JP3861341B2 - 発酵液の膜除菌方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エシェリヒア属に属する微生物を培養して得られた発酵液の処理において菌体、菌体破砕物等の懸濁物質、または溶存高分子不純物を膜で除去するに際し、緩和な条件での前処理で膜透過流束を向上させる方法に関する。すなわち、膜閉塞物質を前処理し、膜除菌時の透過速度を著しく向上させ、処理時間の短縮、設備を極小化する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、遺伝子組変え菌体による発酵生産技術が進歩しており、遺伝子操作の容易な、エシェリヒア属に属するエシェリヒア・コリ（以下E. coliと略す。）がこの目的のためにしばしば利用されている。発酵終了時、目的生産物が菌体外にある場合は殺菌後、膜分離または遠心分離による除菌を行ない、得られた菌体除去液を次の処理工程に供するのが通常である。また、目的生産物が菌体内に存在する場合、凍結、ホモジナイザー、ミル等を用いて菌体を破砕してから膜分離または遠心分離による菌体、菌体破砕物の除去を実施する。
【０００３】
一般に膜分離の方が完全に菌体を除去でき、遠心分離に比べて清澄な除菌液を取得できるが、その透過速度が低いことから装置が大きくなるという欠点を持つ。除菌用の膜としては精密濾過膜（以下ＭＦと略す。）、限外濾過膜（以下ＵＦと略す。）等が一般的であるが、E. coliを培養して得られた発酵液（以下、E. coli発酵液と略す。）の場合、菌体の破砕の有無によらずその透過速度が低いことが問題となる。
【０００４】
従来、発酵液の膜除菌における透過流束の向上法としては、前処理法として発酵液の加熱処理が有効であることが知られている。例えば、日本特許公開公報特開昭57-91196には、イノシンまたはグアノシン発酵液をpH5.5〜9.0で90〜110℃に加熱処理することにより、限外濾過膜で菌体および高分子物質を分離する際の膜透過速度が向上することが記載されている。また、日本特許公開公報特開昭60-78588には、アミノ酸発酵液を50〜100℃で加熱処理することにより、限外濾過膜透過速度が向上することが記載されている。
【０００５】
しかしながら、前述したように、E. coli発酵液から膜を用いて除菌する場合、極めて低い透過速度のため過大な膜処理設備を要してしまう。また、pH調整と加熱操作の組み合わせによる前処理で透過速度を向上させることも可能ではあるが、E. coli発酵液に関しては、それほど効果的ではない。また、加熱処理はしばしば発酵液の着色や反応による微量不純物の副生を生じやすく、また目的物が熱的に不安定な場合には使用することができない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、エシェリヒア属に属する微生物を培養して得られた発酵液から菌体を膜を用いて分離する方法において、より緩和な前処理条件で膜透過速度を向上させる方法の開発が求められている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、エシェリヒア属に属する微生物を培養して得られた発酵液を膜濾過し、菌体、菌体破砕物等の懸濁物質または溶存高分子不純物を分離する方法において、発酵液にポリエチレンイミン（以下、ＰＥＩと略す。）を添加した後、膜濾過し、菌体を分離することを特徴とする膜除菌方法に関するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明に用いられるエシェリヒア属に属する微生物は、野生株または変異株のいずれでもよいし、細胞融合もしくは遺伝子操作などの遺伝学的手法により誘導される組み替え株等も用いることができる。エシェリヒア属に属する微生物としては、エシェリヒア・コリが挙げられる。これらの微生物の目的生産物は、本発明に用いられるＵＦ膜、ＭＦ膜を透過する物質であれば良く、例えば、リジン、グルタミン酸、イソロイシン、バリン、ロイシン等のアミノ酸、イノシン、グアノシン等の核酸、乳酸、リンゴ酸等の有機酸、ビタミン等を挙げることができる。
【０００９】
本発明に用いられる発酵液は、上記微生物を適当な培地で培養増殖せしめることにより、得ることができる。そのような培地には格別の制限はなく、通常の炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要に応じ有機栄養源を含む通常の培地でよい。培養は、特許国際出願公開WO95/16042、欧州特許公開685555号、日本特許公開公報特開平08-047397等に記載の方法で、上記微生物の生育に適した条件下、実施すればよい。
【００１０】
炭素源としては、上記微生物が利用可能であればいずれも使用でき、具体的には、グルコース、フルクトース、シュークロース、マルトース等の糖類、フマール酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸等の有機酸類及びこれらの塩類等を使用することができる。
【００１１】
窒素源としては上記微生物が利用可能であればいずれも使用でき、具体的には、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等の無機塩のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカー等の有機窒素化合物、あるいはこれらの混合物を使用することができる。
【００１２】
他に無機塩、微量金属塩、ビタミン類等、通常の培養に用いられる栄養源を適宜、混合して用いることができる。
【００１３】
ＰＥＩは、一般に水溶液として入手することが可能であるが、E. coli発酵液に添加または混入させる場合には、1〜50％水溶液として添加することがＰＥＩ水溶液の粘度上昇を押さえ取り扱い上、また添加による発酵液の希釈防止上有効である。添加方法としては例えば発酵終了時点で発酵液を攪拌しながら、10％ＰＥＩ溶液を所定量添加混合する方法等が挙げられるが、均一に混合できれば特に方法は問わない。
ＰＥＩ添加量は、E. coli発酵液に対し0.0005〜0.5重量％であり、好ましくは0.001〜0.05重量％である。
添加されるＰＥＩは水溶性であれば良く、その平均分子量は特に問わないが、10,000〜100,000程度のものが入手も容易で扱い易い。
【００１４】
ＰＥＩ添加後、膜分離処理を行えば、膜透過速度向上の効果を得ることができるが、更にＰＥＩ添加後のE. coli発酵液のpHを3〜9、好ましくは4〜7の範囲に調整することで、膜透過速度向上のより高い効果を得ることができる。ＰＥＩ添加後の発酵液のpHが中性付近の場合にはあらためてpH調整を実施する必要はないが、上記範囲でpH調整を実施することでより高い効果を得ることができる場合もあり必要に応じて実施することができる。
pH調整には、通常使用される塩酸、硫酸、燐酸等の酸、苛性ソーダ、苛性カリ、アンモニア等のアルカリを用いることができる。
【００１５】
また、ＰＥＩの添加前及び／または添加後に発酵液を加熱処理することも可能である。加熱条件としては、50〜130℃の温度、10〜20分の時間が適当である。加熱処理することにより、ＰＥＩの混合効率の向上、透過速度の向上が得られる。
【００１６】
使用する膜はＭＦでもＵＦでも構わない。膜装置としては平膜、ホローファイバー、管状膜、スパイラルいずれの形式でも用いることができる。また、膜材質もポリスルフォン、ポリオレフィン、ポリビニリデンジフルオライド、テフロン等の有機膜でも良いし、セラミック等の無機材質の膜でも良い。ＵＦの場合は、分画分子量1,000〜500,000程度の膜が実用的には便利であるし、ＭＦの場合には細孔径0.05〜1μm程度のものが適当である。
【００１７】
【実施例】
以下に、本発明の方法を実施例に基づいて詳細に説明する。
実施例１および実施例２の膜透過実験は米国Millipore社製Minitan moduleに同社製PTTK膜２枚（ＵＦ膜、分画分子量30,000）を設置して実施した。また、ＰＥＩはSIGMA社より購入した平均分子量50,000の50％ＰＥＩ溶液を純水で希釈して得られた10％溶液を使用した。
【００１８】
実施例１
国際特許出願公開WO95/16042の実施例に記載の方法に従い、エシェリヒア・コリB-399株にプラスミドRSFD80を導入したB-399/RSFD80株を用い、Ｌ−リジンを生産した。培養は以下の生産培地を用い、培養時間48時間、温度37゜Cの条件下、撹拌114〜116ｒｐｍで行った。
【００１９】
（Ａ：Ｂを４：１で混合し、1Ｌに対してＣを30g加えて溶解し、抗生物質（ストレプトマイシン 100μg/ml、カナマイシン5μg/ml）を加え、生産培地とした。） 培養終了時のＬ−リジンの生産量は、リジン塩酸塩として9.2g/Lであった。
【００２０】
このようにして得られたリジン発酵液各300mlに前記10％ＰＥＩ溶液をそれぞれ0.32g、0.91g、1.6g添加後、98％硫酸でpH4.0に調整し、60℃で20分撹拌しながら加熱した。各ＰＥＩ溶液添加後の発酵液中のＰＥＩ濃度は、それぞれ約100、300、500ppmである。
【００２１】
上記処理後の各発酵液を膜透過実験に使用した。膜透過実験は、処理後の各発酵液を50℃に保持したまま、1000ml/分の速度で上記のＵＦ除菌設備に給液し、平均圧力0.9kg-f/cm2で実施した。透過時間30分経過までの透過速度の経時変化を測定したところ、図１に示す結果が得られた。
【００２２】
図１より明らかなようにE. coli発酵液においては膜除菌初期（開始後5分以内）の段階で急激な膜透過速度の低下が起こり以後次第に安定化する。30分経過時点での膜透過速度を比較すると、ＰＥＩ添加により無添加の場合に比べ最大４倍程度にまで向上することが分かる。また透過速度の向上は100ppm程度のＰＥＩ添加でも顕著であり、２倍程度に向上した。
【００２３】
実施例２
欧州特許公開685555号もしくは日本特許公開公報特開平08-047397の実施例に記載のエシェリヒア・コリAJ12919株をＬ−イソロイシン生産に用いた。バクトトリプトン1%、酵母エキス0.5%、NaCl0.5%、寒天1.5%、ストレプトマイシン100μg/ml、アンピシリン100μg/mlからなる培地にAJ12919株を塗布し、37゜Cで18ないし24時間培養後、その一部を白金耳で300mlの発酵培地（グルコース4%、硫酸アンモニウム1.6%、リン酸二水素カリウム0.1%、硫酸マグネシウム７水塩0.1%、硫酸第一鉄７水塩0.001%、硫酸マンガン５水塩0.001%、酵母エキス0.2%、炭酸カルシウム3%、pH7.0）に接種し、撹拌数400rpm、通気量300ml/minにて37゜Cで16時間培養して種培養液を得た。得られた種培養液をグルコース6%、硫酸アンモニウム1.6%、リン酸二水素カリウム0.1%、硫酸マグネシウム７水塩0.1%、硫酸第一鉄７水塩0.001%、硫酸マンガン５水塩0.001%、酵母エキス0.2%、pH7.0の組成の発酵培地に接種して、37゜C、通気量300ml/minにて、培地中の溶存酸素濃度が5％以上となるように撹拌数を制御しながら、グルコースを適宜供給し、アンモニアガスにてpH7.0付近に維持しつつ23時間培養を行った。培養終了時のＬ−イソロイシン蓄積量は37g/Lであった。
【００２４】
このようにして得られたＬ−イソロイシン発酵液を発酵終了時点で120℃で10分加熱後、塩酸でpH4.0に調整した。この処理済み発酵液300mlに10%ＰＥＩ溶液0.3gを添加後、再度60℃で20分間加熱した。対照として、ＰＥＩ無添加のまま60℃で20分間加熱した発酵液を用いた。膜透過実験は実施例１と同じ装置および条件で実施し、表１の結果が得られた。
【００２５】
【表１】
【００２６】
表１から明らかなようにイソロシン発酵液においても100ppmのＰＥＩ添加量で膜透過速度の向上が確認された。
【００２７】
実施例３
エシェリヒア属に属し、β−２−チエニルアラニン耐性を有し、Ｌ−ロイシンを生産する能力を持つ、日本特許公報特公昭62-34397に記載のエシェリヒア・コリ株（FERM-P 5274)に日本特許公開公報特開平8-70879の実施例１の方法に従って、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンによる変異処理を施した後、４−アザロイシンに耐性を有する菌株を釣菌分離し、Ｌ−ロイシン生産能力の向上した菌株を得た。
【００２８】
このようにして得られた菌株をグルコース5g/dL、(NH4)2SO4 2.5g/dL、KH2PO4 0.2 g/dL、MgSO4・7H2O 0.1g/dL、酵母エキス 0.05g/dL、サイアミン塩酸塩 1mg/L、FeSO4・7H2O 1mg/dL、MnSO4・4H2O 1mg/dL、炭酸カルシウム 2.5g/dLの組成を持つ、pH 7.0の水溶液培地を用い、31℃で72時間攪拌培養した。培養終了時のＬ−ロイシンの生産量は3.1g/Lであった。
【００２９】
発酵終了後、発酵液を300mlずつに分け、上述のSIGMA社製１０％PEI水溶液を添加しそれぞれPEI濃度が0, 200, 1000ppmになるように調整した。PEI濃度調整後、発酵液のpHを硫酸で4.0に調整し撹拌しながら60℃で30分間加熱処理した。
【００３０】
膜透過実験には旭化成社製ペンシル型モジュール（PSP-003、細孔径0.3μm、膜面積150cm2）を使用した。膜透過実験は循環流量約600ml/分、入口圧力1kg/cm2で実施し、60分の透過実験を行って図２の結果を得た。Ｌ−ロイシン発酵液においても本発明の方法により膜除菌時の大幅な透過速度の向上が達成された。
【００３１】
【発明の効果】
本文で明らかになったように、本発明の方法を用いれば、過大な付帯設備を要することなく容易に発酵液の膜透過速度を向上することが可能となり、膜除菌工程の効率を高めること及び除菌用膜分離設備の小型化が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】リジン発酵液のＵＦ濾過における透過速度の経時変化とＰＥＩ添加量との関係を示したものである。
【図２】ロイシン発酵液のＭＦ濾過における透過速度の経時変化とＰＥＩ添加量との関係を示したものである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、エシェリヒア属に属する微生物を培養して得られた発酵液の処理において菌体、菌体破砕物等の懸濁物質、または溶存高分子不純物を膜で除去するに際し、緩和な条件での前処理で膜透過流束を向上させる方法に関する。すなわち、膜閉塞物質を前処理し、膜除菌時の透過速度を著しく向上させ、処理時間の短縮、設備を極小化する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、遺伝子組変え菌体による発酵生産技術が進歩しており、遺伝子操作の容易な、エシェリヒア属に属するエシェリヒア・コリ（以下E. coliと略す。）がこの目的のためにしばしば利用されている。発酵終了時、目的生産物が菌体外にある場合は殺菌後、膜分離または遠心分離による除菌を行ない、得られた菌体除去液を次の処理工程に供するのが通常である。また、目的生産物が菌体内に存在する場合、凍結、ホモジナイザー、ミル等を用いて菌体を破砕してから膜分離または遠心分離による菌体、菌体破砕物の除去を実施する。
【０００３】
一般に膜分離の方が完全に菌体を除去でき、遠心分離に比べて清澄な除菌液を取得できるが、その透過速度が低いことから装置が大きくなるという欠点を持つ。除菌用の膜としては精密濾過膜（以下ＭＦと略す。）、限外濾過膜（以下ＵＦと略す。）等が一般的であるが、E. coliを培養して得られた発酵液（以下、E. coli発酵液と略す。）の場合、菌体の破砕の有無によらずその透過速度が低いことが問題となる。
【０００４】
従来、発酵液の膜除菌における透過流束の向上法としては、前処理法として発酵液の加熱処理が有効であることが知られている。例えば、日本特許公開公報特開昭57-91196には、イノシンまたはグアノシン発酵液をpH5.5〜9.0で90〜110℃に加熱処理することにより、限外濾過膜で菌体および高分子物質を分離する際の膜透過速度が向上することが記載されている。また、日本特許公開公報特開昭60-78588には、アミノ酸発酵液を50〜100℃で加熱処理することにより、限外濾過膜透過速度が向上することが記載されている。
【０００５】
しかしながら、前述したように、E. coli発酵液から膜を用いて除菌する場合、極めて低い透過速度のため過大な膜処理設備を要してしまう。また、pH調整と加熱操作の組み合わせによる前処理で透過速度を向上させることも可能ではあるが、E. coli発酵液に関しては、それほど効果的ではない。また、加熱処理はしばしば発酵液の着色や反応による微量不純物の副生を生じやすく、また目的物が熱的に不安定な場合には使用することができない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、エシェリヒア属に属する微生物を培養して得られた発酵液から菌体を膜を用いて分離する方法において、より緩和な前処理条件で膜透過速度を向上させる方法の開発が求められている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、エシェリヒア属に属する微生物を培養して得られた発酵液を膜濾過し、菌体、菌体破砕物等の懸濁物質または溶存高分子不純物を分離する方法において、発酵液にポリエチレンイミン（以下、ＰＥＩと略す。）を添加した後、膜濾過し、菌体を分離することを特徴とする膜除菌方法に関するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明に用いられるエシェリヒア属に属する微生物は、野生株または変異株のいずれでもよいし、細胞融合もしくは遺伝子操作などの遺伝学的手法により誘導される組み替え株等も用いることができる。エシェリヒア属に属する微生物としては、エシェリヒア・コリが挙げられる。これらの微生物の目的生産物は、本発明に用いられるＵＦ膜、ＭＦ膜を透過する物質であれば良く、例えば、リジン、グルタミン酸、イソロイシン、バリン、ロイシン等のアミノ酸、イノシン、グアノシン等の核酸、乳酸、リンゴ酸等の有機酸、ビタミン等を挙げることができる。
【０００９】
本発明に用いられる発酵液は、上記微生物を適当な培地で培養増殖せしめることにより、得ることができる。そのような培地には格別の制限はなく、通常の炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要に応じ有機栄養源を含む通常の培地でよい。培養は、特許国際出願公開WO95/16042、欧州特許公開685555号、日本特許公開公報特開平08-047397等に記載の方法で、上記微生物の生育に適した条件下、実施すればよい。
【００１０】
炭素源としては、上記微生物が利用可能であればいずれも使用でき、具体的には、グルコース、フルクトース、シュークロース、マルトース等の糖類、フマール酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸等の有機酸類及びこれらの塩類等を使用することができる。
【００１１】
窒素源としては上記微生物が利用可能であればいずれも使用でき、具体的には、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等の無機塩のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカー等の有機窒素化合物、あるいはこれらの混合物を使用することができる。
【００１２】
他に無機塩、微量金属塩、ビタミン類等、通常の培養に用いられる栄養源を適宜、混合して用いることができる。
【００１３】
ＰＥＩは、一般に水溶液として入手することが可能であるが、E. coli発酵液に添加または混入させる場合には、1〜50％水溶液として添加することがＰＥＩ水溶液の粘度上昇を押さえ取り扱い上、また添加による発酵液の希釈防止上有効である。添加方法としては例えば発酵終了時点で発酵液を攪拌しながら、10％ＰＥＩ溶液を所定量添加混合する方法等が挙げられるが、均一に混合できれば特に方法は問わない。
ＰＥＩ添加量は、E. coli発酵液に対し0.0005〜0.5重量％であり、好ましくは0.001〜0.05重量％である。
添加されるＰＥＩは水溶性であれば良く、その平均分子量は特に問わないが、10,000〜100,000程度のものが入手も容易で扱い易い。
【００１４】
ＰＥＩ添加後、膜分離処理を行えば、膜透過速度向上の効果を得ることができるが、更にＰＥＩ添加後のE. coli発酵液のpHを3〜9、好ましくは4〜7の範囲に調整することで、膜透過速度向上のより高い効果を得ることができる。ＰＥＩ添加後の発酵液のpHが中性付近の場合にはあらためてpH調整を実施する必要はないが、上記範囲でpH調整を実施することでより高い効果を得ることができる場合もあり必要に応じて実施することができる。
pH調整には、通常使用される塩酸、硫酸、燐酸等の酸、苛性ソーダ、苛性カリ、アンモニア等のアルカリを用いることができる。
【００１５】
また、ＰＥＩの添加前及び／または添加後に発酵液を加熱処理することも可能である。加熱条件としては、50〜130℃の温度、10〜20分の時間が適当である。加熱処理することにより、ＰＥＩの混合効率の向上、透過速度の向上が得られる。
【００１６】
使用する膜はＭＦでもＵＦでも構わない。膜装置としては平膜、ホローファイバー、管状膜、スパイラルいずれの形式でも用いることができる。また、膜材質もポリスルフォン、ポリオレフィン、ポリビニリデンジフルオライド、テフロン等の有機膜でも良いし、セラミック等の無機材質の膜でも良い。ＵＦの場合は、分画分子量1,000〜500,000程度の膜が実用的には便利であるし、ＭＦの場合には細孔径0.05〜1μm程度のものが適当である。
【００１７】
【実施例】
以下に、本発明の方法を実施例に基づいて詳細に説明する。
実施例１および実施例２の膜透過実験は米国Millipore社製Minitan moduleに同社製PTTK膜２枚（ＵＦ膜、分画分子量30,000）を設置して実施した。また、ＰＥＩはSIGMA社より購入した平均分子量50,000の50％ＰＥＩ溶液を純水で希釈して得られた10％溶液を使用した。
【００１８】
実施例１
国際特許出願公開WO95/16042の実施例に記載の方法に従い、エシェリヒア・コリB-399株にプラスミドRSFD80を導入したB-399/RSFD80株を用い、Ｌ−リジンを生産した。培養は以下の生産培地を用い、培養時間48時間、温度37゜Cの条件下、撹拌114〜116ｒｐｍで行った。
【００１９】
【００２０】
このようにして得られたリジン発酵液各300mlに前記10％ＰＥＩ溶液をそれぞれ0.32g、0.91g、1.6g添加後、98％硫酸でpH4.0に調整し、60℃で20分撹拌しながら加熱した。各ＰＥＩ溶液添加後の発酵液中のＰＥＩ濃度は、それぞれ約100、300、500ppmである。
【００２１】
上記処理後の各発酵液を膜透過実験に使用した。膜透過実験は、処理後の各発酵液を50℃に保持したまま、1000ml/分の速度で上記のＵＦ除菌設備に給液し、平均圧力0.9kg-f/cm2で実施した。透過時間30分経過までの透過速度の経時変化を測定したところ、図１に示す結果が得られた。
【００２２】
図１より明らかなようにE. coli発酵液においては膜除菌初期（開始後5分以内）の段階で急激な膜透過速度の低下が起こり以後次第に安定化する。30分経過時点での膜透過速度を比較すると、ＰＥＩ添加により無添加の場合に比べ最大４倍程度にまで向上することが分かる。また透過速度の向上は100ppm程度のＰＥＩ添加でも顕著であり、２倍程度に向上した。
【００２３】
実施例２
欧州特許公開685555号もしくは日本特許公開公報特開平08-047397の実施例に記載のエシェリヒア・コリAJ12919株をＬ−イソロイシン生産に用いた。バクトトリプトン1%、酵母エキス0.5%、NaCl0.5%、寒天1.5%、ストレプトマイシン100μg/ml、アンピシリン100μg/mlからなる培地にAJ12919株を塗布し、37゜Cで18ないし24時間培養後、その一部を白金耳で300mlの発酵培地（グルコース4%、硫酸アンモニウム1.6%、リン酸二水素カリウム0.1%、硫酸マグネシウム７水塩0.1%、硫酸第一鉄７水塩0.001%、硫酸マンガン５水塩0.001%、酵母エキス0.2%、炭酸カルシウム3%、pH7.0）に接種し、撹拌数400rpm、通気量300ml/minにて37゜Cで16時間培養して種培養液を得た。得られた種培養液をグルコース6%、硫酸アンモニウム1.6%、リン酸二水素カリウム0.1%、硫酸マグネシウム７水塩0.1%、硫酸第一鉄７水塩0.001%、硫酸マンガン５水塩0.001%、酵母エキス0.2%、pH7.0の組成の発酵培地に接種して、37゜C、通気量300ml/minにて、培地中の溶存酸素濃度が5％以上となるように撹拌数を制御しながら、グルコースを適宜供給し、アンモニアガスにてpH7.0付近に維持しつつ23時間培養を行った。培養終了時のＬ−イソロイシン蓄積量は37g/Lであった。
【００２４】
このようにして得られたＬ−イソロイシン発酵液を発酵終了時点で120℃で10分加熱後、塩酸でpH4.0に調整した。この処理済み発酵液300mlに10%ＰＥＩ溶液0.3gを添加後、再度60℃で20分間加熱した。対照として、ＰＥＩ無添加のまま60℃で20分間加熱した発酵液を用いた。膜透過実験は実施例１と同じ装置および条件で実施し、表１の結果が得られた。
【００２５】
【表１】
表１から明らかなようにイソロシン発酵液においても100ppmのＰＥＩ添加量で膜透過速度の向上が確認された。
【００２７】
実施例３
エシェリヒア属に属し、β−２−チエニルアラニン耐性を有し、Ｌ−ロイシンを生産する能力を持つ、日本特許公報特公昭62-34397に記載のエシェリヒア・コリ株（FERM-P 5274)に日本特許公開公報特開平8-70879の実施例１の方法に従って、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンによる変異処理を施した後、４−アザロイシンに耐性を有する菌株を釣菌分離し、Ｌ−ロイシン生産能力の向上した菌株を得た。
【００２８】
このようにして得られた菌株をグルコース5g/dL、(NH4)2SO4 2.5g/dL、KH2PO4 0.2 g/dL、MgSO4・7H2O 0.1g/dL、酵母エキス 0.05g/dL、サイアミン塩酸塩 1mg/L、FeSO4・7H2O 1mg/dL、MnSO4・4H2O 1mg/dL、炭酸カルシウム 2.5g/dLの組成を持つ、pH 7.0の水溶液培地を用い、31℃で72時間攪拌培養した。培養終了時のＬ−ロイシンの生産量は3.1g/Lであった。
【００２９】
発酵終了後、発酵液を300mlずつに分け、上述のSIGMA社製１０％PEI水溶液を添加しそれぞれPEI濃度が0, 200, 1000ppmになるように調整した。PEI濃度調整後、発酵液のpHを硫酸で4.0に調整し撹拌しながら60℃で30分間加熱処理した。
【００３０】
膜透過実験には旭化成社製ペンシル型モジュール（PSP-003、細孔径0.3μm、膜面積150cm2）を使用した。膜透過実験は循環流量約600ml/分、入口圧力1kg/cm2で実施し、60分の透過実験を行って図２の結果を得た。Ｌ−ロイシン発酵液においても本発明の方法により膜除菌時の大幅な透過速度の向上が達成された。
【００３１】
【発明の効果】
本文で明らかになったように、本発明の方法を用いれば、過大な付帯設備を要することなく容易に発酵液の膜透過速度を向上することが可能となり、膜除菌工程の効率を高めること及び除菌用膜分離設備の小型化が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】リジン発酵液のＵＦ濾過における透過速度の経時変化とＰＥＩ添加量との関係を示したものである。
【図２】ロイシン発酵液のＭＦ濾過における透過速度の経時変化とＰＥＩ添加量との関係を示したものである。
Claims (5)
- エシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物を培養して得られた発酵液を膜濾過し、菌体を分離する方法において、発酵液にポリエチレンイミンを添加した後、膜濾過し、菌体を分離することを特徴とする膜除菌方法。
- エシェリヒア属に属する微生物を培養して得られた発酵液を膜濾過し、菌体を分離する方法において、発酵液にポリエチレンイミンを添加し、さらに発酵液のｐＨを３〜７に調整した後、菌体を膜分離することを特徴とする膜除菌方法。
- 使用する膜が限外濾過膜または精密濾過膜であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の膜除菌方法。
- ポリエチレンイミンの添加量が、発酵液に対し、0.0005〜0.5重量％であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１請求項に記載の膜除菌方法。
- ポリエチレンイミン添加前及び／または添加後に発酵液を５０〜１３０℃に加熱することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１請求項に記載の膜除菌方法。
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