JPS61126070A - Ｌ−トリプトフアンの脱色精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 る。

さらに詳しくは発酵または酵素法により得られたＬ−ト
リプトファンを含む反応マスから１着色不純物を除去し
て色相のすぐれた精Ｌ−１−リブトファンを得る方法に
関する。

Ｌ−トリプトファンは、必須アミノ酸の一つであり、医
薬品、飼料などに使用される有用な化合物である。

Ｌ−トリプトファンの製造方法としては、発酵法、酵素
法が知られているが、合成法と違い１発酵法、酵素法の
場合は菌体由来の不純物が蓄積し、各種精製工程を経て
も不純物は充分除去しきれず。

発泡成分、着色成分として残留する。寥たＬ−トリプト
ファン自体熱、光に弱く、遮光下においても濃縮などの
熱履歴により、発泡成分や着色成分が蓄積される。

Ｌ−１−リフトファンを医薬品として用いる場合は、商
品価値を高めるためにも、特にＵＶ吸収が４３０ｎｍ付
近にある、外観としては黄色味を呈する着色原因となる
物質を出来得る限り除去する必要がめるが、再結晶工程
に付すことなく日本薬局方規格に満足する透過率（Ｔｌ
を有する晴製品を得ることは大変困難である。

本発明方法では、晶出後再度再結晶に付すことなくＴ％
９７〜９８％の高純度のし一トリプトファンを得ること
が可能な脱色精製方法である。

従来の技術 発酵法または酵素法によるＬ−トリプトファン製造法は
、中性付近の水性媒体中で、トリプトファンシンセター
ゼの作用を有する酵素や菌体の存在下で、例えばインド
ールとセリンとを反応させて得られているが、得られた
反応液中に含有されている菌体や酵素を除去せねばなら
ず、通常のアミノ酸処理方法としては活性炭、吸着シリ
カゲルなどの固体物質に吸着分離させる方法や、遠心分
離器などにより沈降分離する方法などが知られている。

また一方、イオン交換樹脂や、非極性多孔性樹脂を用い
てアミノ酸を分離精製する方法も知られている。

例えば、特開昭５８−８９５公報では、Ｌ−１−リブト
ファン反応液またはこれから晶出した回収および精製母
液中に含有、蓄積された反応阻害物質のような副生不純
物を除去するため、非イオン交換性の多孔質性樹脂によ
る接液処理と、限外ｐ過膜によるｐ過処理工程を組み合
せた方法が開示されている。

その外、晶出時にアミノ酸反応液をアルカリ側に調整し
て予め既級アルコールまたはケトン類を晶出液に添２Ｉ
ｉｌすることにより、固液分離性のよい結晶にして色素
や他の不純物などの挾雑物を分離する方法（特開昭５９
−３９８５７）も公知である。

発明が解決しようとする問題占 本発明者らは、再結晶工程を全く行うことなく、Ｌ−１
−リブトファン反応液から晶出して得られた製品スペッ
クのＴ％が９７〜９８チである実質的に無色のＬ−）−
リプトファンを得る精製方法を種々検討した。

その結果、特開昭５８−８９５公報記載のように、公知
の非イオン性多孔質性樹脂による単一接液処理だけでな
く、限外濾過を併用した場合においては、たしかにその
相乗効果は認められるものの、脱色に関してはさらに再
結晶を行なわなければ、例えばＴ％が９５−以上の日本
薬局方に合格できる程度の脱色した精製品は得られない
ことがわかった。

その理由は、着色物質は菌体由来からの物質の影響が大
きく、従って反応液中に含有している発酵ブロス、菌体
、酵素など由来の不純物をほぼ完全に除去した前処理を
行った後、多孔質樹脂に接液しない限り限外濾過を併用
しても、微量の菌体由来の不純物が晶出工程に含有され
、また晶析のため濃縮工程でのトリプトファン熱履歴に
よる着色成分が蓄積されるためと推定される。

即ち、発酵または酵素法により得られた反応終了液中に
は、菌体膜や酵素などのタンパク質の比較的高分子成分
の外に、菌体成長過程で排出された代謝産物や官能基を
失ったトリプトファン自身の分解由来物などが含まれて
いるが、非イオン性多孔質性樹脂の接液処理では、トリ
プトファン分解由来物や代謝産物の低分子の不純物は比
較的容易に除去できるものの該公報記載のような沈降分
離や、通常の活性炭処理だけでは菌体膜などのり７バク
質は完全に除去できず、これらの成分及び接液処理後の
濃縮工程などでトリプトファン自身の分解由来の成分が
蓄積され完全な脱色ができないものと推定される。

また前記特開昭５９−３９１１５７公報記載方法のよう
に、晶出工程においてアルカリ領域中でアルコールなど
を添加して結晶形態を変えて分離してもある＠闇の製品
色相の改善は見られるものの、充分な効果は得られない
こともわかった。

問題を解決するための手段 本発明者らは、従来の技術による未解決の課題、即ち、
反応液からの晶出たけにより、日本薬局方規格に合格す
る無色のＬ−トリプトファンｍ製品を提供すべく脱色精
製方法を鋭意検討した結果、本発明に到達した。

即ち、本発明方法は、（１）反応液のＰＨを酸性領域に
調整し、活性炭の存在下に熱処理することにより主に菌
体由来の微細な着色不純物をフロック状に集菌、吸着さ
せ、吸着された活性炭を熱ｐ過などにより固液分離する
特定の前処理を行うことにより、主にタンパク質の菌体
由来の不純物をほとんど完全に除去した後、（２）主に
菌体成分などの既分子不純物、及び主に（１）の熱処理
により微量だが生成されたトリブｈファン自身の分解物
由来の分子内にカルボキシル基やアミン基などが失なわ
れた比較的極性の小さな物質を、非極性多孔１Ｒ姓樹脂
に接液させることにより分離し、（３）さらにこの処理
液からＬ−トリプトファンを晶出分離するため濃縮工程
などにより蓄積された微量の不純物をｐ液側に抽出移行
せしめるため、この酸性処理液に低級脂肪族アルコール
を添ＩＪＩｌｌシて晶出させる、これらの工程よりなる
脱色精製方法である。

酵素または微生物を用いたし一トリプトファンの製造法
は種々の方法が知られているが、その代表的方法の一つ
として、大腸菌由来の酵素トリプトファンシンターゼを
用いて、インドールとＬ−セリンを縮合させる酵素法に
ついて述べると、例えば、エシェリヒア・コリ（ＦＥＲ
Ｍ　ＢＰ−１９，１９版ＢＰ−２０）などを培養して、
トリプトファンシンターゼを含む培養菌体をそのまま用
いて、インドールとＬ−セリンをほぼ等モルで水性媒体
中で縮合反応を行なわせしめ、はぼ定量的にＬ−トリプ
トファンへ転換させている。反応マス中には、Ｌ−トリ
プトファンの他に菌体成分や培地成分由来のタンパク質
、多糖類などの高分子物質、及び菌体成分、菌体の代謝
産物、培地成分、反応系由来の有機物、糖類、脂質類、
などの低分子物質が含まれている。

これら種々の不純物を含む反応マスより淘汰を行い高品
質のＬ−トリプトファンを高収率で得るには順次不純物
の物性に合わせた淘汰方法を組み合わせねばならない。

またそれぞれの淘汰方法においては、Ｌ−トリプトファ
ンのロスが少なく、かつ操作性が良い方法でないと工業
的実施は難しい。

上記の観点より本発明方法は、完成されたものであり、
まず水性反応マスを硫酸などでＰＨ２〜５、好ましくは
ＰＨ４付近の酸性側に調節して、活性炭を加え７０〜１
００°Ｃで０．５〜１．０　）（ｒ加熱処理して特にタ
ンパク質成分を活性炭を核としてフロック状に凝集させ
、通常の熱ｆ過などの手段で取り除く。ＰＨをこの範囲
に維持して加熱処理することによりタンパク質成分はフ
ロック状に活性炭に凝集、吸着されるので除菌効果が高
められる。

上記処理を付した反応マスは、ＰＨ４〜６の微酸性であ
るが、Ｌ−ト１１ブトファン自身アルカリ側で特に加熱
の場合は不安定であるので以降製品取り出しまでは、Ｐ
Ｈ調整を行なわず微酸性の系で処理をする。

次にトリプトファ７などに比べて糧性の比較的既いぼ分
子物質や分子の大きさが１００〜１０００Ａ程度の不純
物を非極性多孔質性樹脂（ハイポーラスポリマー）に接
液することにより除去する。

樹脂への接液方法としては、樹脂を充填した塔へ被処理
水溶液を、塔上部より適当な流量好ましくは５Ｖ＝２〜
１０程度で通液する。処理温度は被処理液中のトリプト
ファン濃度により決まるがが存在する場合、樹脂の目詰
まりを生じ著しく樹脂の効率を低下させるため予しめ除
いておくことメタノール、エタノール、イソプロピルア
ルコール、アセトンなどの有機溶媒類あるいはこれらア
ルコールと水の混合溶媒などを、被処理液の性質により
適宜使用する。使用量は樹脂量の１〜５倍程度でほぼ完
全に再生される。

使用される樹脂は、細孔半径が１００〜１０００Ａのス
チレンもしくは核ハロゲン化スチレ／を基材とした非極
性もしくは、１性の弱いハイポーラスポリマーであり、
ダイヤイオンＨＰ−１０゜２０．２１．３０．４０．５
０．またはセパビーズ５Ｐ−２０６，２０７（以上三菱
化我社商品名）などであるが、特にセパピーズ５Ｐ−２
０６゜２０７は好適である。

次に樹脂に接液処理したこの反応マスは、常法に従い減
圧または常圧下、−５０〜１００°Ｃに加熱濃縮して、
Ｌ−）−リブ８７７２５〜３０重量％含有、好ましくは
１０〜２０重量％含有の濃縮液とする。次に濃縮液は酸
性のまま放置冷却後、濃縮時の熱劣化や、未淘汰のまま
存在している着色成分となる不純物をＦ液側へ抽出移行
せしめて晶析操作ができるよう、系中へ脂肪族低級アル
コールが添加される。用いる脂肪族低級アルコールは、
メタノール、エタノール、ｎ−プロパツール、イソプロ
パノール、ｎ−ブタノール、イソブタメールなとであり
、特にイソプロパノールは好ましく用いるアルコールの
共沸点以下、好ましくは２０〜５０℃の濃縮液にアルコ
ールを添加して、アルコールの濃度が少くとも５重量％
以上になるようにして晶析を行う。晶析マス中のアルコ
ール濃度が５チ以下では精製効果に乏しく、また、５０
〜８０重量％のような高濃度にする必要はなく、必要量
以上のアルコールの添加は工業的メリットがないだけで
なく、精り一トリプトファンの収率も低下する傾向にな
るので、通常は不純物の含有量にあわせて２０〜３０ｆ
ｆｉ量チの範囲の製置で実施するのが好ましい。また晶
析工程に付す晶析マス中のＬ−トリプトファン濃度は５
重量％以上に濃度アップすれば充分であり、必要以上の
濃縮は避けたほうがよい。晶析工程、及びこれにより得
られたスラリの固液分離の温度は一１Ω〜２０°Ｃが適
当であり、晶析工程では窒素雰囲気下でもよく。

鵠撹拌しながら２〜４０時間析出させるのが望ましい。

分離したＬ−トリプトファンは、その後さらに水もしく
は含水アルコールで洗浄し、望ましくは８０℃以下の望
気または窒素雰囲気下で乾燥すれば、着色成分となる不
純物を殆んど含有しない精Ｌ−１−リブトファンが得ら
れる。

以下実施例を示すが、実施例中チは重量−である。

実施例１ 大ＩＩ％菌と培養して生産された酵素トリブトファノシ
ンターゼの存在下、水性媒体中でインドールとセリンを
縮合させて得たＬ−トリプトファンを含む反応液に、活
性炭及び水を添加し、硫酸にてＰ）（４として９５〜１
００℃で１時間加熱して菌体を７０ツク化後、活性炭に
吸着された活性炭をその末末ｐ過により除去した。この
ようにして前処理して得られたＬ−トリプトファン約４
％を含有する水溶液５２（ＩＯＪＦ（ト１１ブトファン
分約２００ｇ含有）を、非極性多孔質性樹脂（セパビー
ズＳＰ−２１１７）２０１１ｍを充填した径２５鴎の保
温ジャケット付き樹脂塔に上記前部処理されたトリプト
ファン水溶液を、８０℃に保温しながら、５Ｖ＝Ｓで通
液し、さらに温水３００Ｉにて樹脂塔内の残留トリプト
ファン水溶液を押し出して処理波計５４６０ｇ（トリプ
トファン約１９６におけるＴ％Ｃ％過率）を測定したと
ころ被処理液４２．５％、処理液８７．０％であった。

次に該処理液をトリプトファン濃度が約１２チとなる様
に常圧で９５〜１００℃、１５時間かけて加熱濃縮した
。

次に室温末で冷却後、Ｐ　Ｈ５，５の濃縮マスにイソプ
ロピルアルコール１５１１（ｌを添加して、５℃にて約
２時間冷却してトリプトファンを析出させた。晶出後、
得られたスラリー液炙、ヌツチェを用いて濾過し、６０
０ｇの冷水を用いてヂ洗後。

Ｎ２気流下８０℃で減圧乾燥させた。

このようにしてＬ−トリプトファンのドライケーキ１６
０．６．９を得た。（収率７８．７％対ゼインドール 得られたケーキの透過率は表−１のごとくであり、純度
など他の分析値はすべて１日本薬局方第１Ｏ改正基準値
を満たすものであった。

実施例２ 実施例１と同様にして、樹脂を２７回繰り返し。

運転、再生を行なった後も被処理液のＴ％　４１．６チ
、処理液のＴ％　８８４チであり、ドライケーキの収率
８２１％、ドライケーキ／７’ｌＴ％は表−１のごとく
であった。

比較例１ 実施例１で活性炭処理の工程を省略したほかは実施例１
と全く同様にして、Ｌ−トリプトファンのケーキを得た
。ドライケーキの収率８０．４％、ドライケーキのＴ％
は表−１のごとくであった。

注）　透過率の測定方法は乾燥サンプル（ドライケーキ
）を２ＮのＨＣｌに溶かし、２％水溶液とし、４３０ｎ
ｍで透過率（Ｔ％）を錠した。

発明の効果 以上のごとく、本発明方法は、発酵または酵素法により
得られた反応液から目的生成物のＬ−１−リブトファン
を晶出させる工程に本発明方法を組み込ませることによ
り、分離したＬ−トリプトファンは殆んど無色の’ｒ％
　　９’１以上のものが得られる。

したがって、常法の粗結晶（−次晶出結晶）虎再結晶に
付す必要はない。再結晶法においては、目的物の分離収
率が当然ながら低下するだけでなく、操作的にも繁雑で
あり、数工程の単位操作の追加が必要となり、工業的製
造法においてはコスト高となり１本発明は工業的に有利
な方法といえる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　発酵または酵素法により得られたＬ−トリプトファ
   ン反応液を、ＰＨ２〜５の酸性に調整して、活性炭存在
   下に加熱して菌体を活性炭に吸着させ、これを固液分離
   して、Ｌ−トリプトファンを含むろ液を、非極性多孔質
   性樹脂に接液させ、この処理液を濃縮後、脂肪族低級ア
   ルコールを添加して晶出を行うことを特徴とするＬ−ト
   リプトファンの脱色精製方法。 ２　脂肪族低級アルコールがイソプロパノールである特
   許請求の範囲第１項記載の方法。