JPS6317696A - アルコ−ルの発酵方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はザイモモナス属に属する細菌によるアルコール
発酵法に関し、詳しくは、ザイモモナス属に属する細菌
の培養に際し、常用の培地組成の他に特定のアミノ酸類
の所要量を培地に添加して、耐久性のあるアルコール発
酵を行う事に関する。

（従来の技術〕 バイオマスからの発酵法によるアルコール製造は酵母に
よるものと考えられてきたが、近年、細菌によるアルコ
ール発酵が注目されている。中でも、ザイモモナス属に
属する細菌〔特にザイモモナス・モビリス（７ｍｏｂｉ
ｌｉｓ　）　）はグルコース１０％を炭素源とする培地
におい゛Ｃ１酵母（サツカロマイセス・カールスベルゲ
ンシス（鎖−ｃｃｈａｒｏｓ　ｃｅｓ　　Ｃａｒｌｓｂ
ｅｒ　ｅｎｓｉｓ）　）に比べて、単位菌体■当たりの
エタノール生産速度及びグルコース代謝速度が数倍も扁
＜、アルコール生成収率にも若干の向上が認められてい
る。〔ビー・エル・ロジャーズ、ケー・ジエイ・リー　
アンド　デー・イー・トライベ；バイオテクノロジー　
レター　（Ｐ、Ｌ、Ｒｏｇｅｒｓ＋に、Ｊ、Ｌｅｅ　ａ
ｎｄ　Ｄ、Ｅ、Ｔｒｉｂｅ；ＢｉｏＬｅｃｈ−ｎｏｌ、
　ＬｅｔＬ、）　　１．１６５−１７０　（１９７９）
　）　、また、外材らもザイモモナス属に属する細菌は
酵母に比べ°ζζ発達速度窩いことを認め、これがザイ
モモナス」に属する細菌によるアルコール発５）Ｉの最
も大きな特徴の一つであると述べている。

しかし、ザイモモナス属に属する細菌は、高濃度のグル
コース（約１２〜１３％以上）の存在下、あるいは８Ｊ
！蜜のような夾雑物の多い原料を用いると、発酵速度が
低下する短所があり、バイオマス原料の種類や仕込み濃
度が制限され°ζいる（外材健三。

簗瀬英司：発酵と工業、す、１８０−１８９＜１９８４
））　。

そのために、オークらは、グルコース低濃度培地から発
酵を開始し、グルコースを培養の進行と共に段階的に加
えてゆく方法を報告し、糖仕込濃度の向上の方向を提示
している〔ケー・オーク。

ケー・スパンオング　アンド　ニス・ハヤシグ：ジャー
ナル・ファーメンテ−ジョン・テクノロジー　（Ｋ、０
ｈＬａ、に、Ｓｕｐａｎｗｏｎｇ　ａｎｄ　Ｓ、Ｈａｙ
ａｓｈｉｄａ：Ｊ、Ｆｅｒ−ｍｅｎｔ、Ｔｅｃｎｏｌ、
５９４３５−４３９（１９８１））　、また、糖蜜のザ
イモモナス属細菌に対する発酵阻害の主因かに゛。

Ｍｇ”、Ｃａ”等の塩類であることをニス・ケー・リー
（Ｓ、に、Ｒｈｅｅ）らは報告し、脱塩の方法が検討さ
れた。彼等は膜分離技術を糖蜜の前処理に適用し、塩類
含量を２０〜３０％低下せしめた糖蜜を発酵原料に用い
ると、糖濃度２０％までの仕込みを可能ならしめたと報
告し°ζいる〔エフ・ケー・リー、ピー・エソ・パガン
、エム・エフ・リーフェボーレ。

エル・ロング　アンド　ピー・エル・ロジャース；ジャ
ーナル・フォーメンテ−ジョン・テクノロジー（Ｓ、に
、Ｌｅｅ、Ｐ、Ｆ、　Ｐａｇａｎ、Ｍ、Ｆ、Ｌｅｆｅｂ
ｖｒｅ、Ｌ、Ｗｏｎｇａｎｄ　Ｐ、Ｌ、Ｒｏｇｅｒｓ；
Ｊ、ＦｅｒｍｅｎＬｏ、Ｔｅｃｈｎｏｌ、６２，２９７
−３００（１９８４））　、　Ｌかし、アルコール生成
収率は６０％どまりであり、工業的な実用水準には達し
ていないものと思われる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上述の如く、従来技術によれば、ザイモモナス属細菌の
もつ酵母に勝る発酵性能はグルコースを原料とする低濃
度培地系においては発揮されているが、より高濃度のア
ルコール生成を目指す培地では未だ成功していない。

このような現状から、本発明者等はアルコール発酵にお
けるザイモモナス属に属する細菌の耐久性を賦与する方
法を開発すべく、鋭意研究したところ、発酵阻害の現れ
る窩糖濃度及び塩類含をの培地に、特定のアミノ酸類を
添加せしめれば、それらの発酵阻害を解除でき、ザイモ
モナス属に属する細菌の発酵性能（アルコール生成ｌ及
びアルコール生成収率）を飛躍的に改善できることを見
出し、本発明を完成した。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明はザイモモナス属に属する細菌によるアルコール
生成培養に際し、常用の培地組成の他に、特定のアミノ
酸類を添加して、耐久性のあるアルコール発酵法を提供
するものである。

ごごに、耐久性とは、本来ザイモモナス属に属する細菌
の培養には不通過な条件である製糖、高塩、アルコール
の存在等に対する抵抗性を意味し、いわゆる゛１ルコー
ルの高濃度発酵に重要な能力を賦与するものである。

本発明における使用微生物はザイモモナス属に属する細
菌のうち、アルコール発酵能を存するザイモモナス・モ
ビリスＣハＬμ駐μリュ（以下「Ｚ、」と略記する）ｓ
＋ｏｂＨｉｓ）である。

具体的にはザイモモナス・サブスピーシース・モビリス
（１゜虹旺阻５ｕｂｓρ、鯨紅ムＬ（例えばＡＴＣＣ３
１８２１，ＡＴＣＣ１０９８８，ＮＲＲＬ　Ｂ−８０６
及びＩＦｏ　１３７５６など）およびザイモモナス・サ
ブスピーシース・ポアセアエ（Ｚｏｍｏｂｉｌｉｓ　　
５ｕｂｓｐ＋　Ｌ匣憇憇）（例えばＡＴＣＣ２９１２）
等を挙げることができる。

又、それら菌株を変異処理、改良された株閑も含まれる
。

さらに、これらの菌株の固定化物も含まれる。

生産培地の組成はザイモモナス属に属する細菌の培養に
一般に用いられる培地を基本培地とし、これに特定のア
ミノ酸、例えばシスチン、ヒスチジン、ロイシン、チロ
シン、トリプトファン、スレオニン、グルタミン酸、セ
リン及びアスパラジン酸の１種又は２種以上のＬ型アミ
ノ酸を添加せしめた培地が使用される。

就中、これらのアミノ酸のうち、グルタミン酸。

セリン又はアスパラギン酸を好適なものとしζ用いるこ
とができる。

なお、これらアミノ酸類は該アミノ酸含量の高いペプチ
ド（例えばペプトン等）を添加することによることもで
きる。これらアミノ酸類の添加時期は培地調製時、培養
開始時又は培養途中のいずれでも良いが、培地調製時の
添加が好ましい。また、これらアミノ酸類の添加量は培
地当たり０．０５（Ｗ／Ｖ）％以上、好ましくは０．１
〜０．５　（Ｗ／Ｖ）％が使用される。

次に培養条件は使用する菌株の性質によって適宜選ぶこ
とができる０例えばザイモモナス・モビリス（Ｚ　、　
５ｏｂｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ３１８２１株を用いた場合、
上述の生産培地を用い、初発のｐＨを５．０〜６．０と
し、３０℃〜３５℃にて、約７２〜１２０時間静置培養
するのが良い、また、培養の途中で、ＩＪ！質原料のフ
ィード、ｐＨ調節、及びフラッシュしてエタノールの系
外除去等の制御をしても良い。

なお、培養終了液からのアルコールの分離、回収はそれ
自体公知の方法に従って実施することができる。

次に実施例を示して、本発明を具体的に説明す実施例１ ３００ｙ＋／容三角フラスコにグルコース５　（Ｗ／Ｖ
）％、酵母エキス０．５（Ｗ／Ｖ）％の組成からなる種
母培地１００−を分注し、１２０℃、１５分間滅菌した
。

冷却後、斜面寒天培養したザイモモナス・モビリス（７
ｍｏｂｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ３１８２１の１白金耳を摂取
し、３０℃、２日間静置培養した。この種母培養液５１
Ｒ１を３００−容三角フラスコに分注した次に示す生産
培地１００−に移植し、３０℃、９６時間静置培養した
。

生産培地はグルコース３０　（Ｗ／Ｖ）％、酵母エキス
１、０　（Ｗ／Ｖ）％よりなる基本培地に、第１表に示
した各種アミノ酸を０．５　（Ｗ／Ｖ）％添加し、１２
０℃、１５分間滅菌し°ζ調製した。対照培地はアミノ
酸無添加の基本培地とし、同様に滅菌して調製した。

培養終了液につき、生成したエタノール量をＨＰＬＣ法
にて測定した結果を第１表に示した。

第　　　１　　　表 ロイシン　　　　　　　７１．ＯＩＩ カザアミノ酸　　　　　６５．８’Ｉ［［第１表から明
らかなように、対照培地におけるエタノール生成量に比
べ、順位■にランクしたグルタミン酸、アスパラギン酸
及びセリンを添加した培地における生成量は２５％以上
間上していることが判る。

実施例２ 実施例１と同様に種母培養液５１Ｒ１を以下に示した生
産培地１００−に移植し、３０℃、１２０時間静置培養
した。

生産培地はグルコース２０　（Ｗ／Ｖ）％、酵母エキス
１、０　（Ｗ／Ｖ）％よりなる基本培地Ａ、グルコース
２５（Ｗ／Ｖ）％、酵母エキス１．　Ｏ（Ｗ／Ｖ）％よ
りなる基本培地Ｂ、グルコース３０　（Ｗ／Ｖ）％、酵
母エキス１．０（Ｗ／Ｖ）％よりなる基本培地Ｃ、グル
コース３５（圓／Ｖ）％、酵母エキス１．０　（Ｗ／Ｖ
）％よりなる基本培地りに、グルタミン酸、セリン、ア
スパラギン酸あるいはペプトンをそれぞれ０．４　（Ｗ
／Ｖ）％添ノ用し、１２０℃１１５分間滅菌して調製し
た。対照培地は無添加の基本培地とし、同様に滅菌して
調製した。

培養終了液につき、生成したエタノール量をＨＰＬＣ法
に°ζ測定した結果を第２表に示した。

第２表　各培地におけるエタノール生成量（ｇ／　ｊ！
　）実施例３ 実施例１と同様に、種母培養液５−を以下に示した生産
培地１００−に移植し、３０℃、９６時間静置培養した
。

生産培地はグルコース２０　（Ｗ／ν）％、酵母エキス
１、０　（Ｗ／Ｖ）　％、Ｋ　（Ｊｌ、　Ｏ（Ｗ／Ｖ）
％よりなる基本培地に第３表に示すアミノ酸類を単独に
あるいは複合して、それぞれ０．４　（Ｗ／Ｖ）％添加
し、１２０℃。

１５分間滅菌し”ζ調製した。対照培地は無添加の基本
培地とし、同様に滅菌して調製した。

培養終了液につき、生成したエタノール量をＨＰＬＣ法
にて測定した結果を第３表に示した。

第３　表 実施例４ 実施例１と同様に、種母培養液５−を以下に示した生産
培地１００艷に移植し、３０℃、９６時間静置培養した
。

生産培地はグルコース２０　（Ｗ／Ｖ）％、酵母エキス
１、０　（Ｗ／Ｖ）％、よりなる基本培地Ａ、グルコー
ス２０　（Ｗ／Ｖ）％、酵母エキス１．０（Ｗ／Ｖ）　
％、　ｙ、　ａＯ，５（Ｗ／Ｖ）％よりなる基本培地Ｂ
、およびグルコース２０　（Ｗ／Ｖ）％、酵母エキス１
．０　（Ｗ／Ｖ）％、　ＫＩＪｌ、０（Ｗ／Ｖ）％より
なる基本培地Ｃに、グルタミン酸をそれぞれ０．０５．
０．１　、０．２及び０．５（讐／Ｖ）％添加し、１２
０℃、１５分間滅菌して！Ｐｌ製した。対照培地は無添
加の基本培地とし、同様に滅菌して調製した。

培養終了液につき、生成したエタノール量を）ＨＰＬＣ
法にて測定した結果を第４表に示した。

第　　　４　　　表 実施例５ インドネシア産塘蜜２．１　ｋｇに水を添加して全量３
７！とした糖蜜希釈液をイオン交換樹脂ＰＫ２０８（Ｈ
’型）５００−のカラムを通過させ、次いで、イオン交
換樹脂ＰＡ３０６　（Ｏ）Ｉ−型）　５００−のカラム
を通過させた０通過液の￥Ｍ濃度を測定し、全糖濃度２
０（Ｗ／Ｖ）％になるように水で希釈後、０．４Ｎ　Ｋ
Ｏｊ＋にてρ１１を５．０に調製し、脱塩糖蜜液３．５
Ｉｌを得た。これを糖質原料とした生産培地１００−に
、実施例１と同様の種母培養液５−を移植し、３０℃、
９６時間静置培養した。

生産培地は上述の脱塩糖蜜液に酵母エキス０．５（Ｗ／
Ｖ）％、Ｍｇ５Ｏ４Ｈ７ＨｚＯＯ，０５（Ｗ／Ｖ）％を
添加した組成よりなる基本培地にグルタミン酸、セリン
、アスパラギン酸をそれぞれ０．５　（Ｗ／Ｖ）％添加
し、１２０℃、１５分間滅菌して調製した。対照培地は
基本培地とし、同様に滅菌して調製した。

培養終了液につき、生成したエタノール量をＨＰＬＣ法
にて測定した結果を第５表に示す。

第　　　５　　　表 （ｇ／ｌ） 〔発明の効果〕 本発明の方法によれば、グルコース２０％を炭素源とす
る培地において、従来法のアルコール生成量は約８０ｇ
／／２であるのに対し、約９０ｇ／ｌの生成量となり、
アルコール生成収率を向上せしめることができた。また
、グルコース３０％を炭素源とする培地において、従来
法のアルコール生成ｌは約６５ｇ／ｌであるが、本発明
の方法によれば約１００ｇ／ｌのアルコール生成Ｉが得
られ、糖の濃厚仕込が可能になった。次に、グルコース
２０％を炭素源とする培地にＫｃ１１％を添加した時、
従来法におけるアルコール生成量は６５ｇ／ｊ＋に低下
するのに対し、本発明の方法によれば約９０ｇ／ｊ！の
生成量を示し、塩存在下における発酵阻害が完全に回復
された。

同様の効果は、脱塩処理した糖蜜を原料とする培地にお
いζも確認できた。

特許出願人　　　新エネルギー総合開発機構（ほか１名
）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ザイモモナス属に属する細菌によるアルコール生産
   培養に際し、常用の培地組成の他に特定のアミノ酸類を
   添加することを特徴とするアルコールの発酵方法。 ２、特定のアミノ酸類がシスチン、ヒスチジン、ロイシ
   ン、チロシン、トリプトファン、スレオニン、グルタミ
   ン酸、セリン及びアスパラギン酸の１種又は２種以上の
   Ｌ型アミノ酸である特許請求の範囲第１項記載のアルコ
   ールの発酵方法。 ３、特定のアミノ酸類がグルタミン酸、セリン又はアス
   パラギン酸である特許請求の範囲第２項記載のアルコー
   ルの発酵方法。