ES2238773T3 - Procedimiento para la produccion microbiana de aminoacidos de las familias del aspartato y/o glutamato, y agentes utilizables en el procedimiento. - Google Patents
Procedimiento para la produccion microbiana de aminoacidos de las familias del aspartato y/o glutamato, y agentes utilizables en el procedimiento.Info
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Abstract
Procedimiento para la producción microbiana de aminoácidos de la familia de los aspartatos y/o glutamatos, en el que se aumenta la actividad de piruvato-carboxilasa mediante modificación genética de la enzima y/o la expresión génica de piruvato-carboxilasa, de un microorganismo productor del correspondiente aminoácido.
Description
Procedimiento para la producción microbiana de
aminoácidos de las familias del aspartato y/o glutamato, y agentes
utilizables en el procedimiento.
La invención se refiere a un procedimiento para
la producción microbiana de aminoácidos de las familias de los
aspartatos y/o glutamatos conforme a las reivindicaciones 1 a 17, a
genes de piruvato-carboxilasa conformes a las
reivindicaciones 18 a 23, a estructuras de genes conformes a la
reivindicación 24, a vectores conformes a la reivindicación 25, a
células transformadas conformes a las reivindicaciones 26 a 31, así
como a utilizaciones conformes a las reivindicaciones 32 a 37.
Los aminoácidos son de gran interés económico,
siendo multifacética la utilización de aminoácidos. Así, por
ejemplo, se requieren L-lisina así como
L-treonina, L-metionina y
L-triptofano como aditivos en los piensos,
L-glutamato como aditivo en especias,
L-isoleucina y L-tirosina en la
industria farmacéutica, L-arginina y
L-isoleucina como medicamento, o
L-glutamato, L-aspartato y
L-fenilalanina como sustancias de partida para la
síntesis de productos químicos finos o purificados.
Un método preferido para la producción de estos
aminoácidos sumamente diversos es su producción biotecnológica por
medio de microorganismos, ya que de esta manera se obtiene
directamente la forma biológicamente eficaz y ópticamente activa del
correspondiente aminoácido, y es posible emplear materias primas
simples y económicas. Como microorganismos se utilizan, por ejemplo,
Corynebacterium glutamicum y sus relacionados ssp.
Flavum y ssp. Lactofermentum (Liebl. et al., Int.
J. System. Bacteriol. 1991, 41: 255 a 260), así como Escherichia
coli y bacterias relacionadas.
Sin embargo, normalmente estas bacterias producen
los aminoácidos solamente en la cantidad necesaria para su
desarrollo, por lo que no se forman ni excretan aminoácidos
excedentes. El fundamento de esto es que en la célula se controla de
múltiples maneras la biosíntesis de los aminoácidos. Como
consecuencia de ello, ya se conocen los más diversos procedimientos
para aumentar la formación del producto por medio de la desconexión
de los mecanismos de control. En estos procesos se aplican, por
ejemplo, análogos de aminoácidos, con el fin de desconectar la
regulación efectiva de la biosíntesis. Así, por ejemplo, se describe
un procedimiento en el que se utilizan cepas de
Corynebacterium que son resistentes a análogos de
L-tirosina y L-fenilalanina
(documentos JP 19037/1976 y 39517/1078). También se han descrito
procedimientos en los que se aplican bacterias resistentes con
respecto a análogos de L-lisina o también con
respecto a análogos de L-treonina, con el fin de
superar los mecanismos de control (documentos EP 0 205 849, GB 2 152
509).
Por otra parte, también se conocen
microorganismos construidos mediante técnicas de ADN recombinante,
en los que también se ha suspendido la regulación de la biosíntesis,
para lo cual se clonan y expresan los genes que no codifican las
enzimas clave que ya no pueden inhibirse por retroalimentación. Así,
por ejemplo, se conoce una bacteria recombinante, productora de
L-lisina, con aspartatoquinasa codificada mediante
plásmido, resistente a la retroalimentación (documento EP 0 381
527). También se ha descrito una bacteria recombinante, productora
de L-fenilalanina, con prefenatodehidrogenasa
resistente a la retroalimentación (documentos JP 123475/1986, EP 0
488 424).
Además de ello, se lograron rendimientos
acrecentados de aminoácidos se lograron por medio de la
sobreexpresión de genes que no codifican enzimas sensibles a la
retroalimentación, de la síntesis de aminoácidos. Así, por ejemplo,
la formación de lisina se mejora por medio de una síntesis reforzada
de la dihidrodipicolinatosintasa (documento EP 0 197 335). De la
misma manera, mediante una síntesis reforzada de la
treoninadehidratasa, se logra una mejor formación de isoleucina
(documento EP 0 436 886).
Otras tentativas de aumentar la producción de
aminoácidos están orientadas a una disposición mejorada de los
metabolitos celulares primarios del metabolismo central. Así, se
sabe que la sobreexpresión de la transcetolasa, lograda mediante
técnicas recombinantes, posibilita una formación productiva mejorada
de L-triptofano, L-tirosina o
L-fenilalanina (documento EP 0 600 463). Además, la
reducción de la actividad de
fosfonenolpiruvato-carboxilasa en
Corynebacterium conduce a una formación mejorada de
aminoácidos aromáticos (documento EP 0 331 145), mientras que el
aumento de la actividad de
fosfoenolpiruvato-carboxilasa en
Corynebacterium condujo a una mayor secreción de aminoácidos
de la familia de los aspartatos (documento EP 0 358 940).
Durante el desarrollo y, en especial. bajo
condiciones de producción de aminoácidos es necesario reabastecer el
ciclo de ácidos tricarboxílicos de manera continua y efectiva con
Compuestos C_{4}, por ejemplo, oxalacetato, con el fin de
reemplazar los productos intermedios que se retiran para la
biosíntesis de los aminoácidos. Hasta hace poco se suponía que para
estas denominadas funciones anapleróticas en Corynebacterium
es responsable la fosfoenolpiruvato-carboxilasa
(Kinoshíta, Biology of industrial micro-organisms
1985: 115 a 142, Benjamin/Cummings Publishing Company, Londres;
Liebl, The prokaryotes II, 1991: 1157 a 1171, editorial Springer N.
Y.; Vallino und Stephanopoulos, Biotechnol Bioeng 1993, 41: 633 a
646). Sin embargo, se ha encontrado que en comparación con las
correspondientes cepas de partida crecen mutantes
fosfonenolpiruvato-carboxilasa-negativos
de la misma manera en todos los medios ensayados
(Peters-Wendisch et al., FEMS Microbiology
Letters 1993, 112: 269 a 274; Gubler et al, Appl. Microbiol.
Biotechnol 1994, 40: 857 a 863). Este resultado mostró que la
fosfonenolpiruvato-carboxilasa no es esencial para
el desarrollo y que para las reacciones anapleróticas tiene un rol
nulo o solamente secundario. Por otra parte, el resultado antes
mencionado apuntó a que en Corynebacterium debe haber por lo
menos otra enzima responsable de la síntesis de oxalacetato, que es
necesaria para el desarrollo. De hecho, hace poco se encontró
ciertamente también una actividad de
piruvato-carboxilasa en células permeabilizadas de
Corynebacterium glutamicum (Peters-Wendisch
et al, Microbiology 1997, 143: 1095 a 1103). Esta enzima se
inhibe de manera efectiva por medio de AMP, ADP y
acetil-coenzima A, y se forma en mayores cantidades
en presencia de lactato como fuente de carbono. La existencia de una
piruvato-carboxilasa en Corynebacterium
glutamicum también se detectó o confirmó por otro grupo de
trabajo independiente, por espectroscopía de
^{13}C-RMN y GS-MS (Park et
al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997, 47:
430-440). Ya que era necesario partir de la premisa
que esta enzima es responsable en primer lugar del reabastecimiento
de los ciclos de ácido tricarboxílico durante el desarrollo, cabía
esperar que un aumento de la expresión génica, o de la actividad
enzimática no conduciría a ningún aumento, o a lo sumo a un aumento
insignificante, de los aminoácidos pertenecientes a la familia de
los aspartatos. Además, se esperaba que un aumento de la expresión
génica, o de la actividad enzimática, de la
piruvato-carboxilasa tampoco tendría una influencia
sobre la producción de aminoácidos de otras familias.
Se encontró ahora con sorpresa que después del
aumento de la actividad de piruvato-carboxilasa por
modificación genética de la enzima y/o después del aumento de la
expresión del gen de piruvato-carboxilasa, aumenta
la producción microbiana de aminoácidos de las familias de los
aspartatos y/o glutamatos. Se demostró que en especial cepas con un
mayor número de copias del gen de
piruvato-carboxilasa secretan en el medio de cultivo
aproximadamente 50% más de lisina, 40% más de treonina y 150% más de
homoserina. Por otra parte, se comprobó, también de manera
sorprendente, que también la producción de glutamato aumenta de
manera significativa (Véase en especial, el ejemplo de realización
en 6. y la Tabla 4).
La modificación genética de la
piruvato-carboxilasa para aumentar la actividad
enzimática tiene preferiblemente lugar por medio de mutación del gen
endógeno. Las mutaciones de este tipo pueden generarse de manera
aleatoria sobre la base de métodos clásicos, tal como, por ejemplo,
por radiación ultravioleta, o mediante productos químicos que
desencadenen mutaciones, o de manera selectiva mediante métodos de
tecnología de genes, tales como deleción(es),
inserción(es) y/o intercambio(s) de nucleótidos.
inserción(es) y/o intercambio(s) de nucleótidos.
La expresión del gen de
piruvato-carboxilasa aumenta por medio del
incremento del número de copias del gen y/o mediante el refuerzo de
factores reguladores que influyen positivamente sobre la expresión
del gen. Así, un refuerzo de elementos reguladores puede
preferiblemente tener lugar en el plano de la transcripción, en
especial por medio del aumento de las señales de transcripción. Esto
puede tener lugar, por ejemplo, aumentando la actividad del promotor
mediante la modificación de la secuencia promotora, antepuesta al
gen de estructura, o intercambiando el promotor por completo por
promotores más eficaces. También puede tener lugar un refuerzo de la
transcripción si se influye de manera correspondiente sobre un gen
regulador asociado al gen de piruvato-carboxilasa.
Por otra parte, mediante mutación de una secuencia génica reguladora
puede eventualmente influirse sobre la efectividad de la unión de
una proteína reguladora en el ADN del gen de
piruvato-carboxilasa que debe regularse, de manera
que con ello se refuerce la transcripción y, por lo tanto aumente la
expresión del gen. Además, al gen de
piruvato-carboxilasa puede también haber asociados
los reforzadores como secuencias reguladoras, los cuales, por medio
de una interacción mejorada entre ARN-polimerasa y
ADN, también determinan una mayor expresión del gen de
piruvato-carboxilasa. Sin embargo, además de ello
también es posible un refuerzo de la traducción, por ejemplo
mejorando la estabilidad del ARN-m.
Para aumentar el número de copias del gen, se
incorpora el gen de piruvato-carboxilasa en una
construcción génica, o en un vector. La construcción génica
contiene, en especial, las secuencias reguladoras asociadas al gen
de piruvato-carboxilasa, preferiblemente del tipo
que refuerzan la expresión del gen. Para la incorporación del gen de
piruvato-carboxilasa en una construcción génica, el
gen se aísla preferiblemente a partir de una cepa de microorganismos
del género Corynebacterium, y se transforma en una cepa de
microorganismos productores de aminoácidos, en especial
Corynebacterium, o en Escherichia coli o Serratia
marcescens. Para el procedimiento conforme a la invención son
especialmente adecuados genes procedentes de C. glutamicum o C.
glutamicum ssp. flavum o C. glutamicum ssp.
lactofermentum. Después del aislamiento del gen y de la
recombinación in-vitro con vectores conocidos
(véase, por ejemplo, Simon et al., Bio/Technology 1983, 1:
784 a 791; Eikmanns et al., Gene 1991, 102: 93 a 98), tiene
lugar la transformación, por electroporación, en la cepas
productoras de aminoácidos, (Liebl et al., FEMS Microbiology
Letters 1991, 65: 299 a 304) o por conjugación (Schäfer et
al., J Bacteriol. 1990, 172: 1663 a 1666). Como cepas
hospedantes se utilizan preferiblemente productores de aminoácidos
que están desregulados en la síntesis de los aminoácidos
correspondientes y/o presentan una mayor actividad del portador de
exportación para el aminoácido correspondiente. Además, se prefieren
aquellas cepas que contienen una mayor proporción de metabolitos del
metabolismo central del tipo que participan en la síntesis del
aminoácido correspondiente, y/o cepas del tipo que contienen una
menor proporción de los metabolitos del metabolismo central que no
participan en la síntesis del aminoácido correspondiente, en
especial de metabolitos que son competentes para reacciones
competitivas; es decir se prefieren aquellas cepas en las que la vía
de biosíntesis que compite con la vía de síntesis del aminoácido
correspondiente, discurre con una actividad disminuida. Así, es
adecuada una cepa de microorganismos corineformes, resistente contra
el éster \beta-metílico de ácido
L-aspártico (EMA), con una reducida actividad de
citrato-sintasa (documento EP 0 551 614).
Después del aislamiento pueden obtenerse genes de
piruvato-carboxilasa con secuencias de nucleótidos,
que codifican la secuencia de aminoácidos indicada como SEQ ID No.
2, o sus variaciones alélicas, o que presentan la secuencia de
nucleótidos desde el nucleótido 165 al 3587 conforme a SEQ ID No. 1,
o una secuencia de ADN que actúa de manera esencialmente igual.
Además, pueden obtenerse genes con un promotor antepuesto a la
secuencia de nucleótidos, desde el nucleótido 20 a 109 conforme a
SEQ ID No. 1, o una secuencia de ADN que actúa esencialmente de la
misma manera. Las variaciones alélicas, o las secuencias de ADN que
tienen el mismo efecto, abarcan en especial derivados funcionales
que pueden obtenerse por deleción(es), inserción(es)
y/o sustituciones de nucleótidos a partir de secuencias
correspondientes, manteniéndose o aún elevándose la actividad o
función, de la enzima. Estos genes de
piruvato-carboxilasa se aplican preferiblemente en
el procedimiento conforme a la invención.
Al gen de piruvato-carboxilasa,
con o sin promotor antepuesto, o con o sin un gen regulador asociado
con él, pueden estar antepuestas y/o dispuestas a continuación, una
o varias secuencias de ADN, por lo que el gen se halla contenido en
una estructura de genes.
Es preferible que el promotor-tac
(gen lacl^{Q}) esté antepuesto al gen de la
piruvato-carboxilasa, habiendo en especial
secuencias reguladoras asociadas al mismo.
Por clonación del gen de
piruvato-carboxilasa es posible obtener plásmidos
que contienen el gen y que son adecuados para la transformación de
un productor de aminoácidos. Las células que pueden obtenerse
mediante transformación, de las que se trata preferiblemente de
células transformadas de Corynebacterium, contienen el gen en
forma replicable, es decir en forma de copias adicionales en el
cromosoma, integrándose las copias del gen por recombinación en
lugares arbitrarios del genoma, y/o en un plásmido o vector.
Ejemplo de
realización
A partir de zonas conservadas de todos los genes
de piruvato-carboxilasa (genes pyc) conocidos hasta
ahora, de Saccharomyces cerevisiae (J Biol Chem 1988, 263:
11493-11497; Mol Gen Genet 1991, 229:
307-315), ser humano (Biochim Biophys Acta 1994,
1227: 46-52), ratón (Proc Natl Acad Sci, USA 1993,
90: 1766-1770), Aedes aegypti
(EMBL-GenBank: Nº de Acceso: L36530), así como de
Mycobacterium tubercolosis (EMBL-GenBank: Nº
de Acceso: U00024) se sintetizaron cebadores de RCP (MWG Biotech).
Los cebadores correspondían a las bases 810 a 831 y 1015 a 1037 del
gen pyc de M. tuberculosis. Con estos cebadores y por medio de RCP
conforme al método estándar de Innis et al. (PCR protocols: A
guide to methods and applicatíons, 1990, Academic Press) para
cebadores homólogos no degenerados, fue posible amplificar un
fragmento de aproximadamente 200 pb de ADN cromosómico de C.
glutamicum ATCC 13032, que se aisló como se describe en Eikmanns
et al. (Microbiology 1994, 140: 1817-1828).
El tamaño de 200 pb correspondía a lo previsto para genes pyc. El
producto de la RCP se secuenció como se describe en Sanger et
al. (Proc Natl Acad Sci USA 1977, 74:
5463-5467). La secuenciación se llevó a cabo con
ddNTPs marcados por fluorescencia, por medio de un aparato
automático de secuenciación de ADN (Applied Biosystems).
A partir de este fragmento de ADN de C.
glutamicum se prepararon los siguientes oligonucleótidos
homólogos:
- pyc 1 5'- CGTCTTCATCGAAATGAAC-3'
- pyc 2 5'- ACGGTGGTGATCCGGCACT-3'
Los oligonucleótidos se utilizaron como cebadores
de RCP para aislar una sonda para el gen de
piruvato-carboxilasa (pyc) a partir de C.
glutamicum. Los cebadores se emplearon en una reacción de RCP
con ADN cromosómico de C. glutamicum y nucleótidos marcados
con digoxigenina. La reacción se llevó a cabo según las
prescripciones del "`PCR DIG Labeling Kits" de la Firma
Boehringer Mannheim. Con esta tanda posible amplificar un fragmento
de ADN marcado con digoxigenina, que correspondía al tamaño esperado
de aproximadamente 200 pb. Seguidamente se aplicó la sonda pyc, así
preparada, para identificar por hibridación de transferencia Blot un
fragmento de ADN en el ADN cromosómico de C. glutamicum, en
el que se halla localizado el gen pyc. Para ello se procedió en cada
caso a cortar 2 a 5 \mug de ADN cromosómico de C.
glutamicum WT con las enzimas de restricción HindIII, SphI,
SaII, Dral, EcoRI y BamHI, y los fragmentos de ADN obtenidos se
separaron durante 16 h a 20 V en gel de agarosa al 0,8% por
electroforesis en gel, de acuerdo con su tamaño. Los fragmentos de
ADN situados en el gel de agarosa se desnaturalizaron según un
método de Southern (J Mol Biol 1975, 98: 503-517),
se los transfirió bajo soporte de vacío mediante el aparato VacuGene
Blot de Pharmacia LKB (Uppsala, Suecia) a partir de la matriz de
gel, sobre una membrana de nilón (Nytran N13 de Schleicher und
Schüll, Dassel. Suiza), se los inmovilizó, y se detectó el marcaje
con digoxigenina mediante conversión de
NBT/X-fosfato por medio de fosfatasa alcalina. De
esta manera fue posible detectar los siguientes fragmentos
cromosómicos que se hibridan con la sonda pyc-ADN:
un fragmento HindIII de 17 kb, un fragmento SaII de 6,5 kb y un
fragmento EcoRI de 1,35 kb.
El fragmento HIndIII de 17 kb se aisló y clonó.
Para ello se utilizó un banco de genes de cósmidos de ADN
cromosómico de C. glutamicum en el cósmido pHC79, que
representaba en un 99% (Microbiol 1992,6: 317-326)
el genoma de C. glutamicum. Se transformó la cepa DH5\alpha
de E. coli con este banco de genes por medio del método de
CaCl_{2} de Sambrook et al. (Molecular Cloning, A
laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press), y se
la extendió sobre placas, a razón de aproximadamente 300 colonias
por placa de LB-agar, junto con 50 \mug/l de
canamicina (en total 5.000 colonias). Seguidamente los transformados
obtenidos se transfirieron a filtros de Nytran N13, y los mismos se
incubaron durante 5 min sobre papel Whatmann impregnado con NaOH 0,5
M y NaCl 1,5 M, para la lisis alcalina de las células y la
desnaturalización del ADN. La neutralización subsiguiente tuvo lugar
con Tris/HCl 1 M pH 7,5 y NaCl 1,5 M. Después de la incubación de
los filtros en 2 x SSC se fijó el ADN liberado sobre el filtro por
radiación UV a 366 nm. Seguidamente se separaron los residuos
celulares por sacudimiento en 3 x SSC SDS al 0,1%, a 50ºC. Los
filtros se utilizaron en esta forma para la hibridación con una
sonda pyc específica, como se describe en Southern (J Mol Biol 1975,
98: 503-517). Se identificaron 3 transformados que
hibridaban contra la sonda pyc. A partir de dichos transformados se
aisló el ADN de cósmido mediante preparación de plásmido según el
método de la lisis alcalina de Birnboim (Meth Enzymol 1983, 100,
243-255), y seguidamente se lo sometió a ensayo por
restricción y análisis de transferencia Southern para establecer la
presencia del fragmento HindIII. El cósmido
pHC79-10, que contenía un inserto de 40 kb, portaba
el fragmento HindIII completo, y fue objeto de un análisis ulterior.
Se comprobó que también después de la restricción con las
endonucleasas SaII y EcoRI se obtenían los mismos fragmentos
hibridantes que en el ADN cromosómico, es decir un fragmento SaII de
6,5 kb y un fragmento EcoRI de 1,35 kb. El fragmento HindIII, de 17
kb, se aisló por medio de restricción con HindIII a partir del
cósmido, y se ligó en el vector de E. coli, pUC18, que
también se había cortado con HindIII. Se realizó un análisis de
restricción del fragmento en el vector pUCpyc resultante. La
representación física en mapa se ha representado en la Figura 1.
En otros pasos de subclonación se aislaron por
restricción con las correspondientes enzimas de restricción a partir
del plásmido pUCpyc, un fragmento SaII-EcoRI de 0,85
kb, el fragmento EcoRI de 1,35 kb, un fragmento
EcoRI-EcoRI-StuI, de 1,6 kb así como
un fragmento ClaI de 1,6 kb, que se solapaba parcialmente con el
fragmento SaII-EcoRI de 0,85 kb. Mediante ligación
se clonaron los fragmentos en el respectivo vector pUC18 restringido
correspondiente, y seguidamente se los secuenció según Sanger et
al. (Proc Natl Acad Sci USA 1977, 74:
5463-5467), como anteriormente se describe. Las
secuencias de nucleótidos obtenidas se analizaron por medio del
paquete de programas HUSAR (Release 3.0) del Deutschen
Krebsforschungszentrums (Centro Alemán de Investigaciones
Oncológicas) (Heidelberg). El análisis de la secuencia de los
fragmentos dio como resultado un marco de lectura abierto continuo
de 3576 pb, que codifica una secuencia de proteínas de 1140
aminoácidos. Una comparación de la secuencia de proteínas derivada,
con el EMBL Gen-Datenbank (Banco de Datos Génicos de
EMBL) (Heidelberg) permitió establecer similitudes con todas las
piruvato-carboxilasas conocidas. La identidad más
elevada (62%) se encontró con respecto a la
piruvato-carboxilasa putativa de
Mycobacterium tuberculosis (EMBL GenBank: nº de Acceso
U00024). Si se tienen en cuenta los intercambios conservados de
aminoácidos, la similitud era de 76%. Una comparación con las
piruvato-carboxilasas de otros organismos resultó en
46 a 47% de aminoácidos idénticos y 64 a 65% de aminoácidos
similares (Gene 1997, 191: 47-50; J Bacteriol 1996,
178: 5960-5970; Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90:
1766-1770; Biochem J 1996,316:
631-637; EMBL-GenBank: nº de Acceso
L36530; J Biol Chem 1988,263: 11493-11497; Mol Gen
Genet 1991, 229; 307-315). A partir de estos
resultados se llegó a la conclusión que el fragmento clonado porta
el gen para la piruvato-carboxilasa de C.
glutamicum. La secuencia de nucleótidos del gen se indicó como
SEQ ID No. 1, y la correspondiente secuencia de aminoácidos, como
SEQ ID No. 2,
Para la sobreexpresión del gen para la
piruvato-carboxilasa de C. glutamicum se
procedió a clonar el gen a partir del plásmido pUCpyc en forma de
fragmento SspI-ScaI de 6,2 kb en el vector oscilante
de E. coli-C. glutamicum, pEKO (Gene 1991, 102:
93-98), que se había cortado con las endonucleasas
de restricción EcoRI y PstI. Mediante el tratamiento de
Klenow-polimerasa se completaron (EcoRI) los
extremos sobresalientes, o se los digerió (PstI), para obtener
extremos lisos o romos, y el vector linearizado se ligó con el
fragmento SspI-ScaI de 6,2 kb. La construcción
pEK0pyc obtenida se transformó primeramente en la cepa DH5á de E.
coli, se aisló el ADN del plásmido sobre el transformado
resultante, y se controló la autenticidad del inserto por
restricción. A continuación se introdujo el ADN en la cepa SP733 por
electroporación (FEMS Microbiol Lett 1989, 65:
299-304). En cuanto a esta cepa, se trata de un
mutante de la cepa R127, negativa a la restricción, de C.
glutamicum (Dechema Biotechnology Conference 1990, 4
323-327, editorial Chemie) que se había obtenido por
mutagénesis química y que se caracteriza porque no puede
desarrollarse en un medio mínimo con piruvato y lactato como únicas
fuentes de carbono (Microbiology 1997, 143:
1095-1103). Este fenotipo es causado por un defecto
en la piruvato-carboxilasa y pudo complementarse
mediante la introducción del gen de
piruvato-carboxilasa de C. glutamicum; es
decir la cepa que porta el plásmido pEK0pyc, estaba nuevamente en
condiciones, en contraposición con la cepa de partida, de crecer en
un medio mínimo con lactato como única fuente de carbono. Con ello
también se aportó la prueba que el gen codifica una
piruvato-carboxilasa funcional.
Además de ello, se transformó el plásmido pEK0pyc
por electroporación en el C. glutamicum de tipo salvaje, ATCC
13032. La cepa WT resultante (pEK0pyc) se investigó por comparación
con el tipo salvaje ATCC 13032, en relación con su actividad de
piruvato-carboxilasa. Las cepas se cultivaron en
medio complejo (Luria-Bertani, Molecular Cloning, A
laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press) con
0,5% de lactato, y en medio mínimo con 2% de lactato o 4% de
glucosa, y se llevó a cabo el ensayo de
piruvato-carboxilasa según el método descrito por
Peters-Wendisch et al. (Microbiology 1997,
143: 1095-1103). El resultado del análisis (Tabla 1)
muestra que la actividad de piruvato-carboxilasa en
la cepa portadora de pEKO-pyc es de aproximadamente
el cuádruplo de la de la cepa de partida.
Para investigar el efecto de la sobreexpresión
del gen para la piruvato-carboxilasa sobre la cepa
productora de lisina, DG52-5 (J Gen Microbiol 1988,
134: 3221-3229), se utilizó el vector de expresión
pVWEX1, que permite una expresión inducible por IPTG. El gen pyc se
introdujo en este vector por clonación, sin promotor. Para ello se
sintetizó en primer lugar el cebador de RCP (Cebador 1 = Posición
112-133, Cebador 2 = Posición 373 a 355 en la
secuencia de nucleótidos conforme a SEQ ID No. 1), y por RCP se
amplificaron 261 pb de la zona inicial, carente de promotor, del gen
de piruvato-carboxilasa. Los cebadores se eligieron
de manera que el cebador 1 induce un lugar de corte de PstI, y el
cebador 2 un lugar de corte de BamHI. Después de la RCP se aisló el
producto de RCP de 274 pb, obtenido, se le ligó a concatémeros, y
seguidamente se lo cortó con las enzimas de restricción PstI y
BamHI. La tanda de restricción se concentró mediante precipitación
con etanol, y seguidamente se ligó con el vector pVWEX1 cortado con
PstI-BamHI. La construcción
pVWEXI-RCP obtenida se sometió a ensayo por
restricción. La zona extrema del gen pyc se aisló por tratamiento
con RcaI-Klenow-SaII a partir del
vector pEK0pyc, y se ligó en el vector pVWEX1-RCP
tratado con BamHI-Klenow-SaII. La
construcción pVWEXlpyc obtenida se analizó mediante representación
en mapa de restricción. Un mapa físico del plásmido se muestra en la
Figura 2.
El plásmido se introdujo en la cepa
DG52-5 de C. glutamicum mediante
electroporación. Como control se transformó la cepa
DG52-5 con el vector pVWEX1 sin inserto, y se
comparó la secreción de L-lisina con sendos tres
transformandos distintos. Para ello se cultivaron
DG52-5(pVWEX1)1, 2 y 3, así como
DG52-5(pVWEXlpyc) 3, 4 y 6 en medio complejo
(2xTY; Molecular Cloning, A laboratory manual. 1989.Cold Spring
Harbour Laboratory Press; con 50 \mug/l de canamicina), y el medio
de fermentación, CGXII (J Bacteriol 1993, 175:
5595-5603) se inoculó en cada caso por separado a
partir de los cultivos preliminares. El medio contenía
adicionalmente canamicina, para mantener los plásmidos estables. Se
implementaron en cada caso dos tandas paralelas; en uno de los
matraces se añadieron 200 \mug de ITPG/ml, mientras que el segundo
matraz no contenía IPTG. Después de cultivo durante 48 horas a 30ºC
en el sacudidor giratorio a 120 rpm, se determinó la cantidad de
lisina acumulada en el medio. La determinación de la concentración
de aminoácidos tuvo lugar mediante cromatografía de líquidos a alta
presión (J Chromat 1983, 266: 471-482). El
resultado de la fermentación se ha representado en la Tabla 2, en la
que los valores indicados representan valores medios de en cada caso
tres experimentos con diferentes clones. Se demostró que la
sobreexpresión del gen de piruvato-carboxilasa
conduce a un incremento del 50% de la acumulación de lisina en el
medio. Por lo tanto, la utilización del gen descubierto y descrito
para la enzima anaplerótica piruvato-carboxilasa,
representa un procedimiento para mejorar de manera decisiva la
formación de L-lisina.
De manera análoga a los experimentos para la
formación de L-lisina se investigó también la
acumulación de treonina en el sobrenadante del cultivo mediante la
sobreexpresión del gen para la piruvato-carboxilasa.
Para ello se procedió, tal como se describe en el punto 4, a
transformar la cepa DM368-3 de C. glutamicum
(Degussa AG) productora de treonina con el plásmido pVWEX1pyc, así
como, para control, con el plásmido pVWEX1, y se investigó la
secreción de treonina, de en cada caso tres transformados distintos.
Para ello se cultivaron
DM368-3(pVWEXI)1, 2 y 3, así como
DM368-3(pVWEXIpyc)1, 2 y 3 en medio
complejo (2xTY con 50 \mug/l de canamicina), y el medio de
fermentación CGXII (J Bacteriol 1993, 175:
5595-5603) se inoculó en cada caso a partir de los
cultivos preliminares. El medio contenía adicionalmente canamicina,
para mantener estables los plásmidos. Se implementaron dos tandas
paralelas, en uno de los matraces se añadieron 200 \mug de
ITPG/ml, mientras que el segundo matraz no contenía IPTG. Después de
cultivo durante 48 horas a 30ºC en el sacudidor giratorio a 120 rpm,
se determinó la cantidad de treonina acumulada en el medio. La
determinación de la concentración de aminoácidos también tuvo lugar
por cromatografía de líquidos a alta presión (J Chromat 1983, 266:
471-482). El resultado de la fermentación se ha
representado en la Tabla 3, en la que los valores indicados
representan valores medios de en cada caso tres experimentos con
clones distintos. Se demostró que la sobreexpresión del gen de
piruvato-carboxilasa conduce a un incremento de
aproximadamente 40% de la concentración de treonina en el medio. Por
lo tanto, la utilización del gen descubierto y descrito para la
enzima anaplerótica piruvato-carboxilasa, representa
un procedimiento para mejorar de manera decisiva la formación de
L-treonina.
Por otra parte, la determinación de la
concentración de los aminoácidos demostró de manera sorprendente que
la cepa con gen de piruvato-carboxilasa
sobreexpresado secreta además aproximadamente 150% más de homoserina
en el medio que la cepa con gen no sobreexpresado. Los resultados
correspondientes también se han representado en la Tabla 3. Ponen de
manifiesto que el procedimiento conforme a la invención puede
mejorar decisivamente la formación tanto de treonina como de
homoserina.
De manera análoga a los experimentos para la
formación de L-lisina, L-treonina y
L-homoserina (véanse los puntos 4 y 5 anteriores),
se investigó también la acumulación de glutamato en el sobrenadante
del cultivo, por medio de la sobreexpresión del gen para la
piruvato-carboxilasa. Para ello se procedió, tal
como se describe en el punto 4, a transformar el Tipo Salvaje de
C. glutamicum, ATCC 13032, con el plásmido pVWEX1pyc, así
como, para control, con el plásmido pVWEX1, y se investigó la
secreción de glutamato, a partir de en cada caso dos transformandos
distintos. Para ello se cultivaron C. glutamicum ATCC 13032
(pVWEXIpyc)D1 y D2, así como C. glutamicum ATCC 13032
(pVWEXIpyc)1 y 2, en medio complejo (2xTY con 50 \mug/l de
canamicina), y el medio de fermentación CGXII (J Bacteriol 1993,
175: 5595-5603) se inoculó en cada caso por separado
a partir de los cultivos preliminares. El medio contenía
adicionalmente canamicina, con el fin de mantener estables los
plásmidos. Para la inducción de la secreción de glutamato se
añadieron al medio aproximadamente 6 horas después de la
inoculación, 25 mg de Tween 60 por ml. Se implementaron dos tandas
paralelas; en uno de los matraces se añadieron 200 \mug de
ITPG/ml, mientras que el segundo matraz no contenía IPTG. Después de
cultivo durante 48 horas a 30ºC en el sacudidor giratorio a 120 rpm,
se determinó la cantidad de glutamato acumulada en el medio. La
determinación de la concentración de aminoácidos también tuvo lugar
mediante cromatografía de líquidos a alta presión (J Chromat 1983,
266: 471-482). El resultado de la fermentación se
presenta en la Tabla 4, en la que los valores indicados representan
valores medios de en cada caso dos experimentos con distintos
clones. Se demostró que la sobreexpresión del gen de la
piruvato-carboxilasa conduce a un incremento de
hasta 500% de la acumulación de glutamato en el medio. Por lo tanto,
la utilización del gen descubierto y descrito para la enzima
anaplerótica piruvato-carboxilasa, ofrece un
procedimiento para mejorar de manera decisiva la formación de
L-glutamato.
(1) DATOS GENERALES
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Forschunqstentrum Juelich GmbH
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Postfach 1913
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- LOCALIDAD: Juelich
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PAÍS: ALEMANIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- CÓDIGO POSTAL: 52425
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DESIGNACIÓN DE LA INVENCIÓN: Piruvato Carboxilasa
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- VERSIÓN LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Soporte de Datos: Floppy Disk
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Ordenador: IBM PC Compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Sistema Operativo: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Software: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPA)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARCTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3728 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: cadena sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN del genoma
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARCTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1140 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: cadena sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (37)
1. Procedimiento para la producción microbiana de
aminoácidos de la familia de los aspartatos y/o glutamatos, en el
que se aumenta la actividad de piruvato-carboxilasa
mediante modificación genética de la enzima y/o la expresión génica
de piruvato-carboxilasa, de un microorganismo
productor del correspondiente aminoácido.
2. Procedimiento conforme a la reivindicación 1,
caracterizado porque se genera una enzima con una elevada
actividad de piruvato-carboxilasa mediante mutación
del gen endógeno de piruvato-carboxilasa.
3. Procedimiento conforme a la reivindicación 1 ó
2, caracterizado porque se aumenta la expresión génica de la
piruvato-carboxilasa mediante el aumento del número
de copias del gen.
4. Procedimiento conforme a la reivindicación 3,
caracterizado porque para aumentar el número de copias del
gen se incorpora el gen de piruvato-carboxilasa en
una construcción génica.
5. Procedimiento conforme a la reivindicación 4,
caracterizado porque el gen se incorpora en una construcción
génica que contiene secuencias génicas reguladoras asociadas al gen
de piruvato-carboxilasa.
6. Procedimiento conforme a la reivindicación 4 ó
5, caracterizado porque se transforma un microorganismo
productor del aminoácido correspondiente, con la construcción
génica que contiene el gen.
7. Procedimiento conforme a la reivindicación 6,
caracterizado porque se transforma un microorganismo del
género Corynebacterium, con la construcción génico que
contiene el gen.
8. Procedimiento conforme a la reivindicación 6 ó
7, caracterizado porque para la transformación se emplea un
microorganismo, en el que las enzimas que participan en la síntesis
del aminoácido correspondiente están desreguladas y/o presentan una
mayor actividad del portador de exportación para el aminoácido
correspondiente.
9. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones 6 a 8, caracterizado porque para la
transformación se emplea un microorganismo que contiene una mayor
proporción de metabolitos del metabolismo central que participan en
la síntesis del aminoácido correspondiente.
10. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones 6 a 9, caracterizado porque para la
transformación se emplea un microorganismo en el que una vía de
biosíntesis que compite con la vía de biosíntesis de aminoácidos
correspondiente, discurre con una actividad disminuida.
11. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el gen de
piruvato-carboxilasa se aísla a partir de una cepa
de microorganismos del género Corynebacterium.
12. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se aumenta
la expresión del gen mediante el refuerzo de las señales de
transcripción.
13. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el
promotor tac se antepone al gen de
piruvato-carboxilasa.
14. Procedimiento conforme a la reivindicación
13, caracterizado por secuencias reguladoras asociadas al
promotor tac.
15. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque como gen
de piruvato-carboxilasa se emplea un gen con una
secuencia de aminoácidos indicada bajo SEQ ID No. 2 y una secuencia
de nucleótidos que codifica sus variaciones alélicas.
16. Procedimiento conforme a la reivindicación
15, caracterizado porque como gen de
piruvato-carboxilasa se emplea un gen con la
secuencia de nucleótidos, de los nucleótidos 165 a 3587, de acuerdo
con SEQ ID No 1, o una secuencia de ADN que actúa esencialmente de
la misma manera.
17. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones precedentes, para la producción de lisina,
treonina, homoserina. glutamato y/o arginina.
18. Gen de piruvato-carboxilasa,
con una secuencia de aminoácidos indicada bajo SEQ ID No.2 y/o una
secuencia de nucleótidos que codifica sus variaciones alélicas.
19. Gen de piruvato-carboxilasa
conforme a la reivindicación 18, con la secuencia de nucleótidos, de
los nucleótidos 165 a 3587, conforme a SEQ ID Nr. 1 o a una
secuencia de ADN que actúa esencialmente de la misma manera.
20. Gen de piruvato-carboxilasa
conforme a la reivindicación 18 ó 19, con un promotor antepuesto a
la secuencia de
nucleótidos. de los nucleótidos 20
a 109 conforme a SEQ ID No. 1, o una secuencia de ADN que actúa
esencialmente de la misma
manera.
21. Gen de piruvato-carboxilasa
conforme a la reivindicación 18 ó 19, con un promotor tac
antepuesto.
22. Gen de piruvato-carboxilasa
conforme a la reivindicación 21, con secuencias reguladoras
asociadas al promotor.
23. Gen de piruvato-carboxilasa
conforme a una de las reivindicaciones 18 a 20, con secuencias
génicas reguladoras asociadas al mismo.
24. Estructura génica, que contiene un gen de
piruvato-carboxilasa conforme a una de las
reivindicaciones 18 a 23.
25. Vector, que contiene un gen de
piruvato-carboxilasa conforme a una de las
reivindicaciones 18 a 23, o una estructura génica conforme a la
reivindicación 24.
26. Célula transformada, que contiene en forma
replicable un gen de piruvato-carboxilasa conforme a
una de las reivindicaciones 18 a 23, o una estructura génica
conforme a la reivindicación 24.
27. Célula transformada conforme a la
reivindicación 26, que contiene un vector conforme a la
reivindicación 25.
28. Célula transformada conforme a la
reivindicación 26 ó 27, caracterizada porque pertenece al
género Corynebacterium.
29. Célula transformada conforme a una de las
reivindicaciones 26 a 28, caracterizada porque las enzimas en
ella que participan en la síntesis del correspondiente aminoácido
y/o las enzimas que participan en la exportación del aminoácido
correspondiente, están desreguladas.
30. Célula transformada conforme a una de las
reivindicaciones 26 a 29, caracterizada porque contiene una
mayor proporción de metabolitos del metabolismo central que
participan en la síntesis del aminoácido correspondiente.
31. Célula transformada conforme a una de las
reivindicaciones 26 a 30, caracterizada porque contiene una
proporción reducida de metabolitos del metabolismo central que no
participan en la síntesis del aminoácido correspondiente.
32. Uso de un gen de
piruvato-carboxilasa para incrementar la producción
de aminoácidos de la familia de los aspartatos y/o glutamatos, a
partir de microorganismos.
33. Uso conforme a la reivindicación 32,
caracterizado porque se utiliza un gen de
piruvato-carboxilasa mutado que codifica una enzima
con una elevada actividad de
piruvato-carboxilasa.
34. Uso conforme a la reivindicación 32 ó 33,
caracterizado porque se transforma el microorganismo
productor del correspondiente aminoácido con una construcción génica
que contiene un gen de piruvato-carboxilasa.
35. Uso conforme a la reivindicación 34,
caracterizado porque la construcción génica contiene
adicionalmente secuencias génicas reguladoras.
36. Uso conforme a una de las reivindicaciones 32
a 35, caracterizado porque se utiliza un gen de
piruvato-carboxilasa de Corynebacterium.
37. Uso conforme a una de las reivindicaciones 32
a 36, caracterizado porque se utiliza Corynebacterium
como microorganismo productor de aminoácidos.
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