SU583641A1 - Способ получени -лейцина - Google Patents

Description

1

Изобретение относитс  к способу получени  L-лейцина при выраодивании продуцирующих его микроорганизмов на питательной среде в микробиологической промышленности и используетс  также в качестве питательной добавки к пиш.евым продуктам и корму животных и как компонент питательных смесей и реактивов в медицине, фармацевтической и химической промышленности .

Известны способы получени  L-дейцина путем вырашивани  продуцирующих его микроорганизмов из рода Brevibacterium и Соrynebacterium 1, 2.

В этих способах в качестве продуцентов L-лейцина примен ют мутантные цлтаммы микроорганизмов Сог. glutamicum, Вг. flavum , Сог. acetoacidophilum, Br. lactofermentum , генетические свойства которых обеспечивают сверхсинтез L-лейцина и накопление его в питательной среде, а именно: относительную потребность дл  роста в изолейцине , метионине, фенилаланине, валине или их смеси; резистентность к антагонистам лейцина , в частности 2-тиазолаланину и 4-алазейцину; сочетание потребности дл  роста в треонине, изолейцине и метионине с резистентностью к ретроингибированию лейцином и его антагонистами, в частносги 2-тиазолаланпном и /(-окснлейцином, фермента 1 а-изопропилмалатсинтетазы .

При получении указанных мутантных штаммов в качестве исходных штаммов были использованы штаммы дикого типа, известные как продуценты глутаминовой кислоты .

Уровень накоплени  L-лейцина известными штаммами составл ет 4-22,1 г/л, причем наиболее продуктивными  вл ютс  мутанты , отселекционированные антагонистами лейцина, синтез которых сложен, а их стоимость значительна.

В известных способах в питательные среды необходимо в качестве источников роста донолнительно вводить различные гидролиаты белка, в частности соевой муки, микроб ной массы, казеина, а также экстракты дрожжей или печени.

Claims (3)

1. Наиболее близким решением к описываемому изобретению по технической сущности и достигаемому результату  вл етс  способ получени  L-лейцина нутем глубинного выращивани  продуцирующих его микроорганизмов Brevibacterium flavum на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода углеводы, источник азота, минеральные соли и источник ростовых веществ 3J. Однако такой способ сложен, так как требует использовани  допо;1нительного оборудовани  дл  гидролиза белковых продуктов , и дорогосто щий за счет использовани  в оелекции штамма-продуцента дорогих реактивов (антагонистов лейцина). С целью упрощени  и удешевлени  саособа предложено из микроорганизмов Brevibacterium flavum использовать штамм ВНИИгенетика-758, при селекции которого не примен ют антагонистов лейцина, а отбирают первичный продуцент среди ревертантов ,к гомосериннезависимости у штаммапродуцента-лизина и затем ввод т отобранному ревертанту мутацию зависимости от витамина Bia (или метиовина), что позвол ет при культивировании этого штамма и получении лейцина использовать в питательных средах в качестве источника ростовых веществ кормовой концентрат витамина В la или кормобактерин. Способ заключаетс  в следующем. Культуру 1птамма Brevibaeterium flavum ВНИИгенетика-758 выращивают на агаризованной среде Хот1ингера, зате.м выссиают в предварительно простерилизованиые вместе со средой колбы на м сопептонный бульон дл  выращивани  посевного :,1атериала . После засева культуры колбы устанавливают на круговой качалке с 220- 240 об/мин при 30°С. Готовый посевной материал внос т в колбы с ферментационной средой, содержащей ИСТОЧ1И1КИ углерода, азота, ростовых веществ и минеральные соли, при этом в качестве источника ростовых веществ используют кормовой концентрат витамина В и и;т кор.мобактерин. Все комцонепть1 среды стерилизуют под давлением, рН среды довод т до заданной до и после стерилизации. Ферментацию провод т на указанной выще качалке при 30°С. После образовани  L-лейцина его содержание определ ют методом тонкослойной хроматографии на пластинах «Silufol. Пример 1. Культуру щтамма Brevibaeterium flavum ВНИИгенетика-758 выращивают 24 ч при 30°С на агаризованной среде Хоттингера, затем петлей высевают в колбы Эрленмейера емкостью 750 мл, содержащие 30-100 мл м со-пептонного бульона, включающего компоненты, вес. °/о: .м сна  вода и иептон 1,0; NaCl 0,5; сахароза 1,0. Колбы вместе со средой предварительно стерилизуют в автоклаве при 0,8 атм 30 мин. После засева культуры колбы устанавливают на круговую качалку с 220-240 об/мин и выращивают посевной материал 16 ч при 30°С. Готовый посевной материал внос т 3- 10% (но объему) в колбы Эрленмейера е.мкостью 750 мл, содержащие 30 мл ферментационной среды, состава, г/л: сахароза 100; (NH,).SO, 30; КН2РО4 1,5; MgSO4 0,5; CaC.Oj 40; биотип 100 мкг/.ч или дестибиотин 300 мкг/л; кормовой концентрат витамина В; г 5,0; водопрово.ана  вода. Все компоненты среды стери;тзуют при 0,8 атм 30 .мин, рН среды довод т после стерилизации стерилыц км 25%-ным растворо .м Н 7SO4 до 7,5. Ферментацию провод т на указанной выше качалке при 30°С. После 60 ч в культура.тьной жидкости образуетс  13,7 г/л L-лейцина, содержание которого определ ют методом тонкослойной хроматографии на пластинах «Silufol после разгоики в течение 1,2 ч в системе растворителей: этилацетат, изонропанол, а.ммиак, вода в соотношении 20:20:1,5-25 и обработки 0,5%-ным раствором нингидрина в ацетоне. Пример 2. Культурой щтам.ма-продуцента , выращенной на агаризованной среде согласно примеру 1, засевают колбы е.мкостью 750 мл, содержащие 30-100 мл посевной среды следующего состава, г/л: сахароза 30; (ЫН«)г5О; 15; КН,РО, 0,8; MgSO. 0,2; кукурузный экстракт 10 (по сырому весу); кормовой концентрат витамина Bi; 10; водопроводна  вода. рН среды до стерилизации довод т растворо.м NaOH до 7,6---7,8, стерилизацию среды п)овод т согласно примеру 1. рН среды после стерилизации 7,0 7,2. Посевной материал выращивают на качалке при 30°С 20 ч, засев ферментационных колб и ферментацию провод т на среде и при режиме согласно примеру 1. После 65 ч в культуральной жидкости образуетс  13,2 г/л L-лейцина, определ емого согласно методике примера 1. Пример 3. Выращивание посевного .материала провод т согласно примеру 1. В составе ферментационной среды по примеру 1 кор.мовой концентрат вита.мина Bi2 за.мен ют 5 г/л кормобактерина. Режим стери.лизации, засев фер.ментационных колб и услови  фер.ментации аналогичны примеру 1. После 72 ч культивировани  образуетс  10,0 г/л L-лейцина, который определ ют согласно методике примера 1. Пример 4. Выращивание посевного материала провод т по примеру 1. В составе ферментационной среды иримера 1 кормовой KOHLjcHTpaT витамина Bi замен ют на 100 мкг,л чистого препарата витамина Bj и 200 .мкг/л чистого препарата витамина Bi (тиамина). Все остальные услови  аналогичны примеру 1. Культивируют 72 ч, в культура;1ьной жидкости образуетс  10,9 г/л L-лейцина, определ е .мого по методике примера 1. Пример 5. Выращивание посевного ма,териала провод т согласно примеру 1. В составе ферментационной среды по примеру 1 кормовой концентрат витамина замен ют на 200 мкг/л витамина Bi и 300 мкг/л метионина. Все другие услови  аналогичны примеру 1. Культивируют 72 ч, получают 12,3 г/л L-лейцина в культуральной жидкости. Содержание лейцина определ ют согласно методике примера 1. Описываемый способ получени  L-лейцина по сравнению с известным дешев, так как не требует применени  дорогосто щих реактивов и вместо чистых препаратов витаминов BI и В 12 в питательных средах могут быть использованы сухие кормовые концентраты , например кормовой концентрат витамина Bi2 или кормобактерин, и метионин,  вл ющийс  продуктом химического синтеза и выпускаемого в качестве кормовой добавки дл  использовани  в животноводстве. Описываемый способ прост, так как не требует применени  оборудовани  дл  гидролиза белковых продуктов. 6 Формула изобретени  Способ получени  L-лейцина путем глубинного выращивани  продуцирующих его микроорганизмов Brevibacterium flavum на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода углеводы, источник азота , минеральные соли и источник ростовых веществ, отличающийс  тем, что, с целью упрощени  и удещевлени  способа, из микроорганизмов Brevibacterium flaum используют ВНИИгенетика-758, требующий дл  своего развити  витамин Biz или метионин, при этом в качестве источника ростовых веществ используют кормовой концентрат-витамина В|2 или кормобактерин. Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе: 1.Патент США № 3668073, кл. 195-29, 1972.
2. 2.Патент Франции № 2264088, кл. С 12 D 13/06, 1975.
3. 3. Патент США № 2264088, кл. С 12 D 13/06, 1975.