JP2002508921A - アスパラギン酸−及び（又は）グルタミン酸系アミノ酸の微生物による産生方法及びこの方法で使用可能な剤 - Google Patents
アスパラギン酸−及び（又は）グルタミン酸系アミノ酸の微生物による産生方法及びこの方法で使用可能な剤Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 アスパラギン酸- 及び( 又は) グルタミン酸系アミノ酸の微生物による産生方法及びこの方法で使用可能な剤
【解決手段】本発明はピルビン酸カルボキシラーゼ活性をこの酵素の遺伝子変化によって及び( 又は) 対応するアミノ酸を産生する微生物のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子発現によって増加させることを特徴とする、アスパラギン酸- 及び( 又は) グルタミン酸系アミノ酸の微生物による産生方法に関する。さらに、本発明はピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子及びまた本発明の方法で使用可能な剤に関する。
Description
【０００１】 本発明は、請求項１ないし1 ７記載のアスパラギン酸- 及び( 又は) グルタ
ミン酸系アミノ酸の微生物による産生方法、請求項１８ないし２３記載のピルビ
ン酸カルボキシラーゼ遺伝子、請求項２４記載の遺伝子構造、請求項２５記載の
ベクター、請求項２６ないし３１記載の形質転換された細胞並びに請求項３２な
いし３７記載の使用方法に関する。
ミン酸系アミノ酸の微生物による産生方法、請求項１８ないし２３記載のピルビ
ン酸カルボキシラーゼ遺伝子、請求項２４記載の遺伝子構造、請求項２５記載の
ベクター、請求項２６ないし３１記載の形質転換された細胞並びに請求項３２な
いし３７記載の使用方法に関する。
【０００２】 アミノ酸は、産業上極めて重要であり、アミノ酸の使用は多様である：すなわ
ちたとえばＬ- リジン、たとえばＬ- スレオニン、Ｌ- メチオニン及びＬ- トリ
プトファンは飼料添加物として、Ｌ- グルタミン酸(Glutamat)は調味料として、
Ｌ- イソロイシン及びＬ- チロシンは医薬業界で、Ｌ- アルギニン及びＬ- イソ
ロイシンは薬剤として、あるいはＬ- グルタミン酸、Ｌ- アスパラギン酸(Aspar
at) 及びＬ- フエニルアラニンはファインケミカルズの合成用出発化合物として
必要とされる。
ちたとえばＬ- リジン、たとえばＬ- スレオニン、Ｌ- メチオニン及びＬ- トリ
プトファンは飼料添加物として、Ｌ- グルタミン酸(Glutamat)は調味料として、
Ｌ- イソロイシン及びＬ- チロシンは医薬業界で、Ｌ- アルギニン及びＬ- イソ
ロイシンは薬剤として、あるいはＬ- グルタミン酸、Ｌ- アスパラギン酸(Aspar
at) 及びＬ- フエニルアラニンはファインケミカルズの合成用出発化合物として
必要とされる。
【０００３】 この種々のアミノ酸製造の好ましい方法は、微生物によるバイオテクノロジー
法である。というのはこの方法で各アミノ酸の生物学的に有効かつ光学的に活性
な形が直ちに得られ、簡単かつ価格上有利な未精製物質を使用することができる
からである。微生物としてたとえばコリネバクテリウムグルタミクム(Corynebac
terium glutamicum)及びその同属菌ｓｓｐ．フラブム(flavum)及びｓｓｐ．ラク
トフェルメンタム(lactofermentum)(Liebel 等、Int J System Bacteriol (1991
) 41:255-260) 及びエシェリキア・コリ（大腸菌）(Escherichia coli)及びその
同属菌が使用される。
法である。というのはこの方法で各アミノ酸の生物学的に有効かつ光学的に活性
な形が直ちに得られ、簡単かつ価格上有利な未精製物質を使用することができる
からである。微生物としてたとえばコリネバクテリウムグルタミクム(Corynebac
terium glutamicum)及びその同属菌ｓｓｐ．フラブム(flavum)及びｓｓｐ．ラク
トフェルメンタム(lactofermentum)(Liebel 等、Int J System Bacteriol (1991
) 41:255-260) 及びエシェリキア・コリ（大腸菌）(Escherichia coli)及びその
同属菌が使用される。
【０００４】 しかしこの菌は、一般にアミノ酸を増殖に必要な量でしか産生しないので、過
剰のアミノ酸は産生されず、分離もされない。これは細胞内でアミノ酸の生合成
が簡単な方法で調節されるということに基づく。したがって生成物産生をコント
ロールメカニズムの遮断によって増加させる種々の方法はすでに公知である。こ
の方法に於ては、たとえばアミノ酸相似体を、生合成の有効な調節を遮断するた
めに使用する。したがってたとえばＬ- チロシン- 及びＬ- フエニルアラニン相
似体に耐性であるコリネバクテリウム菌株を使用する方法が開示されている（特
開昭５１−１９０３７号及び同５３−３９５１７号公報）。同様にＬ- リジン-
又はＬ- スレオニン相似体に耐性の細菌がコントロールメカニズムを阻害するた
めに使用されることが記載されている（ヨーロッパ特許第０２０５８４９号明細
書、英国特許第２１５２５０９号明細書）。
剰のアミノ酸は産生されず、分離もされない。これは細胞内でアミノ酸の生合成
が簡単な方法で調節されるということに基づく。したがって生成物産生をコント
ロールメカニズムの遮断によって増加させる種々の方法はすでに公知である。こ
の方法に於ては、たとえばアミノ酸相似体を、生合成の有効な調節を遮断するた
めに使用する。したがってたとえばＬ- チロシン- 及びＬ- フエニルアラニン相
似体に耐性であるコリネバクテリウム菌株を使用する方法が開示されている（特
開昭５１−１９０３７号及び同５３−３９５１７号公報）。同様にＬ- リジン-
又はＬ- スレオニン相似体に耐性の細菌がコントロールメカニズムを阻害するた
めに使用されることが記載されている（ヨーロッパ特許第０２０５８４９号明細
書、英国特許第２１５２５０９号明細書）。
【０００５】 更に、組換えＤＮＡ- 法によって産生された微生物も公知である。この際、同
様に生合成の調節は、もはやフィードバック阻害しない鍵酵素をコードする遺伝
子をクローン化し、そして発現することによって抑えられる。したがって、たと
えばプラスミド- コードされたフィードバック- 耐性アスパルタートキナーゼを
有する組換えられた、Ｌ- リジン産生細菌は公知である（ヨーロッパ特許第０３
８１５２７号明細書）。同様にフィードバック- 耐性プレフエナートデヒドロゲ
ナーゼを有する組換えられた、Ｌ- フエニルアラニン産生細菌も記載されている
（特開昭６１−１２３４７５号公報、ヨーロッパ特許第０４８８４２４号明細書
）。
様に生合成の調節は、もはやフィードバック阻害しない鍵酵素をコードする遺伝
子をクローン化し、そして発現することによって抑えられる。したがって、たと
えばプラスミド- コードされたフィードバック- 耐性アスパルタートキナーゼを
有する組換えられた、Ｌ- リジン産生細菌は公知である（ヨーロッパ特許第０３
８１５２７号明細書）。同様にフィードバック- 耐性プレフエナートデヒドロゲ
ナーゼを有する組換えられた、Ｌ- フエニルアラニン産生細菌も記載されている
（特開昭６１−１２３４７５号公報、ヨーロッパ特許第０４８８４２４号明細書
）。
【０００６】 更にアミノ酸合成のフィードバックセンスティブ酵素をコードしない遺伝子の
過発現によっても、増加されたアミノ酸収量が得られる。したがってたとえばリ
ジン産生は、ジヒドロピコリナートシンターゼの高められた合成によって改良さ
れる（ヨーロッパ特許第０１９７３３５号明細書）。スレオニンデヒドラターゼ
の高められた合成も改良されたイソロイシン産生が得られる（ヨーロッパ特許第
０４３６８８６号明細書）。
過発現によっても、増加されたアミノ酸収量が得られる。したがってたとえばリ
ジン産生は、ジヒドロピコリナートシンターゼの高められた合成によって改良さ
れる（ヨーロッパ特許第０１９７３３５号明細書）。スレオニンデヒドラターゼ
の高められた合成も改良されたイソロイシン産生が得られる（ヨーロッパ特許第
０４３６８８６号明細書）。
【０００７】 アミノ酸産生を増加させためのその他の試みは、主要な物質代謝の細胞の第一
代謝物質の改良された補給に向けられる。したがって組換え法によって得られる
、トランスケトラーゼの過発現が、Ｌ- トリプトファン、Ｌ- チロシン、又はＬ
- フエニルアラニンの改良された生成物産生を可能にすることは公知である（ヨ
ーロッパ特許第０６００４６３号明細書）。更に、コリネバクテリウム中でのホ
スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性の減少は、芳香族アミノ酸の改良
された産生を生じる（ヨーロッパ特許第０３３３１１４５号公報）。これに反し
て コリネバクテリウム中でのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性の増
加は、アスパラギン酸系アミノ酸の高められた分離を生じる（ヨーロッパ特許第
０３５８９４０号明細書）。
代謝物質の改良された補給に向けられる。したがって組換え法によって得られる
、トランスケトラーゼの過発現が、Ｌ- トリプトファン、Ｌ- チロシン、又はＬ
- フエニルアラニンの改良された生成物産生を可能にすることは公知である（ヨ
ーロッパ特許第０６００４６３号明細書）。更に、コリネバクテリウム中でのホ
スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性の減少は、芳香族アミノ酸の改良
された産生を生じる（ヨーロッパ特許第０３３３１１４５号公報）。これに反し
て コリネバクテリウム中でのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性の増
加は、アスパラギン酸系アミノ酸の高められた分離を生じる（ヨーロッパ特許第
０３５８９４０号明細書）。
【０００８】 増殖、とくにアミノ酸産生条件下での増殖の間、アミノ酸生合成で消費された
中間体を補充するために、トリカルボン酸回路はＣ４- 化合物、たとえばオキサ
ロ酢酸を連続的及び効果的に補給しなければならない。最近までコリネバクテリ
ウム中のこのいわゆるアナプレロティック作用にホスホエノールピルビン酸カル
ボキシラーゼが関与すると考えられていた(Kinoshita, Biology of industrial
micro-organisms 1985: 115-142, Benjamin/Cummings Publishing Company,ロン
ドン； Liebl, The prokaryotes II, 1991: 1157-1171, Springer 出版、 ニュー
ヨーク；Vallino 及び Stephanopoulos, Biotechnol Bioeng 1993, 41: 633-646
) 。しかしホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ陰性変異体はそれぞれの
出発菌株に比べてすべての試験される培地上で同様に増殖することが分かった（
Peters-Wendisch 等、FEMS Microbiology Letters 1993, 112: 269-274; Gubler等、Appl Microbiol Biotechnol 1994, 40: 857-863)。この結果は、ホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼが増殖に不可欠ではなく、かつアナプレ
ロティック反応にとって、あまり問題ではないか又はわずかしか問題ではないこ
とを示している。更に、上記結果から、増殖に必要であるオキサロ酢酸の合成に
係わるその他の酵素少なくとも１種をコリネバクテリウムに加えなければならな
いことが示されている。最近、実際にまたピルビン酸カルボキシラーゼ活性はコ
リネバクテリウムグルタミクムの透過細胞中にも見出されている（Peters-Wendi
sch 等、Microbiology 1997, 143: 1095-1103)。この酵素は、ＡＭＰ、ＡＤＰ及
びアセチル−補酵素Ａによって有効に阻害され、そして炭素源として乳酸(Lakta
t)の存在下に増加された量で生じる。この酵素は増殖の際にトリカルボン酸回路
の補給にまず関与することから開始しなければならないので、遺伝子発現の増加
又は酵素活性の増加はアスパラギン酸系に属するアノ酸の増加をまったく生じな
いか又は場合により少量の増加を生じることが予想された。更に、ピルビン酸カ
ルボキシラーゼの遺伝子発現の増加又は酵素活性の増加は同様にその他の系列の
アミノ酸の産生にまったく影響を与えないであろうと考えられる。
中間体を補充するために、トリカルボン酸回路はＣ４- 化合物、たとえばオキサ
ロ酢酸を連続的及び効果的に補給しなければならない。最近までコリネバクテリ
ウム中のこのいわゆるアナプレロティック作用にホスホエノールピルビン酸カル
ボキシラーゼが関与すると考えられていた(Kinoshita, Biology of industrial
micro-organisms 1985: 115-142, Benjamin/Cummings Publishing Company,ロン
ドン； Liebl, The prokaryotes II, 1991: 1157-1171, Springer 出版、 ニュー
ヨーク；Vallino 及び Stephanopoulos, Biotechnol Bioeng 1993, 41: 633-646
) 。しかしホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ陰性変異体はそれぞれの
出発菌株に比べてすべての試験される培地上で同様に増殖することが分かった（
Peters-Wendisch 等、FEMS Microbiology Letters 1993, 112: 269-274; Gubler等、Appl Microbiol Biotechnol 1994, 40: 857-863)。この結果は、ホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼが増殖に不可欠ではなく、かつアナプレ
ロティック反応にとって、あまり問題ではないか又はわずかしか問題ではないこ
とを示している。更に、上記結果から、増殖に必要であるオキサロ酢酸の合成に
係わるその他の酵素少なくとも１種をコリネバクテリウムに加えなければならな
いことが示されている。最近、実際にまたピルビン酸カルボキシラーゼ活性はコ
リネバクテリウムグルタミクムの透過細胞中にも見出されている（Peters-Wendi
sch 等、Microbiology 1997, 143: 1095-1103)。この酵素は、ＡＭＰ、ＡＤＰ及
びアセチル−補酵素Ａによって有効に阻害され、そして炭素源として乳酸(Lakta
t)の存在下に増加された量で生じる。この酵素は増殖の際にトリカルボン酸回路
の補給にまず関与することから開始しなければならないので、遺伝子発現の増加
又は酵素活性の増加はアスパラギン酸系に属するアノ酸の増加をまったく生じな
いか又は場合により少量の増加を生じることが予想された。更に、ピルビン酸カ
ルボキシラーゼの遺伝子発現の増加又は酵素活性の増加は同様にその他の系列の
アミノ酸の産生にまったく影響を与えないであろうと考えられる。
【０００９】 驚くべきことに本発明者は、酵素の遺伝的変化にるピルビン酸カルボキシラー
ゼ活性の増加によって及び( 又は) ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子発現の増
加によってアスパラギン酸- 及び( 又は) グルタミン酸系アミノ酸の微生物によ
る産生が増加することを見出した。ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の増加さ
れたコピー数を有する特定の菌株は、約５０％以上のリジン、４０％以上のスレ
オニン及び１５０％以上のホモセリンを培地中に分離することが分かった。更に
、驚くべきことにまたグルタミン酸の産生は著しく増加されることも分かった（
特に実施例６以下及び表４参照）。
ゼ活性の増加によって及び( 又は) ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子発現の増
加によってアスパラギン酸- 及び( 又は) グルタミン酸系アミノ酸の微生物によ
る産生が増加することを見出した。ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の増加さ
れたコピー数を有する特定の菌株は、約５０％以上のリジン、４０％以上のスレ
オニン及び１５０％以上のホモセリンを培地中に分離することが分かった。更に
、驚くべきことにまたグルタミン酸の産生は著しく増加されることも分かった（
特に実施例６以下及び表４参照）。
【００１０】 酵素活性の増加のためのピルビン酸カルボキシラーゼの遺伝的変化は、好まし
くは内因性遺伝子の突然変異によって行われる。このような突然変異は典型的な
方法にしたがって、たとえばＵＶ照射によって又は突然変異を引き起こす化学物
質によって不正に引き起こされるか、あるいは合目的に遺伝子工学によって、た
とえば欠失、 挿入及び( 又は) ヌクレオチド交換によって引き起こすことができ
る。
くは内因性遺伝子の突然変異によって行われる。このような突然変異は典型的な
方法にしたがって、たとえばＵＶ照射によって又は突然変異を引き起こす化学物
質によって不正に引き起こされるか、あるいは合目的に遺伝子工学によって、た
とえば欠失、 挿入及び( 又は) ヌクレオチド交換によって引き起こすことができ
る。
【００１１】 ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子発現は、遺伝子コピー数の増加によって及
び( 又は) 遺伝子の発現に積極的に影響を与える調節因子の補強によって高めら
れる。従って調節因子の補強は好ましくは転写レベルで行うことができる。この
場合特に転写シグナルは増加される。これはたとえば構造遺伝子に連結されたプ
ロモーター配列の変化によってその有効性が高められるか又はプロモーターをよ
り有効なプロモーターと完全に置き換えることによって行うことができる。また
転写の増大をピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子に整合された(zugeordneten)調
節遺伝子に対応する影響を与えることで行うことができる。更に、場合により調
節遺伝子配列の突然変異によって調節すべきピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子
のＤＮＡで調節たんぱく質の産生の有効性は影響され、これによって転写が増大
されかつ同時に遺伝子発現が増加するようになる。さらにしかもまたいわゆる“
エンハンサー”──────これはＲＮＡ−ポリメラーゼとＤＮＡとの間の改善
された相互作用によって同様に高められたピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子発
現を生じる───────は調節遺伝子としてピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝
子に整合させることができる。しかしこれと共にたとえばm-RNA の安定性が改善
されるので翻訳の増加も起こりうる。
び( 又は) 遺伝子の発現に積極的に影響を与える調節因子の補強によって高めら
れる。従って調節因子の補強は好ましくは転写レベルで行うことができる。この
場合特に転写シグナルは増加される。これはたとえば構造遺伝子に連結されたプ
ロモーター配列の変化によってその有効性が高められるか又はプロモーターをよ
り有効なプロモーターと完全に置き換えることによって行うことができる。また
転写の増大をピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子に整合された(zugeordneten)調
節遺伝子に対応する影響を与えることで行うことができる。更に、場合により調
節遺伝子配列の突然変異によって調節すべきピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子
のＤＮＡで調節たんぱく質の産生の有効性は影響され、これによって転写が増大
されかつ同時に遺伝子発現が増加するようになる。さらにしかもまたいわゆる“
エンハンサー”──────これはＲＮＡ−ポリメラーゼとＤＮＡとの間の改善
された相互作用によって同様に高められたピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子発
現を生じる───────は調節遺伝子としてピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝
子に整合させることができる。しかしこれと共にたとえばm-RNA の安定性が改善
されるので翻訳の増加も起こりうる。
【００１２】 遺伝子コピー数を増加させるために、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を遺
伝子構造中に又はベクター中に組み込む。この遺伝子構造は、特にピルビン酸カ
ルボキシラーゼ遺伝子に整合された調節配列を、好ましくは遺伝子発現を増大す
るような調節配列を含有する。遺伝子構造にピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子
を組み込むには、好ましくはコリネバクテリウム属の微生物株からこの遺伝子を
単離し、アミノ酸産生微生物株、特にコリネバクテリウム中で又はエシェリキア
・コリ（大腸菌）又はセラチア・マルセッセンス (Serratia marcescens)中で形
質転換させる。本発明による方法には、C.グルタミクム又はC.グルタミクム ssp.フラブム又は C. グルタミクム ssp. ラクトフェルメンタムからの遺伝子が
とくに適当である。遺伝子の単離及び公知のベクターによる試験管内組換え（た
とえばSimon 等、Bio/Tehcnnology 1983, 1:784-791; Eikmanns 等、Gene 1991,
102:93-98)の後、アミノ酸- 産生菌株中での形質転換をエレクトロポレーション
(Liebel 等、ＦＥＭＳ Microbiology Letters 1991,65:299-304)又は接合 (Konjugation)(Schaefer等、J Bacteriol 1990, 172:1663-1666)によって行う。
対応するアミノ酸の合成において調節されていないか及び（又は）対応するアミ
ノ酸に対して高められたエキスポートキャリヤー活性を有するようなアミノ酸産
生体を宿主菌株として使用するのが好ましい。更に、対応するアミノ酸の合成に
関与する主要な物質代謝産物の高められた割合を含有する菌株及び（又は）対応
するアミノ酸の合成に関与しない主要な物質代謝産物の、とくに競合反応に特有
である代謝物質の低下された割合を含有する菌株が好ましい。すなわち対応する
アミノ酸の生合成経路に競合する生合成経路が減少された活性と共に進行するよ
うな菌株が好ましい。したがって減少されたクエン酸合成活性を有する、Ｌ−ア
スパラギン酸−β−メチルエステル（ＡＭＥ）に耐性のコリネ型微生物菌株が特
に適当である（ヨーロッパ特許第０５５１６１４号明細書）。
伝子構造中に又はベクター中に組み込む。この遺伝子構造は、特にピルビン酸カ
ルボキシラーゼ遺伝子に整合された調節配列を、好ましくは遺伝子発現を増大す
るような調節配列を含有する。遺伝子構造にピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子
を組み込むには、好ましくはコリネバクテリウム属の微生物株からこの遺伝子を
単離し、アミノ酸産生微生物株、特にコリネバクテリウム中で又はエシェリキア
・コリ（大腸菌）又はセラチア・マルセッセンス (Serratia marcescens)中で形
質転換させる。本発明による方法には、C.グルタミクム又はC.グルタミクム ssp.フラブム又は C. グルタミクム ssp. ラクトフェルメンタムからの遺伝子が
とくに適当である。遺伝子の単離及び公知のベクターによる試験管内組換え（た
とえばSimon 等、Bio/Tehcnnology 1983, 1:784-791; Eikmanns 等、Gene 1991,
102:93-98)の後、アミノ酸- 産生菌株中での形質転換をエレクトロポレーション
(Liebel 等、ＦＥＭＳ Microbiology Letters 1991,65:299-304)又は接合 (Konjugation)(Schaefer等、J Bacteriol 1990, 172:1663-1666)によって行う。
対応するアミノ酸の合成において調節されていないか及び（又は）対応するアミ
ノ酸に対して高められたエキスポートキャリヤー活性を有するようなアミノ酸産
生体を宿主菌株として使用するのが好ましい。更に、対応するアミノ酸の合成に
関与する主要な物質代謝産物の高められた割合を含有する菌株及び（又は）対応
するアミノ酸の合成に関与しない主要な物質代謝産物の、とくに競合反応に特有
である代謝物質の低下された割合を含有する菌株が好ましい。すなわち対応する
アミノ酸の生合成経路に競合する生合成経路が減少された活性と共に進行するよ
うな菌株が好ましい。したがって減少されたクエン酸合成活性を有する、Ｌ−ア
スパラギン酸−β−メチルエステル（ＡＭＥ）に耐性のコリネ型微生物菌株が特
に適当である（ヨーロッパ特許第０５５１６１４号明細書）。
【００１３】 単離の後、ヌクレオチド配列を有するピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が得
られ、これはSEQ ID No.2 に記載されたアミノ酸配列、又はそのすべての変化を
コードするか又はSEQ ID No.１によるヌクレオチド１６５ないし３５８７のヌク
レオチド配列又は実質上同一に作用するＤＮＡ配列を有する。さらに、SEQ IDNo
. １によるヌクレオチド２０ないし１０９のヌクレオチド配列に連結されたプロ
モーター又は実質上同一に作用するＤＮＡ配列を有する遺伝子が得られる。すべ
ての変化又は同一に作用するＤＮＡ配列は、官能性誘導体を包含し、それは対応
する配列からヌクレオチドの欠失、 挿入及び( 又は) 置換によって得られる。こ
の場合酵素活性又は−機能は変わらないか又はさらに増加される。これらのピル
ビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を本発明の方法に使用するのが好ましい。
られ、これはSEQ ID No.2 に記載されたアミノ酸配列、又はそのすべての変化を
コードするか又はSEQ ID No.１によるヌクレオチド１６５ないし３５８７のヌク
レオチド配列又は実質上同一に作用するＤＮＡ配列を有する。さらに、SEQ IDNo
. １によるヌクレオチド２０ないし１０９のヌクレオチド配列に連結されたプロ
モーター又は実質上同一に作用するＤＮＡ配列を有する遺伝子が得られる。すべ
ての変化又は同一に作用するＤＮＡ配列は、官能性誘導体を包含し、それは対応
する配列からヌクレオチドの欠失、 挿入及び( 又は) 置換によって得られる。こ
の場合酵素活性又は−機能は変わらないか又はさらに増加される。これらのピル
ビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を本発明の方法に使用するのが好ましい。
【００１４】 連結されたプロモーターを有するか又はこれを有しないかあるいは整合された
調節遺伝子を有するか又はこれを有しないピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子に
ＤＮＡ配列１種又はそれ以上を前−又は後連結させることができ、その結果とし
てこの遺伝子は遺伝子構造に含まれる。
調節遺伝子を有するか又はこれを有しないピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子に
ＤＮＡ配列１種又はそれ以上を前−又は後連結させることができ、その結果とし
てこの遺伝子は遺伝子構造に含まれる。
【００１５】 ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子にｔａｃ−プロモーター（lacIQ - 遺伝子
）を連結させるのが好ましく、この場合これに特に調節配列を整合させる。
）を連結させるのが好ましく、この場合これに特に調節配列を整合させる。
【００１６】 ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子のクローン化によってこの遺伝子を有し、
そしてアミノ酸産生体の形質転換に適するプラスミドが得られる。形質転換によ
って得られた細胞──── これはコリネバクテリウムの形質転換細胞であるの
が好ましい──────は、上記遺伝子を複製可能な形で、すなわち染色体上（
この場合遺伝子コピーはゲノムの任意の位置での組換えによって完全なものとさ
れる）での及び（又は）プラスミド又はベクター上での更なるコピー形で包含す
る。 実施例 １．コリネバクテリウムグルタミクムからのピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子
のクローン化 従来公知のすべてのピルビン酸カルボキシラーゼ(pyc-)遺伝子の保存領域から
、サッカロマイセスセレヴィシアエ (Saccharomyces cerevisiae) (J Biol Chem 1988, 263: 11493-11497; Mol Gen Genet 1991, 229: 307-315), ヒト (Biochim Biophys Acta 1994, 1227: 46-52), マウス（Proc Natl Acad Sci, US
A 1993, 90: 1766-1770), アエデスアエジプチ(Aedes aegypti)(EMBL-GenBank:A
ccession No. L36530)から及びマイコバクテリウムツバキュロシス (Mycobacrerium tuberculosis) (EMBL-GenBank: Accession No. U00024) から出
発して、ＰＣＲプライマーを合成する(MWG Biotech) 。このプライマーはM ． tuberculosisのpyc-遺伝子の塩基810 〜831 及び1015〜1037に相当する。このプ
ライマーを用いて、 非変性(nicht-degenerierte)相同性プライマーに関するInni
s 等の標準法に従うＰＣＲ（PCR protocols. A guide to methods and applicat
ions, 1990, Academic Press) によってＣ．グルタミクム ATCC 13032 の染色体
ＤＮＡ（これはたとえばEikmanns等 (Microbiology 1994, 140: 1817-1828)に記
載されている）から約２００bpのフラグメントを単離して、増幅させる。２００
bpの大きさはpyc-遺伝子に対する予想値に相当する。ＰＣＲ生成物をSanger等 (Proc Natl Acad Sci, USA 1977, 74: 5463-5467) に記載されているように配列
化する。この配列化は自動ＤＮＡ配列化装置（Applied Biosystems) で蛍光標識
されたddNTPsを用いて行われる。Ｃ．グルタミクムからのこのＤＮＡフラグメン
トから出発して、つぎの相同オリゴヌクレオチドを産生させる：
そしてアミノ酸産生体の形質転換に適するプラスミドが得られる。形質転換によ
って得られた細胞──── これはコリネバクテリウムの形質転換細胞であるの
が好ましい──────は、上記遺伝子を複製可能な形で、すなわち染色体上（
この場合遺伝子コピーはゲノムの任意の位置での組換えによって完全なものとさ
れる）での及び（又は）プラスミド又はベクター上での更なるコピー形で包含す
る。 実施例 １．コリネバクテリウムグルタミクムからのピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子
のクローン化 従来公知のすべてのピルビン酸カルボキシラーゼ(pyc-)遺伝子の保存領域から
、サッカロマイセスセレヴィシアエ (Saccharomyces cerevisiae) (J Biol Chem 1988, 263: 11493-11497; Mol Gen Genet 1991, 229: 307-315), ヒト (Biochim Biophys Acta 1994, 1227: 46-52), マウス（Proc Natl Acad Sci, US
A 1993, 90: 1766-1770), アエデスアエジプチ(Aedes aegypti)(EMBL-GenBank:A
ccession No. L36530)から及びマイコバクテリウムツバキュロシス (Mycobacrerium tuberculosis) (EMBL-GenBank: Accession No. U00024) から出
発して、ＰＣＲプライマーを合成する(MWG Biotech) 。このプライマーはM ． tuberculosisのpyc-遺伝子の塩基810 〜831 及び1015〜1037に相当する。このプ
ライマーを用いて、 非変性(nicht-degenerierte)相同性プライマーに関するInni
s 等の標準法に従うＰＣＲ（PCR protocols. A guide to methods and applicat
ions, 1990, Academic Press) によってＣ．グルタミクム ATCC 13032 の染色体
ＤＮＡ（これはたとえばEikmanns等 (Microbiology 1994, 140: 1817-1828)に記
載されている）から約２００bpのフラグメントを単離して、増幅させる。２００
bpの大きさはpyc-遺伝子に対する予想値に相当する。ＰＣＲ生成物をSanger等 (Proc Natl Acad Sci, USA 1977, 74: 5463-5467) に記載されているように配列
化する。この配列化は自動ＤＮＡ配列化装置（Applied Biosystems) で蛍光標識
されたddNTPsを用いて行われる。Ｃ．グルタミクムからのこのＤＮＡフラグメン
トから出発して、つぎの相同オリゴヌクレオチドを産生させる：
【００１７】
【外１】
【００１８】 オリゴヌクレオチドをＣ．グルタミクムからのピルビン酸カルボキシラーゼ (pyc) 遺伝子用ゾンデの単離のためのＰＣＲ−プライマーとして使用する。この
プライマーはＣ．グルタミクムの染色体ＤＮＡとジゴキシゲニン（Digoxigenin)
標識されたヌクレオチドと共にＰＣＲ−反応に使用される。この反応をベーリン
ガーマンハイム社の“ＰＣＲＤＩＧラベリングキット”の処理にしたがって実施
する。このバッチを用いて、約２００bpの予想された大きさに相当するジゴキシ
ゲニン標識されたＤＮＡフラグメントを増幅させることができる。ついで産生さ
れたpyc-ソンデ(Sonde) を使用して、サザンブロットハイブリダイゼイションに
よってpyc-遺伝子が局在しているＣ．グルタミクムからの染色体ＤＮＡ中でＤＡ
Ｎフラグメントを同定する。さらにそれぞれ２〜５μｇのＣ．グルタミクムWTか
らの染色体ＤＮＡを制限酵素 HindIII, SphI, SalI ,DraI, EcoRI 及び BamHI で切断し、得られたＤＡＮフラグメントを１６時間２０Ｖで０．８％アガ
ロースゲル中で電気泳動によりその大きさに対応して分離する。アガロースゲル
中に存在するＤＡＮフラグメントをサザンの方法(J Mol Biol 1975, 98: 503-51
7)にしたがって変性し、Pharmacia LKB (Uppsala, スエーデン）のVacuGene Blo
t 装置で減圧保護し、ゲルマトリックスからナイロン膜（Schleicher及びSchuel
l のNytran N13, ダッセル、スイス）上に移して、固定化し、ジゴキシゲニン標
識物をNBT/X-ホスファターゼ反応によりアルカリ性ホスファターゼによって検出
する。この処理で、pyc-ＤＮＡソンデとハイブリット形成させる、次の染色体フ
ラグメントを検出することができる：17kb HindIII- フラグメント, 6.5kb SalI
- フラグメント及び1.35kb EcoRI- フラグメント。
プライマーはＣ．グルタミクムの染色体ＤＮＡとジゴキシゲニン（Digoxigenin)
標識されたヌクレオチドと共にＰＣＲ−反応に使用される。この反応をベーリン
ガーマンハイム社の“ＰＣＲＤＩＧラベリングキット”の処理にしたがって実施
する。このバッチを用いて、約２００bpの予想された大きさに相当するジゴキシ
ゲニン標識されたＤＮＡフラグメントを増幅させることができる。ついで産生さ
れたpyc-ソンデ(Sonde) を使用して、サザンブロットハイブリダイゼイションに
よってpyc-遺伝子が局在しているＣ．グルタミクムからの染色体ＤＮＡ中でＤＡ
Ｎフラグメントを同定する。さらにそれぞれ２〜５μｇのＣ．グルタミクムWTか
らの染色体ＤＮＡを制限酵素 HindIII, SphI, SalI ,DraI, EcoRI 及び BamHI で切断し、得られたＤＡＮフラグメントを１６時間２０Ｖで０．８％アガ
ロースゲル中で電気泳動によりその大きさに対応して分離する。アガロースゲル
中に存在するＤＡＮフラグメントをサザンの方法(J Mol Biol 1975, 98: 503-51
7)にしたがって変性し、Pharmacia LKB (Uppsala, スエーデン）のVacuGene Blo
t 装置で減圧保護し、ゲルマトリックスからナイロン膜（Schleicher及びSchuel
l のNytran N13, ダッセル、スイス）上に移して、固定化し、ジゴキシゲニン標
識物をNBT/X-ホスファターゼ反応によりアルカリ性ホスファターゼによって検出
する。この処理で、pyc-ＤＮＡソンデとハイブリット形成させる、次の染色体フ
ラグメントを検出することができる：17kb HindIII- フラグメント, 6.5kb SalI
- フラグメント及び1.35kb EcoRI- フラグメント。
【００１９】 17kb HindIII-フラグメントを単離し、サブクローン化する。さらにＣ．グルタ
ミクムの染色体ＤＡＮからのコスミド- 遺伝子バンク──────これはＣ．グ
ルタミクムのゲノムを９９％まで示す( Mol Microbiol 1992, 6: 317-326) ──
─────をコスミドpHC79 中で使用する。大腸菌株DH5 αをこの遺伝子バンク
を用いてSambrook等のCaCl2 方法(Molecular Cloning, A laboratory manual, 1
989, Cold Spring Habour Laboratry Press)によって形質転換させ、カナマイシ
ン５０μｇ／ｌを有するLB- 寒天プレート１つあたり約３００のコロニーを塗布
する（全体で５０００のコロニー）。ついで得られた形質転換体をNytran N13-
フィルター上に移し、この細胞をアルカリ性溶菌しかつＤＮＡを変性するために
、0.5M NaOH 及び1.5M NaCl で浸漬されたワットマン（Whatmann）紙上で５分間
インキュベートする、。つぎの中和は、1Mトリス /HCl pH 7.5及び1.5M NaCl を
用いて行われる。２×SSC 中でのフィルターをインキュベートした後、遊離され
たＤＮＡを３６６nmでＵＶ照射してフィルター上に固定する。ついで残りの細胞
残部を３×SSC30.1% SDS中で５０℃で振出して除去する。このフィルターを、サ
ザン（J Mol Biol 1975, 98: 503-517）に記載されているように特異的pyc-ソン
デを用いるハイブリッド形成のためにこの形態で使用する。pyc-ソンデに対して
ハイブリッド形成する３つの形質転換体を同定する。この形質転換体からコスミ
ド- ＤＮＡをBirnboimのアルカリ性溶菌法（Meth Enzymol 1983, 100: 243-255)
にしたがってプラスミド- 調製物を用いて単離し、次いで制限及びサザンブロッ
ト分析によってHindIII-フラグメントの存在をテストする。４０kb挿入を含有す
るコスミドpHC79-10は完全に17kb HindIII- フラグメントを有し、更に分析する
。エンドヌクレアーゼSalI及び EcoRIで制限した後でも染色体ＤＮＡにおけると
同一のハイブリット形成するフラグメント、 すなわち6.5kb SalI- 及び1.35kb E
coRI- フラグメントが得られることがわかった。17kb HindIII- フラグメントを
HindIII で制限して上記コスミドから単離して、同様にHindIII で切断されたEc
oli-ベクターpUC18 に連結させる。得られたベクターpUCpyc中でのフラグメント
の制限酵素分析が準備される。フラグメントの物理的地図を図１に示す。 ２．ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の配列化 別のサブクローン化工程で、0.85kb SalI- EcoRI- フラグメント、1.35kb Eco
RI- フラグメント、1.6kb EcoRI-EcoRI-StuI- フラグメント及び1.6kb ClaI- フ
ラグメント─────これは一部0.85kb SalI- EcoRI- フラグメントと重複する
───を対応する制限酵素での制限によってプラスミドpUCpycから単離する。連
結によって、これらのフラグメントをそれぞれ対応する制限されたベクターpUC1
8 中でクローン化し、ついでSanger等(Proc Natl Acad Sci, USA 1977, 74: 546
3-5467) に記載されているように配列化する。得られたヌクレオチド配列をドイ
ツ癌研究センター（ハイデルベルグ）のプログラムパケット（Programmpaket)HU
SAR (Release 3.0) で分析する。フラグメントの配列分析は１１４０個のアミノ
酸の蛋白質配列をコードする3576bpのことごとく開いた選択網目スクリーン（La
seraster) を生じる。誘導された蛋白質配列とEMBL遺伝子- データバンク（ハイ
デルベルグ）を比較すると、すべての公知のピルビン酸カルボキシラーゼとの相
似性を生じる。最も高い同定（62% ）は、推定上のピルビン酸カルボキシラーゼ
に対してマイコバクテリウムツバキュロシス（EMBL- 遺伝子バンク：Accession
No.U00024)から見出される。相似性は保存アミノ酸交換の考慮下で７６％である
。その他の微生物のピルビン酸カルボキシラーゼとの比較から、同一アミノ酸４
６〜４７％及び類似のアミノ酸６４〜６５％が生じる（Gene 1997.191:47-50; J
Bacteriol 1996,178: 5960-5970; Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 1766-17
70; Biochem J 1996, 316: 631-637; EMBL-GenBank: Accession No. L36530; J
BiolChem 1998, 263: 11493-11497; Mol Gen Genet 1991, 229: 307-315)。 この
結果からクローン化されたフラグメントはＣ．グルタミクムからのピルビン酸カ
ルボキシラーゼに対する遺伝子を有することが結論づけられる。この遺伝子のヌ
クレオチド配列はSEQ ID No.1 に、そして対応するアミノ酸配列はSEQ ID No.2
に記載されている。 ３．ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の過発現 Ｃ．グルタミクムからのピルビン酸カルボキシラーゼに対する遺伝子の過発現
のために、プラスミドpUCpycからの遺伝子を6.2kb SspI-ScaI-フラグメントとし
て、制限エンドヌクレアーゼ EcoRI及びPstIで切断される大腸菌- Ｃ．グルタミ
クム- ペンデル(Pendel)ベクターpEK0(Gene 1991, 102:93-98)中でクローン化す
る。クレノーポリメラーゼ処理によって突出（付着）端を平滑末端にするか (aufgefuellt) （EcoRI ）又は持続させて(abgedaut)（PstI）、線状化されたベ
クターを6.2kb SspI-ScaI-フラグメントに連結させる。得られた構造pEK0pyc を
まず大腸菌DH5 α株中で形質転換させ、得られた形質転換体上でプラスミド-DNA
を単離して、挿入の適正を制限によって制御する。ついでこのDNA を菌株SP733
中にエレクトロポラーションによって挿入する（FEMS Microbiol Lett 1989, 65
: 299-304)。この菌株は制限陰性Ｃ．グルタミクム菌株 R127 の突然変異であっ
て (Dechema Biotechnology Conference 1990, 4: 323-327, Verlag Chemie)、これ
は化学的突然変異生成によって得られ、そして唯一の炭素源としてピルビン酸及
び乳酸を有する最小培地上で増殖できないことで特徴づけられる（Microbiology
1997, 143:1095-1103)。この表現型はピルビン酸カルボキシラーゼ中で欠損させ
ることによって誘発され、Ｃ．グルタミクムからのピルビン酸カルボキシラーゼ
遺伝子の挿入によって相補することができる。すなわちプラスミドpEK0pyc を有
する菌株は出発菌株とは対照的に、唯一の炭素源として乳酸を有する最小培地上
で再び増殖できる。したがってこの遺伝子は官能性ピルビン酸カルボキシラーゼ
をコードすることが証明される。
ミクムの染色体ＤＡＮからのコスミド- 遺伝子バンク──────これはＣ．グ
ルタミクムのゲノムを９９％まで示す( Mol Microbiol 1992, 6: 317-326) ──
─────をコスミドpHC79 中で使用する。大腸菌株DH5 αをこの遺伝子バンク
を用いてSambrook等のCaCl2 方法(Molecular Cloning, A laboratory manual, 1
989, Cold Spring Habour Laboratry Press)によって形質転換させ、カナマイシ
ン５０μｇ／ｌを有するLB- 寒天プレート１つあたり約３００のコロニーを塗布
する（全体で５０００のコロニー）。ついで得られた形質転換体をNytran N13-
フィルター上に移し、この細胞をアルカリ性溶菌しかつＤＮＡを変性するために
、0.5M NaOH 及び1.5M NaCl で浸漬されたワットマン（Whatmann）紙上で５分間
インキュベートする、。つぎの中和は、1Mトリス /HCl pH 7.5及び1.5M NaCl を
用いて行われる。２×SSC 中でのフィルターをインキュベートした後、遊離され
たＤＮＡを３６６nmでＵＶ照射してフィルター上に固定する。ついで残りの細胞
残部を３×SSC30.1% SDS中で５０℃で振出して除去する。このフィルターを、サ
ザン（J Mol Biol 1975, 98: 503-517）に記載されているように特異的pyc-ソン
デを用いるハイブリッド形成のためにこの形態で使用する。pyc-ソンデに対して
ハイブリッド形成する３つの形質転換体を同定する。この形質転換体からコスミ
ド- ＤＮＡをBirnboimのアルカリ性溶菌法（Meth Enzymol 1983, 100: 243-255)
にしたがってプラスミド- 調製物を用いて単離し、次いで制限及びサザンブロッ
ト分析によってHindIII-フラグメントの存在をテストする。４０kb挿入を含有す
るコスミドpHC79-10は完全に17kb HindIII- フラグメントを有し、更に分析する
。エンドヌクレアーゼSalI及び EcoRIで制限した後でも染色体ＤＮＡにおけると
同一のハイブリット形成するフラグメント、 すなわち6.5kb SalI- 及び1.35kb E
coRI- フラグメントが得られることがわかった。17kb HindIII- フラグメントを
HindIII で制限して上記コスミドから単離して、同様にHindIII で切断されたEc
oli-ベクターpUC18 に連結させる。得られたベクターpUCpyc中でのフラグメント
の制限酵素分析が準備される。フラグメントの物理的地図を図１に示す。 ２．ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の配列化 別のサブクローン化工程で、0.85kb SalI- EcoRI- フラグメント、1.35kb Eco
RI- フラグメント、1.6kb EcoRI-EcoRI-StuI- フラグメント及び1.6kb ClaI- フ
ラグメント─────これは一部0.85kb SalI- EcoRI- フラグメントと重複する
───を対応する制限酵素での制限によってプラスミドpUCpycから単離する。連
結によって、これらのフラグメントをそれぞれ対応する制限されたベクターpUC1
8 中でクローン化し、ついでSanger等(Proc Natl Acad Sci, USA 1977, 74: 546
3-5467) に記載されているように配列化する。得られたヌクレオチド配列をドイ
ツ癌研究センター（ハイデルベルグ）のプログラムパケット（Programmpaket)HU
SAR (Release 3.0) で分析する。フラグメントの配列分析は１１４０個のアミノ
酸の蛋白質配列をコードする3576bpのことごとく開いた選択網目スクリーン（La
seraster) を生じる。誘導された蛋白質配列とEMBL遺伝子- データバンク（ハイ
デルベルグ）を比較すると、すべての公知のピルビン酸カルボキシラーゼとの相
似性を生じる。最も高い同定（62% ）は、推定上のピルビン酸カルボキシラーゼ
に対してマイコバクテリウムツバキュロシス（EMBL- 遺伝子バンク：Accession
No.U00024)から見出される。相似性は保存アミノ酸交換の考慮下で７６％である
。その他の微生物のピルビン酸カルボキシラーゼとの比較から、同一アミノ酸４
６〜４７％及び類似のアミノ酸６４〜６５％が生じる（Gene 1997.191:47-50; J
Bacteriol 1996,178: 5960-5970; Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 1766-17
70; Biochem J 1996, 316: 631-637; EMBL-GenBank: Accession No. L36530; J
BiolChem 1998, 263: 11493-11497; Mol Gen Genet 1991, 229: 307-315)。 この
結果からクローン化されたフラグメントはＣ．グルタミクムからのピルビン酸カ
ルボキシラーゼに対する遺伝子を有することが結論づけられる。この遺伝子のヌ
クレオチド配列はSEQ ID No.1 に、そして対応するアミノ酸配列はSEQ ID No.2
に記載されている。 ３．ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の過発現 Ｃ．グルタミクムからのピルビン酸カルボキシラーゼに対する遺伝子の過発現
のために、プラスミドpUCpycからの遺伝子を6.2kb SspI-ScaI-フラグメントとし
て、制限エンドヌクレアーゼ EcoRI及びPstIで切断される大腸菌- Ｃ．グルタミ
クム- ペンデル(Pendel)ベクターpEK0(Gene 1991, 102:93-98)中でクローン化す
る。クレノーポリメラーゼ処理によって突出（付着）端を平滑末端にするか (aufgefuellt) （EcoRI ）又は持続させて(abgedaut)（PstI）、線状化されたベ
クターを6.2kb SspI-ScaI-フラグメントに連結させる。得られた構造pEK0pyc を
まず大腸菌DH5 α株中で形質転換させ、得られた形質転換体上でプラスミド-DNA
を単離して、挿入の適正を制限によって制御する。ついでこのDNA を菌株SP733
中にエレクトロポラーションによって挿入する（FEMS Microbiol Lett 1989, 65
: 299-304)。この菌株は制限陰性Ｃ．グルタミクム菌株 R127 の突然変異であっ
て (Dechema Biotechnology Conference 1990, 4: 323-327, Verlag Chemie)、これ
は化学的突然変異生成によって得られ、そして唯一の炭素源としてピルビン酸及
び乳酸を有する最小培地上で増殖できないことで特徴づけられる（Microbiology
1997, 143:1095-1103)。この表現型はピルビン酸カルボキシラーゼ中で欠損させ
ることによって誘発され、Ｃ．グルタミクムからのピルビン酸カルボキシラーゼ
遺伝子の挿入によって相補することができる。すなわちプラスミドpEK0pyc を有
する菌株は出発菌株とは対照的に、唯一の炭素源として乳酸を有する最小培地上
で再び増殖できる。したがってこの遺伝子は官能性ピルビン酸カルボキシラーゼ
をコードすることが証明される。
【００２０】 更に、プラスミドpEK0pyc をＣ．グルタミクム野生型ATCC 13032中でエレクト
ロポラーションに形質転換させる。得られた菌株WT（pEK0pyc ）を、そのピルビ
ン酸カルボキシラーゼ活性に関して野生型ATCC 13032と比べて調べる。この菌株
を0.5%乳酸を有する複合培地中で（Luria-Bertani, Molecular Cloning, A laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press)及び2%乳
酸又は4%グルコースを有する最小培地上で増殖して、ピルビン酸カルボキシラー
ゼテストをPeters-Wendisch 等(Microbiology 1997, 143: 1095-1103) に記載さ
れているような方法にしたがって行う。分析の結果（表１）から、pEK0-pyc- 保
持- 菌株中のピルビン酸カルボキシラーゼ活性は出発菌株におけるよりも約４倍
高いことが分かる。 ４．Ｃ．グルタミクムDG52-5中でのピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の過発現
によるリジンの増加された蓄積 リジン産生菌株DG52-5中でのピルビン酸カルボキシラーゼに対する遺伝子の過発
現の発生を調べるために（J Gen Microbiol 1988, 134; 3221-3229),IPTG- 誘発
発現を可能にする発現ベクターpVWEX1を使用する。このベクター中でpyc 遺伝子
はプロモーター不含でクローン化される。更にＰＣＲ- プライマー（プライマー
１＝SEQ ID No.1 によるヌクレオチド配列において位置112-133;プライマー２＝
SEQ ID No.1 によるヌクレオチド配列において位置373-355 ）をまず合成し、つ
いでピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子のプロモーター不含出発領域261bp をＰ
ＣＲによって増幅する。このプライマーは、プライマー１がPstI切断部位をもた
らし、そしてプライマー２がBamHI 切断部位をもたらすように選ばれる。ＰＣＲ
の後、得られた274 bp PCR- 生成物を単離して、コンカテマーに連結させ、つい
で制限酵素PstI及びBamHI で切断する。反応調製物を、エタノール沈殿によって
濃縮し、ついでPstI-BamHI- 切断されたベクターpVWEX1に連結させる。得られた
構造pVWEX1-PCRを制限によってテストする。pcy 遺伝子の末端域をRcaI- クレノ
ー-SalI-処理によってベクターpEK0pcy から単離して、BamHI-クレノー-SalI-処
理されたベクターpVWEX1-PCRに連結させる。得られた構造pVWEX1pcy を制限酵素
地図によって分析する。プラスミドの物理的地図を図２に示す。
ロポラーションに形質転換させる。得られた菌株WT（pEK0pyc ）を、そのピルビ
ン酸カルボキシラーゼ活性に関して野生型ATCC 13032と比べて調べる。この菌株
を0.5%乳酸を有する複合培地中で（Luria-Bertani, Molecular Cloning, A laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press)及び2%乳
酸又は4%グルコースを有する最小培地上で増殖して、ピルビン酸カルボキシラー
ゼテストをPeters-Wendisch 等(Microbiology 1997, 143: 1095-1103) に記載さ
れているような方法にしたがって行う。分析の結果（表１）から、pEK0-pyc- 保
持- 菌株中のピルビン酸カルボキシラーゼ活性は出発菌株におけるよりも約４倍
高いことが分かる。 ４．Ｃ．グルタミクムDG52-5中でのピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の過発現
によるリジンの増加された蓄積 リジン産生菌株DG52-5中でのピルビン酸カルボキシラーゼに対する遺伝子の過発
現の発生を調べるために（J Gen Microbiol 1988, 134; 3221-3229),IPTG- 誘発
発現を可能にする発現ベクターpVWEX1を使用する。このベクター中でpyc 遺伝子
はプロモーター不含でクローン化される。更にＰＣＲ- プライマー（プライマー
１＝SEQ ID No.1 によるヌクレオチド配列において位置112-133;プライマー２＝
SEQ ID No.1 によるヌクレオチド配列において位置373-355 ）をまず合成し、つ
いでピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子のプロモーター不含出発領域261bp をＰ
ＣＲによって増幅する。このプライマーは、プライマー１がPstI切断部位をもた
らし、そしてプライマー２がBamHI 切断部位をもたらすように選ばれる。ＰＣＲ
の後、得られた274 bp PCR- 生成物を単離して、コンカテマーに連結させ、つい
で制限酵素PstI及びBamHI で切断する。反応調製物を、エタノール沈殿によって
濃縮し、ついでPstI-BamHI- 切断されたベクターpVWEX1に連結させる。得られた
構造pVWEX1-PCRを制限によってテストする。pcy 遺伝子の末端域をRcaI- クレノ
ー-SalI-処理によってベクターpEK0pcy から単離して、BamHI-クレノー-SalI-処
理されたベクターpVWEX1-PCRに連結させる。得られた構造pVWEX1pcy を制限酵素
地図によって分析する。プラスミドの物理的地図を図２に示す。
【００２１】 プラスミドをエレクトロポレーションによってＣ. グルタミクム菌株 DG52-5
に挿入する。コントロールとして、菌株 DG52-5 をベクターpVWEX1で挿入せずに
形質転換させて、それぞれ３つの異なる形質転換体のL-リジン分離を比較する。
更に DG52-5 （pVWEX1）１、２及び３並びにDG52-5（pVWEX1pcy ）３、４及び６
を複合培地（2 ×TY; Molecular Cloning, A laboratory manual, 1989, Cold S
pringHarbour Laboratory Press;５０μｇ／ｌカナマイシンを含有）中で増殖さ
せ、ついで醗酵培地CGXII(J Bioteriol; 1993, 175: 5595-5603)に前培養からそ
れぞれ分離して、 植菌する。この培地は、プラスミドを安定に保つためにさらに
カナマイシンを含有する。それぞれ２つの平行した調製を行う。この際１つのフ
ラスコに２００μｇIPTG/ml を添加し、一方もう一つのフラスコはIPTGを含有し
ない。１２０Upm の回転振とう機で３０℃で４８時間培養した後、培地中に蓄積
するリジン量を測定する。アミノ酸濃度の測定は高圧液体クロマトグラフィー (J Chromat 1983, 266; 471-482)によって行われる。醗酵の結果を表２に示す。
この際記載された値は異なるクローンを用いたそれぞれ３つの発現からの平均値
である。ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の過発現は、培地中でリジン濃度の
約５０％増加を生じる。したがってアナプレロティック酵素ピルビン酸カルボキ
シラーゼに対して見出されかつ記載された遺伝子の有用性は、Ｌ−リジン形成を
著しく改善する処理にある。 ５．Ｃ. グルタミクムDM368-3 菌株でのピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の過
発現によるスレオニン及びホモセリンの増加された蓄積 Ｌ−リジン形成のための発現と同様に、培養上澄み液中のスレオニンの蓄積も
またピルビン酸カルボキシラーゼに対する遺伝子の過発現によって調べる。上記
４に記載したように、これにはスレオニン産生菌株Ｃ. グルタミクムDM368-3 (D
eggusa AG)をプラスミドpVWEX1pcy で並びにコントロールのためにプラスミド pVWEX1で形質転換して、それぞれ３つの異なる形質転換体のスレオニン分離を調
べる。更にDM368-3 （pVWEX1）１、２及び３並びにDM368-3 （pVWEX1pcy ）１、
２及び３を複合培地（2 ×TY; ５０μｇ／ｌカナマイシンを含有）中で増殖させ
、ついで醗酵培地CGXII(J Bioterio; 1993, 175: 5595-5603) に前培養からそれ
ぞれ分離して、 植菌する。この培地は、プラスミドを安定に保つためにさらにカ
ナマイシンを含有する。それぞれ２つの平行した調製を行う。この際１つのフラ
スコに２００μｇIPTG/ml を添加し、一方もう一つのフラスコはIPTGを含有しな
い。１２０Upm の回転振とう機で３０℃で４８時間培養した後、培地中に蓄積す
るスレオニン量を測定する。アミノ酸濃度の測定は同様に高圧液体クロマトグラ
フィー（J Chromat 1983, 266; 471-482) によって行われる。醗酵の結果を表３
に示す。この際記載された値は異なるクローンを用いたそれぞれ３つの発現から
の平均値である。ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の過発現は、培地中でスレ
オニン濃度の約４０％増加を生じる。したがってアナプレロティック酵素ピルビ
ン酸カルボキシラーゼに対して見出されかつ記載された遺伝子の有用性は、Ｌ−
スレオニン形成を著しく改善する処理にある。
に挿入する。コントロールとして、菌株 DG52-5 をベクターpVWEX1で挿入せずに
形質転換させて、それぞれ３つの異なる形質転換体のL-リジン分離を比較する。
更に DG52-5 （pVWEX1）１、２及び３並びにDG52-5（pVWEX1pcy ）３、４及び６
を複合培地（2 ×TY; Molecular Cloning, A laboratory manual, 1989, Cold S
pringHarbour Laboratory Press;５０μｇ／ｌカナマイシンを含有）中で増殖さ
せ、ついで醗酵培地CGXII(J Bioteriol; 1993, 175: 5595-5603)に前培養からそ
れぞれ分離して、 植菌する。この培地は、プラスミドを安定に保つためにさらに
カナマイシンを含有する。それぞれ２つの平行した調製を行う。この際１つのフ
ラスコに２００μｇIPTG/ml を添加し、一方もう一つのフラスコはIPTGを含有し
ない。１２０Upm の回転振とう機で３０℃で４８時間培養した後、培地中に蓄積
するリジン量を測定する。アミノ酸濃度の測定は高圧液体クロマトグラフィー (J Chromat 1983, 266; 471-482)によって行われる。醗酵の結果を表２に示す。
この際記載された値は異なるクローンを用いたそれぞれ３つの発現からの平均値
である。ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の過発現は、培地中でリジン濃度の
約５０％増加を生じる。したがってアナプレロティック酵素ピルビン酸カルボキ
シラーゼに対して見出されかつ記載された遺伝子の有用性は、Ｌ−リジン形成を
著しく改善する処理にある。 ５．Ｃ. グルタミクムDM368-3 菌株でのピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の過
発現によるスレオニン及びホモセリンの増加された蓄積 Ｌ−リジン形成のための発現と同様に、培養上澄み液中のスレオニンの蓄積も
またピルビン酸カルボキシラーゼに対する遺伝子の過発現によって調べる。上記
４に記載したように、これにはスレオニン産生菌株Ｃ. グルタミクムDM368-3 (D
eggusa AG)をプラスミドpVWEX1pcy で並びにコントロールのためにプラスミド pVWEX1で形質転換して、それぞれ３つの異なる形質転換体のスレオニン分離を調
べる。更にDM368-3 （pVWEX1）１、２及び３並びにDM368-3 （pVWEX1pcy ）１、
２及び３を複合培地（2 ×TY; ５０μｇ／ｌカナマイシンを含有）中で増殖させ
、ついで醗酵培地CGXII(J Bioterio; 1993, 175: 5595-5603) に前培養からそれ
ぞれ分離して、 植菌する。この培地は、プラスミドを安定に保つためにさらにカ
ナマイシンを含有する。それぞれ２つの平行した調製を行う。この際１つのフラ
スコに２００μｇIPTG/ml を添加し、一方もう一つのフラスコはIPTGを含有しな
い。１２０Upm の回転振とう機で３０℃で４８時間培養した後、培地中に蓄積す
るスレオニン量を測定する。アミノ酸濃度の測定は同様に高圧液体クロマトグラ
フィー（J Chromat 1983, 266; 471-482) によって行われる。醗酵の結果を表３
に示す。この際記載された値は異なるクローンを用いたそれぞれ３つの発現から
の平均値である。ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の過発現は、培地中でスレ
オニン濃度の約４０％増加を生じる。したがってアナプレロティック酵素ピルビ
ン酸カルボキシラーゼに対して見出されかつ記載された遺伝子の有用性は、Ｌ−
スレオニン形成を著しく改善する処理にある。
【００２２】 更に、アミノ酸濃度測定から、驚くべきことにまた、過発現されたピルビン酸
カルボキシラーゼ遺伝子を有する菌株は過発現されていない遺伝子を有する菌株
に比べて約150 ％多くのホモセリンを培地中に分離することが分かった。この対
応する結果は同様に表３に示す。このことから本発明の方法によればスレオニン
形成及びホモセリン形成を著しく改善することができることが明らかである。 ６．Ｃ. グルタミクムの野生型でのピルビン酸カルボキシラーゼに対する遺伝子
の過発現によるグルタミン酸(Glutamat)の増加された蓄積 Ｌ−リジン- ，Ｌ−スレオニン- 及びＬ−ホモセリン- 形成のための発現と同
様に（上記４及び５参照）、培養上澄み液中のグルタミン酸の蓄積もまたピルビ
ン酸カルボキシラーゼに対する遺伝子の過発現によって調べる。上記４に記載し
たように、野生型Ｃ. グルタミクムＡＴＣＣ13032 をプラスミドpVWEX1pcy で並
びにコントロールのためにプラスミドpVWEX1で形質転換して、それぞれ２つの異
なる形質転換体のグルタミン酸分離を調べる。更にＣ. グルタミクムＡＴＣＣ13
032 （pVWEX1pcy ）Ｄ１及びＤ２並びにＣ. グルタミクムＡＴＣＣ13032 （pVWE
X1pcy ）１及び２を複合培地（2 ×TY; ５０μｇ／ｌカナマイシンを含有）中で
増殖し、ついで醗酵培地CGXII(J Bioteriol; 1993, 175: 5595-5603)に前培養か
らそれぞれ分離して、 植菌する。この培地は、プラスミドを安定に保つためにさ
らにカナマイシンを含有する。グルタミン酸分離を誘発するために、接種約６時
間後１ｍｌあたりトゥイーン６０２５ｍｇを培地に添加する。それぞれ２つの平
行した調製を行う。この際１つのフラスコに２００μｇIPTG/ml を添加し、一方
もう一つのフラスコはIPTGを含有しない。１２０Upm の回転振とう機で３０℃で
４８時間培養した後、培地中に蓄積するグルタミン酸量を測定する。アミノ酸濃
度の測定は同様に高圧液体クロマトグラフィー（J Chromat 1983, 266; 471-482
) によって行われる。醗酵の結果を表４に示す。この際記載された値は異なるク
ローンを用いたそれぞれ２つの発現からの平均値である。ピルビン酸カルボキシ
ラーゼ遺伝子の過発現は、培地中でグルタミン酸濃度約５００％までの増加を生
じる。したがってアナプレロティック酵素ピルビン酸カルボキシラーゼに対して
見出されかつ記載された遺伝子の有用性は、Ｌ−グルタミン酸形成を著しく改善
する操作にある。
カルボキシラーゼ遺伝子を有する菌株は過発現されていない遺伝子を有する菌株
に比べて約150 ％多くのホモセリンを培地中に分離することが分かった。この対
応する結果は同様に表３に示す。このことから本発明の方法によればスレオニン
形成及びホモセリン形成を著しく改善することができることが明らかである。 ６．Ｃ. グルタミクムの野生型でのピルビン酸カルボキシラーゼに対する遺伝子
の過発現によるグルタミン酸(Glutamat)の増加された蓄積 Ｌ−リジン- ，Ｌ−スレオニン- 及びＬ−ホモセリン- 形成のための発現と同
様に（上記４及び５参照）、培養上澄み液中のグルタミン酸の蓄積もまたピルビ
ン酸カルボキシラーゼに対する遺伝子の過発現によって調べる。上記４に記載し
たように、野生型Ｃ. グルタミクムＡＴＣＣ13032 をプラスミドpVWEX1pcy で並
びにコントロールのためにプラスミドpVWEX1で形質転換して、それぞれ２つの異
なる形質転換体のグルタミン酸分離を調べる。更にＣ. グルタミクムＡＴＣＣ13
032 （pVWEX1pcy ）Ｄ１及びＤ２並びにＣ. グルタミクムＡＴＣＣ13032 （pVWE
X1pcy ）１及び２を複合培地（2 ×TY; ５０μｇ／ｌカナマイシンを含有）中で
増殖し、ついで醗酵培地CGXII(J Bioteriol; 1993, 175: 5595-5603)に前培養か
らそれぞれ分離して、 植菌する。この培地は、プラスミドを安定に保つためにさ
らにカナマイシンを含有する。グルタミン酸分離を誘発するために、接種約６時
間後１ｍｌあたりトゥイーン６０２５ｍｇを培地に添加する。それぞれ２つの平
行した調製を行う。この際１つのフラスコに２００μｇIPTG/ml を添加し、一方
もう一つのフラスコはIPTGを含有しない。１２０Upm の回転振とう機で３０℃で
４８時間培養した後、培地中に蓄積するグルタミン酸量を測定する。アミノ酸濃
度の測定は同様に高圧液体クロマトグラフィー（J Chromat 1983, 266; 471-482
) によって行われる。醗酵の結果を表４に示す。この際記載された値は異なるク
ローンを用いたそれぞれ２つの発現からの平均値である。ピルビン酸カルボキシ
ラーゼ遺伝子の過発現は、培地中でグルタミン酸濃度約５００％までの増加を生
じる。したがってアナプレロティック酵素ピルビン酸カルボキシラーゼに対して
見出されかつ記載された遺伝子の有用性は、Ｌ−グルタミン酸形成を著しく改善
する操作にある。
【００２３】
【表１】
【００２４】
【表２】
【００２５】
【表３】
【００２６】
【表４】
【配列表】
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１１年１０月５日（１９９９．１０．５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００８】 増殖、とくにアミノ酸産生条件下での増殖の間、アミノ酸生合成で消費された
中間体を補充するために、トリカルボン酸回路はＣ４- 化合物、たとえばオキサ
ロ酢酸を連続的及び効果的に補給しなければならない。最近までコリネバクテリ
ウム中のこのいわゆるアナプレロティック作用にホスホエノールピルビン酸カル
ボキシラーゼが関与すると考えられていた(Kinoshita, Biology of industrial
micro-organisms 1985: 115-142, Benjamin/Cummings Publishing Company,ロン
ドン； Liebl, The prokaryotes II, 1991: 1157-1171, Springer 出版、 ニュー
ヨーク；Vallino 及び Stephanopoulos, Biotechnol Bioeng 1993, 41: 633-646
) 。しかしホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ陰性変異体はそれぞれの
出発菌株に比べてすべての試験される培地上で同様に増殖することが分かった（
Peters-Wendisch 等、FEMS Microbiology Letters 1993, 112: 269-274; Gubler等、Appl Microbiol Biotechnol 1994, 40: 857-863)。この結果は、ホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼが増殖に不可欠ではなくかつアナプレロ
ティック反応にあまり重要な働きをまったくしないか又はほんのわずかにしかし
ないことを示す。更に、上記結果から、増殖に必要であるオキサロ酢酸の合成に
係わるその他の酵素少なくとも１種をコリネバクテリウムに加えねばならないこ
とが示される。最近、実際にまたピルビン酸カルボキシラーゼ活性はコリネバク
テリウム グルタミクムの透過細胞中にも見出される（Peters-Wendisch 等、Mi
crobiology 199７, 143: 1095-1103) 。この酵素は、ＡＭＰ、ＡＤＰ及びアセチ
ル−補酵素Ａによって有効に阻害され、そして炭素源として乳酸(Laktat)の存在
下に増加された量で生じる。コリネバクテリウム グルタミクム中のピルビン酸
カルボキシラーゼの産生は、また13C-NMR 及びGS-MS を用いるその他の試験法に
よって検出されるか又は確認される（Park等、Appl. Microbiol. Biotechnol. 1
997. 47: 430-440) 。この酵素は増殖の際にトリカルボン酸回路の補給にまず関
与することから開始しなければならないので、遺伝子発現の増加又は酵素活性の
増加はアスパラギン酸系に属するアノ酸の増加をまったく生じないか又は場合に
より少量の増加を生じることが予想された。更に、ピルビン酸カルボキシラーゼ
の遺伝子発現の増加又は酵素活性の増加は同様にその他の系列のアミノ酸の産生
にまったく影響を与えないであろうと考えられる。
中間体を補充するために、トリカルボン酸回路はＣ４- 化合物、たとえばオキサ
ロ酢酸を連続的及び効果的に補給しなければならない。最近までコリネバクテリ
ウム中のこのいわゆるアナプレロティック作用にホスホエノールピルビン酸カル
ボキシラーゼが関与すると考えられていた(Kinoshita, Biology of industrial
micro-organisms 1985: 115-142, Benjamin/Cummings Publishing Company,ロン
ドン； Liebl, The prokaryotes II, 1991: 1157-1171, Springer 出版、 ニュー
ヨーク；Vallino 及び Stephanopoulos, Biotechnol Bioeng 1993, 41: 633-646
) 。しかしホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ陰性変異体はそれぞれの
出発菌株に比べてすべての試験される培地上で同様に増殖することが分かった（
Peters-Wendisch 等、FEMS Microbiology Letters 1993, 112: 269-274; Gubler等、Appl Microbiol Biotechnol 1994, 40: 857-863)。この結果は、ホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼが増殖に不可欠ではなくかつアナプレロ
ティック反応にあまり重要な働きをまったくしないか又はほんのわずかにしかし
ないことを示す。更に、上記結果から、増殖に必要であるオキサロ酢酸の合成に
係わるその他の酵素少なくとも１種をコリネバクテリウムに加えねばならないこ
とが示される。最近、実際にまたピルビン酸カルボキシラーゼ活性はコリネバク
テリウム グルタミクムの透過細胞中にも見出される（Peters-Wendisch 等、Mi
crobiology 199７, 143: 1095-1103) 。この酵素は、ＡＭＰ、ＡＤＰ及びアセチ
ル−補酵素Ａによって有効に阻害され、そして炭素源として乳酸(Laktat)の存在
下に増加された量で生じる。コリネバクテリウム グルタミクム中のピルビン酸
カルボキシラーゼの産生は、また13C-NMR 及びGS-MS を用いるその他の試験法に
よって検出されるか又は確認される（Park等、Appl. Microbiol. Biotechnol. 1
997. 47: 430-440) 。この酵素は増殖の際にトリカルボン酸回路の補給にまず関
与することから開始しなければならないので、遺伝子発現の増加又は酵素活性の
増加はアスパラギン酸系に属するアノ酸の増加をまったく生じないか又は場合に
より少量の増加を生じることが予想された。更に、ピルビン酸カルボキシラーゼ
の遺伝子発現の増加又は酵素活性の増加は同様にその他の系列のアミノ酸の産生
にまったく影響を与えないであろうと考えられる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２３】
【表１】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２４】
【表２】
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２５】
【表３】
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２６】
【表４】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＲ，Ｃ Ａ，ＣＮ，ＨＵ，ＩＤ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＲＵ，ＳＫ ，ＵＳ (72)発明者 ザーム・ヘルマン ドイツ連邦共和国、Ｄ−52428 ユーリヒ、 ヴェンデリヌスストラーセ、71 Ｆターム(参考） 4B024 BA07 BA71 BA72 BA73 BA74 FA02 GA11 GA14 HA01 4B064 AE08 AE09 AE10 AE17 AE19 AE25 CA02 CA19 CC24 DA16 4B065 AA24X AA24Y AA26Y AB01 BA02 CA17 CA27
Claims (37)
- 【請求項１】 ピルビン酸カルボキシラーゼ活性をこの酵素の遺伝子変化に
よって及び( 又は) 対応するアミノ酸を産生する微生物のピルビン酸カルボキシ
ラーゼ遺伝子発現によって増加させることを特徴とする、アスパラギン酸- 及び
( 又は) グルタミン酸系アミノ酸の微生物による産生方法。 - 【請求項２】 内因性ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の突然変異によっ
て高められたピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有する酵素を産生させる、請求
項１記載の方法。 - 【請求項３】 ピルビン酸カルボキシラーゼの遺伝子発現を遺伝子コピー数
の増加によって高める、請求項１又は２記載の方法。 - 【請求項４】 遺伝子コピー数の増加のためにピルビン酸カルボキシラーゼ
の遺伝子を遺伝子構造中に組み込む、請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子に整合された調節遺伝子
配列を有する遺伝子構造中に上記遺伝子を組み込む、請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 対応するアミノ酸を産生する微生物を上記遺伝子を有する遺
伝子構造で形質転換する、請求項４又は５記載の方法。 - 【請求項７】 コリネバクテリウム属の微生物を上記遺伝子を有する遺伝子
構造で形質転換する、請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 対応するアミノ酸の合成に関与する酵素が調節されていない
か及び( 又は) 対応するアミノ酸に対する高められたエクスポートキャリヤー活
性を有する微生物を形質転換に使用する、請求項６又は７記載の方法。 - 【請求項９】 対応するアミノ酸の合成に関与する主要な物質代謝産生物の
増加された割合を有する微生物を形質転換に使用する、請求項６ないし８のいず
れかに記載の方法。 - 【請求項１０】対応するアミノ酸生合成経路に競合する生合成経路が活性の
低下と共に進行する微生物を形質転換に使用する、請求項６ないし９のいずれか
に記載の方法。 - 【請求項１１】ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子をコリネバクテリウム属
の微生物株から単離する、請求項１ないし１０のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１２】遺伝子発現を転写シグナルの補強によって増加させる、請求
項１ないし１１のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１３】ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子にtac-プロモーターを連
結する、請求項１ないし１２のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１４】 tac- プロモーターに整合された調節配列である、請求項１
３記載の方法。 - 【請求項１５】ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子として、SEQ ID No.2 に
記載されたアミノ酸配列及びそのすべての変化をコードするヌクレオチド配列を
有する遺伝子を使用する、請求項１ないし１４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１６】ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子として,SEQ ID No. １に
よるヌクレオチド１６５ないし３５８７のヌクレオチド配列又は実質上同一作用
のＤＮＡ配列を有する遺伝子を使用する、請求項１５記載の方法。 - 【請求項１７】リジン、スレオニン、ホモセリン、グルタミン酸及び( 又は
) アルギニンを製造する、請求項１ないし１６のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１８】 SEQ ID No.2に記載されたアミノ酸配列及び( 又は) そのす
べての変化をコードするヌクレオチド配列を有するピルビン酸カルボキシラーゼ
遺伝子。 - 【請求項１９】 SEQ ID No. １によるヌクレオチド１６５ないし３５８７の
ヌクレオチド配列又は実質上同一に作用するＤＮＡ配列を有する、請求項１８記
載のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子。 - 【請求項２０】 SEQ ID No. １によるヌクレオチド２０ないし１０９のヌク
レオチド配列に連結されたプロモーター又は実質上同一に作用するＤＮＡ配列を
有する、請求項１８又は１９記載のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子。 - 【請求項２１】連結されたtac-プロモーターを有する、請求項１８又は１９
記載のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子。 - 【請求項２２】上記プロモーターに整合された調節配列を有する、請求項２
１記載のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子。 - 【請求項２３】ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子に整合された調節遺伝子
配列を有する、請求項１８ないし２０のいずれかに記載のピルビン酸カルボキシ
ラーゼ遺伝子。 - 【請求項２４】請求項１８ないし２３のいずれかに記載のピルビン酸カルボ
キシラーゼ遺伝子を有する遺伝子構造。 - 【請求項２５】請求項１８ないし２３のいずれかに記載のピルビン酸カルボ
キシラーゼ遺伝子又は請求項２４記載の遺伝子構造を有するベクター。 - 【請求項２６】請求項１８ないし２３のいずれかに記載のピルビン酸カルボ
キシラーゼ遺伝子又は請求項２４記載の遺伝子構造を複製可能な形で有する、形
質転換された細胞。 - 【請求項２７】請求項２５記載のベクターを有する、請求項２６記載の形質
転換された細胞。 - 【請求項２８】 コリネバクテリウム属である、請求項２６又は２７記載の
形質転換細胞。 - 【請求項２９】形質転換細胞中で対応するアミノ酸の合成に関与する酵素及
び( 又は) 対応するアミノ酸の輸出（エキスポート）に関与する酵素が調節され
ていない、請求項２６ないし２８のいずれかに記載の形質転換された細胞。 - 【請求項３０】対応するアミノ酸の合成に関与する主要な物質代謝産生物の
増加された割合を含有する、請求項２６ないし２９のいずれかに記載の形質転換
された細胞。 - 【請求項３１】対応するアミノ酸の合成に関与しない主要な物質代謝産生物
の低減された割合を含有する、請求項２６ないし３０のいずれかに記載の形質転
換された細胞。 - 【請求項３２】アスパラギン酸- 及び( 又は) グルタミン酸系に由来するア
ミノ酸の微生物による産生を増加させるために、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺
伝子を使用する方法 - 【請求項３３】高められたピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有する酵素を
コードする突然変異ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を使用する、請求項３２
記載の方法。 - 【請求項３４】対応するアミノ酸を産生する微生物をピルビン酸カルボキシ
ラーゼ遺伝子を含有する遺伝子構造で形質転換する、請求項３２又は３３記載の
使用方法。 - 【請求項３５】遺伝子構造が更に調節遺伝子配列をを含有する、請求項３４
記載の使用方法。 - 【請求項３６】 コリネバクテリウムに由来するピルビン酸カルボキシラー
ゼ遺伝子を使用する、請求項３２ないし３５のいずれかに記載の方法。 - 【請求項３７】 アミノ酸産生微生物として、コリネバクテリウムを使用す
る、請求項３２ないし３６のいずれかに記載の方法。
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|---|---|---|---|
| DE19743894.6 | 1997-10-04 | ||
| DE19743894 | 1997-10-04 | ||
| DE19831609A DE19831609B4 (de) | 1997-10-04 | 1998-07-14 | Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren der Aspartat- und/oder Glutamatfamilie und im Verfahren einsetzbare Mittel |
| DE19831609.7 | 1998-07-14 | ||
| PCT/EP1998/006210 WO1999018228A2 (de) | 1997-10-04 | 1998-09-30 | Verfahren zur mikrobiellen herstellung von aminosäuren der aspartat- und/oder glutamatfamilie und im verfahren einsetzbare mittel |
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|---|---|
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000515022A Pending JP2002508921A (ja) | 1997-10-04 | 1998-09-30 | アスパラギン酸−及び（又は）グルタミン酸系アミノ酸の微生物による産生方法及びこの方法で使用可能な剤 |
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|---|---|
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Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010503395A (ja) * | 2006-09-15 | 2010-02-04 | シージェイ チェイルジェダン コーポレイション | Ｌ−リジン生産能の向上したコリネバクテリウム属およびそれを用いたｌ−リジン生産方法 |
| JP2012050372A (ja) * | 2010-08-31 | 2012-03-15 | Toray Ind Inc | コリネ型細菌による化学品の製造方法 |
| US8323933B2 (en) | 2008-04-10 | 2012-12-04 | Cj Cheiljedang Corporation | Vector for transformation using transposons, microorganisms transformed by the vector, and method for producing L-lysine using the same |
| US8426165B2 (en) | 2007-01-24 | 2013-04-23 | Cj Cheiljedang Corporation | Process for producing fermentation product from carbon sources containing glycerol using Corynebacteria |
| US8932861B2 (en) | 2008-04-10 | 2015-01-13 | Cj Cheiljedang Corporation | Transformation vector comprising transposon, microorganisms transformed with the vector, and method for producing L-lysine using the microorganism |
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Families Citing this family (79)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2194122B1 (en) | 1998-04-13 | 2015-12-02 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Pyruvate carboxylase overexpression for enhanced production of oxaloacetate-derived biochemicals in microbial cells |
| DE19931317A1 (de) * | 1999-07-07 | 2001-01-11 | Degussa | L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien und Verfahren zur Herstellung von L-Lysin |
| AU2203399A (en) * | 1998-12-23 | 2000-07-31 | Massachusetts Institute Of Technology | Pyruvate carboxylase from (corynebacterium glutamicum) |
| US6171833B1 (en) | 1998-12-23 | 2001-01-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Pyruvate carboxylase from corynebacterium glutamicum |
| JP2000201692A (ja) | 1999-01-13 | 2000-07-25 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ―グルタミン酸の製造法 |
| TW200734459A (en) | 1999-10-04 | 2007-09-16 | Ajinomoto Kk | Genes for heat resistant enzymes of amino acid biosynthetic pathway derived from thermophilic coryneform bacteria |
| DE19947792A1 (de) * | 1999-10-05 | 2001-04-12 | Degussa | Neue für das Irp Gen codierende Nukleotidsequenzen |
| US7132272B2 (en) | 1999-10-05 | 2006-11-07 | Degussa Ag | Nucleotide sequence encoding corynebacterium glutamicum leucine response regulatory protein |
| RU2207376C2 (ru) * | 1999-10-14 | 2003-06-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Способ получения l-аминокислоты методом ферментации, штамм бактерии escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты) |
| US6949374B2 (en) | 2000-05-04 | 2005-09-27 | Degussa Ag | FadD15 gene of Corynebacterium glutamicum, encoding an acyl-CoA synthase polypeptide |
| DE10021831A1 (de) * | 2000-05-04 | 2001-11-08 | Degussa | Neue für das fadD15-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
| DE10032350A1 (de) | 2000-07-04 | 2002-01-24 | Degussa | Neue für das mdhA-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
| EP1307562B1 (en) * | 2000-08-10 | 2004-12-15 | Degussa AG | Nucleotide sequences which code for the lysr3 gene |
| DE10039049A1 (de) | 2000-08-10 | 2002-02-21 | Degussa | Neue für das IysR3-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
| DE10042051A1 (de) * | 2000-08-26 | 2002-03-07 | Degussa | Neue für das cstA-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
| PL364087A1 (en) * | 2001-02-21 | 2004-12-13 | Basf Aktiengesellschaft | Method for the production of d-pantothenic acid and/or salts thereof as adjunct for animal feedstuffs |
| JP2004523237A (ja) * | 2001-02-21 | 2004-08-05 | ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト | 動物飼料添加剤としてのｄ−パントテン酸および／またはその塩の製造方法 |
| DE10108223A1 (de) * | 2001-02-21 | 2002-10-10 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze als Zusatz zu Tierfuttermitteln |
| DE10108225A1 (de) * | 2001-02-21 | 2002-10-10 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze als Zusatz zu Tierfuttermitteln |
| EP1407035B1 (en) | 2001-07-18 | 2006-04-12 | Degussa AG | Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family which contain an attenuated aspa gene |
| ATE434663T1 (de) | 2001-07-18 | 2009-07-15 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur herstellung von l-threonin durch enterobakteriaceae-stämmen mit verstärkter exprimierung der succ und sucd gene |
| CA2456416A1 (en) * | 2001-08-06 | 2003-02-20 | Degussa Ag | Coryneform bacteria which produce chemical compounds ii |
| US8278076B2 (en) | 2002-02-20 | 2012-10-02 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Microbial production of pyruvate and pyruvate derivatives |
| DE10303571A1 (de) | 2003-01-30 | 2004-08-12 | Degussa Ag | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| DE10316109A1 (de) | 2003-04-09 | 2004-10-21 | Degussa Ag | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| DE102004005836A1 (de) | 2004-02-06 | 2005-09-15 | Degussa Ag | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| DE102004037572A1 (de) * | 2004-08-03 | 2006-02-23 | Degussa Ag | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| DE102005018835A1 (de) | 2005-04-22 | 2006-11-02 | Degussa Ag | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung verbesserter Stämme der Familie Enterobacteriaceae |
| DE102005043979A1 (de) | 2005-09-15 | 2007-03-22 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren zur Produktion von Aminosäuren in aminosäureproduzierenden Mikroorganismen |
| JP2009118740A (ja) | 2006-03-03 | 2009-06-04 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| DE102006032634A1 (de) | 2006-07-13 | 2008-01-17 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren |
| JP2010041920A (ja) | 2006-12-19 | 2010-02-25 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2010088301A (ja) | 2007-02-01 | 2010-04-22 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2010110216A (ja) | 2007-02-20 | 2010-05-20 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸または核酸の製造方法 |
| DE102007051024A1 (de) | 2007-03-05 | 2008-09-11 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| EP1975241A1 (de) | 2007-03-29 | 2008-10-01 | Evonik Degussa GmbH | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| JP2010226956A (ja) * | 2007-07-23 | 2010-10-14 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−リジンの製造法 |
| EP2192170B1 (en) | 2007-09-04 | 2017-02-15 | Ajinomoto Co., Inc. | Amino acid-producing microorganism and method of producing amino acid |
| DE102007044134A1 (de) | 2007-09-15 | 2009-03-19 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| DE102007052270A1 (de) | 2007-11-02 | 2009-05-07 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| EP2060636A1 (de) | 2007-11-14 | 2009-05-20 | Evonik Degussa GmbH | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| JP2011067095A (ja) | 2008-01-10 | 2011-04-07 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法による目的物質の製造法 |
| CN102348806A (zh) | 2008-01-23 | 2012-02-08 | 味之素株式会社 | L-氨基酸的生产方法 |
| EP2098597A1 (de) | 2008-03-04 | 2009-09-09 | Evonik Degussa GmbH | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| DE102008001874A1 (de) | 2008-05-20 | 2009-11-26 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren |
| DE102008002309A1 (de) | 2008-06-09 | 2009-12-10 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| DE102008044768A1 (de) | 2008-08-28 | 2010-03-04 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Herstellung von organisch-chemischen Verbindungen unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| CN102177246B (zh) | 2008-09-08 | 2015-02-11 | 味之素株式会社 | 生产l-氨基酸的微生物和l-氨基酸的生产方法 |
| JP2012029565A (ja) | 2008-11-27 | 2012-02-16 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| EP2267145A1 (de) | 2009-06-24 | 2010-12-29 | Evonik Degussa GmbH | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| WO2011013707A1 (ja) | 2009-07-29 | 2011-02-03 | 味の素株式会社 | Ｌ-アミノ酸の製造法 |
| JP2012223092A (ja) | 2009-08-28 | 2012-11-15 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2013013329A (ja) | 2009-11-06 | 2013-01-24 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| MX2012009816A (es) | 2010-02-25 | 2012-12-10 | Council Scient Ind Res | Procesos para la produccion de arginina utilizando corynebacterium glutamicum atcc 21831 o corynebacterium glutamicum atcc 21493 en un medio de fermentacion que comprende bagazo de mandioca o semilla del fruto de panapen como una fuente de carbono. |
| KR101145943B1 (ko) | 2010-03-11 | 2012-05-15 | 씨제이제일제당 (주) | Ｌ-아미노산 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법 |
| RU2496867C2 (ru) * | 2011-04-25 | 2013-10-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | Способ получения l-аминокислоты семейства глутамата с использованием коринеформной бактерии |
| EP2540834A1 (en) | 2011-06-29 | 2013-01-02 | Metabolic Explorer | Method for the preparation of 1,3-propanediol |
| CN105483145B (zh) * | 2011-12-21 | 2021-04-06 | Cj第一制糖株式会社 | 利用具有产生l-赖氨酸能力的微生物产生l-赖氨酸的方法 |
| JP5831669B2 (ja) | 2013-05-13 | 2015-12-09 | 味の素株式会社 | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| EA201591846A1 (ru) * | 2013-05-17 | 2016-08-31 | Ксилеко, Инк. | Обработка биомассы |
| JP2016165225A (ja) | 2013-07-09 | 2016-09-15 | 味の素株式会社 | 有用物質の製造方法 |
| JP2016192903A (ja) | 2013-09-17 | 2016-11-17 | 味の素株式会社 | 海藻由来バイオマスからのｌ−アミノ酸の製造方法 |
| ES2761596T3 (es) | 2013-10-02 | 2020-05-20 | Ajinomoto Kk | Aparato de control de amoniaco y método de control de amoniaco |
| JP6459962B2 (ja) | 2013-10-21 | 2019-01-30 | 味の素株式会社 | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP6519476B2 (ja) | 2013-10-23 | 2019-05-29 | 味の素株式会社 | 目的物質の製造法 |
| CN105505969A (zh) * | 2014-09-26 | 2016-04-20 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种提高l-苏氨酸转化率的方法及其应用 |
| JP6623690B2 (ja) | 2015-10-30 | 2019-12-25 | 味の素株式会社 | グルタミン酸系ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP7066977B2 (ja) | 2017-04-03 | 2022-05-16 | 味の素株式会社 | Ｌ－アミノ酸の製造法 |
| EP3467099A1 (en) | 2017-10-05 | 2019-04-10 | Evonik Degussa GmbH | Method for the fermentative production of l-amino acids |
| EP3608409A1 (en) | 2018-08-09 | 2020-02-12 | Evonik Operations GmbH | Process for preparing l amino acids using improved strains of the enterobacteriaceae family |
| EP3847270A1 (en) | 2018-09-07 | 2021-07-14 | Archer Daniels Midland Company | Engineered strains of corynebacteria |
| RU2019128538A (ru) | 2018-09-26 | 2021-03-11 | Эвоник Оперейшенс ГмбХ | Способ ферментативного получения l-лизина |
| WO2020071538A1 (en) | 2018-10-05 | 2020-04-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by bacterial fermentation |
| CN113755492B (zh) * | 2020-07-20 | 2023-05-30 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体及其应用 |
| JPWO2022092018A1 (ja) | 2020-10-28 | 2022-05-05 | ||
| WO2023222510A1 (en) | 2022-05-18 | 2023-11-23 | Evonik Operations Gmbh | Biotechnological production of desferrioxamines and analogs thereof |
| WO2023222515A1 (en) | 2022-05-18 | 2023-11-23 | Evonik Operations Gmbh | Biotechnological production of bisucaberins, desferrioxamines and analogs thereof |
| WO2023222505A1 (en) | 2022-05-18 | 2023-11-23 | Evonik Operations Gmbh | Biotechnological production of monomers of bisucaberins, desferrioxamines and analogs thereof |
| US20240117393A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-amino acid |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2223754B (en) | 1988-09-12 | 1992-07-22 | Degussa | Dna encoding phosphoenolpyruvate carboxylase |
| DE4201085A1 (de) | 1992-01-17 | 1993-07-22 | Degussa | Verfahren zur erhoehung der leistungsfaehigkeit l-lysin ausscheidender coryneformer bakterien |
| HU219600B (hu) * | 1993-08-24 | 2001-05-28 | Ajinomoto Co., Inc. | Mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxiláz, ennek génje, valamint eljárás aminosav előállítására |
| US5939307A (en) * | 1996-07-30 | 1999-08-17 | The Archer-Daniels-Midland Company | Strains of Escherichia coli, methods of preparing the same and use thereof in fermentation processes for l-threonine production |
| DE60030400T2 (de) * | 1999-07-09 | 2007-09-13 | Degussa Gmbh | Für den opac-gen kodierende nukleotidsequenzen |
| DE19941478A1 (de) * | 1999-09-01 | 2001-03-08 | Degussa | Neue für das thrE-Gen codierende Nukleotidsequenzen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin mit coryneformen Bakterien |
| DE19959329A1 (de) * | 1999-12-09 | 2001-06-13 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien |
| DE10154102A1 (de) * | 2001-11-02 | 2003-05-15 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
-
1998
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-
2007
- 2007-04-05 US US11/732,869 patent/US20070202571A1/en not_active Abandoned
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010503395A (ja) * | 2006-09-15 | 2010-02-04 | シージェイ チェイルジェダン コーポレイション | Ｌ−リジン生産能の向上したコリネバクテリウム属およびそれを用いたｌ−リジン生産方法 |
| US9109242B2 (en) | 2006-09-15 | 2015-08-18 | Cj Cheiljedang Corporation | Corynebacteria having enhanced L-lysine productivity and a method of producing L-lysine using the same |
| JP2015171366A (ja) * | 2006-09-15 | 2015-10-01 | シージェイ チェイルジェダン コーポレイション | Ｌ−リジン生産能の向上したコリネバクテリウム属およびそれを用いたｌ−リジン生産方法 |
| JP2017221202A (ja) * | 2006-09-15 | 2017-12-21 | シージェイ チェイルジェダン コーポレイション | Ｌ−リジン生産能の向上したコリネバクテリウム属およびそれを用いたｌ−リジン生産方法 |
| US8426165B2 (en) | 2007-01-24 | 2013-04-23 | Cj Cheiljedang Corporation | Process for producing fermentation product from carbon sources containing glycerol using Corynebacteria |
| US8323933B2 (en) | 2008-04-10 | 2012-12-04 | Cj Cheiljedang Corporation | Vector for transformation using transposons, microorganisms transformed by the vector, and method for producing L-lysine using the same |
| US8932861B2 (en) | 2008-04-10 | 2015-01-13 | Cj Cheiljedang Corporation | Transformation vector comprising transposon, microorganisms transformed with the vector, and method for producing L-lysine using the microorganism |
| JP2012050372A (ja) * | 2010-08-31 | 2012-03-15 | Toray Ind Inc | コリネ型細菌による化学品の製造方法 |
| JP7201614B2 (ja) | 2017-05-18 | 2023-01-10 | フォルシュングスツェントルム・ユーリッヒ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | ピルビン酸カルボキシラーゼおよびピルビン酸カルボキシラーゼコーディングｄｎａ、そのｄｎａを含有するプラスミド、ならびに産生用微生物、および生成物であってそれらの生合成が前駆体としてオキサロアセテートを含有する生成物の製造方法、および染色体 |
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