CN1155580A

CN1155580A - 通过膜从发酵肉汤中去除细胞的方法

Info

Publication number: CN1155580A
Application number: CN 96121049
Authority: CN
Inventors: 田边俊哉; 中村彻
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1995-10-13
Filing date: 1996-10-12
Publication date: 1997-07-30

Abstract

当从培养属于埃希氏杆菌属微生物而获得的发酵肉汤中通过使用膜分离细胞时，开发一种在较温和预处理条件下提高膜渗透率的方法。本发明涉及一种使用膜从上述提及发酵肉汤中除去细胞的方法，其特征在于向发酵肉汤中添加聚乙烯亚胺，然后通过膜分离细胞。与未进行本发明处理过程相比，本发明的方法可以使利用膜从发酵肉汤中除细胞的渗透率提高1.5-4.0倍。这使得不用大型设备而轻易提高膜渗透率并且提高膜渗透设备的效率成为可能。

Description

通过膜从发酵肉汤中去除细胞的方法

本发明涉及一种方法，即通过膜处理培养属于埃希氏杆菌属微生物所获得的发酵肉汤以去除细胞、细胞碎片或溶解的高分子杂质时，通过在温和条件下的预处理提高膜的渗透率。也就是说，本发明涉及一种方法，即预先处理使膜阻塞的物质，并且当通过膜除去细胞时提高膜的渗透率，由此缩短处理时间并使设备规模减至最小程度。

近些年，使用重组菌株技术生产发酵产品获得了进步，并为了这个目的常常使用便于遗传操作的大肠杆菌(此后简写作E.Coli)。当发酵完毕所需产品被分沁到细胞外部时，通常是在灭菌后通过膜分离或离心除去细胞，并且将得到的不含细胞的溶液拿去作下一步处理，当所需产品存在于细胞内部时，通过冷冻或使用均质机、研磨机等将细胞研碎，然后通过膜分离或离心除去细胞及细胞碎片。

一般来讲，与离心相比膜分离可以完全去除细胞、得到不含细胞的澄清溶液。但是，在膜分离时渗透率低时，则需要大型的设备。用于去除细胞的膜通常为微滤膜(此后简称作MF)、超滤膜(此后简称作UF)等等。但是，对于培养E Coli菌株获得的发酵肉汤(本文述为“E.Coli发酵肉汤)，这些膜的问题是无论怎样研磨其渗透率都低。

迄今人们早已知道在通过膜以发酵肉汤除去细胞的过程中，加热可以作为有效提高渗透率的预处理手段。例如，JP特许公开91,196/1982描述了当通过超滤膜分离细胞和高分子物质时，在90至110℃下加热处理PH值为5.5至9.0的次黄嘌呤核苷或乌嘌呤核苷发酵肉汤，提高膜的渗透率。此外，JP特许公开78,588/1985中描述了通过在50至100℃下加热氨基酸发醇肉汤提高超滤膜渗透率的方法。

但是，正如上面提到的那样，当通过膜从E.Coli发酵肉汤中去除细胞时，渗透率非常低需要大型膜处理设备。通过上述的方法包括调整PH及热处理E.Coli发酵肉汤也可能会提高渗透率。但是就E.Coli发酵肉汤而言，该方法并不那么有效。此外，不时地进行加热处理易引起发酵肉汤变色或者形成少量副产物杂质。还有当所需产品热不稳定时，该方法便不适用了。

因此，为了从培养属于埃希氏杆菌属微生物所得发酵肉汤中分离细胞，开发一种通过在较温和条件下的预处理过程以提高膜渗透率的方法已势在必需。

本发明涉及一种通过膜从培养属于埃希氏杆菌属微生物而获得的发酵肉汤中除去细胞、细胞碎片或溶解的高分子杂质以分离细胞等的方法，其特征在于向发酵肉汤中添加聚乙烯亚胺(此后简称作PEI)，然后通过膜过滤混合物分离出细胞等。

用于本发明的属于埃希氏杆菌属的微生物可以是野生菌株或者突变株。还可以使用细胞融合或遗传操作而诱导出的重组菌株。属于埃希氏杆菌属的微生物其中一个例子是大肠杆菌。该微生物可以产生能渗透过用于本发明的UF膜或MF膜的所需产物。这些产物的例子包括氨基酸如赖氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸；核酸如次黄嘌呤核苷和乌嘌呤核苷；有机酸如乳酸和苹果酸；以及维生素。

用于本发明的发酵肉汤可以通过在合适的培养基上培养上述微生物而制备。对培养基不作特别的限定，并且它可以是含有碳源、氮源、无机离子的普通培养基，还可以选择性地含有有机营养成分。发酵过程可以通过如W 095/16042、EP 0685,555或JP待许公开047,397/1996中描述的方法在适合于上述微生物生长的条件下进行。

只要适用于上述微生物的任何碳原都可以使用。碳原特定的例子包括糖，如葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖；有机酸，如富马酸、柠檬酸、乙酸和丙酸；以及它们的盐。

只要适用于上述微生物的任何氮源都可以使用。氮原特定的例子包括无机酸铵盐，如硫酸铵和氯化铵；有机酸铵盐，如富马酸铵和柠檬酸铵；硝酸盐，如硝酸钠和硝酸钾；有机氮化合物，如蛋白胨、酵母浸膏、肉浸膏和玉米浸泡液的浓缩液；以及它们的混合物。

若需要，可以使用常规发酵中所使用的营养源。营养源的例子包括无机盐、痕量金属盐和维生素。

一般情况下可以得到水溶液形式的PEI。但是，当把PEI加到E.Coli发酵肉汤中时，可行的方法是添加含有1至50％PEI的水溶液，从而控制PEI水溶液粘度的增加并防止稀释发酵肉汤。就添加PEI而言，发酵完毕时边搅拌发酵肉汤边加入预先定量的10％PEI水溶液。但对添加的方法不作特别的限定，只要能够获得均匀的混合物。

PEI的添加量介于0.0005和0.5％重量之间，基于E.Coli发酵肉汤，优选0.001和0.05％重量之间。

用来添加的PEI可以是水溶液，其平均分子量不作特别限定。容易获得且容易处理的PEI所具有的平均分子量大约从10,000至100,000。

当添加PEI之后进行膜分离时，膜的渗透率可以得到提高。此外，当添加完PEI之后将E.Coli发醇肉汤的PH值调至3-9，优选4-7时，膜的渗透率可以得到进一步提高。当添加完PEI后收酵肉汤的PH接近中性范围时，就没有必要再调整PH。但是，如果再调整PH至上述范围，那么经常会得到较高的膜渗透率。这样的话，可以按需要实施再调整PH的过程。

可以使用常规PH调节剂来调整PH值。其例包括酸，如盐酸、硫酸和磷酸；碱化合物，如氢氧化钠、氢氧化钾和氨。

在添加PEI之前或加PEI之后，发酵肉汤可以经加热处理。适宜的加热处理温度介于50至130℃间，且适宜的加热处理时间为10至20分钟。该加热处理过程能够提高PEI的混合效率以及渗透率。

所用的膜可以是MF，也可以是UF。可用的膜有平板膜、空心纤维膜、管膜或螺旋膜。膜材料可以是有机材料，如聚砜、聚烯烃、聚偏二氟乙烯或特氟隆；或者是无机材料如陶瓷。若使用UF，具有1,000至500,000分子量极限的膜实际很适用。若使用MF，具有0.05至1μm孔径的膜很合适。

实施例

以下有关实施例将对本发明作具体地阐述。

在实施例1和2中，膜渗透性的测试是通过在Millipore制造的Minitan组件上安置两个PTTK膜(Millipore，U.S.A.制造的UF膜，分子量极限30,000)进行的。此外，关于PEI，使用通过纯净水稀释具有50,000分子量的50％PEI溶液(Sigma制造)而获得的10％水溶液。实施例1

通过PCT申请WO 95/16042实施例中描述的方法，使用将质粒/RSFD80导入E.Coli B-399菌株获得的399/RSFD80菌株，生产L-赖氨酸。在37℃下使用，以下配方的培养基进行48小时的发酵，发酵的同时以114至116rpm的速率搅拌。

用于制备L-赖氨酸的培养基配方：

A：(NH₄)₂SO₄ 16g/l

KH₂PO₄ 1g/l

MgSO₄·7H₂O 1g/l

FeSO₄·7H₂O 0.01g/l

MnSO₄·5H₂O 0.01g/l

酵母浸膏(Difco) 2g/l

L-蛋氨酸 0.5g/l

用KOH调PH至7.0，且混合物在115℃下高

压灭菌10分钟(16/20体积)。

B：20％葡萄糖(115℃高压灭菌10分钟)(4/20体积)。

C：通过日本药典的CaCO₃(180℃干热灭菌2天)(30g/l)

(A和B以4∶1比例混合，C添加量为30g/l。混合物中加入抗生素(100μg/ml链霉素和5μg/ml卡那霉素)。使用所获得的混合物作为制备L-赖氨酸用的培养基)。

当发酵完毕，产生的L-赖氨酸浓度按盐酸赖氨酸计算为9.2g/l。

分别向每300ml如此获得的赖氨酸发醇肉汤添加0.32g、0.91g或1.6g上述10％的PEI溶液。用98％硫酸调节混合物的PH至4.0，并且加热至60℃同时搅拌20分钟。按上述量添加PEI后，发酵肉汤中PEI的浓度大约分别是100ppm、300ppm和500ppm。

将如此处理过的发酵肉汤拿来作膜渗透测试。这个膜渗透测试是这样进行的：将每份经上述处理的发酵肉汤以1,000ml/min的速率给入上述提及的UF组件，给入的同时保持发酵肉汤为50℃，并且在0.9kgf/cm²平均压力下将其渗透过膜。在整个30分钟时间的渗透过程中测定渗透率的变化。结果示于图1。

正如图1呈现的那样，当使用E.Coli发酵肉汤时，在除去细胞的开始阶段(开始后5分钟之内)膜渗透率陡然下降，后来逐渐稳定。就30分钟之后的渗透率相比，添加了PEI的渗透率最高是未添加PEI渗透率的4倍。可以明显观察到添加100ppm的PEI后渗透率的提高，这时，其渗透率是未添加PEI渗透率的2倍。实施例2

使用EP 0685,555或JP特许公开047,397/1996中描述的E.Coli AJ12919菌株制备L-异亮氨酸。AJ12919株生长在含有1％细菌胰蛋白胨、0.5％酵母浸膏、0.5％NaCl、1.5％琼脂、100μg/ml链霉素和100μg/mlα-氨基苄青霉素的培养基上，并在37℃下培养18至24小时。用白金圈在300ml发酵介质(含有4％葡萄糖、1.6％硫酸铵、0.1％磷酸二氢钾、0.1％七水硫酸镁、0.001％七水硫酸亚铁、0.001％五水硫酸锰、0.2％酵母浸膏和3％碳酸钙。PH7.0)中接种一部分肉汤，并且在37℃下以300ml/min透气率且400rpm搅拌培养16小时，获得种子培养肉汤。将得到的种子培养肉汤接种于含有6％葡萄糖、1.6％硫酸铵。0.1％磷酸二氨钾、0.1％七水硫酸镁、0.001％七水硫酸亚铁、0.001％五水硫酸锰、和2％酵母浸膏的发酵培养基(PH7.0)。葡萄糖要在37℃下以300ml/min透气率同时控制旋转量的条件下添入，以便使培养基中溶解氧的浓度达到5％或更多。混合物培养23小时同时用氨气保持PH在7.0左右。发酵完毕时L-异亮氨酸积累到37g/l的浓度。

当发酵完毕时，加热如此获得的L-异亮氨酸发酵肉汤至120℃，时间10分钟，并且用盐酸调节PH至4.0。向300ml如此处理过的发酵肉汤中添加0.3g10％PEI溶液，并重新加热混合物至60℃，时间20分钟。将60℃下加热20分钟未加入PEI的发酵肉汤作为对照样。按照实施例1同样的方式进行膜渗透测试。结果示于表1。

表1

渗透时间(分钟)	膜渗透率(l/m²·小时·(kgf/cm²)I
	膜渗透率(l/m²·小时·(kgf/cm²)I		未添加PEI	添加了PEI
	15102030	7560555048	未添加PEI	添加了PEI	9676696258

表1清楚地证明使用异亮氨酸发酵肉汤时，添加100ppm的PEI后膜渗透率也有提高。实施例3

用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍将属于埃希氏杆菌属、对β-2-噻吩丙氨酸有抗性且具产生L-亮氨酸能力的E.Coli FERM-P5274菌株(JP特许公开34,397/1987公开)作突变处理。除了突变株外，分离对4-氮杂亮氨酸有抗性的菌株，得到的菌株具有增进产生L-亮氨酸的能力。

如此获得的菌株在31℃下搅拌培养72小时，所用培养基(含有5g/dl葡萄糖·(NH₄)₂SO₄2.5g/dl，KH₂PO₄0.2g/dlMgSO₄7H₂O0.1g/dl、酵母浸膏0.05g/dl、维生素B1 1mg/L，FeSO₄·7H₂O1mg/dl，MnSO₄·4H₂O1mg/dl，CaCO₃ 2.5g/dl，PH7.0)。发酵完毕时L-亮氨酸积累至3.1g/dl浓度。

向每300ml上述获得的发酵肉汤添加上述提及的10％PEI溶液，分别制备具有PEI浓度为0.200和1000ppm的发酵肉汤。用98％硫酸调节所得肉汤的PH至4.0，并且边搅拌边于60℃下加热30分钟。

用上述处理过的肉汤作膜渗透测试。膜渗透测试这样进行：在进口压力为1.0kgf/cm²下将每份经上述处理的肉汤以600ml/min的速率给入A sahi Chemical Industry Co.Ltd.制造的笔型PSP-003组件(孔径0.3μm，膜面积150cm²)。在整个60分钟时间的过程中测定渗透率的变化。

结果示于图2。从图2看出，当使用L-亮氨酸发酵肉汤时，添加了PEI后膜渗透率也同样有所提高。

如上所述，根据本发明的方法，发酵肉汤的膜渗透率可以不用大型设备而得以提高。此外，还可以提高运用膜从发酵肉汤中去除细胞这一方法的效率。并且使用于除去细胞的膜分离设备的规模限制至最小。

图1是UF过滤赖氨酸发酵肉汤时，整个时间过程中膜渗透率变化和PEI添加量之间的关系曲线。

图2表示MF过滤高氨酸发酵肉汤时，整个时间过程中膜渗透率变化和PEI添加量之间的关系曲线。

Claims

1.一种通过膜从培养属于埃希氏杆菌属微生物而获得的发酵肉汤中去除细胞以分离细胞的方法，其特征在于发酵肉汤中添加聚乙烯亚胺，然后通过膜过滤混合物，分离出细胞。

2.一种通过膜从培养属于埃希氏杆菌属微生物而获得的发酵肉汤中去除细胞以分离细胞的方法，其特征在于发酵肉汤中添加聚乙烯亚胺，调整肉汤的PH为3至7，然后通过膜过滤混合物，分离出细胞。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所用的膜是超过滤膜或微滤膜。

4.根据权利要求1至3中任一权利要求的方法，其中聚乙烯亚胺的添加量基于发酵肉汤为0.0005至0.5重量之间。

5.根据权利要求1至4中任一权利要求的方法，其中在加入聚乙烯亚胺之前及/或之后，加热发酵肉汤至50-130℃。