JPS5945898A - Ｌ−トリプトフアンの精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、微生物を用いて製造したＬ−）！、１ブトフ
ァンの精製方法に関するものである。

従来、Ｌ　−）　ＩＪブトファンは水または含水アルコ
ールで再結晶できることが知られている。

しかし、微生物を利用して製造したＬ　−）　＋７プト
フアンを精製するには、Ｌ−）リブトファンを水に溶解
したときに見られる微生物に由来する濁りを除去する必
要があること、また工業的にはその再結晶時の反容器の
容積効率を高める必要があること、さらに、商品として
は得られたＬ　−）　！Ｊブトファンの結晶形が良好で
ある必要があることなどから、より改善された精製法が
切望されている。

本発明者らは、これらの問題を解決すべく鋭意検討した
。その結果、アルコールとしてイソプロピルアルコール
を用い、かつ６０〜６０容量％の含水物として用い活性
炭処理して再結晶すれば、Ｌ−）リプトファンの含水イ
ソプロピルアルコールへの溶解度が水または含水アルコ
ールにくらべて高いので、再結晶時の反応器の容積効率
が高く、しかも、活性炭処理を併用することにより微生
物に由来する溶解時の濁りも完全に除去でき、その上、
得られるＬ−）リプトファンの結晶形も比較的大きな鱗
片状の結晶となること、さらに、粗製Ｌ−）リプトファ
ンに未反応のインドールが含まれていても、これを完全
に除去できるので、粗製Ｌ−１リプトファンの製造工程
での未反応インドールを除去する工程を省客できること
などを見出し、本発明の方法を完成するに到った。

すなわち、本発明の方法は、微生物を用いてＴ、−）リ
ブトファンを製造する方法において、３０〜６０容ｔ％
含水イソプロピルアルコール中、活性炭処理を併用して
再結晶させることを特徴製 とするＬ−１リプトフアンの精に法である。

本発明の方法において、微生物を用いて製造される粗製
の１．−　）　ＩＪブトファンは、通常良く知られてい
るエシェリヒア・コリの存在下、Ｌ−セリンとインドー
ルより製造したもの、エシェリヒア・コリおよびシュー
ドモナス・プチーダの存在下ＤＬ−セリンとインドール
より製造したもの、バチルス・プチルスの存在下アンス
ラニル酸を前駆体として製造したもの、またはアエロバ
クタ−・アエロゲネの存在下、インドールとピルビン酸
およびアンモニアより製造したもの等があげられる。

例えば、インドールとＬ−セリンより製造するものは、
Ｌ−）リフトファン要求性エシェリヒア・コリのトリプ
トファナーゼ欠損変異株を炭素および窒素源ならびに無
機塩を含有する培地を用いてまず好気性の条件下２８〜
４０℃、ｒ＋ｌ−ｌ６〜８の条件でエシェリヒア・コリ
変異株を培養し、菌体をその培養液のまままたは培地か
ら分離してピリドキザールリン酸塩およびＬ−セリン、
無機物を溶解した溶液に懸濁させる。ｐＨ７５〜９５好
ましくはｐＩ−Ｉ　８〜９０条件下、インドールを直接
、あるいは水と混和しないがインドールと混和する有機
溶媒に溶解したインドール溶液を一括または連続的に酵
素の活性を阻害しないような濃度以下に保ちながら加え
２０〜４０℃の範囲で反応を行いＬ−）ＩＪブトファン
を生成せしめる。

前記の有機溶媒を用いる場合、有機溶媒としては、ベン
ゼン、トルエン、クロルベンゼン、ニトロベンゼン、ア
セトフェノン等の芳香族炭化水素およびその誘導体、炭
素数６以上の脂肪族エステル類、例えばｎ−ブチルアセ
テート、イソアミルアセテート、エチルブチレート、イ
ンブチルアセテート等、炭素数６以上の脂肪族ケトン類
、例えばメチルイソブチルケトン、ジイソブチルケトン
、ジイソプロピルケトン、メチル−ｎ−アミルケトン、
ジ−ｎ−プロピルケトン等クエン酸エステル類、例えば
アセチルトリエチルシトレート、アセチルトリブチルシ
トレート、トリエチルシトレート、トリブチルシ坂 トレード等そのほか酒石夏エステル類、リンゴ酸エステ
ル類が使用される。エーテル類としてアニソール等も使
用される。

この反応において、インドールは水相中の濃度が酵素の
活性阻害濃度以下に維持する必要があるので、インドー
ルを直接加えるときは、反応液中のインドール濃度を確
認しながら適宜添加し、また、前記のような有機溶媒を
用いるときは、使用する有機溶媒の分配能に応じて適当
量の有機溶媒に溶解して添加する。

この際、反応生成物であるＬ−）リブトファンは酵素含
有液中に結晶として析出してくるが、この反応条件下で
は、反応の進行に何ら影響を与えない。

５− 得られた反応混合液から、有機溶媒を用いたときはこれ
を留去した後、酵素を除去する。酵素の除去は、公知の
各種方法で可能であるが、次のような方法で行なえば一
層効果的である。

すなわち、反応混合液に、必要に応じて水または水−ア
ルコールを加え、鉱酸でｐＨ２〜５に調整した後、■加
熱処理して微生物を凝集させ、ついで冷却する。この反
応混合液にアルカリを添加してトリプトファンを溶解し
、凝集した微生物を濾別するか、または■加熱して熱濾
過したり、反応液を十分に希釈したりして、Ｌ−トリプ
トファンの溶解度以下で、凝集した微生物を濾別する。

　　　　　　　。

得られる濾・洗液には生成したＬ　−）　ＩＪブトファ
ンの外、未反応のインドールを含むので、通常これを水
蒸気蒸留または有機溶媒による抽出等で除去するが、本
発明の方法では未反応インドールを含んでいても、精製
工程で除去できるので、前記濾・洗液の未反応インドー
ルの除去工程を省召して濃縮、放冷し濾過して粗製の６
− Ｌ−トリプトファンを得る。

以上のような粗Ｌ−）リプトファンの製造においてＤＬ
−セリンとインドールを用い、セリンラセマーゼとして
のシュードモナス・プティーダ（ＭＴ−１０１８２）ま
たはシュードモナス拳ブンクタータ（ＭＴ−１０２４３
）を併用して、同様に粗製のＬ−）リプトファンを製造
してもよい。

本発明の方法において用いられる含水アルコールは、６
０〜６０容量％、好ましくはろＯ〜５０容量％の含水イ
ソプロピルアルコールである。

Ｔ、−）リプトファンは水または含水アルコールに、例
えば、つぎの溶解度を示す。

溶　媒　　　　　　　　溶解度（ｗｔ％、各溶媒の沸点
）水　　　　　　　　　　　　　　４５ ３０％含水メタノール　　　　２．９ ５０％　　　〃６．７ ７０％　　　〃　　　　　　　ろ、４ ′５０％含水エタノール　　　　３．２５０％　　　〃
５．５ ７０％　　　　　　　　〃　　　　　　　　　　　　　
　　　　ろ、６６０％含水イソプロパツール　　６．０
５０％　　　　〃６５ つぎに、含水イソプロピルアルコールによる再結晶の特
徴は、得られる精製Ｌ−１！Ｊブトファンの結晶形が優
れていることである。すなわち、水または含水メタノー
ルもしくはエタノールで再結晶して得られるものは粉状
または微細な鱗片状の結晶であるのに対し、含水イソプ
ロパツールで再結晶して得られるものは３〜５関ｆの大
きな鱗片状の結晶であり、製品としての外観が一段と優
れたものである。

さらに含水イソプ四ビルアルコールを再結晶する特徴は
、未反応インドールが再結晶処理により除去できること
である。

／ したがって、インドールとセリンを反応させて得た反応
混合液から未反応のインドールを除去する操作を省異し
て得られる粗製のＬ−トリプトファンを用いても、未反
応インドールをほとんど含有しないＬ−）リブトファン
を得ることができる。

本発明の方法に用いられる活性炭は特に限定されるもの
ではない。通常、精製用として使用される粉末活性炭ま
たは造粒活性炭を使用することができる。

活性炭の使用量は、とくに限定はなく、通常、粗り一ト
リプトファンに対して０．１〜１０ｗｔ％使用すれば十
分である。

本発明の精製処理は、粗Ｌ　−）　！Ｊブトファンに対
して１４〜２０重量倍量、好ましくは１４５〜１６）倍
量の６０〜６０％含水イソグロビルアルコールに、活性
炭および粗Ｌ−）リプトファンを添加し、沸点で、Ｌ　
−）　！Ｊブトファンが十分トリプトファンを濾取する
ような一般的な再結晶方法で実施すればよい。

以下、本発明の方法を実施例で示す。

実施例１ エシェリヒア・コリＭＴ−１０２４２を培地組成１の培
地５０ｍ１に一白金耳接種し、６０℃にて２０時間振と
う培養した。

　９− 培地組成Ｉ　　肉エキス　　１．０ｗｔ％ペプトン　　
０．５　ｗｔ％ 酵母エキス　　　０．１ｗｔ％ ＫＨ２ＰＯ４０，２ｗｔ％ 初期ｐＨ７，０ 培養液１Ｌを遠心分離して菌体を集め、これをトリプト
ファン・シンセターゼの酵素源とした。

シュードモナス−プチーダＩＦＯ１２９９６を培地組成
■の培地５０ゴに一白金耳接種し、３０℃にて２０時間
振とう培養した。培養液１ｔを遠心分離して菌体を集め
、これをセリン・ラセマーゼの酵素源とした。

培地組成■　　肉エキス　　１．０ｗｔ％ペプトン　　
０．５ｗｔ％　。

ＮａＣｌ　　　　Ｏ，５ｗｔ％ 初期ｐＨ７０ 攪拌機を備えた３００−フラスコにＤＬ−セリン１１．
５’ｆ、硫酸アンモニウム６２、ピリドキサールリン酸
１０ｍ２および水６６ｆを加え１０− て良くかきまぜる。濃アンモニア水でｐＨを８．５に調
整し、エシェリヒア・コリ湿潤濾塊６８グ（固形分１７
グ）およびシー−トモナス・プチーダ湿潤濾塊３．４１
ｉ’（固形分０．８５１ｉ’）を水に懸濁させ全体の体
積を２０ｍ１として加える。

３５℃に保温したのち１、インドール１１５２を溶解し
たトルエン溶液５Ｚ２７を加え３５℃、４８時間反応さ
せた。反応収率は定量的であった。トルエンを蒸留によ
り除去し、水を加えて全量を４５０ｉｉ’とし、硫酸で
ｒ＋Ｈを６５に調整し、活性炭６７を加え、９５〜９８
℃に加熱する。１時間保温し、Ｌ　−）　！Ｊブトファ
ンが溶解した状態で同温度で熱時濾過を行なう。

この濾液を濃縮し、Ｌ−）　ＩＪブトファン濃度を１０
ｗｔ％にする。２０℃に冷却し、晶出した結晶を濾別す
る。純度９９５％のＬ−）　ＩＪブトファンの結晶が８
０％の単離収率（対インドール）で得られた。

この粗製Ｉ、−）リプトファン結晶を、１６重量倍の５
０％含水イソプロピルアルコールに分散し、’Ｌ−）リ
プトファンに対し、１重量％の粉末活性炭を加え、沸点
まで昇温する。

同温度で１時間加熱し、熱時吸引濾過すると、淡黄色透
明のＬ　−トＩＪブトファン溶液を得た。

５°Ｃまで冷却し析出した結晶を濾別、乾燥した。

回収率８５％、純度１００％、３〜５　ｍｙｒｔ　ｊ’
の鱗片状具のＬ−）リプトファンを得た。

特許出願人 三井東圧化学株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １）微生物を用いてＬ　−）　ＩＪブトファンを製造す
   る方法において、３０〜６０％含水イソプロピルアルコ
   ール中、活性炭処理を併用して再結晶させることを特徴
   とするＬ−）リプトファンの精製法。