CN1275167A - 天冬氨酸和/或谷氨酸系氨基酸的生物制备方法和该方法用的添加剂 - Google Patents

天冬氨酸和/或谷氨酸系氨基酸的生物制备方法和该方法用的添加剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及天冬氨酸和/或谷氨酸系氨基酸的微生物制备方法,其中通过基因改变酶和/或产生相应氨基酸的微生物的丙酮酸羧化酶基因表达而提高丙酮酸羧化酶的活性。另外,本发明涉及丙酮酸羧化酶基因和可用于本发明方法的添加剂。

Description

天冬氨酸和/或谷氨酸系氨基酸的生物 制备方法和该方法用的添加剂
本发明涉及权利要求1-17天冬氨酸和/或谷氨酸系氨基酸的生物制备方法、权利要求18-23的丙酮酸羧化酶基因、权利要求24的基因构建体、权利要求25的载体、权利要求26-31的转化细胞以及权利要求32-37的用途。
氨基酸具有很大的经济价值，因为，氨基酸有各种各样的用途。例如：L-赖氨酸以及L-苏氨酸、L-蛋氨酸和L-色氨酸可用作饲料添加剂，L-谷氨酸用作香料添加剂，L-异亮氨酸和L-酪氨酸用于制药工业，L-精氨酸和L-异亮氨酸用作药物或L-谷氨酸、L-天冬氨酸和L-苯丙氨酸用作合成精细化工品的原料。
制备各种氨基酸的一个优选方法是借助于微生物的生物制备技术；因为用这些方法能直接获得生物有效和光学活性形式的各种氨基酸，同时可使用廉价、易得的原料。微生物例如可使用谷氨酸棒杆菌和其同源物ssp.flavum和ssp.乳酵母(lactofermentum)(Liebl等人，Int J SystemBacteriol 1991，41：255-260)，也可使用大肠杆菌和其有关细菌。
这些细菌以正常方式或只以生长需求量产生氨基酸，因此形成不过量的氨基酸，并且被回收。这是基于按各种方法控制细胞内氨基酸的生物合成的缘故。因此，去除控制机制以提高产率的各种方法已经是众所周知的。在这些方法中，为了除去有效调节生物合成，例如引入氨基酸类似物。为此，现有技术公开了一种方法，该方法使用了抗L-酪氨酸和L-苯丙氨酸类似物的棒状杆菌菌株(JP19037/1976和39517/1978)。同样也公开了一种方法，该方法为了抑制控制机制而使用了抗L-赖氨酸或L-苏氨酸类似物的细菌(EP0205849、GB2152509)。
此外，通过重组体DNA技术构建的微生物也是已知的，其中同样是调节生物合成，在该生物合成中克隆并表达基因，该基因是编码不再反馈抑制的关键酶。例如，众所周知：一种重组体它产生L-赖氨酸的细菌具有质粒编码、抗反馈的天冬氨酸激酶(EP0381527)。同样还公开了一种重组体它产生L-苯丙氨酸的细菌，该细菌具有抗反馈的预苯酚酸脱氢酶(JP123475/1986，EP0488424)。
除此以外，通过基因的过表达来提高氨基酸的产率，所述的基因不对氨基酸合成的反馈敏感性酶进行编码。这里例如通过提高双氢吡啶二羧酸合成酶的合成改进赖氨酸的形成(EP0197335)。同样通过提高苏氨酸脱水酶的合成改进异亮氨酸的形成(EP0436886)。
为提高氨基酸产率进行了其他的尝试，目的在于更好地制备中央物质交替(Zentralstoffwechsel)的细胞初级代谢物。众所周知，通过重组体技术获得的转酮酶的过表达可改进L-色氨酸、L-酪氨酸或L-苯丙氨酸产物的形成(EP0600463)。而降低棒状杆菌中烯醇丙酮酸磷酸羧化酶的活性改进了芳香族氨基酸的形成(EP03331145)，相反，提高棒状杆菌中烯醇丙酮酸磷酸羧化酶的活性则增加了天冬氨酸系氨基酸的析出(EP0358940)。
在氨基酸的生长，特别是氨基酸生产条件下，三羧酸循环(Cyclus)必须连续、有效地用诸如草乙酸酯类的C4化合物补充，以代替氨基酸合成中提取的中间产物。直到不久之前，人们还认为：棒状杆菌中的烯醇丙酮酸磷酸羧化酶起所谓的添补作用(Kinoshita，《工业微生物生物学》，1985：115-142，Benjamin/Cummings Publishing公司，伦敦；Liebl，《原核生物II》，1991：1157-1171，Springer Verlag N.Y.；Vallino和Stephanopoulos，《生物技术、生物工程》1993，41：633-646)。但是，已经发现：烯醇丙酮酸磷酸羧化酶负突变体与所有试验介质的各种起始菌株同样生长(Peters-Wendisch等人，FEMS Microbiology Letters1993，112：269-274；Gubler等人，Appl Microbiol Biotechnol1994，40：857-863)。结果表明：烯醇丙酮酸磷酸羧化酶基本上不生长，对于添补反应无作用或仅起次要作用。上述结果进一步说明：在棒状杆菌中必须至少有另一种酶，这种酶对合成生长所需的草乙酸酯起作用。实际上，最近还在棒状杆菌的透化细胞中发现了丙酮酸羧化酶活性(Peters-Wendisch等人，《微生物学》，1997，143：1095-1103)。这些酶受到了AMP、ADP和乙酰基辅酶A的有效抑制，并且在乳酸的存在下形成大量的碳源。从生长过程中这种酶主要补充三羧酸循环(Cycluses)这一点出发，可以预料：提高基因表达或酶活性不会或者说充其量不会太提高属于天冬氨酸系的氨基酸。还可以预料：提高丙酮酸羧化酶的基因表达或酶活性同样对生产其他系列的氨基酸没有影响。
现在令人惊奇地发现：在通过基因改变酶而提高丙酮酸羧化酶活性后和/或在提高丙酮酸羧化酶基因表达后，能提高天冬氨酸和/或谷氨酸系氨基酸的生物制备。结果表明：特别是有丙酮酸羧化酶基因的提高拷贝数的菌株在培养基中析出约50％以上的赖氨酸、40％以上的苏氨酸和150％以上的高丝氨酸菌株。结果进一步表明：谷氨酸的产量也是令人惊奇地大幅度增加(特别参照实施例第6点和表4)。
为了提高酶活性而进行的丙酮酸羧化酶的基因改变最好通过内源基因的突变进行。这种突变既可按常规方法(例如通过UV辐射或突变诱发的化学品)进行，也可借助于基因技术方法例如缺失、插入和/或核苷酸交换进行。
通过提高基因拷贝数和/或通过增强对基因表达有正影响的调节元件可提高丙酮酸羧化酶的基因表达。因此，调节元件的增强优选在转录平面上进行，其中尤其是提高转录信号。例如可按下列方式进行：通过改变在结构基因上在先启动子序列来提高启动子的效果，或用有效启动子完全交换启动子。也可通过相应地影响有关丙酮酸羧化酶基因的调节基因来增强转录。必要时可通过调节基因序列的突变来影响在需调节丙酮酸羧化酶基因的DNA上结合调节蛋白的效果，使得转录增强并以此提高基因表达。但是，作为调节序列的丙酮酸羧化酶基因也可以是所谓的“增强子”，该增强子通过改善RNA聚合酶和DNA之间的交替作用同样能提高丙酮酸羧化酶的基因表达。此外，也可增强翻译，例如提高m-RNA的稳定性。
为了提高基因拷贝数，在一个基因构建体或载体中构建进丙酮酸羧化酶基因。基因构建体特别含有有关丙酮酸羧化酶基因的调节序列，优选是增强基因表达的调节序列。对于基因构建体中的丙酮酸羧化酶基因的构建来说，优选从棒状杆菌属的微生物菌株中分离的基因并转化成产生氨基酸的微生物菌株，尤其是棒状杆菌或转化成大肠杆菌或粘质沙雷氏菌属。对于本发明的方法，特别合适的是从谷氨酸棒状杆菌或谷氨酸棒状杆菌ssp.flavum或棒状杆菌ssp.乳酵母中分离的基因。在分离基因后并用已知的载体在体外重组(例如参照Simon等人，《生物技术》，1983，1：784-791；Eikmanns等人，《基因》，1991，102：93-98)，通过电穿孔(Liebl等人，FEMS Microbiology Letters 1991，65：299-304)或接合(Schafer等人《细菌学杂志》，1990，172：1663-1666)转化成产生氨基酸的菌株。优选使用这样的氨基酸产品作为宿主菌株，即它们在合成相应的氨基酸时失调(dereguliert)和/或使相应的氨基酸具有提高的输出载体活性。此外，优选的是在中心代谢代谢物中含量高并且参预相应氨基酸合成的菌株和/或在不参预相应氨基酸合成的中心代谢代谢物中含量低，尤其是在负责竞争反应的代谢物中的菌株；即优选这样的菌株，对相应的氨基酸生物合成法竞争的生物合成法具有降低的活性。尤其是抗L-天冬氨酸-β-甲酯(AME)的有柠檬酸-合成酶-活性降低的形成棒状的(coyneformer)微生物菌株(EP0551614)。
在进行分离后获得具有核苷酸序列的丙酮酸羧化酶基因，该基因编码SEQ ID No.2列出的氨基酸序列或其等位基因变异体或具有SEQ ID No.1核苷酸165-3587的核苷酸序列或基本上相同作用的DNA序列。还可获得这样的基因，该基因具有SEQ ID No.1核苷酸20-109的核苷酸序列或基本上作用相同的DNA序列的预连结的启动子。等位基因变异体或相同作用的DNA序列尤其包括官能团衍生物，它们是通过缺失、插入和/或取代核苷酸而由相应的序列中获得的，其中酶活性或酶功能得到保持或甚至得到提高。最好在本发明的方法中使用这种丙酮酸羧化酶基因。
有或没有在先启动子或者有或没有、有关的调节基因的丙酮酸羧酸酶基因，可在先或在后结合一个或多个DNA序列，以便在基因构建体中包含该基因。
优选将tac启动子(lacIQ基因)在先连接到丙酮酸羧化酶基因，由此归入调节序列。
通过克隆丙酮酸羧化酶基因获得质粒，该质粒含有基因并且适于转化氨基酸生产者。通过转化获得的细胞优选是含有可复制的基因，即染色体上的附加拷贝形式的基因的棒状杆菌的转化细胞，其中所述的基因拷贝是通过在基因组的任一位置上重组成为一体。实施例1.由谷氨酸棒状杆菌克隆丙酮酸羧化酶基因
由酿酒酵母(《生物化学杂志》，1988，263：11493-11497；Mol GenGenet 1991，229：307-315)，人(Biochim Biophys Acta 1994，1227：46-52)、小鼠(Proc Natl Acad Sci，USA 1993，90：1766-1770)、埃及伊蚊属(aegypti)(EMBL-基因库：登记号L36530)的所有至今已知的丙酮酸羧化酶(pyc-)基因的保藏部分或以及由结核分枝杆菌(EMBL-基因库：登记号U00024)开始合成PCR引物(MWG生物技术)。该引物相当于结核分枝杆菌pyc基因的碱基810-831和1015-1037。用这些引物借助于PCR按Innis等人的标准方法(PCR方案，《方法和应用导论》，1990，Academic出版)对于未产生的、均匀的引物从谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的染色体DNA(例如Eikmann等人公开，《微生物学》，1994，140：1817-1828)中分离约200bp的片段，并进行扩增。200bp的大小符合pyc基因的要求。正如Sanger等人(Proc Natl Acad Sci USA 1977，74：5463-5467)所描述的，测序PCR产物。测序是用荧光标记的ddNTPs和DNA自动测序仪(生物系统使用)进行。
基于谷氨酸棒状杆菌的DNA片段制备下列同源寡核苷酸：
      pyc1    5′-CGTCTTCATCGAAATGAAC-3′
      pyc2    5′-ACGGTGGTGATCCGGCACT-3′
将寡核苷酸用作PCR引物以分离由谷氨酸棒状杆菌的丙酮酸羧化酶(pyc)基因用的探针。向谷氨酸棒状杆菌染色体DNA和标记洋地黄毒苷的核苷酸的PCR反应中加入引物。按Boehringer Mannheim公司的‘PCR DIG标记试剂盒’步骤进行反应。可用这种添加物扩增洋地黄毒苷标记的DNA片段，该片段的大小相当于约200bp的预定大小。然后使用由此制备的pyc探针，以便通过Southern印迹杂交以在谷氨酸棒状杆菌的染色体DNA中以识别DNA片段，在该DNA片段上定位有pyc基因。对此，用限制酶HindIII、SphI、SaII、DraI、EcoRI和BamHI切割各2-5微克谷氨酸棒状杆菌WT的染色体DNA，在20V 0.8％的琼脂糖凝胶中凝胶电泳16小时分离获得的相应大小的DNA片段。在将琼脂糖凝胶中的DNA片段按Southern法变性和真空促进后(J Mol Biol 1975，98：503-517)，用Pharmacia LKB的Vacu基因印迹装置(Uppsala，瑞典)真空支持分离从凝胶基质转移和固定到尼龙膜上(Schleicher和Schull，Dassel，瑞士的Nytran N13)，借助于用碱性磷酸酶转变NBT/X-磷酸盐，证明洋地黄毒苷标记。接着，可用pyc-DNA-探针杂交的染色体片段检测下列物质：17kb HindIII片段、6.5kb SaII片段和1.35kb EcoRI片段。
分离和亚克隆17kb HindIII片段。对此，在粘粒pHC79中使用由谷氨酸棒状杆菌的染色体DNA得的粘粒基因库，这代表了99％谷氨酸棒状杆菌的基因组(Mol Microbiol 1992，6：317-326)。按Sambrook等人的CaCl2法(《分子克隆》，实验室手册，1989，Cold Spring Habour实验室印刷)用这种基因库转化大肠杆菌菌株DH5α并用50微克/升卡那酶素使每个LB-琼脂板上平铺(ausplattiert)了约300株菌落(总共5000株菌落)。接着将获得的转化体转移到Nytran N13-滤膜中，为碱性裂解细胞和变性DNA，在用0.5M NaOH和1.5M NaCl浸泡的Whatmann纸上将其温育5分钟。接着用1MTris/HCl pH7.5和1.5M NaCl进行中和。在温育滤纸2×SSC后，通过366纳米的UV辐射将释放的DNA固定在滤膜上。接着在50℃下0.1％ SDS中振动3×SSC除去剩余的细胞碎片。使用这种形式的滤膜用特异性pyc探针进行杂交，如Southern所公开的(J Mol Biol 1975，98，503-517)。由pyc探针杂交鉴别3个转化体。按Birnboim的碱性裂解法(Meth Enzymol1983，100：243-255)用质粒-制剂从该转化体中分离出粘粒DNA，接着通过限制和Southern印迹分析对存在的HindIII片段进行试验。含40kb插入片段的粘粒pHC79-10总共携带了17kb HindIII片段并进一步进行分析。结果表明：在用内切核酸酶SaII和EcoRI限制后，获得了与染色体DNA相同的杂交片段，即6.5kb SaII片段和1.35kb EcRI片段。通过用HindIII限制从粘粒中分离出17kb HindIII片段并连接在同样用HindIII切割的大肠杆菌载体pUC18上。在产生的载体pUCpyc中进行片段的限制分析。图1示出了片段的物理图谱。2.丙酮酸羧化酶基因的测序
在其他的亚克隆步骤中，通过用相应的限制酶如1.35kb EcoRI片段、1.6kb EcoRI-EcoRI-StuI片段以及一部分和0.85kb SaII-EcoRI片段搭接的1.6kb ClaI片段限制而从质粒pUCpyc中分离0.85kb SaII-EcoRI片段。通过连接，将该片段克隆在相应的限制载体pUC18中，接着按照如上所述的Sanger等人的方法进行测序(Proc Natl Acad Sci USA 1977，74：5463-5467)。用德国肿瘤研究中心(Heidelberg)的程序包HUSAR(释放3.0)分析获得的核苷酸序列。片段的序列分析获得了3576bp完全敞开的读框(Leseraster)，对1140氨基酸的蛋白质序列进行编码。将得到的蛋白质序列与EMBL基因数据库(Heidelberg)进行对比，表明与所有已知的丙酮酸羧化酶类似。人们发现：高度的一致性(62％)是将结核分枝杆菌(EMBL基因库：登记号U00024)假定为丙酮酸羧化酶。在考虑到保存氨基酸交换的情况下，相似性为76％。与其他有机物的丙酮酸羧化酶对比，相似性为46-47％，类似的氨基酸为64-65％(《基因》，1997，191：47-50；《细菌学杂志》，1996，178：5960-5970；Proc Natl Acad Sci USA1993，90：1766-1770；《生物化学杂志》，1996，316：631-637；EMBL基因库：登记号L36530；《生物化学杂志》，1988，263：11493-11497；Mol Gen Genet 1991，229：307-315)。由这些结果得出：克隆片段是来自谷氨酸棒状杆菌的丙酮酸羧化酶基因。该基因的核苷酸序列是SEQ IDNo1，相应的氨基酸序列为SEQ ID No2。3.丙酮酸羧化酶基因的过表达
为了过表达来自谷氨酸棒状杆菌的丙酮酸羧化酶基因，将来自质粒pUCpyc的基因作为6.2kb SspI-Scal片段克隆在大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌振动载体pEK0中(《基因》1991，102：93-98)，用限制内切核酸酶EcoRI和PstI切割该载体。借助于科列诺聚合酶处理，将突出端添满(EcoRI)或连接(abgedaut)(PstI)成平端并且将线性载体与6.2kb SspI-ScaI片段连接。首先将获得的构建体pEK0pyc转化在大肠杆菌菌株DH5α，接着从获得的转化体中分离质粒DNA，通过限制控制插入片段的正确性。接着通过电穿孔将DNA加入到菌株SP733中(FEMS Microbiol Lett 1989，65：299-304)。该菌株是限制性负谷氨酸棒状杆菌菌株R127的突变体(Dechema生物技术会议1990，4：323-327，化学出版社)，它们通过化学突变制得，其特征在于：它不可能在有作为单个碳源的丙酮酸和乳酸的基本培养基上生长(《微生物学》1997，143：1095-1103)。这种表型是以丙酮酸羧化酶基因缺损而识别的，可通过引入来自谷氨酸棒状杆菌的丙酮酸羧化酶基因进行补偿，即质粒pEK0pyc携带的菌株，在有作为单个碳源的乳酸基本培养基上具有生长的能力的与起始菌株反。因此，结果证明：基因编码了官能性的丙酮酸羧化酶。
此外，质粒pEK0pyc通过电穿孔被转化成谷氨酸棒状杆菌野生型ATCC13032。与有关的野生型ATCC 13032相比，研究所制成的菌株WT(pEK0pyc)的丙酮酸羧化酶活性。在有0.5％乳酸的络合介质(Luria-Bertani，《分子克隆》，实验手册，1989，Cold Spring Harbour实验室出版)中，并在有2％乳酸或4％葡萄糖的基本培养基上培育菌株，并且按Peters-Wendisch等人描述的相应方法进行丙酮酸羧化酶试验(《微生物学》1997，143：1095-1103)。分析结果(表1)表明：pEK0-pyc-携带的菌株中丙酮酸羧化酶活性比起始菌株高约4倍。4.通过谷氨酸棒状杆菌菌株DG52-5中的丙酮酸羧化酶基因的过表达增强赖氨酸的积累
为了检测基因对赖氨酸生产菌株DG52-5中的丙酮酸羧化酶基因的过表达效果(《基因微生物杂志》1988，134：3221-3229)，使用表达载体pVWEX1以促进IPTG可诱导表达。在该载体中无启动子克隆pyc基因。为此，先合成PCR引物(根据SEQ ID No.1，在核苷酸序列中，引物1＝位置112-133；引物2＝位置373-355)并借助于PCR扩增丙酮酸羧化酶基因的261bp的无启动子的开始范围。如此地选择引物，以使得引物1用PstI切割位点，引物2用BamHI切割位点。PCR后分离制得的274bp PCR产物，以连接多联体和接着用限制酶PstI和BamHI切割，通过乙醇沉淀浓缩限制产物，接着与切割的PstI-BamIII的载体pVWEXI连接。通过限制试验获得构建体pVWEXI-PCR。通过RcaI-Klenow-SaII处理从载体pEK0pyc中分离pyc基因的末端范围并连接到BamHI-Klenow-SalI处理的载体pVWEX1-PCR上。通过限制酶切作图分析获得的构建体pVWX1pyc。图2示出了质粒的物理图谱。
通过电穿孔将质粒引入到谷氨酸棒状杆菌菌株DG52-5中。作为对照，在无插入片段的情况下用载体pVWEXI转化菌株DG52-5，对比3种不同转化体的L赖氨酸析出。对此，在络合介质中(2×TY；《分子克隆》，实验室手册，1989，Cold Spring Harbour实验室出版，含有50微克/升卡那霉素)培育DG52-5(pVWEXI)1、2和3以及DG52-5(pVWEXIpyc)3、4和6，并由各预培养基中分别接种各发酵介质CGXII(《细菌学杂志》1993，175：5595-5603)。为使质粒保持稳定，该介质还含有卡那霉素。每次进行2种平行添加，其中向一个烧瓶中添加200微克IPTG/毫升，而第二个烧瓶不含IPTG。在30℃、在120Upm的旋转摇动器上培养48小时后，测定在该介质中积累的赖氨酸量。用高压液相色谱法进行氨基酸浓度的测量(《色谱杂志》，1983，266：471-482)。表2示出了发酵结果，其中所给出的值是进行各种克隆由每3次试验得出的平均值。结果表明：丙酮酸羧化酶基因的过表达导致介质中赖氨酸的积累增加约50％。因此，为了大大提高L-赖氨酸的形成，一种方法是使用隐蔽的和公开的基因作为丙酮酸羧化酶的补充酶。5.通过谷氨酸棒状杆菌菌株DM368-3中的丙酮酸羧化酶基因的过表达增强苏氨酸和高丝氨酸的积累
与试验L-赖氨酸的形成类似，也通过对丙酮酸羧化酶基因的过表达检测在培养上清液中苏氨酸的积累。对此，按第4点描述，用质粒pVWEX1pyc以及作为对照用质粒pVWEX1转化苏氨酸产物菌株谷氨酸棒状杆菌DM368-3(DegussaAG)，检测每3种不同转化体的苏氨酸的析出。对此，在络合介质中(2×TY，含有50微克/升卡那霉素)培育DM368-3(pVWEXI)1、2和3以及DM368-3(pVWEXIpyc)1、2和3，由各预培养基中的发酵介质CGXII(《细菌学杂志》1993，175：5595-5603)进行分别接种。为使质粒保持稳定，该介质还含有卡那霉素。每次进行2个平行添加，其中向一个烧瓶中添加200微克IPTG/毫升，而第二个烧瓶不含IPTG。在30℃、在120Upm的旋转摇动器上培养48小时后，测定在该介质中积累的苏氨酸量。使用高压液相色谱法进行氨基酸浓度的测量(《色谱杂志》，1983，266：471-482)。表3示出了发酵结果，其中所给出的值是进行各种克隆由每3次试验得出的平均值。结果表明：丙酮酸羧化酶基因的过表达导致介质中苏氨酸的浓度增加约40％。因此，为了大大提高L-苏氨酸的形成，一种方法是使用隐蔽的和公开的基因作为丙酮酸羧化酶的补充酶。
氨基酸浓度的测定进一步表明：令人惊奇地是有过表达的丙酮酸羧化酶基因的菌株使在介质中析出的高丝氨酸比没有过表达的菌株高出约150％。相应的结果，同样示于表3，这很明显，通过本发明方法不仅苏氨酸而且高丝氨酸都有重大的改良。6.通过野生型谷氨酸棒状杆菌菌株中的丙酮酸羧化酶基因的过表达增强谷氨酸的积累
与试验L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-高丝氨酸的形成类似(参见上文第4和5点)，也通过对丙酮酸羧化酶基因的过表达检测在培养基上清液中谷氨酸的积累。对此，如第4点的描述，用质粒pVWEX1pyc以及作为对照用质粒pVWEX1转化野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032，检测每2种不同转化体的谷氨酸的析出。对此，在络合介质中(2×TY，含有50微克/升卡那霉素)培育谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032(pVWEXIpyc)D1和D2以及谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032(pVWEXIpyc)1和2，由各预培养基中分别接种发酵介质CGXII(《细菌学杂志》1993，175：5595-5603)。为使质粒保持稳定，该介质还含有卡那霉素。为了诱导谷氨酸析出，在接种后6小时在介质中加入25毫克Tween60/毫升。进行2套平行添加，其中向一个烧瓶中添加200微克IPTG/毫升，而第二个烧瓶不含IPTG。在30℃、在120Upm的旋转摇动器上培养48小时后，测定在该介质中积累的谷氨酸量。同样用高压液相色谱法进行氨基酸浓度的测量(《色谱杂志》，1983，266：471-482)。表4示出了发酵结果，其中所给出的值是由有不同克隆的每2次试验得出的平均值。结果表明：丙酮酸羧化酶基因的过表达导致介质中谷氨酸的浓度增加约500％。因此，为了大大提高L-谷氨酸的形成，一种方法是用隐蔽的和公开的基因作为丙酮酸羧酸酶的添补酶。
                                表1
    菌株  IPTG[微克/毫升]        丙酮酸羧化酶[毫微摩尔 分钟-1毫克 干重-1]
    13032(pEK0pyc)ATCC 13032     00     75±1319±4
    DG52-5(pVWEX1pyc)DG52-5(pVWEX1)     20002000     88±1311±25±26±1
    DM368-3(pVWEX1pyc)DM368-3(pVWEX1)     20002000     76±1012±310±111±2
                               表2
    菌株   IPTG[微克/毫升]     赖氨酸[mM]
  DG52-5(pVWEX1pyc)DG52-5(pVWEX1)     20002000     35.4±2.623.6±2.923.3±2.922.1±4.0
                                     表3
        菌株   IPTG[微克/毫升]   苏氨酸[mM]     高丝案酸[mM]
  DM368-3(pVWEX1pyc)DM368-3(pVWEX1)     20002000   10.2±0.57.9±1.08.0±0.57.5±0.8     14.4±1.25.6±0.25.8±0.76.1±1.0
                                 表4
           菌株   IPTG[微克/毫升]     谷氨酸[mM]
  ATCC 13032ATCC 13032ATCC 13032(pVWEX1-pyc)ATCC 13032(pVWEX1-pyc)     20002000     11±213±267±432±4
                              序列记录(1)一般数据：
(i)申请人：
  (A)名称：Juelich GmbH研究中心
  (B)街道：Postfach 1913
  (C)地点：Juelich
  (E)国家：德国
  (F)邮编：52425
(ii)本发明的特征：丙酮酸羧酸酶
(iii)序列的总数：2
(iv)计算机易读文本：
  (A)数据载体：Floppy盘
  (B)计算机：IBM PC compatible
  (C)驱动系统：PC-DOS/MS-DOS
  (D)软件：Patenln Release#1.0，Version#1.30(EPA)(2)SEQ ID No：1数据：
(i)序列标记：
  (A)长度：3728碱基对
  (B)种类：核苷酸
  (C)束状形式：单束
  (D)拓扑学：线性
(ii)分子种类：基因组-DNA
(xi)序列描述：SEQ ID No：1CGCAACCGTG CTTGAAGTCG TGCAGGTCAG GGGAGTGTTG CCCGAAAACA TTGAGAGGAA       60AACAAAAACC GATGTTTGAT TGGGGGAATC GGGGGTTACG ATACTAGGAC GCAGTGACTG       120CTATCACCCT TGGCGGTCTC TTGTTGAAAG GAATAATTAC TCTAGTGTCG ACTCACACAT       180CTTCAACGCT TCCAGCATTC AAAAAGATCT TGGTAGCAAA CCGCGGCGAA ATCGCGGTCC       240GTGCTTTCCG TGCAGCACTC GAAACCGGTG CAGCCACGGT AGCTATTTAC CCCCGTGAAG       300ATCGGGGATC ATTCCACCGC TCTTTTGCTT CTGAAGCTGT CCGCATTGGT ACCGAAGGCT       360CACCAGTCAA GGCGTACCTG GACATCGATG AAATTATCGG TGCAGCTAAA AAAGTTAAAG       420CAGATGCCAT TTACCCGGGA TACGGCTTCC TGTCTGAAAA TGCCCAGCTT GCCCGCGAGT        480GTGCGGAAAA CGGCATTACT TTTATTGGCC CAACCCCAGA GGTTCTTGAT CTCACCGGTG        540ATAAGTCTCG CGCGGTAACC GCCGCGAAGA AGGCTGGTCT GCCAGTTTTG GCGGAATCCA        600CCCCGAGCAA AAACATCGAT GAGATCGTTA AAAGCGCTGA AGGCCAGACT TACCCCATCT        660TTGTGAAGGC AGTTGCCGGT GGTGGCGGAC GCGGTATGCG TTTTGTTGCT TCACCTGATG        720AGCTTCGCAA ATTAGCAACA GAAGCATCTC GTGAAGCTGA AGCGGCTTTC GGCGATGGCG        780CGGTATATGT CGAACGTGCT GTGATTAACC CTCAGCATAT TGAAGTGCAG ATCCTTGGCG        840ATCACACTGG AGAAGTTGTA CACCTTTATG AACGTGACTG CTCACTGCAG CGTCGTCACC        900AAAAAGTTGT CGAAATTGCG CCAGCACAGC ATTTGGATCC AGAACTGCGT GATCGCATTT        960GTGCGGATGC AGTAAAGTTC TGCCGCTCCA TTGGTTACCA GGGCGCGGGA ACCGTGGAAT       1020TCTTGGTCGA TGAAAAGGGC AACCACGTCT TCATCGAAAT GAACCCACGT ATCCAGGTTG       1080AGCACACCGT GACTGAAGAA GTCACCGAGG TGGACCTGGT GAAGGCGCAG ATGCGCTTGG       1140CTGCTGGTGC AACCTTGAAG GAATTGGGTC TGACCCAAGA TAAGATCAAG ACCCACGGTG       1200CAGCACTGCA GTGCCGCATC ACCACGGAAG ATCCAAACAA CGGCTTCCGC CCAGATACCG       1260GAACTATCAC CGCGTACCGC TCACCAGGCG GAGCTGGCGT TCGTCTTGAC GGTGCAGCTC       1320AGCTCGGTGG CGAAATCACC GCACACTTTG ACTCCATGCT GGTGAAAATG ACCTGCCGTG       1380GTTCCGACTT TGAAACTGCT GTTGCTCGTG CACAGCGCGC GTTGGCTGAG TTCACCGTGT       1440CTGGTGTTGC AACCAACATT GGTTTCTTGC GTGCGTTGCT GCGGGAAGAG GACTTCACTT       1500CCAAGCGCAT CGCCACCGGA TTCATTGCCG ATCACCCGCA CCTCCTTCAG GCTCCACCTG       1560CTGATGATGA GCAGGGACGC ATCCTGGATT ACTTGGCAGA TGTCACCGTG AACAAGCCTC       1620ATGGTGTGCG TCCAAAGGAT GTTGCAGCTC CTATCGATAA GCTGCCTAAC ATCAAGGATC       1680TGCCACTGCC ACGCGGTTCC CGTGACCGCC TGAAGCAGCT TGGCCCAGCC GCGTTTGCTC       1740GTGATCTCCG TGAGCAGGAC GCACTGGCAG TTACTGATAC CACCTTCCGC GATGCACACC       1800AGTCTTTGCT TGCGACCCGA GTCCGCTCAT TCGCACTGAA GCCTGCGGCA GAGGCCGTCG       1860CAAAGCTGAC TCCTGAGCTT TTGTCCGTGG AGGCCTGGGG CGGCGCGACC TACGATGTGG       1920CGATGCGTTT CCTCTTTGAG GATCCGTGGG ACAGGCTCGA CGAGCTGCGC GAGGCGATGC       1980CGAATGTAAA CATTCAGATG CTGCTTCGCG GCCGCAACAC CGTGGGATAC ACCCCGTACC       2040CAGACTCCGT CTGCCGCGCG TTTGTTAAGG AAGCTGCCAG CTCCGGCGTG GACATCTTCC       2100GCATCTTCGA CGCGCTTAAC GACGTCTCCC AGATGCGTCC AGCAATCGAC GCAGTCCTGG        2160AGACCAACAC CGCGGTAGCC GAGGTGGCTA TGGCTTATTC TGGTGATCTC TCTGATCCAA        2220ATGAAAAGCT CTACACCCTG GATTACTACC TAAAGATGGC AGAGGAGATC GTCAAGTCTG        2280GCGCTCACAT CTTGGCCATT AAGGATATGG CTGGTCTGCT TCGCCCAGCT GCGGTAACCA        2340AGCTGGTCAC CGCACTGCGC CGTGAATTCG ATCTGCCAGT GCACGTGCAC ACCCACGACA        2400CTGCGGGTGG CCAGCTGGCA ACCTACTTTG CTGCAGCTCA AGCTGGTGCA GATGCTGTTG        2460ACGGTGCTTC CGCACCACTG TCTGGCACCA CCTCCCAGCC ATCCCTGTCT GCCATTGTTG        2520CTGCATTCGC GCACACCCGT CGCGATACCG GTTTGAGCCT CGAGGCTGTT TCTGACCTCG        2580AGCCGTACTG GGAAGCAGTG CGCGGACTGT ACCTGCCATT TGAGTCTGGA ACCCCAGGCC        2640CAACCGGTCG CGTCTACCGC CACGAAATCC CAGGCGGACA GTTGTCCAAC CTGCGTGCAC        2700AGGCCACCGC ACTGGGCCTT GCGGATCGTT TCGAACTCAT CGAAGACAAC TACGCAGCCG        2760TTAATGAGAT GCTGGGACGC CCAACCAAGG TCACCCCATC CTCCAAGGTT GTTGGCGACC        2820TCGCACTCCA CCTCGTTGGT GCGGGTGTGG ATCCAGCAGA CTTTGCTGCC GATCCACAAA        2880AGTACGACAT CCCAGACTCT GTCATCGCGT TCCTGCGCGG CGAGCTTGGT AACCCTCCAG        2940GTGGCTGGCC AGAGCCACTG CGCACCCGCG CACTGGAAGG CCGCTCCGAA GGCAAGGCAC        3000CTCTGACGGA AGTTCCTGAG GAAGAGCAGG CGCACCTCGA CGCTGATGAT TCCAAGGAAC        3060GTCGCAATAG CCTCAACCGC CTGCTGTTCC CGAAGCCAAC CGAAGAGTTC CTCGAGCACC        3120GTCGCCGCTT CGGCAACACC TCTGCGCTGG ATGATCGTGA ATTCTTCTAC GGCCTGGTCG        3180AAGGCCGCGA GACTTTGATC CGCCTGCCAG ATGTGCGCAC CCCACTGCTT GTTCGCCTGG        3240ATGCGATCTC TGAGCCAGAC GATAAGGGTA TGCGCAATGT TGTGGCCAAC GTCAACGGCC        3300AGATCCGCCC AATGCGTGTG CGTGACCGCT CCGTTGAGTC TGTCACCGCA ACCGCAGAAA        3360AGGCAGATTC CTCCAACAAG GGCCATGTTG CTGCACCATT CGCTGGTGTT GTCACCGTGA        3420CTGTTGCTGA AGGTGATGAG GTCAAGGCTG GAGATGCAGT CGCAATCATC GAGGCTATGA        3480AGATGGAAGC AACAATCACT GCTTCTGTTG ACGGCAAAAT CGATCGCGTT GTGGTTCCTG        3540CTGCAACGAA GGTGGAAGGT GGCGACTTGA TCGTCGTCGT TTCCTAAACC TTTCTGTAAA        3600AAGCCCCGCG TCTTCCTCAT GGAGGAGGCG GGGCTTTTTG GGCCAAGATG GGAGATGGGT        3660GAGTTGGATT TGGTCTGATT CGACACTTTT AAGGGCAGAG ATTTGAAGAT GGAGACCAAG        3720GCTCAAAG(2)SEQ ID No数据：2：
(i)序列标记
  (A)长度：1140氨基酸
  (B)种类：氨基酸
  (C)束状形式：单束
  (D)拓扑学：线性
(ii)分子种类：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID No：2：Met Ser Thr His Thr Ser Ser Thr Leu Pro Ala Phe Lys Lys Ile Leu1               5                   10                  15Val Ala Asn Arg Gly Glu Ile Ala Val Arg Ala Phe Arg Ala Ala Leu
        20                  25                  30Glu Thr Gly Ala Ala Thr Val Ala Ile Tyr Pro Arg Glu Asp Arg Gly
    35                  40                  45Ser Phe His Arg Ser Phe Ala Ser Glu Ala Val Arg Ile Gly Thr Glu
50                  55                  60Gly Ser Pro Val Lys Ala Tyr Leu Asp Ile Asp Glu Ile Ile Gly Ala65                  70                  75                  80Ala Lys Lys Val Lys Ala Asp Ala Ile Tyr Pro Gly Tyr Gly Phe Leu
            85                  90                  95Ser Glu Asn Ala Gln Leu Ala Arg Glu Cys Ala Glu Asn Gly Ile Thr
        100                 105                 110Phe Ile Gly Pro Thr Pro Glu Val Leu Asp Leu Thr Gly Asp Lys Ser
    115                 120                 125Arg Ala Val Thr Ala Ala Lys Lys Ala Gly Leu Pro Val Leu Ala Glu
130                135                  140Ser Thr Pro Ser Lys Asn Ile Asp Glu Ile Val Lys Ser Ala Glu Gly145                 150                 155                 160Gln Thr Tyr Pro Ile Phe Val Lys Ala Val Ala Gly Gly Gly Gly Arg
            165                 170                 175Gly Met Arg Phe Val Ala Ser Pro Asp Glu Leu Arg Lys Leu Ala Thr
        180                 185                 190Glu Ala Ser Arg Glu Ala Glu Ala Ala Phe Gly Asp Gly Ala Val Tyr
    195                 200                 205Val Glu Arg Ala Val Ile Asn Pro Gln His Ile Glu Val Gln Ile Leu
210                 215                 220Gly Asp His Thr Gly Glu Val Val His Leu Tyr Glu Arg Asp Cys Ser225                 230                 235                 240Leu Gln Arg Arg His Gln Lys Val Val Glu Ile Ala Pro Ala Gln His
            245                 250                 255Leu Asp Pro Glu Leu Arg Asp Arg Ile Cys Ala Asp Ala Val Lys Phe
        260                 265                 270Cys Arg Ser Ile Gly Tyr Gln Gly Ala Gly Thr Val Glu Phe Leu Val
    275                 280                 285Asp Glu Lys Gly Asn His Val Phe Ile Glu Met Asn Pro Arg Ile Gln
290                 295                 300Val Glu His Thr Val Thr Glu Glu Val Thr Glu Val Asp Leu Val Lys305                 310                 315                 320Ala Gln Met Arg Leu Ala Ala Gly Ala Thr Leu Lys Glu Leu Gly Leu
            325                 330                 335Thr Gln Asp Lys Ile Lys Thr His Gly Ala Ala Leu Gln Cys Arg Ile
        340                 345                 350Thr Thr Glu Asp Pro Asn Asn Gly Phe Arg Pro Asp Thr Gly Thr Ile
    355                 360                 365Thr Ala Tyr Arg Ser Pro Gly Gly Ala Gly Val Arg Leu Asp Gly Ala
370                 375                 380Ala Gln Leu Gly Gly Glu Ile Thr Ala His Phe Asp Ser Met Leu Val385                 390                 395                 400Lys Met Thr Cys Arg Gly Ser Asp Phe Glu Thr Ala Val Ala Arg Ala
            405                 410                 415Gln Arg Ala Leu Ala Glu Phe Thr Val Ser Gly Val Ala Thr Asn Ile
        420                 425                 430Gly Phe Leu Arg Ala Leu Leu Arg Glu Glu Asp Phe Thr Ser Lys Arg
    435                 440                 445Ile Ala Thr Gly Phe Ile Ala Asp His Pro His Leu Leu Gln Ala Pro
450                 455                 460Pro Ala Asp Asp Glu Gln Gly Arg Ile Leu Asp Tyr Leu Ala Asp Val465                 470                 475                 480Thr Val Asn Lys Pro His Gly Val Arg Pro Lys Asp Val Ala Ala Pro
            485                 490                 495Ile Asp Lys Leu Pro Asn Ile Lys Asp Leu Pro Leu Pro Arg Gly Ser
        500                 505                 510Arg Asp Arg Leu Lys Gln Leu Gly Pro Ala Ala Phe Ala Arg Asp Leu
    515                 520                 525Arg Glu Gln Asp Ala Leu Ala Val Thr Asp Thr Thr Phe Arg Asp Ala
530                 535                 540His Gln Ser Leu Leu Ala Thr Arg Val Arg Ser Phe Ala Leu Lys Pro545                 550                 555                 560Ala Ala Glu Ala Val Ala Lys Lys Thr Pro Glu Leu Leu Ser Val Glu
            565                 570                 575Ala Trp Gly Gly Ala Thr Tyr Asp Val Ala Met Arg Phe Leu Phe Glu
        580                 585                 590Asp Pro Trp Asp Arg Leu Asp Glu Leu Arg Glu Ala Met Pro Asn Val
    595                 600                 605Asn Ile Gln Met Leu Leu Arg Gly Arg Asn Thr Val Gly Tyr Thr Pro
610                 615                 620Tyr Pro Asp Ser Val Cys Arg Ala Phe Val Lys Glu Ala Ala Ser Ser625                 630                 635                 640Gly Val Asp Ile Phe Arg Ile Phe Asp Ala Leu Asn Asp Val Ser Gln
            645                 650                 655Met Arg Pro Ala Ile Asp Ala Val Leu Glu Thr Asn Thr Ala Val Ala
        660                 665                 670Glu Val Ala Met Ala Tyr Ser Gly Asp Leu Ser Asp Pro Asn Glu Lys
    675                 680                 685Leu Tyr Thr Leu Asp Tyr Tyr Leu Lys Met Ala Glu Glu Ile Val Lys
690                 695                 700Ser Gly Ala His Ile Leu Ala Ile Lys Asp Met Ala Gly Leu Leu Arg705                 710                 715                 720Pro Ala Ala Val Thr Lys Leu Val Thr Ala Leu Arg Arg Glu Phe Asp
            725                 730                 735Leu Pro Val His Val His Thr His Asp Thr Ala Gly Gly Gln Leu Ala
        740                 745                 750Thr Tyr Phe Ala Ala Ala Gln Ala Gly Ala Asp Ala Val Asp Gly Ala
    755                 760                 765Ser Ala Pro Leu Ser Gly Thr Thr Ser Gln Pro Ser Leu Ser Ala Ile
770                 775                 780Val Ala Ala Phe Ala His Thr Arg Arg Asp Thr Gly Leu Ser Leu Glu785                 790                 795                 800Ala Val Ser Asp Leu Glu Pro Tyr Trp Glu Ala Val Arg Gly Leu Tyr
            805                 810                 815Leu Pro Phe Glu Ser Gly Thr Pro Gly Pro Thr Gly Arg Val Tyr Arg
        820                 825                 830His Glu Ile Pro Gly Gly Gln Leu Ser Asn Leu Arg Ala Gln Ala Thr
    835                 840                 845Ala Leu Gly Leu Ala Asp Arg Phe Glu Leu Ile Glu Asp Asn Tyr Ala
850                 855                 860Ala Val Asn Glu Met Leu Gly Arg Pro Thr Lys Val Thr Pro Ser Ser865                 870                 875                 880Lys Val Val Gly Asp Leu Ala Leu His Leu Val Gly Ala Gly Val Asp
            885                 890                 895Pro Ala Asp Phe Ala Ala Asp Pro Gln Lys Tyr Asp Ile Pro Asp Ser
        900                 905                 910Val Ile Ala Phe Leu Arg Gly Glu Leu Gly Asn Pro Pro Gly Gly Trp
    915                 920                 925Pro Glu Pro Leu Arg Thr Arg Ala Leu Glu Gly Arg Ser Glu Gly Lys
930                 935                 940Ala Pro Leu Thr Glu Val Pro Glu Glu Glu Gln Ala His Leu Asp Ala945                 950                 955                 960Asp Asp Ser Lys Glu Arg Arg Asn Ser Leu Asn Arg Leu Leu Phe Pro
            965                 970                 975Lys Pro Thr Glu Glu Phe Leu Glu His Arg Arg Arg Phe Gly Asn Thr
        980                 985                 990Ser Ala Leu Asp Asp Arg Glu Phe Phe Tyr Gly Leu Val Glu Gly Arg
    995                 1000                1005Glu Thr Leu Ile Arg Leu Pro Asp Val Arg Thr Pro Leu Leu Val Arg
1010                1015                1020Leu Asp Ala Ile Ser Glu Pro Asp Asp Lys Gly Met Arg Asn Val Val1025                1030                1035                1040Ala Asn Val Asn Gly Gln Ile Arg Pro Met Arg Val Arg Asp Arg Ser
            1045                1050                1055Val Glu Ser Val Thr Ala Thr Ala Glu Lys Ala Asp Ser Ser Asn Lys
        1060                1065                1070Gly His Val Ala Ala Pro Phe Ala Gly Val Val Thr Val Thr Val Ala
    1075                1080                1085Glu Gly Asp Glu Val Lys Ala Gly Asp Ala Val Ala Ile Ile Glu Ala
1090                1095                1100Met Lys Met Glu Ala Thr Ile Thr Ala Ser Val Asp Gly Lys Ile Asp1105                1110                1115                1120Arg Val Val Val Pro Ala Ala Thr Lys Val Glu Gly Gly Asp Leu Ile
            1125                1130                1135Val Val Val Ser
        1140

Claims (37)

1.天冬氨酸和/或谷氨酸系氨基酸的微生物制备方法，其特征在于：通过酶的基因改变和/或产生相应氨基酸的微生物的丙酮酸羧化酶的基因表达提高丙酮酸羧化酶的活性。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于：通过内源性丙酮酸羧化酶基因的突变产生具有较高丙酮酸羧化酶活性的酶。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于：通过提高基因拷贝数提高丙酮酸羧化酶的基因表达。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于：为提高基因拷贝数，在基因构建体中引入丙酮酸羧化酶基因。
5.根据权利要求4的方法，其特征在于：在基因构建体中引入含有有关丙酮酸羧化酶基因的调节基因序列的基因。
6.根据权利要求4或5的方法，其特征在于：用含基因的基因构建体转化产生相应氨基酸的微生物。
7.根据权利要求6的方法，其特征在于：用含基因的基因构建体转化棒状杆菌类的微生物。
8.根据权利要求6或7的方法，其特征在于：使用微生物进行转化，其中参预相应氨基酸合成的酶失调和/或对相应氨基酸具有高的输出载体活性。
9.根据权利要求6-8任一项的方法，其特征在于：使用微生物进行转化，其中提高参预相应氨基酸合成的中央代谢代谢物的含量。
10.根据权利要求6-9任一项的方法，其特征在于：使用微生物进行转化，其中与相应氨基酸合成法竞争的生物合成法使活性降低。
11.根据上述任一项权利要求的方法，其特征在于：从棒状杆菌属微生物菌株中分离丙酮酸羧化酶基因。
12.根据上述任一项权利要求的方法，其特征在于：通过增强转录信号提高基因表达。
13.根据上述任一项权利要求的方法，其特征在于：对丙酮酸羧化酶基因tac启动子在先。
14.根据权利要求13的方法，其特征在于：tac启动子是有关调节序列。
15.根据上述任一项权利要求的方法，其特征在于：使用具有SEQ IDNo.2给出的氨基酸序列的基因和其等位基因变异编码的核苷酸序列的基因作为丙酮酸羧化酶基因。
16.根据权利要求15的方法，其特征在于：使用具有根据SEQ ID No.1核苷酸165-3587的核苷酸序列的基因或基本起相同作用的DNA序列的基因作为丙酮酸羧化酶基因。
17.根据上述任一项权利要求的方法，制备赖氨酸、苏氨酸、高丝氨酸和/或精氨酸。
18.编码具有SEQ ID No.2给出的氨基酸序列和/或等位基因变异的核苷酸序列的丙酮酸羧化酶基因。
19.根据权利要求18的具有SEQ ID Nr.1核苷酸165-3587的核苷酸序列或基本起相同作用的DNA序列的丙酮酸羧化酶基因。
20.根据权利要求18或19的具有SEQ ID No.1核苷酸20-109的核苷酸序列或基本起相同作用的DNA序列的在先启动子的丙酮酸羧化酶基因。
21.根据权利要求18或19的具有在先tac启动子的丙酮酸羧化酶基因。
22.根据权利要求21的具有有关启动子的调节序列的丙酮酸羧化酶基因。
23.根据权利要求18-20任一项的具有其有关的调节基因序列的丙酮酸羧化酶基因。
24.含权利要求18-23任一项丙酮酸羧化酶基因的基因构建体。
25.含权利要求18-23任一项丙酮酸羧化酶基因或权利要求24基因构建体的载体。
26.含权利要求18-23任一项复制形式的丙酮酸羧化酶基因或权利要求24基因构建体的转化细胞。
27.根据权利要求26的转化细胞，含有权利要求25的载体。
28.根据权利要求26或27的转化细胞，其特征在于：它们属于棒状杆菌属。
29.根据权利要求26-28任一项的转化细胞，其特征在于：参预相应氨基酸合成的酶和/或参预相应氨基酸输出的酶失调。
30.根据权利要求26-29任一项的转化细胞，其特征在于：它们含有参预相应氨基酸合成的中央代谢的代谢物具有高含量。
31.根据权利要求26-30任一项的转化细胞，其特征在于：它们含有未参预相应氨基酸合成的中央代谢的代谢物具有低含量。
32.丙酮酸羧酸酶基因的用途，用于提高来自天冬氨酸和/或谷氨酸系菌株的微生物氨基酸产量。
33.根据权利要求32的用途，其特征在于：使用一种编码有高丙酮酸羧化酶活性的酶的突变丙酮酸羧化酶基因。
34.根据权利要求32或33的用途，其特征在于：用含丙酮酸羧化酶基因的基因构建体转化产生相应氨基酸的微生物。
35.根据权利要求34的用途，其特征在于：基因构建体还含有调节基因序列。
36.根据权利要求32-35任一项的用途：其特征在于：使用来自棒状杆菌的丙酮酸羧化酶基因。
37.根据权利要求32-36的用途，其特征在于：使用棒状杆菌作为产生氨基酸的微生物。
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