SK284235B6 - Method for microbial production of amino acids of the aspartate and/or glutamate family and agents which can be used in the said method - Google Patents

Method for microbial production of amino acids of the aspartate and/or glutamate family and agents which can be used in the said method Download PDF

Info

Publication number
SK284235B6
SK284235B6 SK4812000A SK4812000A SK284235B6 SK 284235 B6 SK284235 B6 SK 284235B6 SK 4812000 A SK4812000 A SK 4812000A SK 4812000 A SK4812000 A SK 4812000A SK 284235 B6 SK284235 B6 SK 284235B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
gene
pyruvate carboxylase
ala
amino acid
leu
Prior art date
Application number
SK4812000A
Other languages
English (en)
Other versions
SK4812000A3 (en
Inventor
Bernd Eikmanns
Petra Peters-Wendisch
Hermann Sahm
Original Assignee
Forschungszentrum Juelich Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26040582&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK284235(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from DE19831609A external-priority patent/DE19831609B4/de
Application filed by Forschungszentrum Juelich Gmbh filed Critical Forschungszentrum Juelich Gmbh
Publication of SK4812000A3 publication Critical patent/SK4812000A3/sk
Publication of SK284235B6 publication Critical patent/SK284235B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/20—Aspartic acid; Asparagine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y604/00—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4)
    • C12Y604/01—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4.1)
    • C12Y604/01001—Pyruvate carboxylase (6.4.1.1)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka pyruvátkarboxylázového génu, génových štruktúr, vektorov a transformovaných buniek s jeho obsahom, spôsobu mikrobiálnej prípravy aminokyselín aspartátovej a/alebo glutamátovej skupiny a jeho použitia.
Doterajší stav techniky
Aminokyseliny sú hospodársky veľmi zaujímavé, pričom použitie aminokyselín je mnohostranné. Tak napríklad L-lyzín, ako aj L-treonín, L-metionín a L-tryptofán sa používajú ako prísady do krmiva, L-glutamát ako prísada do korenín, L-izoleucín a L-tyrozín vo farmaceutickom priemysle, L-arginín a L-izoleucín ako liečivo, alebo L-glutamát, L-aspartát a L-fenylalanín ako východisková látka pri syntéze špeciálnych chemikálií.
Výhodným spôsobom prípravy týchto najrozličnejších aminokyselín je biotechnologická príprava prostredníctvom mikroorganizmov; pretože týmto spôsobom sa získa priamo biologicky účinná a opticky aktívna forma príslušnej aminokyseliny a dajú sa použiť jednoduché a lacné suroviny. Ako mikroorganizmy sa používajú napríklad Corynebacterium glutamicum a jeho príbuzné poddruhy flavum a lacíofermentum (Liebi a kol., Int. J. Systém. Bacteriol. 41, 255 až 260, 1991), ako aj Escherichia coli a príbuzné baktérie.
Tieto baktérie produkujú aminokyseliny normálne, ale len v množstve, ktoré je potrebné k rastu, takže sa nevytvárajú a nevylučujú žiadne nadbytočné aminokyseliny. To je spôsobené tým, že v bunke je biosyntéza aminokyselín kontrolovaná mnohými spôsobmi. V dôsledku toho sú už známe najrozličnejšie postupy, ako zvýšiť tvorbu produktov vyradením kontrolných mechanizmov. Pri týchto procesoch sa napríklad používajú analógy aminokyselín, aby sa vyradila účinná regulácia biosyntézy. Tak je napríklad opísaný spôsob, pri ktorom sa používajú Corynebacterium kmene, ktoré sú rezistentné proti analógom L-tyrozínu a L-fenylalanínu (JP 19037/1976 a 39517/1978). Taktiež sú opísané spôsoby, pri ktorých sa používajú baktérie, rezistentné proti analógom L-lyzínu alebo tiež L-treonínu, aby sa prekonali kontrolné mechanizmy (EP 0 205 849, GB 2 152 509).
Ďalej sú známe mikroorganizmy, skonštruované technikami rekombinantnej DNA, pri ktorých sa taktiež zruší regulácia biosyntézy tým, že gény, ktoré kódujú kľúčové enzýmy, ktoré už nie sú inhibované spätnou väzbou, sa klonujú a exprimujú. Tak je napríklad známa rekombinantná baktéria, produkujúca L-lyzín, s plazmidom kódovanou, proti spätnej väzbe rezistentnou aspartátkinázou (EP 0 381 527). Taktiež je opísaná rekombinantná baktéria, produkujúca L-fenylalanín, s proti spätnej väzbe rezistentnou prefenátdehydrogenázou (JP 123475/1986, EP 0 488 424).
Okrem toho sa aj nadexpresiou génov, ktoré nekódujú na spätnú väzbu citlivé enzýmy syntézy aminokyseliny, dosiahli zvýšené výťažky aminokyselín. Tak sa napríklad tvorba lyzínu zlepší zvýšenou syntézou dihydrodipikolinátsyntázy (EP 0 197 335). Taktiež sa zvýšenou syntézou treoníndehydratázy dosiahne zlepšená tvorba izoleucínu (EP 0 436 886).
Ďalšie pokusy o zvýšenie produkcie aminokyselín sa zameriavajú na zlepšenú pripravenosť bunkových primárnych metabolitov centrálnej látkovej výmeny. Tak je známe, že rekombinantnými technikami dosiahnutá nadexpresia transketolázy umožňuje zlepšenú produkciu L-tryptofánu, L-tyrozínu alebo L-fenylalanínu (EP 0 600 463). Ďalej, zníženie aktivity fosfoenolpyruvátkarboxylázy v Corynebacterium vedie k zlepšenej tvorbe aromatických amino kyselín (EP 0 331 145), naproti čomu zvýšenie aktivity fosfoenolpyruvátkarboxylázy v Corynebacterium viedlo k zvýšenému vylučovaniu aminokyselín aspartátovej skupiny (EP 0 358 940).
Počas rastu a špeciálne pri podmienkach tvorby aminokyselín sa cyklus trikarboxylových kyselín (citrátový cyklus) musí kontinuálne a účinne doplniť C4-zlúčeninami, napríklad oxalacetátom, aby sa nahradili medziprodukty, odobraté na biosyntézu aminokyselín. Až donedávna sa predpokladalo, že za tieto takzvané anaplerotické funkcie v Corynebacterium je zodpovedná fosfoenolpyruvátkarboxyláza (Kinoshita, Biology of industrial microorganisms (Biológia priemyselných mikroorganizmov), str. 115 - 142, Benjamin/Cummings Publishing Company, Londýn 1985; Liebi, The prokaryotes II (Prokaryoty II), str. 1157 - 1171, Springer Verlag N. Y. 1991; Vallino a Stephanopoulos, Biotechnol. Bioeng. 41, 633 - 646, 1993). Zistilo sa však, že fosfoenolpyruvátkarboxyláza-negatívne mutanty v porovnaní s príslušnými východiskovými kmeňmi rástli rovnako na všetkých testovaných médiách (Peters-Wendisch a kol., FEMS Microbiology Letters ými kmeňmi rástli rovnako na všetkých testovaných médiách (Peters-Wendisch a kol., FEMS Microbiology Letters 112, 269 - 274, 1993; Gubler a kol., Appl. Microbiol. Biotechnol. 40, 857 - 863, 1994). Tento výsledok ukázal, že fosfoenolpyruvátkarboxyláza nie je podstatná pre rast a pre anaplerotické reakcie nehrá žiadnu alebo len podradnú úlohu. Okrem toho uvedený výsledok poukázal na to, že v Corynebacterium musí byť prinajmenšom jeden ďalší enzým, ktorý je zodpovedný za syntézu oxalacetátu, ktorý je potrebný k rastu. Prednedávnom sa aj skutočne zistila pyruvátkarboxylázová aktivita v permeabilizovaných bunkách Corynebacterium glutamicum (Peters-Wendisch a kol., Microbiology 143, 1095 - 1103, 1997). Tento enzým sa účinne inhibuje AMP, ADP a acetylkoenzýmom A a v prítomnosti laktátu sa ako zdroj uhlíka tvorí vo zvýšenom množstve. Existenciu pyruvátkarboxylázy v Corynebacterium glutamicum dokázala, resp. potvrdila aj ďalšia pracovná skupina pomocou 13CNMR spektroskopie a GS-MS (Park a kol., Appl. Microbiol. Biotechnol. 47, 430 - 440, 1997). Pretože sa muselo vychádzať z toho, že tento enzým je v prvom rade zodpovedný za doplnenie cyklu trikarboxylových kyselín pri raste, dalo sa očakávať, že zvýšenie génovej expresie, resp. enzýmovej aktivity buď nepovedie k žiadnemu, alebo len k malému zvýšeniu tvorby aminokyselín, patriacich k aspartátovej skupine. Okrem toho sa očakávalo, že zvýšenie génovej expresie, resp. enzýmovej aktivity pyruvátkarboxylázy taktiež nebude mať žiadny vplyv na produkciu aminokyselín iných skupín.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je spôsob mikrobiálnej prípravy aminokyselín asparátovej a/alebo glutamátovej skupiny, v ktorom sa zvýši pyruvátkarboxylázová aktivita genetickým pozmenením tohto enzýmu a/alebo sa zvýši pyruvátkarboxylázová génová expresia mikroorganizmu, ktorý produkuje zodpovedajúcu aminokyselinu. Ukázalo sa, že najmä kmene so zvýšeným počtom kópií pyruvátkarboxylázového génu vylučujú do kultivačného média asi o 50 % viac lyzínu, 40 % viac treonínu a 150 % viac homoserinu. Ďalej sa ukázalo, že prekvapujúco sa významne zvýšila aj produkcia glutamátu (porovnaj najmä príklad uskutočnenia pod 6 a tabuľku 4).
Genetické pozmenenie pyruvátkarboxylázy na zvýšenie enzýmovej aktivity sa výhodne uskutočňuje mutáciou en
SK 284235 Β6 dogénneho génu. Takéto mutácie sa môžu vytvoriť buď podľa klasických metód necielene, ako napríklad UV-ožarovaním alebo mutácie vyvolávajúcimi chemikáliami, alebo cielene pomocou metód génových technológií, ako je delécia, inzercia a/alebo výmena nukleotidov.
Pyruvátkarboxylázová génová expresia sa zvýši zvýšením počtu génových kópií a/alebo zosilnením regulačných faktorov, ktoré pozitívne ovplyvňujú expresiu génu. Tak sa zosilnenie regulačných prvkov môže výhodne uskutočniť na úrovni transkripcie tým, že sa zvýšia najmä transkripčné signály. To sa môže uskutočniť napríklad tým, že sa zmenou promótorovej sekvencie, predradenej pred štruktúrny gén, zvýši účinnosť promótora, alebo tým, že sa promótor kompletne zamení účinnejšími promótormi. Zosilnenie transkripcie sa tiež môže uskutočniť zodpovedajúcim ovplyvnením regulačného génu, priradeného pyruvátkarboxylázovému génu. Okrem toho sa prípadne môže účinnosť viazania regulačného proteínu na DNA pyruvátkarboxylázového génu, ktorý sa má regulovať, ovplyvniť mutáciou regulačnej génovej sekvencie tak, že sa tým transkripcia zosilní a tým sa génová expresia zvýši. Okrem toho ale môžu byť pyruvátkarboxylázovému génu ako regulačné sekvencie priradené aj takzvané „zosilňovače transkripcie“, ktoré prostredníctvom zlepšenej interakcie medzi RNA-polymerázou a DNA taktiež spôsobia zvýšenú pyruvátkarboxylázovú génovú expresiu. Popritom je ale tiež možné zosilnenie translácie tým, že sa napríklad zlepši stabilita m-RNA.
Na zvýšenie počtu génových kópií sa pyruvátkarboxylázový gén zabuduje do génového konštruktu, resp. vektora. Génový konštrukt obsahuje najmä regulačné sekvencie, priradené pyruvátkarboxylázovému génu, výhodne také, ktoré zosilňujú génovú expresiu. Na zabudovanie pyruvátkarboxylázového génu do génového konštruktu sa gén izoluje výhodne z kmeňa mikroorganizmu rodu Corynebacterium a transformuje sa do kmeňa mikroorganizmu, ktorý produkuje aminokyseliny, najmä Corynebacterium alebo Escherichia coli, alebo Serratia marcescens. Pre spôsob podľa tohto vynálezu sú vhodné najmä gény z C. glutamicum alebo C, glutamicum ssp. flavum, alebo C. glutamicum ssp. lactofermentum. Po izolovaní génu a in vitrorekombinácii so známymi vektormi (pozri napríklad B. Šimon a kol., Bio/Technology 1, 784 - 791, 1983; Eikmanns a kol., Gene 102, 93 - 98, 1991) sa uskutoční transformácia do kmeňov, ktoré produkujú aminokyseliny, elektroporácíou (Liebl a kol., FEMS Microbiology Letters 65, 299 až 304, 1991) alebo konjugáciou (Schäfer a kol., J. Bacteriol. 172, 1663 - 1666, 1990). Ako materské kmene sa výhodne použijú takí producenti aminokyselín, ktorí sú v syntéze zodpovedajúcej aminokyseliny deregulovaní a/alebo ktorí majú zvýšenú aktivitu exportných nosičov pre zodpovedajúcu aminokyselinu. Ďalej sa uprednostňujú také kmene, ktoré obsahujú zvýšený podiel takých metabolitov centrálnej látkovej výmeny, ktoré sa podieľajú na syntéze zodpovedajúcej aminokyseliny, a/alebo kmene, ktoré obsahujú znížený podiel takých metabolitov centrálnej látkovej výmeny, ktoré sa nepodieľajú na syntéze zodpovedajúcej aminokyseliny, najmä metabolitov, ktoré zodpovedajú za konkurenčné reakcie; t. j. uprednostňujú sa také kmene, pri ktorých cesta biosyntézy, konkurujúca ceste biosyntézy príslušnej aminokyseliny, prebieha so zníženou aktivitou. Tak je najmä vhodný kmeň mikroorganizmu druhu Corynebacterium so zníženou citTátsyntázovou aktivitou, rezistentný proti β-metylesteru kyseliny L-asparágovej (AME) (EP 0 551 614).
Po izolovaní sa dajú získať pyruvátkarboxylázové gény s nukleotidovými sekvenciami, ktoré kódujú aminokyseli novú sekvenciu, uvedenú pod SEQ ID No. 2 alebo jej alelové variácie, resp. ktoré majú nukleotidovú sekvenciu od nukleotidu 165 po 3587 podľa SEQ ID No. 1 alebo v podstate rovnako účinkujúcu DNA-sekvenciu. Okrem toho sa dajú získať gény s predradeným promótorom nukleotidovej sekvencie od nukleotidu 20 po 109 podľa SEQ ID No. 1 alebo v podstate rovnako účinkujúcou DNA-sekvenciou. Alelové variácie, resp. rovnako účinkujúce DNA-sekvencie zahrnujú najmä funkčné deriváty, ktoré sa dajú získať deléciou(ami), inzerciou(ami) a/alebo substitúciou(ami) nukleotidov, pričom enzýmová aktivita, resp. funkcia zostáva zachovaná, alebo sa dokonca zvýši. Tieto pyruvátkarboxylázové gény sa výhodne použijú v spôsobe podľa tohto vynálezu.
K pyruvátkarboxylázovému génu s predradeným promótorom alebo bez neho, resp. s priradeným regulačným génom alebo bez neho sa môže predradiť a/alebo na konci zaradiť jedna alebo viaceré DNA-sekvencie tak, že tento gén bude obsiahnutý v génovej štruktúre.
K pyruvátkarboxylázovému génu je výhodne predradený tac-promótor (tacl^-gén), pričom tomuto sú priradené najmä regulačné sekvencie.
Klonovaním pyruvátkarboxylázového génu sa dajú získať plazmidy, ktoré tento gén obsahujú a sú vhodné na transformáciu producenta aminokyseliny. Transformáciou získateľné bunky, pri ktorých ide výhodne o transformované bunky Corynebaclerium, obsahujú tento gén v replikovateľnej forme, t. j. v dodatočných kópiách na chromozóme, pričom tieto kópie génu sa rekombináciou integrujú na ľubovoľných miestach genómu a/alebo na plazmide, alebo vektore.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Na obr. 1 je znázornené fyzikálne mapovanie fragmentu.
Na obr. 2 je znázornená fyzikálna mapa plazmidu.
Príklad uskutočnenia vynálezu
1. Klonovanie pyruvátkarboxylázového génu z Corynebacterium glutamicum
Vychádzajúc z konzervovaných oblastí všetkých doteraz známych pyruvátkarboxylázových (pyc-)génov zo Saccharomyces cerevisiae (J. Biol. Chem. 263,11493 - 11497, 1988; Mol. Gen Genet. 229, 307 - 315, 1991), človeka (Biochim. Biophys. Acta 1227, 46 - 52, 1994), myši (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1766 - 1770, 1993), Aedes aegypti (EMBL-GenBank: Accession Nr. L36530), ako aj z Mycobacterium tuberculosis (EMBL-GenBank: Accession Nr. U00024) sa syntetizovali PCR-priméry (MWG Biotech). Tieto priméry zodpovedali bázam 810 až 831 a 1015 až 1037 pyc-génu z M. tuberculosis. S týmito primérmi sa prostredníctvom PCR podľa štandardnej metódy Innisa a kol. (PCR protocols. A guide to methods and applications (PCR protokoly. Návod k metódam a aplikáciám), Academic Press 1990) pre nedegenerované, homologické priméry dal amplifikovať fragment asi 200 bp z chromozomálnej DNA z C. glutamicum ATCC 13032, ktorá sa izolovala, ako opísali Eikmanns a kol. (Microbiology 140, 1817 až 1828, 1994). Veľkosť 200 bp zodpovedala očakávaniu pre pyc-gén. PCR-produkt sa sekvenoval, ako opísali Sanger a kol. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 - 5467, 1977). Sekvenovanie sa uskutočnilo s fluorescenčné označenými ddNTP automatickou aparatúrou na sekvenovanie DNA (Applied Biosystems).
Vychádzajúc z tohto DNA-fragmentu z C. glutamicum sa pripravili nasledujúce homologické oligonukleotidy:
pyc 1 5’-CGTCTTCATCGAAATGAAC-3’ pyc 2 5 ‘-ACGGTGGTGATCCGGCACT-3 ’
Oligonukleotidy sa použili ako PCR-priméry na izolovanie sondy pre gén pyruvátkarboxylázy (pyc) z C. glutamicum. Tieto priméry sa použili v PCR-reakcii s chromozomálnou DNA z C. glutamicum a digitoxigenínom značkovanými nukleotidmi. Táto reakcia sa uskutočnila podľa predpisu ‘PCR DIG Labeling Kits’ (PCR DIG značkovacie súpravy) firmy Boehringer Mannheim. S týmto zložením sa dal amplifikovať digitoxigenínom značkovaný DNA-fragment, ktorý zodpovedal očakávanej veľkosti 200 bp. Takto pripravená pyc-sonda sa potom použila, aby sa cez hybridizáciu Southemovým prenosom identifikoval DNA-fragment v chromozomálnej DNA z C. glutamicum, na ktorom je lokalizovaný pyc-gén. Na to sa vždy 2 až 5 pg chromozomálnej DNA z C. glutamicum WT rozštiepilo reštrikčnými enzýmami HindlII, Sphl, Sali, Dral, EcoRI a BamHI, získané DNA-fŕagmcnty sa 16 h pri 20 V gclclcktroforeticky rozdelili v 0,8 % agarózovom géli zodpovedajúco svojej veľkosti. DNA-fragmenty, ktoré sa nachádzali v agarózovom géli, sa metódou Southema (J. Mol. Biol. 98, 503 - 517, 1975) denaturovali a pomocou vákua preniesli VacuGene Blot aparatúrou od firmy Pharmacia LKB (Uppsala, Švédsko) z gélovej matrice na nylonovú membránu (Nytran N13 od firmy Schleicher a Schúli, Dassel, Švajčiarsko), imobilizovali a digitoxigenínové značenie sa dokázalo alkalickou fosfatázou prostredníctvom NBT/X-fosfátovej reakcie. Týmto spôsobom sa podarilo dokázať nasledujúce, s pyc-DNA-sondou hybridizujúce chromozomálne fragmenty: 17 kb HindlII-fragment, 6,5 kb Sall-fragment a 1,35 kb EcoRI-fragment.
kb HindlII-fragment sa izoloval a subklonoval. Na to sa v kozmide pHC79 použila kozmidová génová banka z chromozomálnej DNA z C. glutamicum, ktorá reprezentovala genóm C. glutamicum na 99 % (Mol. Microbiol. 6, 317 - 326, 1992). E. coli kmeň DH5a sa s touto génovou bankou transformoval prostredníctvom CaCI2-metódy od Sambrooka a kol. (Molecular Cloning, A laboratory manual (Molekulové klonovanie, Laboratórne návody), Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989) a naniesol sa na platne po asi 300 kolónii na LB-agarovú platňu s 50 pg/l kanamycínu (spolu 5000 kolónií). Potom sa získané transformandy preniesli na Nytran N13-filter a tieto sa na alkalickú lýzu buniek a denaturáciu DNA inkubovali 5 minút na Whatmannovom papieri, nasiaknutom 0,5 M NaOH a
1,5 M NaCl. Potom nasledujúca neutralizácia sa uskutočnila s 1 M Tris/HCl, pH 7,5, a 1,5 M NaCl. Po inkubácii filtrov vo 2 x SSC sa uvoľnená DNA fixovala na filtri UV-ožiarením pri 366 nm. Potom sa ostatné zvyšky buniek odstránili trepaním v 3 x SSC, 0,1 % SDS pri 50 °C. Filtre sa použili v tejto forme na hybridizáciu so špecifickou pyc-sondou, ako opísal Southcm (J. Mol. Biol. 98, 503 - 517, 1975). Identifikovali sa 3 transformandy, ktoré hybridizovali proti pyc-sonde. Z týchto transformandov sa izolovala kozmidová DNA pomocou prípravy plazmidu metódou alkalickej lýzy podľa Bimboima (Meth. Enzymol. 100, 243 až 255, 1983) a potom sa cez reštrikciu a analýzu Southernovým prenosom testovala na prítomnosť HindlII-fragmentu. Kozmid pHC79-10, ktorý obsahoval 40 kb inzert, niesol úplne 17 kb HindlII-fragment a ďalej sa analyzoval. Ukázalo sa, že aj po reštrikcii s endonukleázami Sali a EcoRI sa získali rovnaké hybridizujúce fragmenty ako v chromozomálnej DNA, t. j. 6,5 kb Sali- a 1,35 kb EcRI
-fragment. 17 kb HindlII-fragment sa reštrikciou s HindlII izoloval z kozmidu a naviazal sa do E. coli vektora pUC 18, ktorý sa taktiež rozštiepil pomocou HindlII. Vypracovala sa reštrikčná analýza fragmentu vo výslednom vektore pUCpyc. Fyzikálne mapovanie fragmentu je znázornené na obr. L
2. Sekvenovanie pyruvátkarboxylázového génu
V ďalších krokoch subklonovania sa izolovali 0,85 kb Sall-EcoRI-fragment, 1,35 kb EcoRI-fragment, 1,6 kb EcoRl-EcoRl-StuI-fragment, ako aj 1,6 kb Clal-fŕagment, ktorý sa čiastočne prekrýval s uvedeným 0,85 kb SallEcoRI-fragmentom, reštrikciou so zodpovedajúcimi reštrikčnými enzýmami z plazmidu pUCpyc. Naviazaním sa tieto fragmenty klonovali do príslušne reštringovaného vektora pUC18 a následne sa sekvenovali podľa Sangera a kol. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 - 5467, 1977), ako je opísané. Získané nukleotidové sekvencie sa analyzovali programovým balíkom HUSÁR (Release 3.0) od Deutsche Krebsforschungszentrum (Nemecké centrum pre výskum rakoviny) (Heidelberg). Sekvenčná analýza fragmentov poskytla priebežný otvorený čítací raster 3576 bp, ktorý kóduje proteínovú sekvenciu 1140 aminokyselín. Porovnanie odvodenej proteínovej sekvencie s EMBL génovou databankou (Heidelberg) ukázalo podobnosti so všetkými známymi pyruvátkarboxylázami. Najvyššia identita (62 %) sa zistila k zdanlivej pyruvátkarboxyláze z Mycobacterium tuberculosis (EMBL-GenBank: Accession Nr. U00024). Táto podobnosť bola pri zohľadnení konzervovaných výmen aminokyselín 76 %. Porovnanie s pyruvátkarboxylázami iných organizmov dalo 46 až 47 % identických a 64 až 65 % podobných aminokyselín (Gene 191, 47 - 50, 1997; J. Bacteriol. 178, 5960 - 5970, 1996; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1766 - 1770, 1993; Biochem. J. 316, 631 až 637, 1996; EMBL-GenBank: Accession Nr. L36530; J. Biol. Chem. 263, 11493 - 11497, 1988; Mol. Gen Genet. 229, 307 - 315, 1991). Z týchto výsledkov sme prišli k záveru, že klonovaný fragment nesie gén pre pyruvátkarboxylázu z C. glutamicum. Nukleotidová sekvencia tohto génu je uvedená pod SEQ ID No. 1 a zodpovedajúca aminokyselinová sekvencia pod SEQ ID No. 2.
3. Nadexpresia pyruvátkarboxylázového génu
S cieľom nadexpresie génu pre pyruvátkarboxylázu z C. glutamicum sa gén z plazmidu pUCpyc klonoval ako 6,2 kb SspI-Scal-fragment do E. coli-C. glutamicum-pendelvektora pEKO (Gene 102, 93 - 98, 1991), ktorý sa rozštiepil reštrikčnými endonukleázami EcoRI a Pstl. Pomocou pôsobenia Klenowovej polymerázy sa vyčnievajúce konce doplnili (EcoRI), resp. natrávili (Pstl) na hladké konce a linearizovaný vektor sa naviazal na 6,2 kb SspI-Scal-fragment. Získaný konštrukt pEKOpyc sa potom transformoval do kmeňa E. coli DH5a, plazmidová DNA na získaných transformandoch sa izolovala a skontrolovala sa na správnosť inzertu reštrikciou. Táto DNA sa potom vniesla do kmeňa SP733 elektroporáciou (FEMS Microbiol. Lett. 65, 299 - 304, 1989). Pri tomto kmeni ide o mutant reštrikčné negatívneho C. glutamicum kmeňa R127 (Dechema Biotechnology Conference 4, 323 - 327, Verlag Chemie 1990), ktorý sa získal chemickou mutagenézou a vyznačuje sa tým, že nemôže na minimálnom médiu s pyruvátom a laktátomrásť ako jediný zdroj uhlíka (Microbiology 143, 1095 až 1103, 1997). Tento fenotyp sa vyvolá defektom v pyruvátkarboxyláze a vnesením pyruvátkarboxylázového génu z C. glutamicum sa dal komplementovať, t. j. kmeň, ktorý nesie plazmid pEKOpyc, bol na rozdiel od východiskového kmeňa opäť schopný na minimálnom médiu s laktátom rásť ako jediný zdroj uhlíka. Tým sa aj priniesol dôkaz, že tento gén kóduje funkčnú pyruvátkarboxylázu.
Okrem toho sa plazmid pEKOpyc elektroporáciou transformoval do C. glutamicum štandardného typu ATCC 13032. Výsledný kmeň WT (pEKOpyc) sa skúmal v porovnaní so štandardným typom ATCC 13032, čo sa týka jeho pyruvátkarboxylázovej aktivity. Kmene sa kultivovali v komplexnom médiu (Luria-Bertani, Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989) s 0,5 % laktátu a na minimálnom médiu s 2 % laktátu, resp. 4 % glukózy, a uskutočnil sa pyruvátkarboxylázový test podľa metódy, ktorú opísali Peters-Wendisch a kol. (Microbiology 143, 1095 - 1103, 1997). Výsledok analýzy (tabuľka 1) ukazuje, že pyruvátkarboxylázová aktivita v kmeni, ktorý nesie pEKOpyc, je asi 4-krát vyššia než vo východiskovom kmeni.
4. Zvýšená akumulácia lyzínu nadexpresiou pyruvátkarboxylázového génu v kmeni C. glutamicum DG52-5
Na skúmanie účinku nadexpresie génu pre pyruvátkarboxylázu v kmeni DG52-5, produkujúcom lyzín (J. Gen. Microbiol. 134, 3221 - 3229, 1988) sa použil vektor expresie pVWEXl, ktorý umožňuje IPTG-indukovateľnú expresiu. Do tohto vektora sa bez promótora vklonoval pyc-gén. Na to sa najprv syntetizovali PCR-priméry (primér 1 = polohy 112 až 133; primér 2 = polohy 373 až 355 v nukleotidovej sekvencií podľa SEQ ID No. 1) a 261 bp bezpromótorovej začiatočnej oblasti pyruvátkarboxylázového génu sa amplifikovalo pomocou PCR. Priméry sa zvolili tak, aby primér 1 vytvoril PstI miesto štiepenia a primér 2 BamHI miesto štiepenia. Po PCR sa získaný 274 bp PCR-produkt izoloval, naviazal na konkateméry a následne sa rozštiepil reštrikčnými enzýmami PstI a BamHI. Reštrikčná zostava sa skoncentrovala etanolovým zrážaním a následne naviazala na vektor pVWEXl, rozštiepený Pstl-BamHI. Získaný konštrukt pVWEXl-PCR sa testoval reštrikciou. Koncová oblasť pyc-génu sa Rcal-Klenow-Sall pôsobením izolovala z vektora pEKOpyc a naviazala sa na vektor pVWEXl -PCR, spracovaný BamHI-Klenow-SalI pôsobením. Získaný konštrukt pVWEXlpyc sa analyzoval reštrikčným mapovaním. Fyzikálna mapa tohto plazmidu je znázornená na obr. 2.
Plazmid sa elektroporáciou vniesol do C. glutamicum kmeňa DG52-5. Ako kontrola sa kmeň DG52-5 s vektorom pVWEXl transformoval bez inzertu a vylučovanie L-lyzínu sa porovnávalo vždy pre tri rozličné transformandy. Na to sa DG52-5(pVWEXl) 1, 2 a 3, ako aj DG52-5(pVWEXlpyc) 4, 5 a 6 pestovali v komplexnom médiu (2χΤΎ; Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989; s 50 pg/l kanamycínu) a fermentačné médium CGXII (J. Bacteriol. 175, 5595 - 5603, 1993) sa naočkovalo vždy oddelene predchádzajúcimi kultúrami. Médium obsahovalo dodatočný kanamycín, aby sa plazmidy udržali stabilnými. Vždy sa uskutočnili dve paralelné vsádzky, pričom sa do jednej laboratórnej banky pridalo 200 pg IPTG/ml, zatiaľ čo druhá laboratórna banka neobsahovala žiadny IPTG. Po kultivácii počas 48 hodín pri 30 °C na rotačnej trepačke pri 120 ot./min. sa určilo množstvo lyzínu, akumulované v médiu. Určenie koncentrácie aminokyseliny sa uskutočnilo pomocou vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie (J. Chromat. 266, 471 - 482, 1983). Výsledok fermentácie je uvedený v tabuľke 2, pričom udané hodnoty predstavujú stredné hodnoty vždy z troch pokusov s rôznymi klonmi. Ukázalo sa, že nadexpresia pyruvátkarboxylázového génu vedie k o 50 % vyššej akumulácii lyzínu v médiu. Takto využitie objaveného a opísaného génu predstavuje pre anaplerotický enzým pyruvátkarboxylázu spôsob, ako podstatne zvýšiť tvorbu L-lyzínu.
5. Zvýšená akumulácia treonínu a homoserínu nadexpresiou pyruvátkarboxylázového génu v kmeni C. glutamicum DM368-3
Analogicky k pokusom na tvorbu L-lyzínu sa skúmala aj akumulácia treonínu v nadbytku kultúry nadexpresiou génu pre pyruvátkarboxylázu. Na to sa, ako je opísané v bode 4, treonín produkujúci kmeň C. glutamicum DM368-3 (Degussa AG) transformoval plazmidom pVWEXlpyc, ako aj na kontrolu plazmidom pVWEXl a skúmalo sa vylučovanie treonínu vždy troch rôznych transformandov. Na to sa pestovali DM368-3(pVWEXl) 1, 2 a 3, ako aj DM368-3(pVWEXlpyc) 1, 2 a 3 v komplexnom médiu (2xTY s 50 pg/l kanamycínu) a fermentačné médium CGXII (J. Bacteriol. 175, 5595 - 5603, 1993) sa naočkovalo vždy oddelene predchádzajúcimi kultúrami. Médium obsahovalo dodatočný kanamycín, aby sa plazmidy udržali stabilnými. Uskutočnili sa dve paralelné vsádzky, pričom sa do jednej laboratórnej banky pridalo 200 pg IPTG/ml, zatiaľ čo druhá laboratórna banka neobsahovala žiadny IPTG. Po kultivácii počas 48 hodín pri 30 °C na rotačnej trepačke pri 120 ot./min. sa určilo množstvo treonínu, akumulované v médiu. Určenie koncentrácie aminokyseliny sa uskutočnilo taktiež pomocou vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie (J. Chromat. 266, 471 - 482, 1983). Výsledok fermentácie je uvedený v tabuľke 3, pričom udané hodnoty predstavujú stredné hodnoty vždy z troch pokusov s rôznymi klonmi. Ukázalo sa, že nadexpresia pyruvátkarboxylázového génu vedie k asi 40 % zvýšeniu koncentrácie treonínu v médiu. Takto využitie objaveného a opísaného génu predstavuje pre anaplerotický enzým pyruvátkarboxylázu spôsob, ako podstatne zvýšiť tvorbu L-trconínu.
Okrem toho určovanie koncentrácie aminokyseliny ukázalo, že kmeň s nadexprimovaným pyruvátkarboxylázovým génom okrem toho prekvapujúco vylúčil do média asi 150 % viac homoserínu než kmeň bez nadexprimovaného génu. Zodpovedajúce výsledky sú taktiež uvedené v tabuľke 3. Jasne z nich vyplýva, že spôsobom podľa tohto vynálezu sa dá podstatne zlepšiť tak tvorba treonínu, ako aj tvorba homoserínu.
6. Zvýšená akumulácia glutamátu nadexpresiou génu pre pyruvátkarboxylázu v štandardnom type C. glutamicum
Analogicky k pokusom na tvorbu L-lyzínu, L-treonínu a L-homoscrínu (pozri pod 4. a 5.) sa skúmala aj akumulácia glutamátu v nadbytku kultúry nadexpresiou génu pre pyruvátkarboxylázu. Na to sa, ako je opísané v bode 4, C. glutamicum ATCC 13032 štandardného typu transformoval plazmidom pVWEXlpyc, ako aj na kontrolu plazmidom pVWEXl a skúmalo sa vylučovanie glutamátu vždy dvoch rôznych transformandov. Na to sa pestovali C. glutamicum ATCC 13032 (pVWEXlpyc) Dl a D2, ako aj C. glutamicum ATCC 13032 (pVWEXlpyc) 1 a 2 v komplexnom médiu (2xTY s 50 pg/l kanamycínu) a fermentačné médium CGXII (J. Bacteriol. 175, 5595 - 5603, 1993) sa naočkovalo vždy oddelene predchádzajúcimi kultúrami. Médium obsahovalo dodatočný kanamycín, aby sa plazmidy udržali stabilnými. Na indukovanie vylučovania glutamátu sa k médiu asi 6 hodín po naočkovaní pridalo 25 mg Tween 60 na ml. Uskutočnili sa dve paralelné vsádzky, pričom sa do jednej laboratórnej banky pridalo 200 pg IPTG/ml, zatiaľ čo druhá laboratórna banka neobsahovala žiadny IPTG. Po kultivácii počas 48 hodín pri 30 °C na rotačnej trepačke pri 120 ot./min. sa určilo množstvo glutamátu, ktoré sa akumulovalo v médiu. Určenie koncentrácie aminokyseliny sa uskutočnilo taktiež pomocou vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie (J. Chromat. 266, 471 až 482, 1983). Výsledok fermentácie je uvedený v tabuľke 4, pričom udané hodnoty predstavujú stredné hodnoty vždy z dvoch pokusov s rôznymi klonmi. Ukázalo sa, že nadexpresia pyruvátkarboxylázového génu vedie k až do 500 % zvýšeniu koncentrácie glutamátu v médiu. Takto využitie objaveného a opísaného génu predstavuje pre anaplerotický enzým pyruvátkarboxylázu spôsob, ako podstatne zvýšiť tvorbu L-glutamátu.
Tabuľka 1
Kmeň IPTG [pg/ml] Pyruvátkarboxyláza [nmol.min',.(mg sušiny) ’]
13032(pEK0pyc) 0 75 ±13
ATCC 13032 0 19 ±4
DG52-5(pVWEXlpyc) 200 88+13
0 11 ±2
DG52-5(pVWEXl) 200 5±2
0 6± 1
DM368-3(pVWF.Xlpyc) 200 76± 10
0 12 ±3
DM368-3(pVWEXl) 200 10+1
0 11 ±2
Tabuľka 2
Kmeň IPTG [pg/ml] Lyzín [mM]
DG52-5(pVWEXlpyc) 200 35,4 ±2,6
0 23,6 ± 2,9
DG52-5(pVWEXl) 200 23,3 ±2,9
0 22,1 ±4,0
Tabuľka 3
Kmeň IPTG [pg/ml] Treonín [mM] Homoserin [mM]
DM368- 3(pVWEXlpyc) DM368-3(pVWEXl) 200 0 200 0 10,2 ± 0,5 7,9 ± 1,0 8,0 + 0,5 7,5 ±0,8 14,4+1,2 5,6 ± 0,2 5,8 ± 0,7 6,1 ± 1,0
Tabuľka 4
Kmeň IPTG [pg/ml] Glutamát [mM]
ATCC 13032 200 11 ±2
ATCC 13032 0 13 ± 2
ATCC 13032(pVWEXl-pyc) 200 67 + 4
ATCC 13032(pVWEXl-pyc) 0 32 ± 4
Sekvenčný protokol (1) Všeobecné údaje:
(i) Prihlasovateľ:
(A) Meno: Forschungszentrum Juelich GmbH (B) Ulica: Poštová schránka 1913 (C) Miesto: Juelich (E) Štát: Nemecko (F) Poštové smerové číslo: 52425 (ii) Označenie vynálezu: pyruvátkarboxyláza (iii) Počet sekvencii: 2 (iv) Počítačovo čitateľné vydanie:
(A) Nosič údajov: disketa (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Softvér: Patentln Release #1.0, Version (EPA) (2) Údaje k SEQ ID No. 1:
(i) Znaky sekvencie:
(A) DÍžka: 3728 bázových párov (B) Druh: nukleotid (C) Vláknová forma: jednovlákno (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: genómová DNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 1:
#1.30
CGCAACCG7G CTTGAACTCG TGCAGGTCAG AACÄAAAACC GATGTTTGAT TGGGGGAATC CTATCACCCT TGGCGGTCTC TTGTTGAAAG CTTCAACGCT TCCAGCATTC AAAAAGATCT GTGCTTTCCG TGCAGCACTC GAAACCGGTG ATCGGGGATC AÍTCCACCGC TCTTTTGCTT CACCAGTCÄA GGCGTACCTG GACATCGATG
GGGAGTGTTG CCCGAAAACA TTGAGAGGAA60
GGGGGTTACG ATACTAGGAC GCAGTGACTG120
GAATAATTAC TCTAGTGTCG ACTCACACAT180
TGGTAGCAAA CCGCGGCGAA ATCGCGGTCC240
CAGCCACGGT AGCTATTTAC CCCCGTGAAG300
CTGAAGCTGT CCGCATTGGT ACCGAAGGCT360
AAATTATCGG TGCAGCTAAA AAAGTTAAAG420
CAGATGCCAT TTACCCGGGA TACGGCTTCC GTGCGGAAAA CGGCATTACT TTTATTGGCC ATAAG7CTCG CGCGGTAACC GCCGCGAAGA CCCCGAGCAA AAACATCGAT GAGATCGTTA TTGTGAAGGC AGTTGCCGGT GGTGGCGGAC AGCTTCCCAA ATTAGCAACA GAAGCATCTC CGGTATATGT CGAACGTGCT GTGATTAACC ATCACACTGG AGAAGTTGTA CACCTT7ATG AAAAAGTTGT CGAAATTGCG CCAGCACAGC GTGCGGATGC AG7AAAG7TC TGCCGCTCCA TCTTGGTCGA TGAAAAGGGC AACCACGTCT AGCACÄCCGT GACTGAAGAA GTCACCGAGG CTGCTGGTGC AA.CCTTGAAG GAATTGGGTC CAGCACTGCA GTGCCGCATC ACCACGGAAG GAACTATCAC CGCGTACCGC TCACCAGGCG AGCTCGGTGG CGAAATCACC GCACACTTTG GTTCCGACTT TGAAACTGCT GTTGCTCGTG CTGGTGTTGC AACCAACAT? GGTTTCTTGC CCAAGCGCAT CGCCACCGGA TTCATTGCCG CTGATGATGA GCAGGGACGC ATCCTGGATT ATGGTGTGCG TCCAAAGGAT GTTGCASCTC TGCCACTGCC ACGCGGTTCC CGTGACCGCC GTGATCTCCG TGAGCAGGAC GCACTGGCAG AGTCTTTGCT TGCGACCCGA GTCCGCľCAT CAAAGCTGAC TCC7GAGCTT TTGTCCGTGG CGATGCGTTT CCTCTTTGAG GATCCGTGGG CGAÄTGTAAA CATTCAGATG CTGGTTCGCG CAGACTCCGT CTGCCGCGCG TTTGTTAAGG
TGTCTGAAAA TGCCCAGCTT GCCCGCGAGT480
CAACCCCAGA GGTTCTTGAT CTCA'XGGTw540
AGGCTGGTCT GCCAGTTTTG GCGGAATCGA600
AAAGCGCTGA AGGCCAGACT TACCCCATOT660
GCGGTATGCG TTTTGTTGCT TCACCTGATG720
GTGAACCTGA AGCGGCTTTC GGCGATGGCG780
CTCÄGCA7AT TGAAGTGCAG A7CCTTGGCG840
AACGTGACTG CTCACTGCAG CGTCGTCACC900
ATTTGGA7CC AGAACTGCGT GATCGCATTT960
TTGGTTACCÄ GGGCGCGGGA ACCGTGGAAT1020
TCATCGAAAT GAACCCACGT ATCCAGGTTG1080
TGGACCTGGT GAAGGCGCAG ATGCGCTTGG1140
TGACCCAAGA TAAGATCAAG ACCCACGGTG1200
ATCCAAACAA CGGCTTCCGC CCAGATACCG1260
GAGCTGGCGT ľCGTCTTGAC GGTGCÄGCTC1320
ACTCCATGCT GGTGAAAATG ACCTGCCGTG1380
CACAGCGCGC GTTGGCTGAG TTCACCGTGT1440
GTGCGTTGCT GCGGGAAGAG GACTTCACTT1500
ATCACCCGCA CCTCCTTCÄG GCTCCACCTG1560
ACTTGGCAGA TGTCACCGTG AACAAGCCTC1620
CTATCGATAA GCTGCCTAAC ATCAAGGATC1680
TGAAGCAGCT TGGCCCAGCC GOGTTTGCTC1740
TTAC7GATAC CÄCCT7CCGC GAľGCACACC1900
TCGCACTGAA GCCTGCGGCA GAGGCCGTCG1960
AGGCCTGGGG CGGCGCGAGC TACGATGTGG1920
ACAGGCTCGA CGAGCTGCGC GAGGCGATGC1930
GCCGCAACAC CGTGGGATAC ACCCCGTACC2040
AAGCTGCCAG CTCCGGCGTG GACATCtTCC2100
GCATCTTCGA CGCGCTTAAC GACGTCTCCC AGACCÄACA cgcggtagcc gaggtggcta ATGAAAAGCT CTACACCCTG GATTACTACC GCGCTCACAT CTTGGCCATT AAGGATATGG AGCTGGTCAG CGCACTGCGC CGTGAATTCG CTGCGGGTGG CCAGCTGGCA ACCTACTTTG ACGGTGCTTC CGCACCACTG TCTGGCACCA ctgcahcg: GCACACCCGT cgcgätaccg AGCCGTACTG GGAAGCAGTG CGCGGACTGT CAACCGGTCG cgtctaccgc cacgaaatcc AGGCCACCGC ACTGGGCCTT GCGGATCGTT TTAATGAGAT GCTGGGACGC CCAACCAAGG
AGATGCGTCC AGCAAČCGAU GCAGTCCTGG2160
TGGCTTATTC TGGTGATCTC TCTGATCCAA2220
TAAAGATGGC AGAGGAGATC GTCAAGTCTG2280
CTGGTCTGCT TCGCCCAGCT GCGGTAACCA2340
ATCTGCCAGT GCACGTGCAC ACCCACGACA2400
CTGCAGCTCA AGCTGGTGCA GATGCTGTTG2460
CZTCCCAGCC ATCCCTGTCT GCCATTGTTG2520
GTTTGAGCCT CGAGGCTGTT TCTGACCTCG2580
ACCTGCCATT TGAGTCTGGA ACCCCAGGCC2640
CAGGCGGACA GTTGTCCAAC CTGCGTGCAC2700
TCGAACTCAT CGAAGACAAC TACGCAGCCG2760
TCACCCCATC CTCCÄAGGTT GTTCGCGACC2820
TCGCACTCCA CCTCGTTGGT GCGGGTGTGG ATCCAGCAGA CTTTGCTGCC GATCCACAAA 2880 AGTACGACAT CCCAGACTCT GTCATCGCGT TCCTGCGCGG CGAGCTTGGT AACCCTCCAG 2940 GTGGCTGGCC AGAGCCACTG CGCACCCGCG CACTGGÄAGG CCGCTCCGAA GGCAAGGCAC 3000 CTCTGACGGA AGTTCCTGAG GAAGAGCAGG CGCACCTCCA CGCTGATGAT TCCAAGGAäC 3060 GTCGCAATAG CCTCAACCGC CTGCTGTTCC CGAÄGCCAAC CGAAGAGTTC CTCGAGCACC 3120 GTCGCCGCTT CGGCAACACC TCTGCGCTGG ATGATCGTGA ATTCTTCTAC GGCCTGGTCG 3180 AAGGCCGCGA GACTTTGATC CGCCTGCCAG ATGTGCGCAC CCCACTGCTT GTTCGCCTGG 3240 ATGCGATCTC TGAGCCAGAC GATAAGGGTA TGCGCAATGT TGTGGCCAAC GTCAACGGCC 3300 AGATCCGCCC AATGCGTGTG CGTGACCGCT CCGTTGAGTC TGTCACCGCA ACCGCAGAAA 3360 AGGCAGATTC CTCCAACAAG GGCCATGTTG CTGCACCATT CGCTGGTGTT GTCACCGTGA 3420 CTGTTGCTGA AGGTGATGAG GTCAAGGCTG GAGATGCAGT CGCAATCATC GAGGCTATGA 3480 AGATGGAAGC AACAATCACT GCTTCTGTTG ACGGCAAAAT CGATCGCGTT GTGGITCCTG 3540 CTGCAACGAA GGTGGAAGGT GGCGACTTGA TCGTCGTCGT TTCCTAAACC TTTCTGTAAA 3600 AAGCCCCGCG TCTTCCTCAT GGAGGAGGCG GGGCTTTTTG GGCCAAGATG GGAGATGGGT 3660 GAGTTGGATT TGGTCTGATT CGACACTTTT AAGGGCAGAG ATTTGAAGAT GGAGACCAAG 3720 (2) Údaje k SEQ ID No. 2:
(i) Znaky sekvencie:
(A) Dĺžka: 1140 aminokyselín (B) Druh: aminokyselina (C) Vláknová forma: jednovlákno (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 2:
Met Ser Thr His Thr Ser Ser Thr Leu Pro Ala Phe Lys Lys íle Leu
1 5 10 15
Val Ala Asn Arg 20 Gly Glu íle Ala Val 25 Arg Ala Phe Arg Ala 30 Ala Leu
Glu Thr Gly Ala 35 Ala Thr Val Ala 40 íle Tyr Pro Arg Glu 45 Asp Arg Gly
Ser Phe His Arg 5 C Ser Phe Ala 55 Ser Glu Ala Val Arg 60 íle Gly Thr Glu
Gly Ser Pro Val 65 Lys Ala 70 Tyr Leu Asp íle Asp 75 GLu íle íle Gly Ala 60
Ala Lys Lys Val Lys 85 Ala Asp Ala íle Tyr 90 Pro Gly Tyr Gly Phe 95 Leu
Ser Glu Asn Ala 100 GLn Leu Ala Arg Glu 105 cys Ala Glu Asn Gly 110 íle Thr
Phe íle Gly Pro 115 Thr Pro Glu Val 120 Leu Asp Leu Thr Gly 125 Asp Lys Ser
Arg Ala Val Thr 130 Ala Ala Lys 135 Lys Ala Gly Leu Pro 140 val Leu Ala Glu
Ser Thr Pro Ser 145 Lys Asn 150 íle Asp Glu íle Val 155 Lys Ser Ala Glu Gly 160
Gin Thr Tyr Pro íle 165 Phe Val Lys Ala Val 170 Ala Gly Gly Gly Gly 175 Arg
Gly Met Arg Phe 180 Val Ala Ser Pro Asp 185 GLu Leu Arg Lys Leu 190 Ala Thr
Glu Ala Ser Arg 195 Glu Ala Glu Ala 200 Ala Phe Gly Asp Gly 205 Ala Val Tyr
Val Glu Arg Ala 210 Val íle Asn 215 Pro Gin His íle Glu 220 Val Gin rie Leu
Gly Aap His Thr 225 Gly Glu 230 Val Val His Leu Tyr 235 Glu Arg Asp Cys Ser 240
Leu Gin Arg Arg His 245 Gin Lys Val Val Glu 250 íle Ala Pro Ala Gin 2SS His
Leu Asp Pro Glu 260 Leu Arg Asp Arg íle 265 Cys Ala Asp Ala Val 270 Lys Phe
Cys Arg Ser íle 275 Gly Tyr Gin Gly 280 Ala Gly Thr Val Glu 265 Phe Leu Val
Asp Glu Lys Gly 290 Asn His Val 295 Phe íle Glu Met Asn 300 Pro Arg íle Gin
Val Glu His Thr 305 Val Thr 310 Glu Glu Val Thr Glu 315 Val Asp Leu Val Lys 320
Ala Gin Met Arg Leu 325 Ala Ala Gly Ala Thr 330 Leu Lys Glu Leu Gly 335 Leu
Thr Gin Asp Lys íle Lys Thr His Gly Ala Ala Leu Gin Cys Arg íle
340 345 350
Thr Thr Glu Asp Pro Asn Asn Gly Phe Arg Pro Asp Thr Gly Thr íle
355 360 365
Thr Ala Tyr Arg Ser Pro Gly Gly Ala Gly Val Arg Leu Aso Gly Ala
370 375 380
Ala Gin Leu Gly Gly Glu íle Thr Ala His Phe Asd Ser Ne t Leu Val
385 390 395 400
Lys Met Thr Cys Arg Gly Ser Asp Phe Glu Thr Ala Val Ala Arg Ala
405 410 415
Gin Arg Ala Leu Ala G1U Phe Thr Val Ser GLy Val Ala Thr Asn íle
420 425 430
Gly Phe Leu Arg Ala Leu Leu Arg Glu Glu Asp Phe Thr Ser Lys Arg
435 440 445
íle Ala Thr Gly Phe íle Ala Asp His Pre His Leu Leu Gin Ala Pro
450 455 460
Pro Ala Asp Asp Glu Gin Gly Arg íle Leu Asp Tyr Leu Ala Asp Val
465 470 475 480
Thr Val Asn Lys Pro His Gly Val Arg Pro Lys Asp Val Ala Ala Pro
485 490 495
íle Asp Lys Leu Pre Asn íle Lys Asp leu Pro Leu Pro Arg Gly Ser
500 505 510
Arg Asp Arg Leu Lys Gin Leu Gly Pro Ala Ala Phe Ala Arg Asp Leu
515 520 525
Arg Glu Gin Asp Ala Leu Ala Val Thr Asp Thr Thr Phe Arg Asp Ala
530 S35 540
His Gin Ser Leu Leu Ala Thr Arg Val Arg Ser Phe Ala Leu Lys Pro
545 550 555 S60
Ala Ala Glu Al_a Val Ala Lys Lys Thr Pro GLu Leu Leu Ser Val Glu
565 570 575
Ala Trp Gly Gly Ala Thr Tyr Asp Val Ala Met Arg Phe Leu Phe Glu
S80 5Θ5 590
Asp Pro Trp Asp Arg Leu Asp Glu Leu Arg Glu Ala Met Pro Asn Val
595 600 605
Asn íle Gin Met Leu Leu Arg Gly Arg Asn Thr Val Gly Tyr Thr Pro
610 615 620
Tyr Pro Asp Ser Val Cys Arg Ala Phe Val Lys Glu Ala Ala Ser Ser
625 630 635 €40
Gly Val Asp íle Phe Arg íle Phe Asp Ala Leu Asn Asp Val Ser Gin
645 650 655
Mer Arg Pre Ala íle Asp Ala Val Leu Glu Thr Asn Thr Ala Val Ala
660 665 670
Glu Val Ala Met Ala Tyr Ser Gly Asp Leu Ser Asp Pro Asn Glu Lys
675 660 685
Leu Tyr Thr Leu Asp Tyr Tyr Leu Lys Met Ala Glu Glu íle Val Lys
690 695 700
Ser Gly Ala His íle Leu Ala íle Lys Asp Met Ala Gly Leu Leu Arg
70S 710 715 720
Pro Ala Ala Val Thr Lys Leu Val Thr Ala Leu Arg Arg Glu Phe Asp
725 730 735
Leu Pro Val His Val His Thr His Asp Thr ALa Gly Gly Gin Leu Ala
740 745 750
Thr Tyr Phe Ala Ala Ala GLn Ala Gly Ala Asp Ala Val Asp .Gly Ala
755 760 765
Ser Ala Pro Leu Ser Glv Thr Thr Ser Gin Pro Ser Leu Ser Ala íle
770 77S 780
Val 765 Ala Ala Phe Ala His 7S0 Thr Arg Arg Asp Thr 795 Gly Leu Ser Leu Glu 800
Ala Val Ser Asp Leu Glu Pro Tyr Trp Glu Ala Val Arg Gly Leu Tyr
605 810 815
Leu Pro Phe Glu Ser Gly Thr Pro Gly Pro Thr Gly Arg Val Tyr Arg
820 825 830
His G1U íle Pro Gly Gly Gin Leu Ser Asn Leu Arg Ala Gin Ala Thr
835 840 845
Ala Leu Gly Leu Ala Asp Arg Phe Glu Leu íle Glu Asp Asn Tyr Ala
850 05S 860
Ala Val Asn Glu Met Leu Gly Arg Pro Thr Lys Val Thr Pro Ser Ser
965 670 875 880
Lys Val Val Gly Asp Leu Ala Leu His Leu VaL Gly Ala Gly Val Asp
885 090 895
Pro Ala Asp Phe Ala Ala Asp Pro Gin Lys Tyr Asp íle Pro Asp Ser
900 905 910
Val· íle Ala Phe Leu Arg Gly Glu Leu Cly Asn Pro Pro Gly Gly Trp
915 920 925
Ecu Glu Pro Leu Arg Thr Arg Ala Leu Glu Gly Arg Ser Glu Gly Lys
930 935 940
Ala Pro Leu Thr Glu Val Pro Glu Glu Glu Gin Ala His Leu Asp Ala
945 950 955 960
Asp Asp Ser Lys Glu Arg Arg Asn Ser Leu Asn Arg Leu Leu Phe Pro
965 970 975
Lys Pro Thr Glu Glu Phe Leu Glu His Arg Arg Arg Phe Gly Asn Thr
980 985 990
Ser Ala Leu Asp Asp Arg Glu Phe Phe Tyr Gly Leu Val GLu Gly Arg
995 1001 ) 1005
Glu Thr Leu íle Arg Leu Pro Asp Val Arg Thr Pro Leu Leu Val Arg
1010 1015 1020
Leu Asp Ala íle Ser Glu Pro Asp Asp Lys Gly Mec Arg Asn Val Val
1025 1030 1035 1040
Ala Asn Val Asn Gly Gin íle Arg Pro Mec Arg Val Arg Asp Arg Ser
1045 1050 1055
Val Glu Ser Val Thr Ala Thr Ala Glu Lys Ala Asp Ser Ser Asn Lys
1060 1063 1070
Gly ! ils ' Val Ala Ala Pro Phe Ala Gly Val Val Thr Val Thr Val Ala
1075 1080 1085
Glu i · Asp Glu Val Lys Ala Gly Asp Ala Val Ala íle ILe Glu Ala
1090 2095 1100
Met 1 Lys 1 Met Glu Ala Thr íle Thr Ala Ser Val Asp Gly Lys íle Asp
1105 1110 1115 1120
Arg Val Val Val Pro Ala Ala Thr Lys Val Glu Gly Gly Asp Leu He 1125 1130 H3S
Val Val Val Ser

Claims (36)

1. Spôsob mikrobiálnej prípravy aminokyselín aspartátovej a/alebo glutamátovej skupiny, vyznačujúci sa tým, že sa pri ňom zvýši pyruvátkarboxylázová aktivita genetickým pozmenením enzýmu a/alebo expresia pyruvátkarboxylázového génu mikroorganizmu, ktorý produkuje zodpovedajúcu aminokyselinu.
2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že mutáciou endogénneho pyruvátkarboxylázového génu sa vytvorí enzým s vyššou pyruvátkarboxylázovou aktivitou.
3. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že génová expresia pyruvátkarboxylázy sa zvýši zvýšením počtu kópií génu.
4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že na zvýšenie počtu kópií génu sa pyruvátkarboxylázový gén zabuduje do génového konštruktu.
5. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že gén sa zabuduje do génového konštruktu, ktorý obsahuje regulačnú génovú sekvenciu, priradenú pyruvátkarboxylázovému génu.
6. Spôsob podľa nároku 4 alebo 5, vyznačujúci sa tým, že mikroorganizmus, ktorý produkuje zodpovedajúcu aminokyselinu, sa transformuje génovým konštruktom, ktorý obsahuje uvedený gén.
7. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že mikroorganizmus rodu Corynebacterium sa transformuje génovým konštruktom, ktorý obsahuje uvedený gén.
8. Spôsob podľa nároku 6 alebo 7, vyznačujúci sa tým, že na transformáciu sa použije mikroorganizmus, v ktorom sú enzýmy, ktoré sa podieľajú na syntéze zodpovedajúcej aminokyseliny, deregulované a/alebo majú zvýšenú aktivitu exportných nosičov pre zodpovedajúcu aminokyselinu.
9. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 6 až 8, vyznačujúci sa tým, že na transformáciu sa použije mikroorganizmus, ktorý obsahuje zvýšený podiel metabolitov centrálnej látkovej výmeny, podieľajúcich sa na syntéze zodpovedajúcej aminokyseliny.
10. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 6 až 9, vyznačujúci sa tým, že na transformáciu sa použije mikroorganizmus, pri ktorom biosyntetická dráha, konkurujúca biosyntetickej dráhe zodpovedajúcej aminokyseliny, prebieha so zníženou aktivitou.
11. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že pyruvátkarboxylázový gén sa izoluje z kmeňa mikroorganizmov rodu Corynebacterium.
12. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že génová expresia sa zvýši zosilnením transkripčných signálov.
13. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že pyruvátkarboxylázovému génu sa predradí tac-promótor.
14. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že obsahuje regulačné sekvencie, priradené tac-promótoru.
15. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že ako pyruvátkarboxylázový gén sa použije gén s nukleotidovou sekvenciou, kódujúcou aminokyselinovú sekvenciu, uvedenú pod SEQ 1D No. 2 a jej alelové variácie s rovnakou funkciou.
16. Spôsob podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že ako pyruvátkarboxylázový gén sa použije gén s nukleotidovou sekvenciou od nukleotidu 165 po 3587 podľa SEQ ID No. 1 alebo s v podstate rovnako účinkujúcou DNA-sekvenciou.
17. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že sa pripraví lyzin, treonín, homoserín, glutamát a/alebo arginín.
18. Pyruvátkarboxylázový gén, ktorého nukleotidová sekvencia kóduje aminokyselinovú sekvenciu, uvedenú pod SEQ ID No. 2, a/alebo jej alelové variácie s rovnakou funkciou.
i 9. Pyruvátkarboxylázový gén podľa nároku 18, ktorý má nukleotidovú sekvenciu od nukleotidu 165 po 3587 podľa SEQ ID No. 1 alebo v podstate rovnako účinkujúcu DNA-sekvenciu.
20. Pyruvátkarboxylázový gén podľa nároku 18 alebo 19, ktorý má predradený promótor s nukleotidovou sekvenciou zodpovedajúcou nukleotidom od 20 po 109 podľa SEQ ID No. 1 alebo v podstate rovnako pôsobiacu DNA-sekvenciu.
21. Pyruvátkarboxylázový gén podľa nároku 18 alebo 19, ktorý má predradený tac-promótor.
22. Pyruvátkarboxylázový gén podľa nároku 21, s regulačnými sekvenciami priradenými promótoru.
23. Pyruvátkarboxylázový gén podľa ktoréhokoľvek z nárokov 18 až 20, s týmito priradenými regulačnými génovými sekvenciami.
24. Génová štruktúra, ktorá obsahuje pyruvátkarboxylázový gén podľa ktoréhokoľvek z nárokov 18 až 23.
25. Vektor, ktorý obsahuje pyruvátkarboxylázový gén podľa ktoréhokoľvek z nárokov 18 až 23 alebo génovú štruktúru podľa nároku 24.
26. Transformovaná bunka, ktorá obsahuje v replikovateľnej forme pyruvátkarboxylázový gén podľa ktoréhokoľvek z nárokov 18 až 23 alebo génovú štruktúru podľa nároku 24.
27. Transformovaná bunka podľa nároku 26, ktorá obsahuje vektor podľa nároku 25.
28. Transformovaná bunka podľa nároku 26 alebo 27, ktorá patrí k rodu Corynebacterium.
29. Transformovaná bunka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 26 až 28, v ktorej enzýmy, podieľajúce sa na syntéze zodpovedajúcej aminokyseliny, a/alebo enzýmy, podieľajúce sa na exporte zodpovedajúcej aminokyseliny, sú deregulované.
30. Transformovaná bunka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 26 až 29, že obsahuje zvýšený podiel metabolitov centrálnej látkovej výmeny, podieľajúcich sa na syntéze zodpovedajúcej aminokyseliny.
31. Transformovaná bunka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 26 až 30, že obsahuje znížený podiel metabolitov centrálnej látkovej výmeny, ktoré sa nepodieľajú na syntéze zodpovedajúcej aminokyseliny.
32. Použitie pyruvátkarboxylázového génu na zvýšenie produkcie aminokyselín aspartátovej a/alebo glutamátovej skupiny mikroorganizmami.
33. Použitie podľa nároku 32, vyznačujúce sa tým, že sa použije mutovaný pyruvátkarboxylázový gén, ktorý kóduje enzým so zvýšenou pyruvátkarboxylázovou aktivitou.
34. Použitie podľa nároku 32 alebo 33, vyznačujúce sa tým, že mikroorganizmus, produkujúci zodpovedajúcu aminokyselinu, sa transformuje génovým konštruktom, ktorý obsahuje pyruvátkarboxylázový gén.
35. Použitie podľa nároku 34, vyznačujúce sa tým, že génový konštrukt obsahuje dodatočne regulačné génové sekvencie.
36. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 32 až 35, vyznačujúce sa tým, že sa použije pyruvátkarboxylázový gén z Corynebacterium.
37. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 32 až 36, vyznačujúce sa tým, že ako aminokyselinu produkujúci mikroorganizmus sa použije Corynebacterium.
SK4812000A 1997-10-04 1998-09-30 Method for microbial production of amino acids of the aspartate and/or glutamate family and agents which can be used in the said method SK284235B6 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19743894 1997-10-04
DE19831609A DE19831609B4 (de) 1997-10-04 1998-07-14 Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren der Aspartat- und/oder Glutamatfamilie und im Verfahren einsetzbare Mittel
PCT/EP1998/006210 WO1999018228A2 (de) 1997-10-04 1998-09-30 Verfahren zur mikrobiellen herstellung von aminosäuren der aspartat- und/oder glutamatfamilie und im verfahren einsetzbare mittel

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK4812000A3 SK4812000A3 (en) 2000-09-12
SK284235B6 true SK284235B6 (en) 2004-11-03

Family

ID=26040582

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK4812000A SK284235B6 (en) 1997-10-04 1998-09-30 Method for microbial production of amino acids of the aspartate and/or glutamate family and agents which can be used in the said method

Country Status (15)

Country Link
US (2) US7267967B1 (sk)
EP (1) EP1015621B1 (sk)
JP (1) JP2002508921A (sk)
CN (1) CN1323171C (sk)
AT (1) ATE290602T1 (sk)
AU (1) AU741038B2 (sk)
BR (1) BRPI9813021B1 (sk)
CA (1) CA2305577A1 (sk)
DE (1) DE59812638D1 (sk)
ES (1) ES2238773T3 (sk)
HU (1) HU224055B1 (sk)
ID (1) ID26644A (sk)
RU (1) RU2231552C2 (sk)
SK (1) SK284235B6 (sk)
WO (1) WO1999018228A2 (sk)

Families Citing this family (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002511250A (ja) * 1998-04-13 2002-04-16 ザ ユニバーシティ オブ ジョージア リサーチファウンデーション，インコーポレイティド 微生物におけるオキサロ酢酸由来生化学物質の生産増強のためのピルビン酸カルボキシラーゼの過剰発現
DE19931317A1 (de) * 1999-07-07 2001-01-11 Degussa L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien und Verfahren zur Herstellung von L-Lysin
US6171833B1 (en) 1998-12-23 2001-01-09 Massachusetts Institute Of Technology Pyruvate carboxylase from corynebacterium glutamicum
BR9816106A (pt) * 1998-12-23 2001-09-11 Massachusetts Inst Technology Carboxilase de piruvato de corynebacterium glutamicum
JP2000201692A (ja) 1999-01-13 2000-07-25 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ―グルタミン酸の製造法
TW200734459A (en) 1999-10-04 2007-09-16 Ajinomoto Kk Genes for heat resistant enzymes of amino acid biosynthetic pathway derived from thermophilic coryneform bacteria
DE19947792A1 (de) * 1999-10-05 2001-04-12 Degussa Neue für das Irp Gen codierende Nukleotidsequenzen
US7132272B2 (en) 1999-10-05 2006-11-07 Degussa Ag Nucleotide sequence encoding corynebacterium glutamicum leucine response regulatory protein
RU2207376C2 (ru) * 1999-10-14 2003-06-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Способ получения l-аминокислоты методом ферментации, штамм бактерии escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты)
DE10021831A1 (de) * 2000-05-04 2001-11-08 Degussa Neue für das fadD15-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
US6949374B2 (en) 2000-05-04 2005-09-27 Degussa Ag FadD15 gene of Corynebacterium glutamicum, encoding an acyl-CoA synthase polypeptide
DE10032350A1 (de) 2000-07-04 2002-01-24 Degussa Neue für das mdhA-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
AU2001276385A1 (en) * 2000-08-10 2002-02-18 Degussa A.G. Nucleotide sequences which code for the lysr3 gene
DE10039049A1 (de) 2000-08-10 2002-02-21 Degussa Neue für das IysR3-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
DE10042051A1 (de) * 2000-08-26 2002-03-07 Degussa Neue für das cstA-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
ATE349544T1 (de) * 2001-02-21 2007-01-15 Basf Ag Verfahren zur herstellung von d-pantothensäure und/oder deren salze als zusatz zu tierfuttermitteln
DE10108225A1 (de) * 2001-02-21 2002-10-10 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze als Zusatz zu Tierfuttermitteln
EP1385975B1 (de) * 2001-02-21 2007-01-03 Basf Aktiengesellschaft Verfahren zur herstellung von d-pantothensäure und/oder salze als zusatz zu tierfuttermitteln
DE10108223A1 (de) * 2001-02-21 2002-10-10 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze als Zusatz zu Tierfuttermitteln
AU2002354853A1 (en) 2001-07-18 2003-03-03 Degussa Ag Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family
AU2002345081A1 (en) 2001-07-18 2003-03-03 Degussa Ag Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family
ATE409752T1 (de) * 2001-08-06 2008-10-15 Evonik Degussa Gmbh Coryneforme bakterien, die chemische substanzen bilden ii
US8278076B2 (en) 2002-02-20 2012-10-02 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Microbial production of pyruvate and pyruvate derivatives
DE10303571A1 (de) 2003-01-30 2004-08-12 Degussa Ag Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE10316109A1 (de) 2003-04-09 2004-10-21 Degussa Ag Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102004005836A1 (de) 2004-02-06 2005-09-15 Degussa Ag Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102004037572A1 (de) * 2004-08-03 2006-02-23 Degussa Ag Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102005018835A1 (de) 2005-04-22 2006-11-02 Degussa Ag Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung verbesserter Stämme der Familie Enterobacteriaceae
DE102005043979A1 (de) 2005-09-15 2007-03-22 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur Produktion von Aminosäuren in aminosäureproduzierenden Mikroorganismen
JP2009118740A (ja) 2006-03-03 2009-06-04 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
DE102006032634A1 (de) 2006-07-13 2008-01-17 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren
EP2066782A4 (en) * 2006-09-15 2010-02-03 Cj Cheiljedang Corp CORYNEBACTERIA WITH IMPROVED L-LYSINE PRODUCTIVITY AND METHOD FOR THE PREPARATION OF L-LYSINE THEREWITH
JP2010041920A (ja) 2006-12-19 2010-02-25 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
KR100830826B1 (ko) 2007-01-24 2008-05-19 씨제이제일제당 (주) 코리네박테리아를 이용하여 글리세롤을 포함한탄소원으로부터 발효산물을 생산하는 방법
JP2010088301A (ja) 2007-02-01 2010-04-22 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2010110216A (ja) 2007-02-20 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸または核酸の製造方法
DE102007051024A1 (de) 2007-03-05 2008-09-11 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
EP1975241A1 (de) 2007-03-29 2008-10-01 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
JP2010226956A (ja) * 2007-07-23 2010-10-14 Ajinomoto Co Inc Ｌ−リジンの製造法
WO2009031565A1 (ja) 2007-09-04 2009-03-12 Ajinomoto Co., Inc. アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法
DE102007044134A1 (de) 2007-09-15 2009-03-19 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102007052270A1 (de) 2007-11-02 2009-05-07 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
EP2060636A1 (de) 2007-11-14 2009-05-20 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
JP2011067095A (ja) 2008-01-10 2011-04-07 Ajinomoto Co Inc 発酵法による目的物質の製造法
BRPI0906795A2 (pt) 2008-01-23 2015-08-18 Ajinomoto Kk Método para produzir um l-aminoácido
EP2098597A1 (de) 2008-03-04 2009-09-09 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
US8932861B2 (en) 2008-04-10 2015-01-13 Cj Cheiljedang Corporation Transformation vector comprising transposon, microorganisms transformed with the vector, and method for producing L-lysine using the microorganism
KR101126041B1 (ko) 2008-04-10 2012-03-19 씨제이제일제당 (주) 트랜스포존을 이용한 형질전환용 벡터, 상기 벡터로형질전환된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신 생산방법
DE102008001874A1 (de) 2008-05-20 2009-11-26 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren
DE102008002309A1 (de) 2008-06-09 2009-12-10 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102008044768A1 (de) 2008-08-28 2010-03-04 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von organisch-chemischen Verbindungen unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
BRPI0918299B1 (pt) 2008-09-08 2018-08-14 Ajinomoto Co., Inc. Método para produzir um l-aminoácido
JP2012029565A (ja) 2008-11-27 2012-02-16 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
EP2267145A1 (de) 2009-06-24 2010-12-29 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
JPWO2011013707A1 (ja) 2009-07-29 2013-01-10 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2012223092A (ja) 2009-08-28 2012-11-15 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2013013329A (ja) 2009-11-06 2013-01-24 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
CN102947459B (zh) * 2010-02-25 2015-07-29 高露洁-棕榄公司 在包含木薯渣或菠萝蜜种子作为碳源的发酵培养基中利用谷氨酸棒杆菌atcc 21831或谷氨酸棒杆菌atcc 21493生产精氨酸的方法
KR101145943B1 (ko) 2010-03-11 2012-05-15 씨제이제일제당 (주) Ｌ-아미노산 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법
JP5796282B2 (ja) * 2010-08-31 2015-10-21 東レ株式会社 コリネ型細菌による化学品の製造方法
RU2496867C2 (ru) * 2011-04-25 2013-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Способ получения l-аминокислоты семейства глутамата с использованием коринеформной бактерии
EP2540834A1 (en) 2011-06-29 2013-01-02 Metabolic Explorer Method for the preparation of 1,3-propanediol
EP3404101A3 (en) * 2011-12-21 2018-12-26 Cj Cheiljedang Corporation Method for producing l-lysine using microorganisms having ability to produce l-lysine
MY185322A (en) 2013-05-13 2021-05-04 Ajinomoto Kk Method for producing l-amino acid
MX2015015336A (es) * 2013-05-17 2016-03-04 Xyleco Inc Procesamiento de biomasa.
JP2016165225A (ja) 2013-07-09 2016-09-15 味の素株式会社 有用物質の製造方法
JP2016192903A (ja) 2013-09-17 2016-11-17 味の素株式会社 海藻由来バイオマスからのｌ−アミノ酸の製造方法
PL3053999T3 (pl) 2013-10-02 2020-03-31 Ajinomoto Co., Inc. Przyrząd do regulowania poziomu amoniaku i sposób regulowania poziomu amoniaku
WO2015060314A1 (ja) 2013-10-21 2015-04-30 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
WO2015060391A1 (ja) 2013-10-23 2015-04-30 味の素株式会社 目的物質の製造法
CN105505969A (zh) * 2014-09-26 2016-04-20 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种提高l-苏氨酸转化率的方法及其应用
JP6623690B2 (ja) 2015-10-30 2019-12-25 味の素株式会社 グルタミン酸系ｌ−アミノ酸の製造法
JP7066977B2 (ja) 2017-04-03 2022-05-16 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
DE102017004751A1 (de) 2017-05-18 2018-11-22 Forschungszentrum Jülich GmbH Pyruvatcarboxylase und für die Pyruvatcarboxylase kodierende DNA, Plasmid enthaltend die DNA, sowie Mikroorganismus zur Produktion und verfahren zur Herstellung von Produkten, deren Bioynthese Oxalacetat als Vorstufe beeinhaltet und Chromosom
EP3467099A1 (en) 2017-10-05 2019-04-10 Evonik Degussa GmbH Method for the fermentative production of l-amino acids
EP3608409A1 (en) 2018-08-09 2020-02-12 Evonik Operations GmbH Process for preparing l amino acids using improved strains of the enterobacteriaceae family
CN112969797A (zh) 2018-09-07 2021-06-15 阿彻丹尼尔斯米德兰德公司 工程化棒状杆菌属菌株
RU2019128538A (ru) 2018-09-26 2021-03-11 Эвоник Оперейшенс ГмбХ Способ ферментативного получения l-лизина
EP3861109A1 (en) 2018-10-05 2021-08-11 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by bacterial fermentation
CN113755492B (zh) * 2020-07-20 2023-05-30 中国科学院天津工业生物技术研究所 丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体及其应用
JPWO2022092018A1 (sk) 2020-10-28 2022-05-05
WO2023222510A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Evonik Operations Gmbh Biotechnological production of desferrioxamines and analogs thereof
WO2023222515A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Evonik Operations Gmbh Biotechnological production of bisucaberins, desferrioxamines and analogs thereof
WO2023222505A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Evonik Operations Gmbh Biotechnological production of monomers of bisucaberins, desferrioxamines and analogs thereof
US20240117393A1 (en) 2022-09-30 2024-04-11 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-amino acid

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2223754B (en) 1988-09-12 1992-07-22 Degussa Dna encoding phosphoenolpyruvate carboxylase
DE4201085A1 (de) 1992-01-17 1993-07-22 Degussa Verfahren zur erhoehung der leistungsfaehigkeit l-lysin ausscheidender coryneformer bakterien
AU682547B2 (en) 1993-08-24 1997-10-09 Ajinomoto Co., Inc. Variant phosphoenolpyruvate carboxylase, gene thereof, and process for producing amino acid
US5939307A (en) * 1996-07-30 1999-08-17 The Archer-Daniels-Midland Company Strains of Escherichia coli, methods of preparing the same and use thereof in fermentation processes for l-threonine production
MX240992B (es) * 1999-07-09 2006-10-10 Degussa Secuencias de nucleotidos que codifican para el gen opca.
DE19941478A1 (de) * 1999-09-01 2001-03-08 Degussa Neue für das thrE-Gen codierende Nukleotidsequenzen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin mit coryneformen Bakterien
DE19959329A1 (de) * 1999-12-09 2001-06-13 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
DE10154102A1 (de) * 2001-11-02 2003-05-15 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI9813021B1 (pt) 2016-04-05
ATE290602T1 (de) 2005-03-15
EP1015621B1 (de) 2005-03-09
HU224055B1 (hu) 2005-05-30
US7267967B1 (en) 2007-09-11
DE59812638D1 (de) 2005-04-14
AU1148299A (en) 1999-04-27
RU2231552C2 (ru) 2004-06-27
CN1323171C (zh) 2007-06-27
HUP0004381A3 (en) 2003-08-28
CA2305577A1 (en) 1999-04-15
US20070202571A1 (en) 2007-08-30
WO1999018228A2 (de) 1999-04-15
ID26644A (id) 2001-01-25
ES2238773T3 (es) 2005-09-01
JP2002508921A (ja) 2002-03-26
BR9813021A (pt) 2000-08-15
EP1015621A2 (de) 2000-07-05
AU741038B2 (en) 2001-11-22
HUP0004381A1 (en) 2001-03-28
WO1999018228A3 (de) 1999-05-20
CN1275167A (zh) 2000-11-29
SK4812000A3 (en) 2000-09-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK284235B6 (en) Method for microbial production of amino acids of the aspartate and/or glutamate family and agents which can be used in the said method
KR100526316B1 (ko) 아스파테이트 및 글루타메이트계열 아미노산의 미생물적제조방법과 이 방법에 사용되는 작용제
EP0723011B1 (en) Variant phosphoenolpyruvate carboxylase, gene thereof, and process for producing amino acid
JP4881739B2 (ja) Ｌ−アルギニン、ｌ−オルニチンまたはｌ−シトルリンの製造法
JP2926991B2 (ja) 発酵法によるｌ−リジン及びｌ−グルタミン酸の製造方法
US20040142435A1 (en) Method for producing L-amino acid using methylotroph
JP3738449B2 (ja) コリネバクテリウム属細菌由来の新規遺伝子及びその利用
SK15292000A3 (sk) Nukleotidové sekvencie kódujúce gén pck a spôsoby fermentačnej výroby l-aminokyselín
TW200533745A (en) Methods for the preparation of lysine by fermentation of corynebacterium glutamicum
AU2016284767B2 (en) Microorganisms for producing putrescine or ornithine and process for producing putrescine or ornithine using them
FR2847264A1 (fr) Adn codant une proteine lyse mutante, bacterie le contenant et procede de production de l-aminoacides l'utilisant
US20180057798A1 (en) Pyruvate dehydrogenase variants, a microorganism comprising the same and a method for producing l-amino acid using the same
CA2324496A1 (en) New nucleotide sequences coding for the genes succ and sucd
JP2017023147A (ja) 発酵法による目的物質の製造法
WO2022017223A1 (zh) 丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体及其应用
SK18572000A3 (sk) Nukleotidové sekvencie kódujúce gény sdha, sdhb a sdhc
SK3382001A3 (en) Nucleotide sequences coding for the dapc gene and process for the preparation of l-lysine
JP2009507505A (ja) 微生物を使用するアミノ酸産生法
CN114630903B (zh) 内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽及使用其生产l-苏氨酸的方法
KR102593871B1 (ko) 피루브산 카르복실라제 및 피루브산 카르복실라제 암호화 dna, 상기 dna를 함유한 플라스미드 및 그 생산을 위한 미생물, 그리고 자체의 생합성에서 전구체로서 옥살로아세테이트가 포함되는 것인 생성물의 제조 방법, 그리고 염색체
KR20220101509A (ko) GlxR 단백질 변이체 또는 이를 이용한 쓰레오닌 생산방법
EP2397545B1 (en) Method for producing amino acid
MXPA00003224A (en) Method for microbial production of amino acids of the aspartate and/or glutamate family and agents which can be used in said method
CN116004501A (zh) Nadp-铁氧还蛋白还原酶突变体及其在生产谷氨酸中的应用