JPS5945897A - Ｌ−トリプトフアンの分離法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、微生物を利用して製造したＬ−）ＩＪブトフ
ァンの反応液よりＬ−）リプトファンを単離する方法に
関するものである。

微生物を利用した反応方法では、反応生成物と微生物を
分離することが必要であり、反応液より微生物を除去し
、反応生成物を単離する方法として、従来、いくつかの
方法が知られている。例えば、Ｌ−グルタミン酸酵崗液
に界面活性剤を添加し、加熱することで凝沈を容易にし
、珪藻土を加え沢別する方法（特公昭３Ｂ−１６４６０
）、アミノ酸醗酵液などを限外沢過膜で沢過してから晶
析単離する方法（特開昭５３−２９９９６）などがある
。

しかし、これらの方法は工業的には未だ十分に満足でき
る方法とは言い難い。すなわち、界面活性剤を添加する
方法では、微生物は容易に除去できるものの、界面活性
剤を反応生成物と容易に分離させることができず、生成
物中に混入してくる恐れがある。また、限外ｆ過膜を使
用する方法では、その装置の性質上洗浄に難点があり、
工業的単離方法とは言えない。

本発明者らは、Ｉ、−）　ＩＪブトファンの単離法につ
いて、これらの問題を解決すべく鋭意検討した結果、酸
性液で加熱すれば不安定であるとされていたＬ−）リプ
トファンが、意外なことに微生物を含むＬ−）ＩＪブト
ファン反応液を鉱酸によりｐＨ２〜５の酸性液として加
熱しても、Ｌ−）リプトファンは安定であり、同時に反
応に使用した微生物が容易にＰ別できる大きさに変性凝
集し、このように変性凝集後に反応液にアルカリを添加
してＬ−トリプトファンのアルカリ塩として溶解させて
も、微生物の凝集は再分散、溶解等の変化がなく、沢過
することにより容易に除去して、Ｌ−トリプトファンを
分離できることを見出し、本発明の方法を完成するに到
った。

すなわち、本発明は微生物を利用してＬ−）ＩＪブトフ
ァンを製造する方法において、’［、−）　ＩＪブトフ
ァンおよび微生物を含有する反応液を鉱酸でｐＨ２〜５
とし、この反応液を加熱処理した後、その反応液をアル
カリで処理して微生物を沢別することを特徴とするＴＪ
　−）　ＩＪブトファンの分離方法である。

反応に利用した微生物は、反応液中に溶解または微細な
形で懸濁した状態で存在している。

この微生物を反応終了後除去するのに、Ｐ別可能な状態
に凝集させようと中性ないしアルカリ性のま〜で加熱し
ても、生成したＬ−）リプトファンを溶解させるためア
ルカリを加えると、凝集した微生物は再びＰ別不可能な
状態に分散してしましかしながら、本発明の方法によれ
ば、反応終了後、ｐＨ２〜５として加熱することにより
、微生物はＰ別可能な状態に凝集し、意外なことに、こ
の処理によりＴ、−）リプトファンが分解することもな
く、さらに酸性側で処理後、アルカリを加えてＬ−）　
ＩＪブトファンを溶解する処理を行なっても凝集した微
生物はｆ別可能な状態にある。

すなわち、本発明の方法はＬ−）ＩＪブトファンの傭を
効率的に実施できる工業的な方法と言える。

本発明の方法が適用される微生物を利用して製造したＬ
−）リプトファン反応液とは、例えば、エシエリヒャ・
コリの存在下、Ｌ−セリンとインドールより合成される
もの、また、この方法でＬ−セリンのかわりにＤＬ−セ
リンを用い、セリンラセマーゼとしてシュードモナス・
プティーダ（ＭＴ−１０１８２）またはシュードモナス
・プンクタータ（ＭＴ−ＩＣＩ２４３）を併用して合成
されたもの、また、バチルス・ズプチルスの存在下、ア
ンスラニル酸より合成されるもの、アエロバクタ−・ア
エロバクタの存在下インドールとピルビン酸、アンモニ
アより合成するものなどがある。

これ等の製造法で合成されたＬ−）ＩＪブトファンは、
いずれも反応に使用した微生物の懸濁した水溶液中に存
在し、その微生物とＬ−）リプトファンの分離が従来き
わめて困難で、工業上その精製工程にかかるコストが太
きかった。

また、これらの方法は、反応媒体として有機溶媒を併用
してもよい。このような反応方法の場合本発明の方法に
適用するに先立って、分液または蒸留などの手段で有機
溶媒を除去する。

本発明の方法において使用される酸は、硫酸、塩酸、燐
酸等の鉱酸である。これらの鉱酸を用いて、Ｔ、　−）
リプトファン反応液のｐＨを２〜５、好ましくは３〜４
に調整する。

このｐＨ調整したＴ、　−）　ＩＪブトファン反応液を
加熱する。加熱は６０〜１２０°Ｃ１好しくは８０〜１
０５°Ｃで実施する。

このｐＨ調整および加熱処理によって、Ｌ−）　ＩＪブ
トファンは変化することはなく安定に存在し、一方、微
生物は変性して容易にＰ別できる大きさに凝集する。

したがって、加熱処理時間はとくに限定されるものでは
なく、微生物がＰ別できる状態に適度に凝集したところ
で終了する。

本発明の方法では上記の処理後、その反応液にアルカリ
を添加してＬ−）リプトファンが溶解した水溶液とする
。

使用されるアルカリとしてはＬ−）リプトファンを塩と
して水に溶解するものであればよく、例えばアンモニア
、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリ
ウム、炭酸水素カリウム等があげられる。

工業的には水溶液中への溶解度も高く回収の容易なアン
モニアが好ましい。

アルカリの使用量ＰＬ通常、反応液を中和するに必要な
量と反応液中に存在するＬ−）リプトファンの等モル量
であればよく、Ｔ、　−）リプトファンはアルカリ塩と
なり溶媒中に極めてすみやかに溶解する。

アルカリ使用量を等モル以上用いても伺ら問題はないが
、Ｔ、−）　ＩＪブトファンの結晶を取出す際、Ｌ−ト
リプトファンの単離収率向上のため、その等電点まで酸
でｐＨ調整をするので、過剰のアルカリの使用は無機塩
を増やす結果となり好ましくない。

アルカリによる処理は、上記の加熱処理した反。

応液を冷却し、０〜５０°Ｃ１好ましくは５〜２００Ｃ
でアルカリを添加してＬ−トリプトファンを溶解させる
。上記以上の高温で処理するとＬ−）リプトファンが分
解またはラセミ化するおそれがあり好ましくない。

アルカリとしてアンモニアガスを用いる場合、溶媒への
アンモニア溶解度を増すため、冷却した状態でアンモニ
アガスを吹き込むことが好ましい。

水酸化ナトリウム等の無機塩基を用いる場合は常温で添
加すればＴ、−）リプトファンはアルカリ塩となり極め
て速やかに溶解する。

ついで、とのＴ、　−）リプトファンのアルカリ塩集し
た微生物は容易に戸別されＬ　−トＩＪブトファン、ア
ルカリ塩水溶液を得ることができる。

得られたＴ、　−）リプトファンのアルカリ塩の水溶液
は中和など通常の方法によりＬ　−）　ＩＪブトファン
として晶析させ取得することができる。

以下、本発明の方法を実施例により説明する。

実施例１ エシェリヒア・コリＭＴ−１０２４２ヲ培地５０罰に一
白金耳接種し、３０００にて２０時間振盪培養した。

培地組成Ｉ　肉エキス　　１．Ｏｗｔ係ペプトン　　０
．５ｗｔ％ 酵母エキス　０．１ｗｔ係 ＫＨ２ＰＯ４０，２Ｗ　ｔ　％ 初期ｐＨ７，０ 培養液１１を遠心分離して菌体を集め、これをトリプト
ファン・シンセターゼの酵素源とした。

シュードモナス・ブチ−ダニＦＯ１２９９６を培地組成
■の培地５ｏｍｌに一白金耳接種し、３０°Ｃにて２０
時間振盪培養した。培養液１１を遠心分離して菌体な集
め、これをセリン・ラセマーゼの酵素源とした。

培地組成■　肉エキス　　１．Ｏｗｔチペプトン　　０
．５ｗｔ係 ＮｃＬｉｌ　　　　０．５ｗｔ％ 初期ＰＨ７，，０ 攪拌機を備えた３００ＴＬｌフラスコにＤＬ−セリン１
１．６ｇ１硫酸アンモニウム６ｇ、ピリドキサールリン
酸１０〜および水６６９を加えて良くかきまぜる。濃ア
ンモニア水でＰＨを８．５に調整し、エシェリヒア・コ
リ湿潤沢塊６８Ｉ（固形分１７ｇ）およびシュードモナ
ス・プチーダ湿潤−塊３、４　ｊｊ　（固形分ｏ、ｓ５
．！ｉ’）を水に懸濁させ全体の体積を２ｏｍｌとして
加える。

３５°Ｃに保温したのち、インドール１１．５．！９を
溶解したトルエン溶液５７．２　ｇを加え３５°Ｃ１４
８時間反応させた。反応収率は定量的であった。

トルエンを蒸留により除去した。

製造されたＬ　−）　ＩＪブトファンの反応溶液を硫酸
でＰＨ４，０に調整し、９５〜９８°Ｃで１時間加熱処
理する。室温まで冷却後アンモニアガスを吹き込み、反
応液中のＬ−）リプトファンｋＬ−１Ｊブトファン、ア
ンモニウム塩として溶解する。こアンを添加し、−過す
ると微生物はセライト５４５、活性炭と共に戸別される
。このｆ液をｉｏｏ’に加熱しアンモニアを除去後、Ｌ
−）リプトファン濃度が１０ｗｔ％になる様に水で調製
し、２ｏ０ｃに冷却し析出した結晶を戸別、水洗、乾燥
する。Ｌ−トリプトファンの単離収率７５チ対生成トリ
プトファイメ純度を液体クロマトグラフィーで測定した
ところ９８．５　％であった。

実施例２ 実施例１と同様に製造されたＬ−）リプトファンの反応
溶液を遠心分離により沈澱としてＬ−トリプトファンの
結晶および微生物の混合物を得る。

この反応カラ環を水に排出し、Ｔ、　−）リプトファン
濃度３０ｗｔ％のスラリー液とする。この液を塩酸でＰ
Ｈ３，５に調整し、９５〜９８°Ｃで２時間加熱し反応
に用いた微生物を凝集させる。室温まで冷却後アンモニ
ア水を加え反応液中のＬ　−１−ＩＪブトファンをＬ−
）リプトファン・アンモニウム塩として溶解する。この
中に活性炭２０　ｗｔ％／）リプトファンを添加し凝集
した菌体を室温で戸別する。このＰ液を加温下窒素ガス
を吹込みアンモニアを除（。５°Ｃに冷却後析出したＬ
−）リプトファンを遠心脱水機で分離した。Ｌ−トリプ
トファンの単離収率８８係対生成トリプトフアン。純度
９８．０％であった。

実施例３ 実施例１と同様にして得られたＬ−）リプトファンの１
２ｗｔ％濃度の水溶液をリン酸でＰＨ４，０に調整し、
９５〜９８°Ｃに加熱する。２５°Ｃに冷却後２０％苛
性ソーダ水溶液を加えＰＩ（１０とする。このＬ−）リ
プトファンの溶解した水溶液に１ トリプトファンを添加し２０°でｒ過した。ｆ液を酢酸
でＰＨ６１Ｃ中和し析出したＬ　−）リプトファンの結
晶を戸別、乾燥したＴ、−）リプトファンの単離収率７
５チ対生成トリプトフアン、純度９９２チであった。

実施例４ 実施例２と同様にして得られたＴ、　−）リプトファン
の反応Ｐ塊を水とイソプロピルアルコール体積比１：１
の溶液に分散しＬ）ＩＪブトファン濃ｆ１２０ｗｔ％の
スラリー溶液とする。硫酸でＰＨ３５に調整し８０〜８
４°に２時間加熱した。５゜に冷却後アンモニアガスを
吹込み、Ｌ−）リプトノアン。アンモニウム塩としてＬ
　−）リプトファンを溶媒に溶解する。

活性炭２０ｗｔ％／）リプトファンを添加し、吸引ｆ過
すると、淡黄色透明の７．−　）　ＩＪブトファン浴液
が得られる。この溶液を加熱下窒素ガスを吹込みアンモ
ニアを除去する。

冷却後析出したＴ、−）　’）ブトファンの結晶を戸別
し乾燥すると単離収率８３チ対生成トリプトフア２ ンで得られた。純度９８．８％。

特許出願人　三井東圧化学株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １）微生物を利用してＬ−）リプトファンを製造する方
   法において、Ｌ−）リプトファンおよび微生物を含有す
   る反応生成液をｐＨ２〜５．で加熱処理し、ついでアル
   カリ処理をした後、微生物を除去することを特徴とする
   Ｌ−）リプトファンの分離方法。