RU2557294C2

RU2557294C2 - СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ Corynebacterium glutamicum АТСС 21831 ИЛИ Corynebacterium glutamicum АТСС 21493 В ФЕРМЕНТАЦИОННОЙ СРЕДЕ, СОДЕРЖАЩЕЙ В КАЧЕСТВЕ ИСТОЧНИКА УГЛЕРОДА ЖОМ МАНИОКА ИЛИ СЕМЕНА ДЖЕКФРУТА

Info

Publication number: RU2557294C2
Application number: RU2012140764/10A
Authority: RU
Inventors: Ашок ПАНДЕЙ; Мадхавен НАМПУТХИРИ; Рави СУБРАМАНИАМ
Original assignee: Колгейт-Палмолив Компани; Каунсил Оф Сайентифик Энд Индастриал Рисерч
Priority date: 2010-02-25
Filing date: 2010-02-25
Publication date: 2015-07-20
Also published as: AR109815A2; TWI515297B; RU2012140764A; MX2012009816A; JP5948254B2; SG183136A1; WO2011106002A8; AU2010346674B2; EP2539457A1; CA2791006A1; US20120309061A1; BR112012021285A2; AU2010346674A1; CL2012002335A1; JP2013520196A; WO2011106002A1; CN102947459B; BR112012021285A8; TW201142032A; US9150892B2

Abstract

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены варианты способа получения аргинина посредством ферментации агропромышленных отходов, в том числе крахмалосодержащих, с получением ферментированной жидкости, содержащей аргинин, и выделения аргинина из ферментированной жидкости. Перед ферментацией может быть осуществлен ферментативный гидролиз агропромышленных отходов для преобразования отходов в восстанавливающие сахара. Ферментацию осуществляют в аэробных условиях при pH от 5,5-7,5, при температуре 27-36°C в течение от 1 до 10 дней в присутствии Corynebacterium glutamicum ATCC 21831 или Corynebacterium glutamicum ATCC 21493. В качестве агропромышленных отходов используют жом, порошок семян, жома маниоки и/или порошок семян джекфрута. Группа изобретений позволяет получить более высокий выход аргинина. 2 н. и 18 з.п. ф-лы, 6 табл., 4 пр.

Description

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к биотехнологическому способу получения L-аргинина ферментацией. Варианты осуществления включают восстанавливающие сахара, полученные ферментативным гидролизом крахмала из недорогих крахмалосодержащих агропромышленных отходов, таких как жом маниоки и порошка семян джекфрута, каждое из которых широко распространено в странах Азии и Африки. Экономичность способа получения аргинина из источников нерафинированного сахара можно повысить путем замены дорогих синтетических источников углерода, таких как глюкоза или сахароза.

Растущий рыночный спрос на аминокислоты сподвиг научное сообщество и промышленников на разработку новых, эффективных и экономически целесообразных способов получения аминокислот. Эта технологическая гонка способствовала производству аминокислот, главным образом, четырьмя способами - экстракцией из белковых гидролизатов, химическим синтезом, ферментативным гидролизом и ферментацией. С экономической точки зрения ферментация является промышленно оправданной и широко применяется за исключением нескольких случаев, когда не были достигнуты высокие выходы продукции. Экономичность этого процесса, в основном, зависит от стоимости источника углерода, количества продукта ферментации, количества очищенного продукта и продуктивности процесса в целом. Рост рыночной стоимости аминокислот, полученных с помощью дифтериеподобных бактерий, привел к значительному развитию в области биотехнологии и технологии производства и выделения целевого продукта. Это повлекло за собой необходимость приложения усилий по повышению эффективности производства и снижению издержек производства (Thomas Hermann, “Industrial production of amino acids by coryneform bacteria”. Journal of Biotechnology 104 155-172 (2003)). Следовательно, любой естественный процесс, оказывающий влияние на выход L-аргинина, востребован для использования в промышленном производстве.

L-аргинин является условно незаменимой аминокислотой ввиду зависимости от стадии развития и состояния здоровья индивидуума. Аргинин стимулирует иммунную систему посредством увеличения выхода Т-клеток, способствует расширению кровеносных сосудов, поддержанию здоровья мышечной системы, удалению аммиака из тела и выработке гормонов. Производство L-аргинина осуществляется тремя традиционными способами: (i) экстракцией из белковых гидролизатов; (ii) химическим синтезом и (iii) ферментативным гидролизом (Takishi Utagawa, “Production of Arginine by fermentation”, J. Nutr. 134:2854S-2857S (2004)). Позднее было обнаружено, что L-аргинин можно получить в небольших количествах ассимиляцией углеводородов штаммами дикого типа Corynebacterium и Brevihacterium (патенты США №3222258 и 3440141), и эти мутантные штаммы производят еще большее количество из углеводов (патент Великобритании № 1278917).

Среди регуляторных мутантов различных микроорганизмов Cotymbacterium glutamicum показал наиболее высокую способность производства L-аргинина (Hajime Yoshida, Kazumi Araki and Kiyoshi Nakayama, “Arginine Production by Arginine Analog-resistant Mutants of Microorganisms”, Agric, Biol. Chem., 45(4), 959-963 (1981)). Некоторые из наиболее типичных мутантов, продуцирующих аргинин, относятся к виду Corynebacterium, устойчивому к 2-тиазолаланину (патент США № 3723249 и патент США № 3878044) и канаванину (патент США № 3849250; Патент Великобритании № 1351518). Кроме того, было обнаружено, что мутанты вида Bacillus (Патент США № 3734829, патент США № 4086137 и патент США № 4430430) и Escherichia (патент США № 4430430, патент США № 6897048) также производят аргинин в значительных количествах.

Производство L-аргинина в значительных количествах посредством микробиологической ферментации было впервые описано Kisumi et al, “Production of L-Arginine by Arginine Hydroxamate-Resistant Mutants of Bacillus subtilis”, Appl. Microbiol. 22,987 (1971). Как известно, кислородное питание оказывает большое влияние на аэробное производство аминокислот микроорганизмами (Takishi Utagawa, “Production of Arginine by fermentation”, J. Nutr. 134:2854S-2857S (2004)). Рост в анаэробных условиях часто приводит к образованию токсичных побочных продуктов, таких как уксусная кислота и этиловый спирт, которые, в свою очередь, приводят к сильному замедлению производства L-аргинина (J. Gong, J. Ding, H. Huang, Q. Chen, Kinetic study and modeling on L-arginine fermentation, Chin. J. Biotech. 9 (1) 9-18 (1993)).

Жом маниоки (Manihot esculenta) используется для производства L-(+)-молочной кислоты штаммами Lactobacillus casei и Lactobacillus delbrueckii. (Rojan P.John, K.Madhavan Nampoothiri and Ashok Pandey, Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol 34, p 263-272 (2006); Rojan P.John, K.Madhavan Nampoothiri and Ashok Pandey, “Solid state fermentation for L-lactic acid production from agro wastes using Lactobacillus delbrueckii,” Process Biochemistry Vol 41, p 759-763 (2006). Он также используется в производстве гибберелловой кислоты (A. Tomasini I, C. Fajardo и J. Barrios-Gonza'lez, “Gibberellic acid production using different solid-state fermentation systems,” Vol 13.p203-206 (1997)) и лимонной кислоты путем одновременного сахарообразования и ферментации (SSF) (Flavera Camargo Prado, Luciana Porto de Souza Vanderberghe and Carlos Ricardo Soccol “Relation between Citric Acid Production by Solid-State Fermentation from Cassava Bagasse and Respiration of Aspergillus niger LPB Semi-Pilot Scale,” Brazilian archives of Biology and Technology, Vol.48, Special n.: pp. 29-36 (2005)). По недавнему сообщению Ubaid et al. жом маниоки используется для получения гамма-линолевой кислоты (Syed Ubaid et al., “Enrichment of γ-linolenic acid in the lipid extracted from Mucor zychae MTCC 5420”, Food Research International, Volume 42, issue 4, May 2009, Pages 449-453)).

Аналогичным образом, порошок семян джекфрута используется в производстве красителей

и в производстве полигидроксибутирата

К некоторым из недостатков существующего процесса ферментации аргинина относятся, например, отсутствие культур дикого типа, способных к производству аргинина, в отличие от глутамата, где штамм дикого типа С.glutamicum способен к производству в больших объемах. Кроме того, затруднения вызывает получение ауксотрофных мутантов, способных к производству аргинина, и существует необходимость в генной инженерии для улучшения подходящих для производства аргинина штаммов. Более того, себестоимость производства аргинина относительно высока в связи с использованием чистой глюкозы как единственного источника углерода. Таким образом, предпочтительны недорогие альтернативы для повышения количества выхода продукции с использованием имеющихся штаммов.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Дальнейшее описание подробно характеризует и устанавливает природу этого изобретения и то, каким образом оно должно быть выполнено. “Микробиологический синтез L-аргинина с использованием производственной среды, содержащей гидролизаты субстратов крахмалосодержащих сельскохозяйственных отходов, например порошок семян джекфрута или жом маниоки, в качестве основного источника углерода, которые ранее не были опробованы для производства таких аминокислот, как аргинин, с использованием Corynebacterium glutamicum”.

Характерным вариантом осуществления настоящего изобретения является использование гидролизатов из локально доступных агропромышленных отходов для замещения чистых сахаров для взращивания штаммов Corynebacterium glutamicum, способных к производству аминокислот. Дополнительным вариантом осуществления настоящего изобретения является развитие биологического процесса, пригодного для производства L-аргинина с использованием гидролизатов агропромышленных отходов в качестве основного источника углерода и ферментации источника углерода в присутствии Corynebacterium glutamicum. Еще одним дополнительным вариантом осуществления настоящего изобретения является очистка аргинина от ферментированной жидкости после ферментации.

В соответствии с характерным вариантом осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ получения аргинина посредством ферментации агропромышленных отходов, состоящий из: ферментации агропромышленных отходов в присутствии, по меньшей мере, одного из штаммов Corynebacterium glutamicum ATCC 21831 или Corynebacterium glutamicum ATCC 21493 до получения ферментированной жидкости, содержащей аргинин; и выделения аргинина из ферментированной жидкости.

В соответствии с другим характерным вариантом осуществления настоящего изобретения, предложен способ получения L-аргинина из крахмалосодержащих агропромышленных отходов, выбираемых из жома маниока, порошка семян джекфрута и их смесей, включающий: ферментативную гидролизацию агропромышленных отходов предпочтительно таких, что от 55 до 85%, предпочтительно от 60% до 75% и более предпочтительно от 65 до 68% субстрата агропромышленных отходов перерабатывается в восстанавливающие сахара; ферментацию восстанавливающих сахаров (предпочтительно, в качестве единственного источника углерода) в присутствии, по меньшей мере, одного из Corynebacterium glutamicum ATCC 21831 или Corynebacterium glutamicum ATCC 21493 до получения ферментированной жидкости, содержащей аргинин; и выделение аргинина из ферментированной жидкости.

Эти и другие характерные особенности и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из нижеследующего подробного описания.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Далее изложены следующие определения и общие положения, не имеющие ограничительного характера, которые должны быть рассмотрены при анализе изложенного описания настоящего изобретения. Используемые в настоящем документе заголовки (такие как «Уровень техники» и «Сущность изобретения») и подзаголовки (например, «Композиции», «Способы») предназначены только для общей организации тем в рамках раскрытия сущности изобретения и не предназначены для ограничения раскрытия сущности изобретения или любого его объекта. В частности, содержание, раскрытое в разделе «Уровень техники», может включать в себя технологические аспекты в рамках изобретения и не может представлять собой известный уровень техники. Содержание, изложенное в разделе «Сущность изобретения», не является исчерпывающим или полностью раскрывающим весь объем изобретения или любого его варианта осуществления. Классификация или пояснение материала в рамках раздела описания изобретения с целью конкретизации (например, уточнение компонента как «активного вещества» или «носителя») представлена для удобства, при этом не следует полагать, что материал должен обязательно или исключительно обладать функцией в соответствии с указанной здесь классификацией при использовании его в той или иной композиции.

Ссылки, приведенные в настоящем документе, не являются признанием их ссылками на уже известный уровень техники или того, что они имеют какое-либо отношение к патентоспособности изобретения, раскрытого в настоящем документе. Любое пояснение содержания ссылок, представленных в разделе «Введение», предназначено лишь для общего ознакомления с утверждениями авторов данных ссылок и не устанавливает точность содержания таких ссылок.

Описание и конкретные примеры, показывающие варианты осуществления изобретения, предусмотрены лишь с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения объема изобретения. Кроме того, перечисление нескольких вариантов осуществления изобретения с указанными характерными особенностями не предполагает исключение других вариантов осуществления изобретения, имеющих дополнительные отличительные признаки, или других вариантов осуществления изобретения, включающих различные комбинации указанных отличительных признаков. Конкретные примеры приведены для иллюстрирования того, как сделать и использовать композиции и способы в соответствии с настоящим изобретением, и, если не оговорено особо, не предполагается, что они несут в себе утверждение или отрицание того, что предложенные варианты осуществления настоящего изобретения были сделаны или апробированы.

Используемые здесь слова «предпочтительный» и «предпочтительно», относятся к вариантам осуществления изобретения, которые при определенных условиях предоставляют определенные преимущества. Однако другие варианты осуществления изобретения также могут быть предпочтительными при аналогичных или иных условиях. Кроме того, перечисление одного или более предпочтительных вариантов осуществления изобретения не означает, что другие варианты осуществления непригодны и не предполагает исключение других вариантов осуществления из объема изобретения. Вместе с тем, композиции и способы могут содержать, состоять по существу из или состоять из описанных в ней элементов.

Диапазоны, применяемые на протяжении всего документа, используются как подразумевающие описание каждого без исключения значения, находящегося в пределах диапазона. Любое значение в пределах диапазона может быть выбрано в качестве конечного диапазона. Кроме того, все приведенные ссылки, включены в настоящий документ во всей полноте посредством ссылки. В случае противоречия в определении, представленном в настоящем описании изобретения, и содержании приведенной ссылки, следует руководствоваться настоящим описанием.

Если не указано иное, все процентные содержания и количества вещества, выраженные здесь и в любом другом месте настоящего описания, следует относить к процентам, исчисляемым от веса. Данные количества вещества основаны на активном весе вещества. Перечисленные здесь конкретные значения, относящиеся к соответствующему количеству компонентов или других признаков различных вариантов осуществления изобретения, даны для обозначения этого значения плюс-минус степень изменчивости для учета ошибок в измерениях. Например, величина в 10% может включать 9,5% или 10,5% с учетом степени погрешности в измерениях, которые будут оценены и понятны специалисту в данной области.

Выражение «Агропромышленные отходы» означает любые отходы, полученные в результате переработки сельскохозяйственной продукции. Различные формы агропромышленных отходов, описанные, например, в PRODUCTS FROM WASTE (INDUSTRIAL AND AGRO WASTE), National institute of Industrial Research, (2003); Carcia-Reyes Refugio, et al., “Contribution of agro-waste material main components (hemicelluloses, and lignin) to the removal of chromium (III) from aqueous solution,” J. of Chem. Tech. & Biotech., Vol. 84, № 10, 1522-1538 (Okt.10, 2009). В ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТАХ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ, АГРОПРОМЫШЛЕННЫЕ ОТХОДЫ СОДЕРЖАТ ЖОМ, ЦЕЛЛЮЛОЗУ, ЛИГНИН, ГЕМИЦЕЛЛЮЛОЗУ, ПОРОШОК СЕМЯН, ЖОМ МАНИОКИ ИЛИ ПОРОШОК СЕМЯН ДЖЕКФРУТА.

Настоящее изобретение включает способ получения аргинина посредством ферментации агропромышленных отходов, состоящий из: ферментации агропромышленных отходов в присутствии, по меньшей мере, одного из Corynebacterium glutamicum ATCC 21831 или Corynebacterium glutamicum ATCC 21493, предпочтительно при температуре в пределах от 20°C до 50°С и значении pH в пределах от 5 до 8, на период времени от 12 часов до 2 недель до получения ферментированной жидкости, содержащей аргинин; и выделения аргинина из ферментированной жидкости.

Известно использование агропромышленных отходов в качестве основного источника углерода для различных выработок микробных метаболитов, таких как ферменты, органических кислот, таких как молочная кислота, пигментов. Не подразумевая связи с какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения считают, что биотехнологические способы получения аминокислот из такого дешевого сырья могут быть улучшены в дальнейшем для того, чтобы сделать их конкурентоспособными по отношению к способам химического получения. Например, авторами изобретения было выбрано два субстрата, принимая во внимание высокое содержание в них крахмала и свидетельство их успешного применения в различных биопроцессах - джекфрут и жом маниоки.

Джекфрут (Artocarpus heterophyllus) - один из наиболее популярных тропических фруктов, растущих в Азии. Наибольший из всех фруктов, произрастающих на деревьях, джекфрут содержит от 100 до 300 семян в одном фрукте. Семена составляют около 10-15% от общей массы фрукта и обладают высоким содержанием белков и углеводов (S. Kumar, A.B. Singh, A.B. Abidi, R.G. Upadhyay, A. Singh., “Proximate composition of jackfruit seeds”, J. Food Sci Technol. 25.141-152 (1988)).

Семена обычно выбрасывают или выпаривают и съедают как закуску или используют в некоторых местных блюдах. Семена сушат и толкут для получения порошка или муки из семян джекфрута. Сахара, полученные из муки после гидролиза крахмала, могут эффективно использоваться для ферментативного получения органических соединений. Крахмал семян джекфрута обладает узким диапазоном температур желатинизации и требует меньше энергозатрат для желатинизации по сравнению с модифицированными крахмалами, что, в конечном итоге, снижает стоимость гидролиза крахмала. Физико-химические свойства семян джекфрута приведены ниже в Таблице 1.

Таблица 1 Физико-химический состав семян джекфрута
Параметр	Вид Artocarpus heterophyllus Lam.
Влагосодержание	2,78
Зола	6,72
Неочищенные белки	20,19
Неочищенные жиры	11,39
Сырая клетчатка	7,10
Углеводы	51,82
Источник: Ibironke Adetolu Ajayi, “Comparative study of the chemical composition and mineral element content of Artocarpus heterophyllus and Treculia africana seeds and seed oils”. Bioresource Technology, Vol 99(11), 5125-5129 (2007).

Маниока (Manihot esculenta Cranz)- тропический корнеплод, который является третьим по значимости источником калорий в тропиках после риса и кукурузы. Маниока занимает четвертое место в мире среди основных продовольственных культур и потребляется более чем 800 миллионами человек (Elkholy H, Eltantawy A, “The world of cassava production: an overview”. Journal of Root Crops, 26: 1-5 (2000)). Промышленная обработка клубней маниоки осуществляется в основном для отделения муки и крахмала, генерируя больше жидких и твердых отходов (в процессе получения муки образуются твердые отходы, в то время как при получении крахмала образуется больше жидких отходов). Твердые отходы включают коричневую кожуру, внутреннюю сторону кожуры, непригодные корни, жом и мучные отходы, среди которых основной объем составляет жом. После обработки около 250-300 т. свежих клубней образуется около 280 т влажного жома маниоки. Жом маниоки образован волокнистым материалом корней и содержит крахмал, который не мог быть выделен в ходе физического способа обработки. Плохие условия обработки могут привести еще к более высокому содержанию крахмала в жоме маниоки. Физико-химический состав жома маниоки показан ниже в Таблице 2.

Таблица 2 Физико-химический состав жома маниоки
Состав	Soccol (1994)	Cereda (1994)	Sterz (1997)	Vandenberghe (1998)
Влагосодержание	5,02	9,52	10,70	11,20
Белки	1,57	0,32	1,60	1,61
Жиры	1,06	0,83	0,53	0,54
Клетчатка	50,55	14,88	22,20	21,10
Зола	1,10	0,66	1,50	1,44
Углеводы	40,50	63,85	63,40	63,00

Источник: Pandey A., Soccol C.R., Nigam P., Soccol V T, Vandenberghe LPS, Mohan R, “Biotechnology potential of agro-industrial residues, II: cassava bagasse”, Bioresourse Technology 74:81-87 (2000).

Аргинин, предпочтительно L-аргинин, может быть получен посредством ферментации агропромышленных отходов, таких как описано выше, по отдельности или в комбинации, в присутствии микроорганизмов для производства смеси, содержащей аргинин, а затем, необаятельно, отделением аргинина из смеси. Подходящие микроорганизмы включают варианты, выбранные из группы, состоящей из Brevibacterium lactofermentum ATCC 21798, Brevibacterium lactofermentum ATCC 21799, Brevibacterium lactofermentum ATCC 21800, Brevibacterium lactofermentum ATCC 21801, Brevibacterium lactofermentum ATCC 21086, Brevibacterium flavum ATCC 21475, Brevibacterium flavum ATCC 21127, Brevibacterium flavum ATCC 21128, Brevibacterium flavum ATCC 21.129, Brevibacterium flavum ATCC 21.474, Brevibacterium flavum ATCC 21493, Brevibacterium flavum ATCC 21406, Brevibacterium flavum ATCC 21605, Brevibacterium ammoniagenes ATCC 19355, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 21.476, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 21407, Corynebacterium glutamicum ATCC 21831, Corynebacterium glutamicum ATCC 13286, Corynebacterium glutamicum ATCC 21659, Corynebacterium glutamicum ATCC 21339, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 21491, или их смеси.

Предпочтительными микроорганизмами, используемыми в настоящем изобретении, являются мутантные штаммы Corynebacterium glutamicum, особенно мутантные штаммы, устойчивые к аналогам аргинина, обозначенные как Corynebacterium glutamicum ATCC 21831 (Патент США № 3849250, который включен в настоящем описании во всей полноте посредством ссылки) и Corynebacterium glutamicum ATCC 21493 (Brevibacterium flavum ATCC 21493) (Патент США № 5196326, включен в настоящем описании во всей полноте посредством ссылки) из Американской коллекции типовых культур. Предпочтительно, культуры содержатся в LBG среде (Бульон Луриа-Бертрани, дополненный глюкозой) и пересеиваются каждые две недели.

В настоящем изобретении предпочтительно, что культуральной средой является естественная среда, содержащая предпочтительное количество источников углерода, источников азота, неорганических солей и небольшие количества незначительных неорганических питательных веществ, необходимых для роста штаммов. Предпочтительные источники углерода в настоящем изобретении включают глюкозу или гидролизаты крахмала любого крахмалосодержащего материала, предпочтительно жома маниоки или порошка семян джекфрута, полученные их ферментативным гидролизом с использованием подходящих осахаривающих крахмал ферментов. Ферменты, осахаривающие крахмал, известны из уровня техники. Подходящие осахаривающие крахмал ферменты включают те, которые описаны, например, в Sasaki, et al., ”Screening of Microorganisms for Raw Starch Saccharifying Enzyme Production”, Agric. Biol. Chem., 50(6), 1661-1664 (1986), Achi, et al., “Production of raw starch, saccharifying amylase by Bacillus alvei grown on different agricultural substrates,” World J Microbiol. And Biotech., 8,206-207 (1991). Такие ферменты включают, например, амилазу, глюкоамилазу, пуллуланазу, Corticium rolfsii AHU 9627, и подобные. Процесс гидролиза может быть оптимизирован для каждого субстрата с помощью методов, известных в данной области техники, наряду с описанными здесь методическими рекомендациями. В предпочтительном варианте осуществления изобретения ферментация гидролизатов крахмала жома маниоки и/или порошка семян джекфрута обеспечивает больший выход, по сравнению с ферментацией чистых сахаров, таких как декстроза, при использовании тех же микроорганизмов.

В качестве источников азота могут быть использованы неорганические соли азота, такие как хлорид аммония и другие традиционные органические источники азота, такие как Nz-амин, гидролизат казеина, жидкий кукурузный экстракт и т.д. Предпочтительно, могут быть использованы неорганические соли, такие как моногидрофосфат калия, дигидрофосат калия, сульфат магния, сульфат железа, сульфат марганца, карбонат кальция, и т.д. Небольшое количество таких веществ, как биотин и тиамин, также может быть добавлено в среду во всех случаях, когда это требуется для видов штаммов, используемых в настоящем изобретении.

Культивирование предпочтительно осуществляют в аэробных условиях, созданных перемешиванием или встряхиванием. Например, культивирование клеток в лабораторных условиях может осуществляться аэробно в погруженных в воду 250 мл колбах Эрленмейера в ротационном шейкере с подходящим перемешиванием. Специалисты в данной области способны масштабировать данный процесс для получения аргинина в коммерческих масштабах. Температура инкубации может быть в пределах от 20°C до 50°C, более предпочтительно от 25°C до 40°C, еще более предпочтительно от 27°C до 36°C, и наиболее предпочтительно от 30°C до 32°C. Предпочтительно, чтобы значение рН ферментации находилось в пределах от 4 до 9, предпочтительно от 5 до 8, более предпочтительно от 5,5 до 7,5, еще более предпочтительно от 6 до 7, и наиболее предпочтительно, чтобы поддерживался нейтральный уровень рН. Незначительная (1-5 единиц) добавка бета-лактамных антибиотиков, таких как пенициллин, предпочтительна для повышения выхода аминокислот. Обычно, ферментация длится в течение от 12 часов до 2 недель, предпочтительно от 1 дня до 10 дней, и наиболее предпочтительно от 2 до 6 дней для того, чтобы накопить достаточное количество аргинина в зависимости от состояния культуры и начального уровня содержания сахара.

После ферментации аргинин, содержащийся в ферментированной жидкости, может быть отделен, например, удалением микробных клеток и любых других осадков с помощью стандартных методов, таких как применение ионообменной смолы или осаждение. Качественное определение аргинина накопленного в культуральной жидкости (ферментированной жидкости) может быть осуществлено с помощью тонкослойной хроматографии и количественного ВЭЖХ после дериватизации дансил-хлорида. Частичная очистка и восстановление аргинина могут быть стандартизированы с помощью сильнокислотной катионообменной смолы, такой как Amberlite.

Специалистам в данной области техники будет понятно, что описанными здесь способами можно также получить другие аминокислоты, такие как, например, глутаминовая кислота и другие основные L-аминокислоты или кислые L-аминокислоты, такие как лизин.

После описания настоящего изобретения в общем смысле более глубокое понимание может быть достигнуто посредством рассмотрения тех или иных конкретных примеров, которые приводятся здесь в иллюстративных целях.

КОНКРЕТНЫЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пример 1:

18-часовой инокулум штамма Corynebacterium glutamicum ATCC 831 инокулировали в ферментационную среду в композиции, содержащей гидролизат порошка семян джекфрута, эквивалентного 6% декстрозы, 0,05% K₂HOP₄, 0,05% KH₂PO₄, 3% (NH₄)₂SO₄, 0,025% MgSO₄·7H₂O, 0,001% FeSO₄·7H₂O, 0,001% MnSO₄·4 H₂O, 0,5% Nz-амина, 50 мкг/л биотина, 2 мг/л тиамина, 500 мкл жидкого кукурузного экстракта и 2% CaCO₃. Значение pH поддерживали нейтральным. В результате инкубации, проводимой в общей сложности 120 часов при 32°C при перемешивании, конечное содержание аргинина составляло 2,27 мг/мл. Количество аргинина, получаемого в течение 120-часового периода, определяли с интервалом в 24, 48, 72, 96 и 120 часов. Результаты показаны ниже в Таблице 3:

Таблица 3 Получение аргинина культурой C. glutamicum ATCC 21831 в гидролизате порошка семян джекфрута
Время (ч)	24	48	72	96	120
Концентрация аргинина (мг/мл)	1,05	2,05	2,10	2,15	2,27

Пример 2:

Для получения посевной культуры для ферментации мутантный штамм Corynebacterium glutamicum (ATCC 21831), продуцирующий L-аргинин, культивировали в среде, содержащей 0,5% декстрозу, 0,5% хлорида натрия, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,5% пептона, 0,2% ферментативного гидролизата казеина, при перемешивании в течение 18 часов. Ферментационную среду (25 мл) распределяли в 250 мл колбе Эрленмейера, засеивали посевную культуру и инкубировали при 32°c в ротационном шейкере. Ферментационная среда содержала гидролизат жома маниоки, эквивалентный 8% декстрозе, 0,05% K₂HOP₄, 0,05% KH₂P0₄, 3% (NH₄)₂S0₄, 0,025% MgS0₄·7H₂0, 0,001% FeS0₄·7 H₂0, 0,001% MnS0₄·4H₂0, 0,5% Nz-амина, 50 мкг/л биотина, 2 мг/л тиамина, 500 мкл жидкого экстракта кукурузы, 2% CaCO_3.Значение pH поддерживали нейтральным. В ходе инкубации в ферментативную среду добавляли лактамные антибиотики. Через 48 часов инкубации содержание L-аргинина, накопленного в ферментированной жидкости, составляло 1,63 мг/мл, что представляло собой максимальную концентрацию L-аргинина. Количество аргинина производимого в течение 120-часового периода определялось с интервалом в 24, 48, 72, 96 и 120 часов. Результаты представлены ниже в таблице 4:

Таблица 4 Получение аргинина культурой С. glutamicum ATCC 21831 в гидролизате жома маниоки
Время (ч)	24	48	72	96	120
Концентрация аргинина (мг/мл)	0,87	1,63	1,10	1,10	1,41

Пример 3:

Для производства L-аргинина посредством глубинной ферментации с использованием мутантного штамма Corynebacterium glutamicum, в частности, Corynebacterium glutamicum ATCC 21493, инокулят подготавливали при перемешивании при 30°С в течение 18 ч в среде, состоящей из 0,5% раствора декстрозы, 0,5% хлорида натрия, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,5% пептона, 0,2% ферментативного гидролизата казеина. 5% от инокулята, полученного таким образом, переносилось на 25 мл порции ферментационной среды. Вышеуказанная ферментационная среда представляет собой водную природную среду, содержащую гидролизат порошка семян джекфрута, эквивалентный 8% декстрозе, 0,05% K₂HOP₄, 0,05% KH₂P0₄, 3% (NH₄)₂S0₄, 0,025% MgS0₄·7H₂0, 0,001% FeS0₄·7 H₂0, 0,001% MnS0₄·4H₂0, 0,5% Nz-амина, 50 мкг/л биотина, 2 мг/л тиамина, 500 мкл жидкого экстракта кукурузы и 2% CaCO_3.

Ферментацию проводили при 32°C в течение 96 часов. В начальной стадии инкубации добавляли лактамные антибиотики. После 96 часов инкубации в ферментированной жидкости накапливалось максимум 1,93 мг/мл аргинина. Количество аргинина, производимого за период 120 часов, определяли с интервалом в 24, 48, 72, 72, 96 и 120 часов. Результаты показаны ниже в Таблице 5:

Таблица 5 Получение аргинина культурой C. glutamicum ATCC 21493 в гидролизате порошка семян джекфрута
Время (ч)	24	48	72	96	120
Концентрация аргинина (мг/мл)	0,15	0,65	1,49	1,93	1,72

Пример 4:

В нижеследующей Таблице 6 показано сравнение максимального производства L-аргинина, получаемого ферментацией с культурой C. Glutamicum ATCC 21831 в различных производственных средах в соответствии с определенными условиями, указанными для штаммов, и, как описано выше в Примерах 1 и 2. Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что производство аргинина отличалось более высокими показателями в среде, основанной на гидролизате, по сравнению со стандартной средой, где в качестве источника углерода использовалась чистая декстроза.

Таблица 6 Производство L-аргинина штаммом C. glutamicum ATCC 21831 в различных средах
Среда	Стандартная, (чистая декстроза)	Гидролизат жома маниоки	Гидролизат семян джекфрута
Концентрация аргинина (мг/мл)	0,45	1,63	2,27

Описанные здесь варианты осуществления изобретения обеспечивают уникальные преимущества для производства аргинина, а также неожиданно превосходный выход аргинина из недорогих агропромышленных отходов, по сравнению с выходом из чистого источника углерода, такого как декстроза. Преимуществом является использование или переработка агропромышленных отходов, таких как жом маниоки или семян джекфрута, которые в противном случае остались бы неиспользованными и/или выброшенными. Другим преимуществом является использование альтернативного способа для сокращения использования в целях ферментации дорогостоящих рафинированных сахаров, таких как декстроза. Еще одним преимуществом является относительно более высокий выход производимого аргинина в среде на основе гидролизата по сравнению с более дорогой средой с декстрозой.

Описанное выше изобретение содержит ссылки на иллюстративные примеры, при этом должно быть понятно, что изобретение не ограничивается описанными вариантами его осуществления. Изменения и модификации, которые могут быть решены специалистами в данной области техники после прочтения описания, также находятся в пределах объема изобретения, который определен в прилагаемой формуле изобретения.

Claims

1. Способ получения аргинина посредством ферментации агропромышленных отходов, включающий:
ферментацию агропромышленных отходов в присутствии, по меньшей мере, одного из Corynebacterium glutamicum ATCC 21831 или Corynebacterium glutamicum ATCC 21493 в аэробных условиях при pH от 5,5-7,5, при температуре 27-36°C в течение от 1 до 10 дней до получения ферментированной жидкости, содержащей аргинин; и
выделение аргинина из ферментированной жидкости, где агропромышленными отходами является источник углерода, полученный путем гидролиза крахмалосодержащих материалов с осахаривающим крахмал ферментом, где крахмалосодержащие материалы выбраны из жома, порошка семян, жома маниоки и/или порошка семян джекфрута.

2. Способ по п.1, где агропромышленные отходы включают в себя источник углерода, выбранный из группы, состоящей из жома маниоки, порошка семян джекфрута и их смеси.

3. Способ по п.1, где агропромышленные отходы являются источником углерода, полученного путем гидролиза крахмалосодержащих материалов с осахаривающим крахмал ферментом.

4. Способ по п.2, где источник углерода производится гидролизом, по меньшей мере, одного из жома маниоки, порошка семян джекфрута или их смеси, с осахаривающим крахмал ферментом.

5. Способ по п.1, где ферментация представляет собой аэробную ферментацию.

6. Способ по п.1, где ферментация проводится в диапазоне температур от 27°C до 36°C.

7. Способ по п.6, где температура составляет от 30°C до 32°C.

8. Способ по п.1, где ферментацию проводят при значении pH в пределах от 5,5 до 7,5.

9. Способ по п.8, где значение pH составляет от 6 до 7.

10. Способ по п.1, где ферментацию проводят за период времени от 1 дня до 10 дней.

11. Способ по п.10, где период времени составляет от 2 дней до 6 дней.

12. Способ по п.1, дополнительно включающий добавление лактамных антибиотиков в процессе ферментации.

13. Способ получения L-аргинина из крахмалосодержащих агропромышленных отходов, выбранных из жома маниоки, порошка семян джекфрута или их смеси, включающий:
ферментативный гидролиз агропромышленных отходов для преобразования отходов в восстанавливающие сахара;
ферментацию восстанавливающих сахаров в присутствии, по меньшей мере, одного из штаммов Corynebacterium glutamicum ATCC 21831 или Corynebacterium glutamicum ATCC 21493 в аэробных условиях при pH от 5,5-7,5, при температуре 27-36°C в течение от 1 до 10 дней до получения ферментированной жидкости, содержащей аргинин; и
выделение аргинина из ферментированной жидкости.

14. Способ по п.13, где ферментативный гидролиз агропромышленных отходов преобразует от 55 до 85% агропромышленных отходов в восстанавливающие сахара.

15. Способ по п.13, где ферментация проводится при температуре в диапазоне от 27°C до 36°C.

16. Способ по п.15, где температура составляет от 30°C до 32°C.

17. Способ по п.13, где ферментация проводится при значении pH в пределах от 5,5 до 7,5.

18. Способ по п.17, где значение pH составляет от 6 до 7.

19. Способ по п.13, где ферментация проводится за период времени от 1 дня до 10 дней.

20. Способ по п.13, дополнительно включающий добавление лактамных антибиотиков во время процесса ферментации.