsável pelo controle de expressão. Exemplos do fator responsável pelo controle de expressão incluem moléculas baixas responsáveis pelo controle de transcrição ou tradução (indutores, inibidores, etc.), proteínas responsáveis pelo controle de transcrição ou tradução (fatores de transcrição, etc.), ácidos nucleicos responsáveis pelo controle de transcrição ou tradução (siRNA etc.) e assim por diante. Adicionalmente, a expressão de um gene pode ser também reduzida, por exemplo, com a introdução de uma mutação que reduz a expressão do gene na região de codificação do gene. Por exemplo, a expressão de um gene pode ser reduzida com a substituição de um códon na região de codificação do gene com um códon sinônimo usados menos frequentemente em um hospedeiro. Adicionalmente, por exemplo, a expressão genética pode ser reduzida devido à interrupção de um gene conforme descrito posteriormente.

[00203] A modificação para reduzir s atividade de uma proteína pode ser também alcançada por exemplo, com a interrupção de um gene de codificação da proteína. A expressão “um gene é interrompido” significa que um gene é modificado de modo que uma proteína que pode normalmente funcionar não é produzida. A declaração de que “uma proteína que

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93/114 normalmente funciona não é produzida” inclui uma declaração de que a proteína não é produzida a partir do gene, e uma declaração de que a proteína cuja função (tal como, atividade ou propriedade) por molécula é reduzida ou eliminada é produzida a partir do gene.

[00204] A interrupção de um gene pode ser alcançada, por exemplo, com a deleção do gene em um cromossomo. O termo “deleção de um gene” se refere à deleção de uma região parcial ou inteira da região de codificação do gene. Adicionalmente, todo um gene o que inclui sequências a montante e a jusante da região de codificação do gene em um cromossomo pode ser excluído. A região a ser excluída pode ser qualquer região, tal como, uma região de terminal N (região que codifica uma região N de uma proteína), uma região interna ou uma região de terminal C (região que codifica uma região de terminal C de uma proteína), contanto que a atividade da proteína possa ser reduzida. A deleção de uma região mais longa pode geralmente inativar de modo mais seguro o gene. A região a ser excluída pode ser, por exemplo, uma região que tem um comprimento de 10% ou mais, 20% ou mais, 30% ou mais, 40% ou mais, 50% ou mais, 60% ou mais, 70% ou mais, 80% ou mais, 90% ou mais, ou 95% ou mais do comprimento total da região de codificação do gene. Adicionalmente, é preferível que quadros de leitura das sequências a montante e a jusante da região a ser excluída não sejam os mesmos. A inconsistência de quadros de leitura pode causar uma comutação de quadro a jusante da região a ser excluída.

[00205] A interrupção de um gene pode ser também alcançada, por exemplo, com a introdução de uma mutação para uma substituição de aminoácido (mutação de sentido errado), um códon de parada (mutação sem sentido), adição ou deleção de um ou dois resíduos de nucleotídeo (mutação de troca de quadro) ou similar na região de codificação do gene em um cromossomo (Journal of Biological Chemistry, 272:8.611 a 8.617 (1997); Proceedings of the National Academy of Sciences, EUA, 95 5.511 a 5.515

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94/114 (1998); Journal of Biological Chemistry, 26 116, 20.833 a 20.839 (1991)). [00206] A interrupção de um gene pode ser também alcançada, por exemplo, com a inserção de outra sequência de nucleotídeos em uma região de codificação do gene em um cromossomo. O local da inserção pode ser em qualquer região do gene e a inserção de uma sequência de nucleotídeos mais

Z longa pode geralmente inativar de modo mais seguro o gene. E preferível que quadros de leitura das sequências a montante e a jusante do local de inserção não sejam os mesmos. A inconsistência de quadros de leitura pode causar uma comutação de quadro a jusante da região a ser excluída. A outra sequência de nucleotídeos não é particularmente limita, contanto que uma sequência que reduz ou elimina a atividade da proteína codificada seja escolhida, e exemplos da mesma incluem, por exemplo, um gene marcador, tal como, genes de resistência antibiótica e um gene útil para produção de uma substância objetiva.

[00207] Particularmente, a interrupção de um gene pode ser realizada de modo que a sequência de aminoácidos da proteína codificada seja excluída. Em outras palavras, a modificação para reduzir a atividade de uma proteína pode ser alcançada, por exemplo, com a deleção da sequência de aminoácidos da proteína, especificamente, com uma modificação de um gene de modo a codificar uma proteína cuja sequência de aminoácidos é excluída. O termo “deleção da sequência de aminoácidos de uma proteína” se refere à deleção de uma região da sequência de aminoácidos parcial ou inteira da proteína. Adicionalmente, o termo “deleção da sequência de aminoácidos de uma proteína” significa que a sequência de aminoácidos original desaparece na proteína e também inclui casos em que a sequência de aminoácidos original é alterada para outra sequência de aminoácidos. Isto é, por exemplo, uma região que foi alterada para outra sequência de aminoácidos por troca de quadro pode ser considerada uma região excluída. Quando a sequência de aminoácidos de uma proteína é excluída, o comprimento total da proteína é

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95/114 tipicamente encurtado, mas pode haver também casos em que o comprimento total da proteína não seja alterado ou estendido. Por exemplo, com a deleção de uma redução parcial ou inteira da região de codificação de um gene, uma região codificada pela região excluída pode ser excluída na proteína codificada. Adicionalmente, por exemplo, coma a introdução de um códon de parada na região de codificação de um gene, uma região codificada pela região a jusante do local de introdução pode ser excluída na proteína codificada. Adicionalmente, por exemplo, pela troca de quadro na região de codificação de um gene, uma região codificada pela região de troca de quadro pode ser excluída na proteína codificada. As descrições mencionadas anteriormente relacionadas à posição e ao comprimento da região a ser excluída na deleção de um gene podem ser aplicadas mutatis mutandis à posição e comprimento da região a ser excluída na deleção da sequência de aminoácidos de uma proteína.

[00208] Tal modificação de um gene em um cromossomo conforme descrito acima pode ser alcançada, por exemplo, com a preparação de um gene tipo interrupção de modo que o mesmo não tenha capacidade para produzir uma proteína que funciona normalmente e transformar um hospedeiro com um DNA recombinante que contém o gene tipo interrupção para causar recombinação homóloga entre o gene tipo interrupção e o gene do tipo selvagem em um cromossomo e, desse modo, substituir o gene tipo interrupção pelo gene do tipo selvagem no cromossomo. Nesse procedimento, se um gene marcador selecionado de acordo com as características do hospedeiro, tal como, auxotrofia for incluído no DNA recombinante, a operação se toma mais fácil. Exemplos do gene tipo interrupção incluem um gene cuja redução parcial ou inteira é excluída, gene que inclui uma mutação de sentido, gene que inclui uma mutação sem sentido, gene que inclui uma mutação de troca de quadro, e gene introduzido com uma sequência de inserção, tal como, um transposon ou gene marcador. A proteína codificada

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96/114 pelo gene tipo interrupção tem uma conformação diferente daquela da proteína do tipo selvagem, mesmo se a mesma for produzida e, portanto, a função da mesma é reduzida ou eliminada. Tal interrupção de gene com base na substituição de gene que utiliza a recombinação homóloga já foi estabelecida e há métodos de uso de um DNA linear, tal como, um método chamado “Integração conduzida por vermelho” (Datsenko, K.A e Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 97:6.640 a 6.645 (2000)), e um método que utiliza a Integração conduzida por vermelho em combinação com um sistema de excisão derivado de fago λ (Cho, E.H., Gumport, R.I., Gardner, J.F., J. Bacteriol., 184:5.200 a 5.203 (2002)) (consultar o documento n° W02005/010175), um método de uso de um plasmídeo que tem uma origem de replicação sensível à temperatura, um método de uso de um plasmídeo com capacidade para transferência conjugativa, um método de uso de um vetor suicida que não tem uma origem de replicação que funciona em um hospedeiro (Patente n- U.S. 6.303.383, Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N- JP 05-007491) e assim por diante.

[00209] A modificação para reduzir a atividade de uma proteína pode ser também alcançada, por exemplo, por um tratamento de mutagênese. Exemplos do tratamento de mutagênese incluem a irradiação de raios X ou ultravioleta e tratamento com um agente de mutação, tal como, N-metil-N'nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), etil metanosulfonato (EMS) e metil metanosulfonato (MMS).

[00210] Tais métodos para reduzir a atividade de uma proteína conforme mencionado acima podem ser usados independentemente ou em uma combinação arbitrária.

[00211] Quando uma proteína funciona como um complexo que consiste em uma pluralidade de subunidades, uma parte ou toda uma pluralidade de subunidades pode ser modificada, contanto que a atividade da proteína seja eventualmente reduzida. Isto é, por exemplo, uma parte ou toda

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97/114 uma pluralidade de genes que codificam as respectivas subunidades pode ser interrompida ou algo similar. Adicionalmente, quando há uma pluralidade de isozimas de uma proteína, uma parte ou todas as atividades da pluralidade de isozimas pode ser reduzida, contanto que a atividade da proteína seja eventualmente reduzida. Isto é, por exemplo, uma parte ou toda uma pluralidade de genes que codificam as respectivas isozimas pode ser interrompida ou algo similar.

[00212] Uma redução na atividade de uma proteína pode ser confirmada com a medição da atividade da proteína.

[00213] Uma redução na atividade de uma proteína pode ser também confirmada com a confirmação de uma redução na expressão de um gene de codificação da proteína. Uma redução na expressão de um gene pode ser confirmada com a confirmação de uma redução na quantidade de transcrição do gene ou uma redução na quantidade da proteína expressa a partir do gene.

[00214] Uma redução na quantidade de transcrição de um gene pode ser confirmada com a comparação da quantidade de mRNA transcrito a parti do gene com aquela de uma cepa não modificada. Exemplos do método para avaliar a quantidade de mRNA incluem hibridização Northem, RT-PCR, micromatriz, seq-RNA e assim por diante (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (EUA), 2001). A quantidade de mRNA é preferencialmente reduzida, por exemplo, para 50% ou menos, 20% ou menos, 10% ou menos, 5% ou menos ou 0% daquela de uma cepa não modificada.

[00215] Uma redução na quantidade de uma proteína pode ser confirmada por Western blotting que usa anticorpos (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (EUA) 2001). A quantidade da proteína (tal como, o número de moléculas da proteína por célula) é preferencialmente reduzida, por exemplo, para 50% ou menos, 20% ou menos, 10% ou menos, 5% ou menos ou 0% daquela de uma cepa não

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98/114 modificada.

[00216] A interrupção de um gene pode ser confirmada com a determinação da sequência de nucleotídeos de uma parte ou do gene todo, mapa de enzima de restrição, comprimento completo, ou similar do gene que dependendo do meio usado para a interrupção.

[00217] Os métodos mencionados anteriormente para reduzir a atividade de uma proteína conforme mencionado acima podem ser aplicados à redução nas atividades de proteína arbitrárias, tais como, uma enzima que catalisa uma reação que se ramifica da trajetória de biossíntese de um Laminoácido do objetivo para gerar um composto além do L-aminoácido objetivo e também à redução na expressão de genes arbitrários, tais como, genes que codificam aquelas proteínas arbitrárias.

<2> MÉTODO PARA PRODUZIR L-AMINOÁCIDO DA PRESENTE INVENÇÃO [00218] O método da presente invenção é um método para produzir um

L-aminoácido que compreende cultivar a bactéria da presente invenção em um meio que contém frutose para acumular um L-aminoácido no meio e/ou células da bactéria, e coletar o L-aminoácido do meio e/ou das células da bactéria. Na presente invenção, um tipo de L-aminoácido pode ser produzido, ou dois ou mais tipos de L-aminoácidos podem ser produzidos.

[00219] O meio a ser usado não é particularmente limitado, contanto que o mesmo contenha frutose, a bactéria da presente invenção pode proliferar no mesmo, e um L-aminoácido do objetivo pode ser produzido. Como o meio, por exemplo, um meio usual usado para o cultivo das bactérias, tais como, bactérias corineformes e bactérias Enterobacteriaceae pode ser usado. Como o meio, por exemplo, um meio que contém fonte de carbono, fonte de nitrogênio, fonte de fósforo e fonte de enxofre, assim como componentes selecionados a partir de outros vários componentes orgânicos e inorgânicos conforme exigido podem ser usados, adicionalmente à frutose.

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Tipos e concentrações dos componentes de meio podem ser apropriadamente determinados de acordo com várias condições, tais como, o tipo de bactéria a ser usada.

[00220] No método da presente invenção, a frutose pode ser ou não usada como a única fonte de carbono. Isto é, no método da presente invenção, a frutose e outra fonte de carbono podem ser usadas em combinação. Exemplos específicos de outra fonte de carbono incluem, por exemplo, sacarídeos, tais como, glicose, sacarose, lactose, galactose, xilose, arabinose, melaço blackstrap, hidrolisatos de amidos e hidrolisatos de biomassa, ácidos orgânicos, tais como, ácido acético, ácido fumárico, ácido cítrico e ácido succínico, álcoois, tais como, glicerol, glicerol cru e etanol e ácidos alifáticos. Exemplos particulares de outra fonte de carbono incluem glicose. Como a outra fonte de carbono, materiais derivados de planta podem ser preferencialmente usados. Exemplos de planta incluem, por exemplo, milho, arroz, trigo, soja, cana-de-açúcar, beterraba e algodão. Exemplos dos materiais derivados de planta incluem, por exemplo, órgãos, tais como, raiz, caule, tronco, ramo, folha, flor e semente, corpos de plantas que incluem os mesmos e produtos de decomposição desses órgãos de planta. As formas dos materiais derivados de planta no momento do uso dos mesmos não são particularmente limitadas, e os mesmos podem ser usados de qualquer forma, tal como, produto não processado, suco, produto moído e produto purificado. Pentoses, tais como, xilose, hexoses, tais como, glicose ou misturas dos mesmos podem ser obtidas, por exemplo, a partir de biomassa de planta e usados. Especificamente, esses sacarídeos podem ser obtidos através da submissão de uma biomassa de planta a tal tratamento como tratamento de vapor, hidrólise com ácido concentrado, hidrólise com ácido diluído, hidrólise com uma enzima, tal como, tratamento com celulase e alcalino. Visto que a hemicelulose é geralmente mais facilmente hidrolisada em comparação com a celulose, hemicelulose em uma biomassa de planta pode ser hidrolisada

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100/114 previamente à liberação de pentoses, e depois celulose pode ser hidrolisada para gerar hexoses. Adicionalmente, xilose pode ser suprida por conversão a partir de hexoses, por exemplo, com a transmissão de uma trajetória para converter hexose, tal como, glicose para xilose para a bactéria da presente invenção. Como outra fonte de carbono, um único tipo de fonte de carbono pode ser usado, ou dois ou mais tipos de fontes de carbono podem ser usadas em combinação.

[00221] Exemplos específicos da fonte de nitrogênio incluem, por exemplo, sais de amônio, tais como, sulfato de amônio, cloreto de amônio e fosfato de amônio, fontes de nitrogênio orgânico, tais como, peptona, extrato de levedura, extrato de carne e produtos de decomposição de proteína de soja, amônia e ureia. Gás de amônia ou amônia aquosa usados para ajustar pH podem ser também usados como a fonte de nitrogênio. Como a fonte de nitrogênio, um único tipo de fonte de nitrogênio pode ser usado, ou dois ou mais tipos de fontes de nitrogênio podem ser usados em combinação.

[00222] Exemplos específicos da fonte de fosfato incluem, por exemplo, sais de ácido fosfórico, tais como, di-hidrogenfosfato de potássio e hidrogenfosfato de dipotássio e polímeros de ácido fosfórico, tais como, ácido pirofosfórico. Como a fonte de fosfato, um único tipo de fonte de fosfato pode ser usado, ou dois ou mais tipos de fontes de fosfato podem ser usados em combinação.

[00223] Exemplos específicos da fonte de enxofre incluem, por exemplo, compostos de enxofre inorgânico, tais como, sulfatos, tiossulfatos e sulfitos e aminoácidos que contêm enxofre, tais como, cisteína, cistina e glutationa. Como a fonte de enxofre, um único tipo de fonte de enxofre pode ser usado, ou dois ou mais tipos de fontes de enxofre podem ser usados em combinação.

[00224] Exemplos específicos de outros componentes orgânicos e inorgânicos incluem, por exemplo, sais inorgânicos, tais como, cloreto de

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101/114 sódio e cloreto de potássio; oligoelementos, tais como, ferro, manganês, magnésio e cálcio; vitaminas, tais como, vitamina Bl, vitamina B2, vitamina B6, ácido nicotínico, nicotinamida e vitamina B12; aminoácidos; ácidos nucleicos; e componentes orgânicos que contêm aqueles, tais como, peptona, ácido casamino, extrato de levedura e produto de decomposição de proteína de soja. Como outros vários componentes orgânicos e inorgânicos, um único tipo de componente pode ser usado, ou dois ou mais tipos de componentes podem ser usados em combinação.

[00225] Adicionalmente, quando um mutante auxotrófico que exige um aminoácido ou similar para o crescimento do mesmo é usado, é preferível suprir um nutriente exigido ao meio.

[00226] Adicionalmente, é preferível também, por exemplo, restringir a quantidade de biotina no meio ou adicionar um tensoativo ou penicilina ao meio.

[00227] As condições de cultura não são particularmente limitadas, contanto que a bactéria da presente invenção possa proliferar e um Laminoácido do objetivo possa ser produzido. A cultura pode ser realizada, por exemplo, em condições usuais usadas para cultivar bactérias, tais como, bactérias corineformes e bactérias Enterobacteriaceae. As condições de cultivo podem ser apropriadamente estabelecidas de acordo com várias condições, tais como, o tipo de bactéria a ser usada.

[00228] O cultivo pode ser realizado com o uso de um meio líquido. No momento do cultivo, a bactéria da presente invenção cultivada em um meio sólido, tal como, meio ágar pode ser diretamente inoculada em um meio líquido, ou a bactéria da presente invenção cultivada em um meio líquido como cultivo de semente pode ser inoculado em um meio líquido para cultivo principal. Isto é, o cultivo pode ser realizado separadamente como cultivo de semente e cultivo principal. Em tal caso, as condições de cultivo de semente e do cultivo principal podem ser ou não as mesmas. A quantidade da bactéria da

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102/114 presente invenção contida no meio no momento do início do cultivo não é particularmente limitada. A cultivo principal pode ser realizada, por exemplo, com a inoculação de um caldo de cultivo de semente em um meio para cultivo principal em uma quantidade de 1 a 50% (v/v).

[00229] O cultivo pode ser realizado como cultivo em batelada, cultivo em batelada por alimentação, cultivo contínuo ou uma combinação dos mesmos. O meio usado no momento do início do cultivo também é denominado “meio de partida”. O meio suprido a um sistema de cultivo (tanque de fermentação) em cultivo por alimentação em batelada ou contínua também é denominado “meio de alimentação”. Adicionalmente, para suprir um meio de alimentação para um sistema de cultivo em cultivo por alimentação em batelada ou contínua também é denominado “alimentação”. Adicionalmente, quando o cultivo é realizado separadamente como cultivo de semente e cultivo principal, por exemplo, tanto o cultivo de semente quanto o cultivo principal podem ser realizados como cultivo em batelada. Altemativamente, por exemplo, o cultivo de semente pode ser realizado como cultivo em batelada, e o cultivo principal pode ser realizado como cultura por alimentação em batelada ou contínua.

[00230] Na presente invenção, os componentes de meio podem ser, cada um, contidos no meio de partida, meio de alimentação ou ambos. Os tipos dos componentes contidos no meio de partida podem ser ou não os mesmos que os tipos dos componentes contidos no meio de alimentação. A concentração de cada componente contido no meio de partida pode ser ou não a mesma que a concentração do componente contido no meio de alimentação. Adicionalmente, dois ou mais tipos de meios de alimentação que contêm diferentes tipos e/ou diferentes concentrações de componentes podem ser usados. Por exemplo, quando meio é intermitentemente alimentado em uma pluralidade de vezes, os tipos e/ou concentrações de componentes contidos nos meios de alimentação podem ser ou não os mesmos para cada

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103/114 alimentação.

[00231] A concentração da fonte de carbono no meio não é particularmente limitada, contanto que a bactéria da presente invenção possa proliferar e produzir um L-aminoácido. A concentração da fonte de carbono no meio pode ser tão alta quanto possível dentro de tal faixa que a produção do L-aminoácido não é inibida. A concentração da fonte de carbono no meio pode ser, como a concentração inicial (a concentração no meio de partida), por exemplo, 1 a 30% (p/v), preferencialmente 3 a 10% (p/v). Adicionalmente, a fonte de carbono pode ser adicionalmente suprida ao meio conforme exigido. Por exemplo, a fonte de carbono pode ser adicionalmente suprida ao meio em proporção ao consumo da fonte de carbono que acompanha o progresso da fermentação.

[00232] Quando frutose e outra fonte de carbono são usadas em combinação, a razão da quantidade de frutose em relação à quantidade total das fontes de carbono não é particularmente limitada, contanto que a bactéria da presente invenção possa utilizar frutose como uma fonte de carbono. A razão da quantidade de frutose em relação à quantidade total das fontes de carbono pode ser, por exemplo, 5% em peso ou mais, 10% em peso ou mais, 20% em peso ou mais, 30% em peso ou mais, 40% em peso ou mais ou 50% em peso ou mais. A razão da quantidade de frutose em relação à quantidade total das fontes de carbono pode estar dentro da faixa exemplificada acima em termos, por exemplo, da quantidade inicial (isto é, a quantidade no meio de partida), a quantidade de alimentação (isto é, a quantidade no meio de alimentação) ou a quantidade de uso total (isto é, a quantidade total de quantidade inicial e quantidade de alimentação).

[00233] A concentração de frutose no meio não é particularmente limita, contanto que a bactéria da presente invenção possa utilizar frutose como uma fonte de carbono. Frutose pode ser contida no meio, por exemplo, a uma concentração de 0,2 p/v% ou mais, 0,5 p/v% ou mais, ou 1,0 p/v% ou

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104/114 mais, o a uma concentração de 30 p/v% ou menos, 20 p/v% ou menos, 10 p/v% ou menos, 5 p/v% ou menos, ou 2 p/v% ou menos, ou a uma concentração dentro da faixa definida com uma combinação das mesmas. Frutose pode ser contida no meio de partida, meio de alimentação ou em ambos a uma concentração dentro da faixa exemplificada acima.

[00234] Quando a frutose está contida no meio de alimentação, a frutose pode ser contida no meio de alimentação em tal concentração que, por exemplo, a concentração de frutose no meio depois da alimentação seja 0,01 p/v% ou mais, 0,02 p/v% ou mais ou 0,05 p/v% ou mais, ou seja 5 p/v% ou menos, 2 p/v% ou menos, ou 1 p/v% ou menos, ou esteja dentro da faixa definida com uma combinação das mesmas.

[00235] A frutose pode estar contida no meio a uma concentração dentro da faixa exemplificada acima, quando a frutose é usada como a única fonte de carbono. Altemativamente, a frutose pode estar contida também no meio a uma concentração dentro da faixa exemplificada acima, quando outra fonte de carbono é usada em combinação. Altemativamente, a frutose pode estar contida também no meio a uma concentração dentro de uma faixa definida apropriadamente com uma modificação da faixa exemplificada acima com base, por exemplo, na razão da quantidade de frutose em relação à quantidade total das fontes de carbono, ou similar, quando outra fonte de carbono é usada em combinação.

[00236] A fructose pode estar ou não contida no meio por todo o período de cultivo. Por exemplo, a frutose pode estar ou não contida no meio dentro de determinada faixa, tal como, a faixa exemplificada acima, por todo o período de cultivo. Por exemplo, a frutose pode estar escassa durante um período parcial do cultivo. O termo “escassa” significa que a quantidade de frutose é menor que a quantidade exigida, e isso pode significar, por exemplo, que a concentração no meio é zero. Por exemplo, a frutose pode estar ou não contida no meio a partir do início do cultivo. Quando a frutose não está

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105/114 contida no meio no início do cultivo, a frutose é suprida ao meio depois do início do cultivo. O momento de suprir frutose pode ser apropriadamente determinado de acordo com várias condições, tais como, a extensão do período de cultivo. Adicionalmente, por exemplo, a frutose pode ser consumida durante o cultivo e, desse modo, a concentração da mesma no meio pode se tomar zero. O termo “período parcial de cultura” pode se referir, por exemplo, a 1% ou menos, 5% ou menos, 10% ou menos, 20% ou menos, 30% ou menos, ou 50% ou menos do período todo do cultivo. Quando o cultivo é realizado como cultivo de semente e cultivo principal separados, o termo “período total do cultivo” pode significar o período total do cultivo principal. É preferível que, durante um período em que a frutose esteja escassa, outra fonte de carbono exista em quantidade suficiente. Mesmo se a frutose estiver escassa durante um período parcial de cultivo, conforme descrito acima, contanto que haja um período de cultivo que usa um meio que contém frutose, o cultivo fica dentro do escopo da expressão “cultivo de uma bactéria em um meio que contém frutose”.

[00237] As concentrações de vários componentes, tais como, frutose podem ser medidas por cromatografia gasosa (Hashimoto, K. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 1996, 70:22 a 30) ou HPLC (Lin, J.T. et al., J. Chromatogr. A., 1998, 808:43 a 49).

[00238] O cultivo pode ser realizado, por exemplo, em condição aeróbica. O termo “condição aeróbica” se refere a uma condição em que a concentração de oxigênio dissolvido no meio líquido não é inferior a 0,33 ppm, que é o limite de detecção para a detecção com um eletrodo de membrana de oxigênio, ou pode ser preferencialmente uma condição em que a concentração de oxigênio dissolvido no meio líquido não é inferior a 1,5 ppm. A concentração de oxigênio pode ser controlada, por exemplo, 5 a 50%, preferencialmente, cerca de 10% da concentração de oxigênio saturado. Especificamente, o cultivo em uma condição aeróbica pode ser realizado por

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106/114 cultivo de aeração, cultivo de sacudida, cultivo de agitação ou uma combinação dos mesmos. O pH do meio pode ser, por exemplo, 3 a 10, preferencialmente 4,0 a 9,5. Durante o cultivo, o pH do meio pode ser ajustado conforme exigido. O pH do meio pode ser ajustado com o uso de várias substâncias alcalinas e ácidas, tais como, gás amônia, amônia aquosa, carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, carbonato de potássio, bicarbonato de potássio, carbonato de magnésio, hidróxido de sódio, hidróxido de cálcio e hidróxido de magnésio. A temperatura de cultivo pode ser, por exemplo, 20 a 45 °C, preferencialmente 25 a 37°C. O período de cultivo pode ser, por exemplo, 10 a 120 horas. O cultivo pode ser continuado, por exemplo, até a fonte de carbono contida no meio ser consumida, ou até a bactéria da presente invenção perder a atividade. Cultivando-se a bactéria da presente invenção sob tais condições conforme descrito acima, um L-aminoácido é acumulado no meio e/ou células da bactéria.

[00239] Adicionalmente, quando ácido L-glutâmico é produzido, o cultivo pode ser realizado com o uso de um meio líquido ajustado para satisfazer uma condição em que o ácido L-glutâmico é precipitado, enquanto precipita o ácido L-glutâmico no meio. Exemplos da condição em que o ácido L-glutâmico é precipitado incluem, por exemplo, pH 5,0 a 4,0, preferencialmente, pH 4,5 a 4,0, mais preferencialmente, pH 4,3 a 4,0, particularmente de preferência cerca de pH 4,0 (EP1078989A).

[00240] A produção de um L-aminoácido pode ser confirmada por métodos conhecidos usados para detecção ou identificação de compostos. Exemplos de tais métodos incluem, por exemplo, HPLC, LC/MS, GC/MS e NMR. Esses métodos podem ser independentemente usados ou podem ser usados em uma combinação apropriada.

[00241] O L-aminoácido produzido pode ser coletado a partir do caldo de fermentação pelos métodos conhecidos usados para separação e purificação de compostos. Exemplos de tais métodos incluem, por exemplo,

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107/114 método de resina de troca de íons (Nagai, H. et al., Separation Science and Technology, 39(16), 3.691 a 3.710), precipitação, separação de membrana (Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N° JP 9-164323 e Patente aberta à inspeção pública (Kokai) N° JP 9-173792), e cristalização (documentos ri’ W02008/078448 e W02008/078646). Esses métodos podem ser independentemente usados ou podem ser usados em uma combinação apropriada. Quando o L-aminoácido é acumulado nas células da bactéria, por exemplo, as células podem ser interrompidas com ondas ultras sônicas ou similares, um sobrenadante pode ser obtido com a remoção das células a partir da suspensão de interrupção de célula por centrifugação e o Laminoácido pode ser coletado a partir do sobrenadante pelo método de resina de troca de íons ou similar. O L-aminoácido a ser coletado pode ser um composto livre, um sal do mesmo ou uma mistura dos mesmos. Exemplos do sal incluem, por exemplo, sulfato, hidrocloreto, carbonato, sal de amônio, sal de sódio e sal de potássio. Quando ácido L-glutâmico é produzido, ácido Lglutâmico a ser coletado pode especificamente, por exemplo, ácido Lglutâmico livre, L-glutamato de sódio (L-glutamato monossódico, MSG), Lglutamato de amônio (L-glutamato de monoamônio) ou uma mistura desses. Por exemplo, L-glutamato monossódico (MSG) pode ser obtido com a adição de um ácido ao caldo de fermentação para cristalizar L-glutamato de amônio contido no mesmo e, depois, com a adição de um equimolar de hidróxido de sódio aos cristais. Adicionalmente, a descolorização pode ser realizada com o uso de carbono ativado antes e/ou depois da cristalização (consultar, Tetsuya KAWAKITA, “Industrial Crystallization for Monosodium L-Glutamate.”, Bulletin of the Society of Sea Water Science, Japão, Vol. 56:5). O cristal de L-glutamato monossódico pode ser usado, por exemplo, como um tempero umami. O cristal de L-glutamato monossódico pode ser também usado como um tempero em combinação com um ácido nucleico, tal como, gaunilato de sódio e inosinato de sódio que também tem um sabor umami.

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108/114 [00242] Quando o L-aminoácido é precipitado no meio, o mesmo pode ser coletado por centrifugação, filtração ou similar. O L-aminoácido precipitado no meio pode ser também isolado junto com o L-aminoácido a dissolver no meio, depois de o L-aminoácido dissolver no meio ser cristalizado.

[00243] O L-aminoácido coletado pode conter tais componentes como células bacterianas, componentes de meio, umidade e metabólitos de subproduto da bactéria adicionalmente ao L-aminoácido. O L-aminoácido coletado pode ser também purificado a uma extensão desejada. A pureza do L-aminoácido coletado pode ser, por exemplo, 50% (p/p) ou mais, preferencialmente 85% (p/p) ou mais, particularmente de preferência 95% (p/p) ou mais (documento n² JP1214636B, USP5,431,933, USP4,956,471, USP4,777,051, USP4,946,654, USP5,840,358, USP6,238,714 e

US2005/0025878).

EXEMPLOS [00244] Doravante no presente documento, a presente invenção será mais especificamente explicada com referência aos exemplos não limitantes.

[00245] Exemplo: A produção de ácido glutâmico que usa cepa de Corynebacterium glutamicum que tem expressão intensificada de genes fucPfrk.

[00246] Nesse Exemplo, a produção de ácido glutâmico foi realizada com o uso de uma cepa de produção de ácido glutâmico de C. glutamicum introduzido com um gene de carreador de absorção de frutose não PTS (fucP) e um gene de frutoquinase (frk), e o efeito de uma expressão intensificada dos genes fucP-frk na produção de ácido glutâmico foi avaliado.

Cl) MATERIAIS

MATERIAIS USADOS NESSE EXEMPLO SÃO APRESENTADOS A SEGUIR.

TABELA 1 <INICIADORES USADOS>____________ | Iniciador | SEQ ID | Sequência de nucleotídeo (5'—>3')

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	NO
1	1	CCAAGCTTGCATGCCATTTGCGCCTGCAACGTAGGTTG
2	2	AACAGGAATGTTCCTTTCGAAAA
3	3	AGGAACATTCCTGTTATGACTTCAAATATCCAAACCAGCG
4	4	TATAATCCTCCTTTAAGCATGTGATTCTTCCTTTGTC
5	5	GAATCACATGCTTAAAGGAGGATTATAATGACTACCCCGATCGTTCTGAG
6	6	CCAAGCTTGCATGCCAGGAGGATTATAATGACTACCCCGATCGTTCTGAG
7	7	CCAAGCTTGCATGCCCGGGGTGCTACGCG
8	8	CGGTACCCGGGGATCAGCACAGGACCGTTTGCCATTG

<Plasmídeos usados>

pVK9 (Km^R; documento ri US2006-0141588) pVK9-xfp (Km^R; documento ri’ W02006/016705) pVK9-P_mSrA-fucP-frk (Km^R; presente pedido) pVS7 (Spc^R; documento ri’ WO2013/069634) pVS7-xfp (Spc^R; presente pedido) <Cepas usadas>

C. glutamicum 2256AsucAAldhA yggB* (documento n² WO2014/185430)

C. glutamicum 2256AsucAAldhA yggB*/pVK9/pVS7 (presente pedido)

C. glutamicum 2256AsucAAldhA yggB7pVK9-P_mSrA-fucPfrk/pVS7 (presente pedido)

C. glutamicum 2256AsucAAldhA yggB7pVK9/pVS7-xfp (presente pedido)

C. glutamicum 2256AsucAAldhA yggB7pVK9-P_msrA-fucPfrk/pVS7-xfp (presente pedido) (2) CONSTRUÇÃO DE PLASMÍDEOS E CEPAS [00247] PCR foi realizada com o uso de DNA genômico da cepa 2256 de C. glutamicum 2256 cepa (ATCC 13869) como o modelo, e iniciadores 1 e 2 para amplificar um fragmento de DNA que contém uma região a montante do gene msrA de C. glutamicum (que inclui uma região de promotor; 369 bp). PCR foi realizada com o uso de DNA genômico de 6872 ATCC de Corynebacterium ammoniagenes ATCC como o modelo, e iniciadores 3 e 4 para amplificar um fragmento de DNA que contém o gene fucP de C.

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110/114 ammoniagenes (GenBank: AMJ44784.1; 1.335 bp). PCR foi realizada com o uso de DNA genômico JCM1217 de Bifidobacterium longum como o modelo, e iniciadores 5 e 6 para amplificar um fragmento de DNA que contém o gene frk de B. longum (GenBank: BAJ66931.1; 897 bp). Os fragmentos de DNA obtidos e pVK9 (documento n- US2006-0141588) digedos com BamH\ e PstI foram mutuamente ligados com o uso do Kit Clontech In-fusion HD (TaKaRa Inc.) para construir pVK9-PmsrA-fiicP-frk que é um plasmídeo de expressão dos genes fucP-frk.

[00248] PCR foi realizada com o uso de pVK9-xip (documento nW02006/016705) como o modelo, e iniciadores 7 e 8 para amplificar um fragmento de DNA que contém o gene de fosfoquetolase (xfp) de JCM1217 de B. longum. O fragmento de DNA obtido e pVS7 (WO2013/069634) digeridos com BamHl e PstI foram mutuamente ligados com o uso do Kit Clontech In-fusion HD Cloning (TaKaRa Inc.) para construir pVS7-xfp que é uma expressão plasmídeo do gene xfp.

[00249] Os plasmídeos construídos foram introduzidos na cepa 2256AsucAAldhA yggB* de C. glutamicum (documento n- WO2014/185430) para construir uma cepa que tem uma expressão intensificada dos genes fucPfrk e do gene xfp. As outras cepas usadas foram também construídas com a introdução dos respectivos plasmídeos. A cepa 2256AsucAAldhA yggB* é uma cepa de produção de ácido glutâmico derivada da cepa 2256 de C. glutamicum (ATCC 13869). A cepa 2256AsucAAldhA yggB* é deficiente em genes IdhA e sucA e tem uma mutação IS (V419::IS) no gene yggB. A sequência de nucleotídeos desse gene yggB mutante (V419::IS) e a sequência de aminoácidos da proteína YggB mutante (V419::IS) codificada pelo gene são mostradas nas SEQ ID NOS: 11 e 12, respectivamente.

(3) CULTURA DE PRODUÇÃO DE ÁCIDO GLUTÂMICO [00250] A cultura de produção de ácido glutâmico foi realizada com o uso das cepas construídas. As composições de meios usados são mostradas na

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Tabela 2.

TABELA 2: COMPOSIÇÃO DE MEIOS

Meio CM2G
Pepton	10	g/i
Extrato de Levedura	10	g/i
NaCl	5	g/1
Biotina	10	pg/l
Glicose	5	g/1

[00251] O meio da composição mencionado anteriormente ajustado para pH 7,0 com KOH foi preparado, esterilizado por autoclave (120 °C, 20

min) e usado para cultura.
Meio 1
Frutose	80	g/i
(NH4)2SO4	30	g/i
ΚΗ2ΡΟ4	1	g/i
MgSO4-7H2O	0,4	g/i
FeSO4-7H2O	0,01	g/i
MnSO4-5H2O	0,01	g/i
VBi	200	pg/i
Biotina	60	pg/i
Mameno	0,48	g/1

[00252] O meio da composição mencionado anteriormente ajustada para pH 8,0 com KOH foi preparado e esterilizado por autoclave (115 °C, 15 min). Ao meio esterilizado foi adicionado CaCO3 a uma concentração de 50

g/1 e usado para cultura.
Meio 2
Glicose	40	g/i
Frutose	40	g/i
(NH4)2SO4	30	g/1
kh2po4	1	g/1
MgSO4-7H2O	0,4	g/1
FeSO4-7H2O	0,01	g/1
MnSO4-5H2O	0,01	g/1
VBi	200	pg/l
Biotina	60	pg/l
Mameno	0,48	g/1

[00253] O meio da composição mencionado anteriormente ajustada para pH 8,0 com KOH foi preparado e esterilizado por autoclave (115 °C, 15 min). Ao meio esterilizado foi adicionado CaCO3 a uma concentração de 50 g/1 e usado para cultura.

<AVALIAÇÃO DE CULTURA 1: AVALIAÇÃO COM UM MEIO QUE CONTÉM FRUTOSE COMO UMA FONTE DE CARBONO>

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112/114 [00254] Cada cepa foi cultivada em uma placa de CM2G com adição de antibiótico (ou antibióticos) correspondente de um dia para o outro a 31,5 °C. Células em uma quantidade que corresponde a 1/6 da placa foram raspadas, inoculadas em 20 ml de Meio 1 contido em um frasco Sakaguchi e cultivada a 30 °C com sacudida a 120 rpm. Um caldo de cultura foi amostrado a 18 horas depois do início do cultivo e a concentração de ácido glutâmico foi medida com o uso de um analisador Biotech AS-310 (SAKURA SI).

[00255] Resultados são mostrados na Figura 1. Foi confirmado que uma expressão intensificada dos genes fucP-frk aprimora o acúmulo de ácido glutâmico. Adicionalmente, foi confirmado também que uma expressão intensificada dos genes fucP-frk em combinação com o gene xfp aprimora adicionalmente o acúmulo de ácido glutâmico. Portanto, foi concluído que os genes jucP-frk são elementos eficazes para a produção de ácido glutâmico que usa frutose como uma fonte de carbono.

<AVALIAÇÃO DE CULTURA 2: AVALIAÇÃO COM UM MEIO QUE

CONTÉM GLICOSE E FRUTOSE COMO FONTES DE CARBONO> [00256] Cada cepa foi cultivada em uma placa de CM2G com adição de antibiótico (ou antibióticos) correspondente de um dia para o outro a 31,5 °C. Células em uma quantidade que corresponde a 1/6 da placa foram raspadas, inoculadas em 20 ml de Meio 2 contido em um frasco Sakaguchi e cultivada a 30 °C com sacudida a 120 rpm. Um caldo de cultura foi amostrado a 18 horas depois do início do cultivo, e a quantidade de células (valor de OD a 620 nm; diluído 101 vezes) e a concentração de ácido glutâmico foram medidos. A concentração de ácido glutâmico foi medida com o uso de um analisador Biotech AS-310 (SAKURA SI).

[00257] Resultados são mostrados na Figura 2. Foi confirmado que uma expressão intensificada dos genes fucP-frk aprimora o acúmulo de ácido glutâmico por quantidade de células. Adicionalmente, foi confirmado também que uma expressão intensificada dos genes fucP-frk em combinação com o

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113/114 gene xfp aprimora adicionalmente o acúmulo de ácido glutâmico por quantidade de células. Portanto, foi concluído que os genes fucP-frk são eficazes para a produção de ácido glutâmico que usa glicose e frutose como fontes de carbono.

EXPLICAÇÃO DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

SEQ ID NOS:

A 8: INICIADORES

9: Sequência de nucleotídeos de gene yggB 2256 de Corynebacterium glutamicum (ATCC 13869)

10: Sequência de aminoácidos de proteína YggB 2256 de Corynebacterium glutamicum (ATCC 13869)

11: Sequência de nucleotídeos de gene yggB mutante (V419::IS) de 2256 de Corynebacterium glutamicum (ATCC 13869)

12: Sequência de aminoácidos de proteína codificada por gene yggB mutante (V419::IS) 2256 de Corynebacterium glutamicum (ATCC 13869)

13: Sequência de nucleotídeos de gene x/p JCM1217 de Bifidobacterium longum.

14: Sequência de aminoácidos de proteína Xfp de JCM1217 de Bifidobacterium longum.

A 25: INICIADORES

26: Sequência de nucleotídeos de gene jucP ATCC 6872 de Corynebacterium ammoniagenes

27: Sequência de aminoácidos de proteína FucP ATCC 6872 de Corynebacterium ammoniagenes

28: Sequência de nucleotídeos de gene JucP AJ13355 de Pantoea ananatis

29: Sequência de aminoácidos de proteína FucP de AJ13355 de Pantoea ananatis

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30: Sequência de nucleotídeos de gene frk de JCM1217 de Bifidobacterium longum

31: Sequência de aminoácidos de proteína Frk de JCM1217 de

Bifidobacterium longum

32: Sequência de nucleotídeos de gene frk (mak) de AJ13355 Pantoea ananatis

33: Sequência de aminoácidos de proteína Frk (Mak) AJ13355 de Pantoea ananatis

34: Sequência de nucleotídeos de gene frk (scrK) AJ13355 de Pantoea ananatis

35: Sequência de aminoácidos de proteína Frk (ScrK) de

AJ13355 de Pantoea ananatis

Claims (26)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para produzir um L-aminoácido, o método caracterizado pelo fato de que compreende:

   cultivar uma bactéria que tem uma capacidade de produção de L-aminoácido em um meio que contém frutose para acumular um Laminoácido no meio e/ou células da bactéria; e coletar o L-aminoácido do meio e/ou das células, em que a bactéria foi modificada de modo que a atividade de um carreador de absorção de frutose não PTS e a atividade de frutoquinase sejam aumentadas em comparação com uma cepa não modificada.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o carreador de absorção de frutose não PTS é uma proteína codificada por genefucP.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a frutoquinase é uma proteína codificada pelo genefrk.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o gene fucP é um gene de codificação de uma proteína definida em (a), (b) ou (c) mencionada abaixo:

   (a) uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 ou 29;

   (b) uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 ou 29, mas que inclui substituição, deleção, inserção e/ou adição de 1 a 10 resíduos de aminoácido, e que tem atividade de absorção de frutose não PTS;

   (c) uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos que mostra uma identidade de 90% ou mais com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 ou 29, e que tem atividade de absorção de frutose não PTS.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado

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   2/5 pelo fato de que o gene frk è um gene de codificação de uma proteína definida em (a), (b) ou (c) mencionada abaixo:

   (a) uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, 33 ou 35;

   (b) uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, 33 ou 35, mas que inclui substituição, deleção, inserção e/ou adição de 1 a 10 resíduos de aminoácido, e que tem atividade de frutoquinase;

   (c) uma proteína que compreende uma sequência de aminoácido que mostra uma identidade de 90% ou mais com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, 33 ou 35, e que tem atividade de frutoquinase.
6. 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a atividade do carreador de absorção de frutose não PTS e a atividade de frutoquinase são aumentadas com o aumento da expressão de um gene de codificação do carreador de absorção de frutose não PTS e um gene de codificação da frutoquinase.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a expressão de cada um dos genes é aumentada com o aumento do número de cópias de cada gene e/ou com a modificação de uma sequência de controle de expressão de cada gene.
8. 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a bactéria foi adicionalmente modificada de modo que a atividade de fosfoquetolase seja aumentada em comparação com uma cepa não modificada.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a fosfoquetolase consiste em D-xilulose-5-fosfato fosfoquetolase e/ou frutose-6-fosfato fosfoquetolase.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 8 ou 9,

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    3/5 caracterizado pelo fato de que a atividade da fosfoquetolase é aumentada com o aumento da expressão de um gene de codificação da fosfoquetolase.
11. 11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a bactéria é uma bactéria corineforme ou uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae.
12. 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a bactéria é uma bactéria que pertence ao gênero Corynebacterium.
13. 13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a bactéria é Corynebacterium glutamicum.
14. 14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a bactéria é uma bactéria que pertence ao gênero Pantoea ou Escherichia.
15. 15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a bactéria é Pantoea ananatis ou Escherichia coli.
16. 16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido é um L-aminoácido da família glutamato.
17. 17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido da família glutamato consiste em um ou mais L-aminoácidos selecionados a partir de ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-prolina, L-arginina, L-citrulina e L-omitina.
18. 18. Método de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido da família glutamato é ácido L-glutâmico.
19. 19. Método de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que o ácido L-glutâmico é L-glutamato de monoamônio ou L-glutamato monossódico.
20. 20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações

    Petição 870180020618, de 14/03/2018, pág. 208/213

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    16 a 19, caracterizado pelo fato de que a bactéria foi adicionalmente modificada de modo que a atividade de α-cetoglutarato desidrogenase e/ou sucinato desidrogenase seja reduzida em comparação com uma cepa não modificada.
21. 21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações

    18 a 20, caracterizado pelo fato de que a bactéria é uma bactéria corineforme, e em que a bactéria foi adicionalmente modificada de modo a portar um gene yggB mutante.
22. 22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o gene yggB mutante é um gene yggB que tem uma mutação que aprimora a capacidade de produção de ácido L-glutâmico da bactéria corineforme.
23. 23. Método de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que o gene yggB mutante é um gene yggB que tem uma mutação definida em (1), (2) ou (3) mencionados abaixo:

    (1) uma mutação na região que codifica os resíduos de aminoácido nas posições 419 a 533 de uma proteína YggB do tipo selvagem, (2) uma mutação na região de codificação de uma região transmembranar de uma proteína YggB do tipo selvagem, e (3) uma combinação das mesmas.
24. 24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a proteína YggB do tipo selvagem é uma proteína definida em (a), (b) ou (c) mencionados abaixo:

    (a) uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10;

    (b) uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, mas que inclui substituição, deleção, inserção e/ou adição

    Petição 870180020618, de 14/03/2018, pág. 209/213

    5/5 de 1 a 10 resíduos de aminoácido, e que tem uma propriedade de que uma expressão aumentada da mesma na bactéria corineforme provê uma capacidade intensificada de produção de ácido L-glutâmico da bactéria corineforme;

    (c) uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos que mostra uma identidade de 90% ou mais com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e que tem uma propriedade de que uma expressão aumentada da mesma na bactéria corineforme provê uma capacidade intensificada de produção de ácido L-glutâmico da bactéria corineforme.
25. 25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que o meio contém adicionalmente uma fonte de carbono além da frutose.
26. 26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a fonte de carbono é glicose.