JPH052313B2 - - Google Patents
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は発酵法によりＬ−フエニルアラニン
（以下単にフエニルアラニンという。）の製造法に
関する。 従来、発酵法によりフエニルアラニンの製造法
としては、ブレビバクテリウム属又はミクロコツ
カス属細菌のＬ−チロシン要求菌を使用する方法
（特公昭37−6345）、生育にＬ−チロシンば要求し
かつ５−メチルトリプトフアンに耐性を有する変
異株を使用する方法（特公昭51−21079）、フエニ
ルアラニンアナログに耐性を有する変異株を使用
する方法（特開昭50−123878、特開昭51−
28712）、更にはデコイニン感受性株を使用する方
法（特公昭56−64793）等が知られている。 本発明者等は更にフエニルアラニン生産性の高
いフエニルアラニン生産菌を育種することを目的
として鋭意研究を重ねた結果、チロシル−グルタ
ミン酸の存在下でフエニルアラニンアナログに耐
性を有する菌株の中にフエニルアラニン生産性の
著しく高い菌株が多数存在することを発見した。
本発明はこの発見に基いて完成されたものであ
る。即ち、本発明はブレビバクテリウム属又はコ
リネバクテリウム属に属し、Ｌ−チロシン要求性
を有し、チロシル−グルタミン酸の存在下でフエ
ニルアナログ又はチロシンアナログに耐性を有
し、かつフエニルアラニン生産能を有する微生物
を培養して培養中にフエニルアラニンを生成、蓄
積せしめ、該フエニルアラニンを採取することを
特徴とする発酵法によるフエニルアラニンの製造
法に係るものである。本発明で用いられる微生物
はブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム
属に属しＬ−チロシン要求性を有し、チロシル−
グルタミン酸の存在下でフエニルアラニンアナロ
グ又はチロシンアナログ、特に2000μｇ／ml以上
のフエニルアラニンアナログに耐性を有しかつフ
エニルアラニン生産能を有する変異株であり、具
体的には次の変異株が代表例として挙げられる。
（以下単にフエニルアラニンという。）の製造法に
関する。 従来、発酵法によりフエニルアラニンの製造法
としては、ブレビバクテリウム属又はミクロコツ
カス属細菌のＬ−チロシン要求菌を使用する方法
（特公昭37−6345）、生育にＬ−チロシンば要求し
かつ５−メチルトリプトフアンに耐性を有する変
異株を使用する方法（特公昭51−21079）、フエニ
ルアラニンアナログに耐性を有する変異株を使用
する方法（特開昭50−123878、特開昭51−
28712）、更にはデコイニン感受性株を使用する方
法（特公昭56−64793）等が知られている。 本発明者等は更にフエニルアラニン生産性の高
いフエニルアラニン生産菌を育種することを目的
として鋭意研究を重ねた結果、チロシル−グルタ
ミン酸の存在下でフエニルアラニンアナログに耐
性を有する菌株の中にフエニルアラニン生産性の
著しく高い菌株が多数存在することを発見した。
本発明はこの発見に基いて完成されたものであ
る。即ち、本発明はブレビバクテリウム属又はコ
リネバクテリウム属に属し、Ｌ−チロシン要求性
を有し、チロシル−グルタミン酸の存在下でフエ
ニルアナログ又はチロシンアナログに耐性を有
し、かつフエニルアラニン生産能を有する微生物
を培養して培養中にフエニルアラニンを生成、蓄
積せしめ、該フエニルアラニンを採取することを
特徴とする発酵法によるフエニルアラニンの製造
法に係るものである。本発明で用いられる微生物
はブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム
属に属しＬ−チロシン要求性を有し、チロシル−
グルタミン酸の存在下でフエニルアラニンアナロ
グ又はチロシンアナログ、特に2000μｇ／ml以上
のフエニルアラニンアナログに耐性を有しかつフ
エニルアラニン生産能を有する変異株であり、具
体的には次の変異株が代表例として挙げられる。
【表】
これら本発明の変異株は、ブレビバクテリウム
属又はコリネバクテリウム属のフエニルアラニン
生産菌を親株として、これに通常の変異誘導操
作、例えば紫外線、Ｘ線照射あるいはＮ−メチル
−N′-−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NG
と略す）亜硝酸等の薬剤処理を施し、変異処理し
た菌体をチロシル−グルタミン酸及び親株が生育
できない量のフエニルアラニンアナログ又はチロ
シンアナログを含有する寒天平板培地で培養し、
該平板培地に成生するコロニーを分離することに
よつて得られる。 上記ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリ
ウム属のフエニルアラニン生産菌は公知のものを
使用すれば良いが、具体例としては次のような変
異株が使用される。
属又はコリネバクテリウム属のフエニルアラニン
生産菌を親株として、これに通常の変異誘導操
作、例えば紫外線、Ｘ線照射あるいはＮ−メチル
−N′-−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NG
と略す）亜硝酸等の薬剤処理を施し、変異処理し
た菌体をチロシル−グルタミン酸及び親株が生育
できない量のフエニルアラニンアナログ又はチロ
シンアナログを含有する寒天平板培地で培養し、
該平板培地に成生するコロニーを分離することに
よつて得られる。 上記ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリ
ウム属のフエニルアラニン生産菌は公知のものを
使用すれば良いが、具体例としては次のような変
異株が使用される。
【表】
親株としてはこの他、ブレビバクテリウム属又
はコリネバクテリウム属の微生物特にグルタミン
酸生産性細菌として知られている微生物を使用す
ることができる。この場合には、グルタミン酸生
産性細菌にＬ−チロシン要求性及びフエニルアラ
ニン生産性を付与した後、チロシル−グルタミン
酸及びフエニルアラニンアナログを含有する培地
で成育する変異株を誘導すれば良い。このような
親株の例としては、ブレビバクテリウム・デバリ
カタムATCC14020、ブレビバクテリウム・ラク
トフエルメンタムATCC13869、ブレビバクテリ
ウム・ロゼウムATCC14066、コリネバクテリウ
ム・アセトアシドフイラムATCC13870、コリネ
バクテリウム・アセトグルタミクムATCC15806、
コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032
等が使用される。 上記チロシルーグルタミン酸はＬ−チロシンと
異りフエニルアラニンアナログ又はチロシンアナ
ログと拮抗しないので、これらアナログの存在下
であつてもＬ−チロシン要求性のフエニルアラニ
ン生産菌の菌体に良好に取り込まれ、該フエニル
アラニン生産菌のＬ−チロシン要求性を満足せし
めることができる。このようなＬ−チロシン源と
なるものはチロシル−グルタミン酸の他にチロシ
ル−アラニン、チロシル−グリシン、チロシル−
ロイシン、チロシル−グリシル−グリシン、チロ
シル−チロシル−チロシン等Ｌ−チロシンのオリ
ゴペプチドが有り、チロシル−グルタミン酸の代
りにこれらのチロシンのオリゴペプチドを用いる
こともできる。 本発明でいうフエニルアラニンアナログとはブ
レビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属の
微生物の生育を阻害するが、この生育阻害がフエ
ニルアラニン（又はＬ−チロシン）の存在によつ
て部分的又は完全に解除されるような化合物をい
い、例としては、例えば、Ｏ−、ｍ−又はｐ−フ
ルオロフエニルアラニン、ｏ−、ｍ−、又はｐ−
アミノフエニルアラニン、β−フエニルセリン、
シクロヘキシルアラニン、α−アミノ−β−フエ
ニルエタンスルフオン酸、ｏ−、ｍ−、又はｐ−
ブロモフエニルアラニン、β−２又はβ−３−チ
エニルアラニン、β−２−ピロールアラニン、１
−シクロペンテン−１−アラニン、１−シクロヘ
キセン−１−アラニン、２−アミノ−４−メチル
−ヘキセン酸、ｓ−（１、２−ジクロルビニル）−
システイン、β−４−ピリジルアラニン、β−２
−ピリジルアラニン、β−４−ピラゾールアラニ
ン、ｐ−ニトロフエニルアラニン等が挙げられ
る。チロシンアナログは上記フエニルアラニンア
ナログと明確に区別されず、例えば、ｐ−フルオ
ロフエニルアラニンはチロシン、フエニルアラニ
ンの何れのアナログとして作用する。その他チロ
シンアナログとしては３−アミノチロシン、３−
フルオロチロシン、３−ハイドロキシチロシン、
３−ニトロチロシン等が挙げられる。 次に本発明で使用する変異株の変異誘導法及び
薬剤に対する耐性度を以下の実験例にて示す。 実験例 １ ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
ATCC13869より誘導したＬ−チロシン要求性の
フエニルアラニン生産菌AJ3435FERM−P1912
をイースとフイヨン寒天斜面培地で培養し、生育
した菌体を集めて1/50Ｍリン酸緩衝液（PH7.0）
に懸濁した（108〜109個／ml菌体を含む）。この
懸濁液にNGを加え（濃度は200μｇ／ml）、室温
に40分間保持した。このようにしてNG変異処理
した菌体を同リン酸緩衝液で充分洗浄した後、ｐ
−フルオロフエニルアラニンを2000μｇ／ml含む
最小寒天平板培地（第１表）に塗布し、31.5℃で
３〜７日間培養した。
はコリネバクテリウム属の微生物特にグルタミン
酸生産性細菌として知られている微生物を使用す
ることができる。この場合には、グルタミン酸生
産性細菌にＬ−チロシン要求性及びフエニルアラ
ニン生産性を付与した後、チロシル−グルタミン
酸及びフエニルアラニンアナログを含有する培地
で成育する変異株を誘導すれば良い。このような
親株の例としては、ブレビバクテリウム・デバリ
カタムATCC14020、ブレビバクテリウム・ラク
トフエルメンタムATCC13869、ブレビバクテリ
ウム・ロゼウムATCC14066、コリネバクテリウ
ム・アセトアシドフイラムATCC13870、コリネ
バクテリウム・アセトグルタミクムATCC15806、
コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032
等が使用される。 上記チロシルーグルタミン酸はＬ−チロシンと
異りフエニルアラニンアナログ又はチロシンアナ
ログと拮抗しないので、これらアナログの存在下
であつてもＬ−チロシン要求性のフエニルアラニ
ン生産菌の菌体に良好に取り込まれ、該フエニル
アラニン生産菌のＬ−チロシン要求性を満足せし
めることができる。このようなＬ−チロシン源と
なるものはチロシル−グルタミン酸の他にチロシ
ル−アラニン、チロシル−グリシン、チロシル−
ロイシン、チロシル−グリシル−グリシン、チロ
シル−チロシル−チロシン等Ｌ−チロシンのオリ
ゴペプチドが有り、チロシル−グルタミン酸の代
りにこれらのチロシンのオリゴペプチドを用いる
こともできる。 本発明でいうフエニルアラニンアナログとはブ
レビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属の
微生物の生育を阻害するが、この生育阻害がフエ
ニルアラニン（又はＬ−チロシン）の存在によつ
て部分的又は完全に解除されるような化合物をい
い、例としては、例えば、Ｏ−、ｍ−又はｐ−フ
ルオロフエニルアラニン、ｏ−、ｍ−、又はｐ−
アミノフエニルアラニン、β−フエニルセリン、
シクロヘキシルアラニン、α−アミノ−β−フエ
ニルエタンスルフオン酸、ｏ−、ｍ−、又はｐ−
ブロモフエニルアラニン、β−２又はβ−３−チ
エニルアラニン、β−２−ピロールアラニン、１
−シクロペンテン−１−アラニン、１−シクロヘ
キセン−１−アラニン、２−アミノ−４−メチル
−ヘキセン酸、ｓ−（１、２−ジクロルビニル）−
システイン、β−４−ピリジルアラニン、β−２
−ピリジルアラニン、β−４−ピラゾールアラニ
ン、ｐ−ニトロフエニルアラニン等が挙げられ
る。チロシンアナログは上記フエニルアラニンア
ナログと明確に区別されず、例えば、ｐ−フルオ
ロフエニルアラニンはチロシン、フエニルアラニ
ンの何れのアナログとして作用する。その他チロ
シンアナログとしては３−アミノチロシン、３−
フルオロチロシン、３−ハイドロキシチロシン、
３−ニトロチロシン等が挙げられる。 次に本発明で使用する変異株の変異誘導法及び
薬剤に対する耐性度を以下の実験例にて示す。 実験例 １ ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
ATCC13869より誘導したＬ−チロシン要求性の
フエニルアラニン生産菌AJ3435FERM−P1912
をイースとフイヨン寒天斜面培地で培養し、生育
した菌体を集めて1/50Ｍリン酸緩衝液（PH7.0）
に懸濁した（108〜109個／ml菌体を含む）。この
懸濁液にNGを加え（濃度は200μｇ／ml）、室温
に40分間保持した。このようにしてNG変異処理
した菌体を同リン酸緩衝液で充分洗浄した後、ｐ
−フルオロフエニルアラニンを2000μｇ／ml含む
最小寒天平板培地（第１表）に塗布し、31.5℃で
３〜７日間培養した。
【表】
平板上に生育したコロニーのうち大きなものを
ｐ−フルオロフエニルアラニン耐性株として採取
した。このようにして得られた耐性株の内には親
株よりフエニルアラニン生産能の著しく優れたも
のが多く見い出された。この内生産能の最も高い
菌株AJ11956を選んだ。同様の変異誘導操作によ
り、特公昭51−21079号公報記載のＬ−チロシン
要求性、５−メチルトリプトフアン耐性かつｐ−
フルオロフエニルアラニン耐性株であるブレビバ
クテリウム・ラクトフエルメンタムAJ3437を親
株とし更にフエニルアラニン生産能の高い
AJ11957を得た。一方、特公昭51−28712号公報
記載のｐ−フルオロフエニルアラニン耐性株であ
るコリネバクテリウム・アセトアシドフイラム
AJ3244を親株とし、これにＬ−チロシン要求性
を付与した後、同様の方法でｐ−フルオロフエニ
ルアラニン耐性株を誘導し、その内からAJ11958
を得た。なお、公知のｐ−フルオロフエニルアラ
ニン耐性株であるブレビバクテリウム・ラクトフ
エルメンタムAJ3437及びコリネバクテリウム・
アセトアシドフイラムAJ3244は、それぞれ1000μ
ｇ／ml及び1200μｇ／mlの濃度のｐ−フルオロフ
エニルアラニンに耐性を有することが特公昭51−
21079号公報及び特公昭51−28712号公報に記載さ
れている。 実験例 ２ 第２表に示す濃度のｐ−フルオロフエニルアラ
ニンを含む第１表の液体培地を試験管に4.0ml宛
分注し加熱殺菌した。これに上記変異株を１白金
耳宛接種し3.15℃にて24時間振等盪培養した。こ
の培養液を水で26倍に希釈し、その562nmに於け
る吸光度を測定して生育度を求めた。その結果を
第２表に示す。尚、第２表には薬剤無添加時の生
育度を100とする相対生育値を示した。
ｐ−フルオロフエニルアラニン耐性株として採取
した。このようにして得られた耐性株の内には親
株よりフエニルアラニン生産能の著しく優れたも
のが多く見い出された。この内生産能の最も高い
菌株AJ11956を選んだ。同様の変異誘導操作によ
り、特公昭51−21079号公報記載のＬ−チロシン
要求性、５−メチルトリプトフアン耐性かつｐ−
フルオロフエニルアラニン耐性株であるブレビバ
クテリウム・ラクトフエルメンタムAJ3437を親
株とし更にフエニルアラニン生産能の高い
AJ11957を得た。一方、特公昭51−28712号公報
記載のｐ−フルオロフエニルアラニン耐性株であ
るコリネバクテリウム・アセトアシドフイラム
AJ3244を親株とし、これにＬ−チロシン要求性
を付与した後、同様の方法でｐ−フルオロフエニ
ルアラニン耐性株を誘導し、その内からAJ11958
を得た。なお、公知のｐ−フルオロフエニルアラ
ニン耐性株であるブレビバクテリウム・ラクトフ
エルメンタムAJ3437及びコリネバクテリウム・
アセトアシドフイラムAJ3244は、それぞれ1000μ
ｇ／ml及び1200μｇ／mlの濃度のｐ−フルオロフ
エニルアラニンに耐性を有することが特公昭51−
21079号公報及び特公昭51−28712号公報に記載さ
れている。 実験例 ２ 第２表に示す濃度のｐ−フルオロフエニルアラ
ニンを含む第１表の液体培地を試験管に4.0ml宛
分注し加熱殺菌した。これに上記変異株を１白金
耳宛接種し3.15℃にて24時間振等盪培養した。こ
の培養液を水で26倍に希釈し、その562nmに於け
る吸光度を測定して生育度を求めた。その結果を
第２表に示す。尚、第２表には薬剤無添加時の生
育度を100とする相対生育値を示した。
【表】
尚、第１表に示すフエニルアラニン生産菌を、
チロシル−グルタミン酸の代りにＬ−チロシンを
含む培地を用いて同様の方法で培養した場合、ｐ
−フルオロフエニルアラニンの濃度が2.0mg／ml
以上になるといずれの菌株も生育しなかつた。こ
のことは、Ｌ−チロシンを用いる従来法では本発
明の変異株を育種することができないことを意味
するものである。本発明のアナログ耐性株とは、
上記実験例２に示す方法に於て2.0mg／ml以上の
アナログの存在下で良好に生育できる変異株を意
味する。 実験例 ３ 実施例１第３表に示すフエニルアラニン生産用
倍地を500ml要振盪フラスコに20ml宛分注し、加
熱殺菌後、別途乾熱殺菌した炭酸カルシウム粉末
1.0ｇを補添した。この培地にブレビバクテリウ
ム・ラクトフエルメンタムAJ3437及びAJ11957
の菌体をそれぞれ１白金耳接種し、30℃にて振盪
培養した。 24時間培養後、遠心分離により集菌し、得られ
た菌体を0.5mMジチオスレイトールを含む
50mMリン酸緩衝液（PH7.5）に懸濁し、超音波
発生装置により破砕した。これを遠心分離した上
清中の３−デオキシ−Ｄ−arabino−ヘプツロソ
ン酸７−リン酸合成酵素（DS）活性をP.R.
Srinivasan and D.B.Sprinsonの方法（ジヤーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第
234巻、716−722頁、1959年）により測定した。
Ｌ−フエニルアラニン1mM及び／又はＬ−チロ
シン1mM存在下においても測定を行い、DS活性
に対するフイードバツク阻害効果を調べた。 その結果、Ｌ−フエニルアラニン及びＬ−チロ
シン非存在下でのDS活性の値を100とした時の相
対活性として、公知のフエニルアラニン生産菌で
あるAJ3437においてはＬ−フエニルアラニン単
独存在下で94、Ｌ−チロシン単独存在下で68、Ｌ
−フエニルアラニン及びＬ−チロシン存在下で40
であり阻害効果が認められたのに対して、本発明
のアナログ耐性株であるAJ11957においてはそれ
ぞれ100、91、93でありほとんど阻害は認められ
なかつた。このことは、DSの脱感作がAJ3437に
おいては不完全であつたが、AJ11957ではほぼ完
全に脱感作されていることを示している。 また、同様にして経時的に菌体抽出液中のDS
活性及び蛋白量を測定し、比活性を求めた。いず
れの菌株も培養開始後40時間前後で最大の比活性
を示したが、最大値がAJ3427においては
25.1nmols／min／mg proteinであつたのに対
し、AJ11957では44.9nmols／min／mg protein
にまで上昇しており、AJ11957ではAJ3437に比
べてDSのリブレツシヨンも解除されていること
が判明した。 比較実験例 １ 実験例１と同様にして、ブレビバクテリウム・
ラクトフエルメンタムAJ3437のNG変異処理した
菌体を、第１表のチロル−グルタミン酸の代わり
にＬ−チロシンを100mg／ml含有し、ｐ−フルオ
ロフエニルアラニンを2000μｇ／ml添加した最小
寒天平板培地に塗布し、31.5℃で３〜７日間培養
した。平板上に生育したコロニーを採取し、計27
株を分離した。このようにして得られた菌株はい
ずれもPEPとの拮抗によりＬ−チロシンが取り
込まれなくても生育可能な変異株、すなわちＬ−
チロシン要求性が消失した復帰変異株であり、フ
エニルアラニン生産能は親株に比べてむしろ低下
していた。 本発明で使用する培地は炭素源、無機塩類及び
Ｌ−チロシンを含み、その他必要に応じてアミノ
酸、ビタミン、該酸等の有機微量栄養素を含有す
る通常の栄養培地が使用される。炭素源としては
使用する変異株の利用可能なものであれば良く、
例えばグルコース、フラクトース、シユークロー
ス、マルトース、澱粉分解物糖蜜等の糖類が使用
され、その他、エタノール、プロパノール等のア
ルコール類、酢酸、クエン酸等の有機酸類、更に
菌株によつてはノルマルパラフイン等も単独ある
いは他の炭素源と併用して使用される。 窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム
塩、硝酸塩、尿素、アンモニア、肉エキス等無機
あるいは有機の窒素源が使用される。有機微量栄
養素としてはアミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核
酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザ
ミノ酸、酵母エキス、蛋白分解物等が使用され、
生育にＬ−チロシン以外のアミノ酸等を要求する
栄養要求性変異株を使用する場合には要求される
栄養素を補添することが必要である。無機塩類と
してはKH2PO4、MgSO4、MnSO4、FeSO4等が
適宜添加される。 培養は好気的条件で行うことが望ましく、培養
期間中培地のPHを５ないし９、温度を20℃ないし
40℃に制後しつつ１日ないし４日間振盪培養又は
通気撹拌培養することによりフエニルアラニンが
著量培養液中に蓄積される。培養液からフエニル
アラニンを採取する方法は公知の方法に従つて行
えばよく、培養液から菌体を分離除去した後、濃
縮晶析する方法あるいはイオン交換樹脂を用いる
方法等により採取される。 以下、実施例にて説明する。 実施例 １ 下記第３表に示すフエニルアラニン生産用培地
を調整し、500ml要振盪フラスコに20ml宛分注し、
120℃で10分間加熱滅菌した。これに別途加熱殺
菌した炭酸カルシウム粉末1.0ｇを補添した。
チロシル−グルタミン酸の代りにＬ−チロシンを
含む培地を用いて同様の方法で培養した場合、ｐ
−フルオロフエニルアラニンの濃度が2.0mg／ml
以上になるといずれの菌株も生育しなかつた。こ
のことは、Ｌ−チロシンを用いる従来法では本発
明の変異株を育種することができないことを意味
するものである。本発明のアナログ耐性株とは、
上記実験例２に示す方法に於て2.0mg／ml以上の
アナログの存在下で良好に生育できる変異株を意
味する。 実験例 ３ 実施例１第３表に示すフエニルアラニン生産用
倍地を500ml要振盪フラスコに20ml宛分注し、加
熱殺菌後、別途乾熱殺菌した炭酸カルシウム粉末
1.0ｇを補添した。この培地にブレビバクテリウ
ム・ラクトフエルメンタムAJ3437及びAJ11957
の菌体をそれぞれ１白金耳接種し、30℃にて振盪
培養した。 24時間培養後、遠心分離により集菌し、得られ
た菌体を0.5mMジチオスレイトールを含む
50mMリン酸緩衝液（PH7.5）に懸濁し、超音波
発生装置により破砕した。これを遠心分離した上
清中の３−デオキシ−Ｄ−arabino−ヘプツロソ
ン酸７−リン酸合成酵素（DS）活性をP.R.
Srinivasan and D.B.Sprinsonの方法（ジヤーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第
234巻、716−722頁、1959年）により測定した。
Ｌ−フエニルアラニン1mM及び／又はＬ−チロ
シン1mM存在下においても測定を行い、DS活性
に対するフイードバツク阻害効果を調べた。 その結果、Ｌ−フエニルアラニン及びＬ−チロ
シン非存在下でのDS活性の値を100とした時の相
対活性として、公知のフエニルアラニン生産菌で
あるAJ3437においてはＬ−フエニルアラニン単
独存在下で94、Ｌ−チロシン単独存在下で68、Ｌ
−フエニルアラニン及びＬ−チロシン存在下で40
であり阻害効果が認められたのに対して、本発明
のアナログ耐性株であるAJ11957においてはそれ
ぞれ100、91、93でありほとんど阻害は認められ
なかつた。このことは、DSの脱感作がAJ3437に
おいては不完全であつたが、AJ11957ではほぼ完
全に脱感作されていることを示している。 また、同様にして経時的に菌体抽出液中のDS
活性及び蛋白量を測定し、比活性を求めた。いず
れの菌株も培養開始後40時間前後で最大の比活性
を示したが、最大値がAJ3427においては
25.1nmols／min／mg proteinであつたのに対
し、AJ11957では44.9nmols／min／mg protein
にまで上昇しており、AJ11957ではAJ3437に比
べてDSのリブレツシヨンも解除されていること
が判明した。 比較実験例 １ 実験例１と同様にして、ブレビバクテリウム・
ラクトフエルメンタムAJ3437のNG変異処理した
菌体を、第１表のチロル−グルタミン酸の代わり
にＬ−チロシンを100mg／ml含有し、ｐ−フルオ
ロフエニルアラニンを2000μｇ／ml添加した最小
寒天平板培地に塗布し、31.5℃で３〜７日間培養
した。平板上に生育したコロニーを採取し、計27
株を分離した。このようにして得られた菌株はい
ずれもPEPとの拮抗によりＬ−チロシンが取り
込まれなくても生育可能な変異株、すなわちＬ−
チロシン要求性が消失した復帰変異株であり、フ
エニルアラニン生産能は親株に比べてむしろ低下
していた。 本発明で使用する培地は炭素源、無機塩類及び
Ｌ−チロシンを含み、その他必要に応じてアミノ
酸、ビタミン、該酸等の有機微量栄養素を含有す
る通常の栄養培地が使用される。炭素源としては
使用する変異株の利用可能なものであれば良く、
例えばグルコース、フラクトース、シユークロー
ス、マルトース、澱粉分解物糖蜜等の糖類が使用
され、その他、エタノール、プロパノール等のア
ルコール類、酢酸、クエン酸等の有機酸類、更に
菌株によつてはノルマルパラフイン等も単独ある
いは他の炭素源と併用して使用される。 窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム
塩、硝酸塩、尿素、アンモニア、肉エキス等無機
あるいは有機の窒素源が使用される。有機微量栄
養素としてはアミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核
酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザ
ミノ酸、酵母エキス、蛋白分解物等が使用され、
生育にＬ−チロシン以外のアミノ酸等を要求する
栄養要求性変異株を使用する場合には要求される
栄養素を補添することが必要である。無機塩類と
してはKH2PO4、MgSO4、MnSO4、FeSO4等が
適宜添加される。 培養は好気的条件で行うことが望ましく、培養
期間中培地のPHを５ないし９、温度を20℃ないし
40℃に制後しつつ１日ないし４日間振盪培養又は
通気撹拌培養することによりフエニルアラニンが
著量培養液中に蓄積される。培養液からフエニル
アラニンを採取する方法は公知の方法に従つて行
えばよく、培養液から菌体を分離除去した後、濃
縮晶析する方法あるいはイオン交換樹脂を用いる
方法等により採取される。 以下、実施例にて説明する。 実施例 １ 下記第３表に示すフエニルアラニン生産用培地
を調整し、500ml要振盪フラスコに20ml宛分注し、
120℃で10分間加熱滅菌した。これに別途加熱殺
菌した炭酸カルシウム粉末1.0ｇを補添した。
【表】
この培地に第４表に示すフエニルアラニン生産
菌を１白金耳接種し、30℃で72時間振盪培養し
た。培養液中のフエニルアラニン生成量を測定
し、その結果を第４表に示した。
菌を１白金耳接種し、30℃で72時間振盪培養し
た。培養液中のフエニルアラニン生成量を測定
し、その結果を第４表に示した。
Claims (1)
- １ ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウ
ム属に属し、Ｌ−チロシン要求性を有し、チロシ
ル−グルタミン酸の存在下で2000μｇ／ml以上の
濃度のフエニルアラニンアナログ又はチロシンア
ナログに耐性を有するがチロシル−グルタミン酸
の代りにＬ−チロシンを含む培地では該耐性を有
せず、かつＬ−フエニルアラニン生産能を有する
微生物を培地中で培養し培養液中にＬ−フエニル
アラニンを生成、蓄積せしめ、これを採取するこ
とを特徴とする発酵法によるＬ−フエニルアラニ
ンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14565382A JPS5934893A (ja) | 1982-08-23 | 1982-08-23 | 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14565382A JPS5934893A (ja) | 1982-08-23 | 1982-08-23 | 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5934893A JPS5934893A (ja) | 1984-02-25 |
| JPH052313B2 true JPH052313B2 (ja) | 1993-01-12 |
Family
ID=15389984
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14565382A Granted JPS5934893A (ja) | 1982-08-23 | 1982-08-23 | 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5934893A (ja) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5610035A (en) * | 1979-06-30 | 1981-02-02 | Tokyo Shibaura Electric Co | Method of supplying current to electric device |
| JPS5717519A (en) * | 1980-07-04 | 1982-01-29 | Omron Tateisi Electronics Co | Dip switch |
-
1982
- 1982-08-23 JP JP14565382A patent/JPS5934893A/ja active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5610035A (en) * | 1979-06-30 | 1981-02-02 | Tokyo Shibaura Electric Co | Method of supplying current to electric device |
| JPS5717519A (en) * | 1980-07-04 | 1982-01-29 | Omron Tateisi Electronics Co | Dip switch |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5934893A (ja) | 1984-02-25 |
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