CN1095874C - 处理发酵液的方法 - Google Patents

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Abstract

开发了一种改进在使由培养埃希氏杆菌属微生物获得的发酵液透过膜来分离细胞时的膜通透性的方法。本发明涉及处理发酵液的方法，其特征在于，在pH1-4.5下于110-200℃处理由培养埃希氏杆菌属微生物获得的发酵液，然后经膜过滤。与未进行本发明的处理的情况相比，按照本发明的方法，在除去其中的细胞的发酵液的膜通透率改善约1.5-20倍。因此，可以容易地改善膜通透率，并且能增加膜过滤设备的效力。

Description

处理发酵液的方法
技术领域
本发明涉及在经膜除去细胞时预先处理膜淤积物以显著改善通透率，从而缩短处理时间并减少膜设备规模的方法。
背景技术
近年来，用重组菌株发酵生产的技术已取得进展，可以容易地进行基因操作的大肠杆菌(此后简写为“E.coli”)已常常用于这一目的。当发酵完成所需产物从菌株分泌出来时，灭菌后常常经膜分离或离心除去细胞，然后将所形成的无细胞液进行后续步骤。当所需产物存在于细胞内时，经冷冻或用匀浆器、磨等弄碎细胞，然后经膜分离或离心除去细胞和细胞碎片。
除去细胞的膜通常是微滤膜(此后简写为“MF”)和超滤膜(此后简写为“UF”)等。与离心法比较，膜分离可以完全除去细胞并给出澄清的无细胞液。因此，膜被用于从由培养短杆菌属或棒状杆菌属的微生物获得的发酵液中分离细胞。然而，当以常规方法经膜过滤由培养E.coli菌株获得的发酵液(此后简写为“E.coli发酵液”)时，不论细胞是否破碎，其膜通透率降低许多。因此，人们发现，在所述的细胞分离中使用膜是不现实的。
同时，改善发酵液膜通透率或在膜过滤前处理发酵液的某些方法是已知的。例如，日本公开专利申请(Kokai)91，196/1982号描述了当经超滤膜分离细胞和高分子物质时，膜通透率可以由在pH5.5-9下于90-110℃加热肌苷或乌苷发酵液得到改善。此外，日本公开专利申请(Kokai)78，588/1985号描述了超滤膜通透率可以由于50-100℃加热氢基酸发酵液得到改善。另外，日本公开专利申请(Kokai)No.14，795/1984号描述了将由以甘蔗糖蜜为碳源获得的氨基酸发酵液调pH至2-5，使得在超滤处理中改善杂质的排除率成为可能。
然而，如上所述，当用膜从E.coli发酵液分离细胞时，膜通透率降低许多，因而是不实用的。以上提及的文件中公开的方法对改进膜过滤的通透率无效，通透率仍然低。因此，这些方法存在需要大规模膜滤过装置的问题。
发明内容
因此，需要开发一种改善经膜过滤由培养埃希氏杆菌属的微生物获得的发酵液的膜渗透率的实用方法。
本发明的发明人发现，在调节至特定pH范围后，高温下加热由培养埃希氏杆菌属的微生物获得的发酵液时，微生物细胞本身或得自细胞的杂质成团或分解，从而在经膜过滤发酵液时，团块的阻力降低，浓缩极化被阻止。由此，他们获得了用膜除去细胞的通透率的改善。
因此，本发明涉及一种处理发酵液的方法，该方法包括经膜过滤由培养埃希氏杆菌属的微生物获得的发酵液分离细胞，其特征在于，在pH1-4.5下于110-200℃处理所述发酵液然后经膜过滤。
附图说明
图1是显示在从由培养E.coli.获得的赖氨酸发酵液除去细胞的整个时间期限内膜通透率变化的图。
图2是显示在从由培养E. coli.获得的赖氨酸发酵液除去细胞的整个时间期限内膜通透率变化的图。
图3是显示在从由培养E.coli获得的亮氨酸发酵液除去细胞的整个时间期限内膜通透率变化的图。
图4是显示从由培养E.coli获得的苯丙氨酸发酵液除去细胞的整个时间期限内膜通透率变化的图。
具体实施方式
用于本发明的属于埃希氏杆菌属的微生物可以是野生型菌株或突变体。经细胞融合或基因操作所得的重组菌株也是可用的。属于埃希氏杆菌属的微生物的一个例子是大肠杆菌。由这种微生物产生的所需产物可以是透过本发明中使用的UF膜或MF膜的产物，它们在高温和低pH下不分解。其例子包括氨基酸(如赖氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸)、核酸(如肌苷和鸟苷)和有机酸(如乳酸和苹果酸)。
用于本发明的发酵液可以由在合适的培养基中培养上述微生物制备物。对培养基没有特别的限制，它可以是包含碳源、氮源、无机盐和可选的有机营养物的普通培养基。发酵可以按国际出版物WO95/16042号、出版的欧洲专利申请0685555号或日本公开专利申请(Kokai)047，397/1996号描述的方法在适宜的条件下培养以上提到的微生物来进行。
只要其可用于以上提到的微生物，任何碳源均可使用。碳源的特定的例子包括糖类(如葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖)、有机酸(如富马酸、柠檬酸、乙酸和丙酸)和其盐。
只要其可用于以上提到的微生物，任何氮源均可使用。氮源的特定的例子包括无机酸铵盐(如硫酸铵和氯化铵)、有机酸铵盐(如富马酸铵和柠檬酸铵)、硝酸盐(如硝酸钠和硝酸钾)、有机氮化合物(如蛋白胨、酵母膏、肉膏和玉米浆)和它们的混合物。
在需要时可以使用普通发酵中采用的营养源。营养源的例子包括无机盐、痕量金属盐和维生素。
在pH1-4.5下，优选地在2-4下，于110-200℃，优选地于110-150℃进行由培养埃希氏杆菌属的微生物获得的发酵液的热处理。加热时间无特殊的限制。进行热处理的时间期限以不使所需产物变性或分解较好。热处理1-10分钟通常是优选的。可以用无机酸(如盐酸、硫酸或磷酸)调节发酵液的pH值。
此外，在热处理之前或之后向发酵液中添加聚合物凝集剂(如聚乙烯亚胺和聚丙烯酸钠)使改善膜通透率更有效。添加的聚合物凝集剂的量为发酵液的0.0005-0.5％(重量)、优选地为0.001-0.05％(重量)。
接着，经膜过滤如此热处理过的发酵液。用于本发明的膜可以是MF或UF。平展膜、空心纤维膜、管状膜或螺旋状膜是可用的。膜材料可以是有机材料(如聚砜、聚烯烃、聚偏二氟乙烯或聚四氟乙烯)或无机材料(如陶瓷)。在UF的情况下，具有1,000-500,000分子量截留(cut off)的膜是适宜的，在MF的情况下，具有0.05-1μm孔直径的膜是适宜的。
在经膜过滤热处理过的发酵液时，勿需调节其pH值。然而，依据过滤中采用的膜材料，可以将发酵液调节至合适的pH值。经膜过滤发酵液时，没有必要加热它。可是，发酵液可以将其加热至50-60℃并保持这一温度以用于获得较高的通透率或阻止腐败的膜过滤中。
用这种方式，可以从发酵液中分离细胞，并且能获得含所需产物的澄清的透过液。
实施例
参照下列实施例具体说明本发明。
实施例1
用B-399/RSFD80菌株(由将质粒/RSFD80引入到E.coli B-399菌株中获得)按国际公开号WO95/16042号实施例中描述的方法生产L-赖氨酸。用具有下列配方的培养基在37℃的温度下进行发酵48小时，同时以114-116rpm搅拌混合物。
产生L-赖氨酸的培养基配方：
A：(NH4)SO4                   16g/l
    KH2PO4                     1g/l
    MgSO·7H2O                  1g/l
    FeSO·7H2O                  0.01g/l
    MnSO·5H2O                  0.01g/l
    酵母膏(Difco)                2g/l
    L-甲硫氨酸                   0.5g/l
    用KOH调pH至7.0，将混合物在115℃下高压灭菌10
    分钟(16/20体积)。
B：20％葡萄糖(于115℃高压灭菌10分钟)(4/20体积)。
C：CaCO3，日本药典(180℃干热灭菌2天)(30g/l)。
将A和B以4∶1比例混合，以30g/l的量将C加入其中。向混合物中加入抗生素(100μg/ml链霉素和5μg/ml卡那霉素)。
发酵完成时，产生的L-赖氨酸的量以L-赖氨酸氢氯化物计算为9.2g/l。这一L-赖氨酸发酵液(pH6.5)各300ml中添加98％硫酸调pH至4.0和2.0，然后在120℃热处理发酵液。高压处理器用于加热。在发酵液的温度达到120℃后，在该温度下保持发酵液10分钟。作为对照，将未经热处理的30ml上述赖氨酸发酵液进行膜通透试验。
在Minitan模件(module)(Millipore制造)上安装两个PTTK膜(Millipore，U.S.A.制造的UF膜，分子量截留：30,000)进行膜通透试验。
以1,000ml/分钟的速率向上述UF模件喂加热处理过的发酵液进行膜通透试验，同时保持发酵液在50℃下，并使其以0.9kg-f/cm2的平均压力透过所述膜。在30分钟的通透期限内测定通透率的变化。结果示于图1中。
从图1明显可见，与未进行加热的情况相比，按本发明的方法在pH2-4下于120℃加热发酵液能改善通透率约3倍。比较实施例1
在pH4.0下于70℃、在pH5.5下于90℃和在pH6.5下于110℃热处理与实施例1中相同的E.coli发酵液10分钟。以与实施例1相同的方法经膜过滤如此处理过的发酵液。此时，在整个期限内测定通透率的变化，结果示于图2中。
从图2明显可见，在pH4.0下于70℃、在pH5.5下于90℃和在pH6.5下于110℃热处理所述发酵液时，30分钟后通透率约201/m2·h(kg-f/cm2)，与未进行热处理的情况大致相同。因此，未观察到通透率的改善。实施例2
用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍进行E.coli FERM-P 5274菌株的突变处理，所述菌株属于埃希氏杆菌属对β-2-噻吩基-丙氨酸有抗性并具有产生L-亮氨酸的能力(在日本公开专利申请(Kokai)34，397/1987号中公开)。在突变菌株中，分离一株对4-氮杂亮氨酸有抗性的菌株，获得具有改善的产L-亮氨酸能力的一个菌株。
在培养基中于31℃搅拌培养如此获得的菌株，所述培养基含有5g/dl葡萄糖、2.5g/dl(NH4)2SO4、0.2g/dl KH2PO4、0.1g/dl MgSO4·7H2O、0.05g/dl酵母膏、1mg/l硫胺素氢氯化物、1mg/dl FeSO4·7H2O、1mg/dlMnSO4·4H2O和2.5g/dl CaCO3，pH7.0)。当发酵完成时，积累的L-亮氨酸的浓度为3.1g/dl。
将98％硫酸添加到这一L-亮氨酸发酵液中，调节pH至4.0，然后于120℃热处理该发酵液。加热中使用高压处理器。在发酵液温度达到120℃时，在该温度下保持发酵液10分钟。作为比较实施例，将以上提到的于60℃下热处理上述亮氨酸发酵液(pH4.0)30分钟。将两种热处理过的发酵液进行膜通透试验。
经在0.9kg-f/cm2的平均压力和700ml/min的流速向装有两个WLP膜(Millipore制造的MF膜，孔径0.1μm)的Minitan模件(Millipore，U.S.A.制造)喂加以上处理过的发酵液来进行膜通透试验。在80分钟的时间期限内测定通透率的变化。
结果示于图3中，从表3明显可见，膜通透率的增加也与120℃热处理L-亮氨酸发酵液的相同。
实施例3
经在发酵培养基中于37℃培养E.coli AJ12604菌株(出版的欧洲专利申请0488,424号中描述)24小时来产生L-丙氨酸，所述发酵培养基在11水中含有20g葡萄糖、29.4g磷酸氢二钠、6g磷酸二氢钾、1g氯化钠、2g氯化铵、10g柠檬酸钠、0.4g谷氨酸钠、3g硫酸镁七水合物、0.23g氯化钙和2mg硫胺素氢氯化物。在发酵完成时，累积的丙苯氨酸浓度为3.7g/l。
将98％硫酸加入到这一L-苯丙氨酸发酵液(pH6.5)中，调节pH至4.0，然后于120℃热处理该发酵液10分钟。作为比较实施例，于60℃热处理上述苯丙氨酸发酵液(pH4.0)30分钟。在向两种热处理过的发酵液中加入聚丙烯酸钠(浓度：30ppm)后，进行这些发酵液的膜通透试验。
经于60℃以0.7kg-f/cm2平均压力向装有PTFE膜(TOYO ROSHI CO.，LTD.制造的MF膜，孔径：1.0μm)的UHP-150模件(TOYO ROSHI CO.，LTD.制造)上喂加以上处理的各发酵液来进行膜通透试验。在15分钟时间期限内测定通透率的变化。
结果示于图4中，从图4清楚可见，与在60℃热处理的情况相比，按本发明的方法在pH4下于120℃加热所述发酵液可以改善通透率约20倍。
如上所述，与不进行本发明的处理的情况相比，按照本发明的方法，所述发酵液的膜通透率可以改善约1.5-20倍。因此，可以获得实用的膜通透率，并且可以容易地改善所述发酵液的膜通透率。此外，增强膜过滤设备的效力也是可能的。

Claims (2)

1.一种处理发酵液的方法，该方法包括经膜过滤由培养埃希氏杆菌属的微生物获得的发酵液分离细胞，其特征在于，在pH1-4.5下于110-200℃处理所述发酵液，然后经膜过滤。
2.权利要求1的方法，其中膜过滤中使用的膜是超滤膜或微滤膜。
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