BR112012021285B1

BR112012021285B1 - Processo para a produção de arginina empregando Corynebacterium glutamicum ATCC 21831 ou Corynebacterium glutamicum ATCC 21493 em um meio de fermentação que compreende bagaço de mandioca ou semente de jaca como uma fonte de carbono

Info

Publication number: BR112012021285B1
Application number: BR112012021285-0A
Authority: BR
Inventors: Ashok Pandey; Madhaven Nampoothiri; Ravi Subramanyam
Original assignee: Colgate-Palmolive Company; Council Of Scientific And Industrial Research
Priority date: 2010-02-25
Filing date: 2010-02-25
Publication date: 2019-03-06
Also published as: AU2010346674B2; TW201142032A; MX2012009816A; SG183136A1; CA2791006C; BR112012021285A8; CA2791006A1; WO2011106002A8; AU2010346674A1; CL2012002335A1; JP2013520196A; RU2012140764A; CN102947459A; TWI515297B; ZA201206021B; WO2011106002A1; EP2539457A1; JP5948254B2; AR109815A2; BR112012021285A2

Abstract

processo para a produção de arginina empregando corynebacterium glutamicum atcc 21831 ou corynebacterium glutamicum atcc 21493 em um meio de fermentação que compreende bagaço de mandioca ou semente de jaca como uma fonte de carbono. são divulgados processos para a produção de arginina através da fermentação em que os açúcares obtidos pela hidrólise enzimática de amido a partir de amido de baixo custo contendo agro-resíduos, tais como bagaço de mandioca e pó de semente de jaca, são fermentados na presença de microrganismos para produzir uma substância líquida fermentada contendo arginina, e recuperação da arginina a partir da substância líquida. o processo pode economicamente ser ampliado para a produção de arginina de fontes de açúcar não refinado tal como a arginina produzida com rendimentos mais elevados, quando em comparação com fontes mais dispendiosas de carbono sintético, como a dextrose ou a sacarose.

Description

PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE ARGININA EMPREGANDO CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM ATCC 21831 OU CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM ATCC 21493 EM UM MEIO DE FERMENTAÇÃO QUE COMPREENDE BAGAÇO DE MANDIOCA OU SEMENTE DE JACA COMO UMA FONTE DE CARBONO

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [001] A presente invenção refere-se a um bioprocesso para a produção de L-arginina através da fermentação. As formas de realização incluem açúcares redutores obtidos pela hidrólise enzimática de amido a partir do amido de baixo custo contendo agro-resíduos, tal como o bagaço de mandioca e pó de semente de jaca, ambos dos quais são abundantes em países da Ásia e África. O processo pode ser economicamente ampliado para a produção de arginina a partir de fontes de açúcar não refinado mediante a substituição de fontes dispendiosas de carbono sintético como dextrose ou sacarose.

[002] A crescente demanda do mercado com relação aos aminoácidos fez com que acadêmicos e industrialistas desenvolvessem novos métodos para produzir aminoácidos de forma eficiente e rentável. Esta corrida tecnológica facilitou a fabricação de aminoácidos principalmente por quatro métodos — extração de hidrolisados de proteína, síntese química, hidrólise enzimática e fermentação. Do ponto de vista econômico, a fermentação é observada ser industrialmente viável e é amplamente utilizada, exceto em alguns casos em que o rendimento de alta produção não foi alcançado. A economia deste método depende principalmente do custo da fonte de carbono, do rendimento de fermentação, do

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2/22 rendimento de purificação e produtividade do processo global. O crescimento em valor de mercado dos aminoácidos produzidos por bactérias corineformes levou a desenvolvimentos significativos em bioprocessos e tecnologia de processamento a jusante. Isto levou aos esforços para aumentar a produtividade e diminuir os custos de produção. (Thomas Hermann, Industrial production of amino acids by coryneform bacteria, Journal of Biotechnology 104 155- 172 (2003)). Portanto, qualquer processo natural que tenha um impacto sobre o rendimento de L-arginina está em demanda para utilização na prática industrial.

[003] A L-Arginina é um aminoácido condicionalmente essencial, assim chamado dependendo do estágio de desenvolvimento e do estado de saúde do indivíduo. A arginina estimula o sistema imune através do aumento da produção de células T, ajuda na vasodilatação, na manutenção da saúde muscular, na remoção de amônia do corpo e na libertação de hormônios. A L-Arginina foi fabricada convencionalmente por três métodos: (i) extrações a partir de hidrolisados de proteína; (ii) síntese química; e (iii) hidrólise enzimática (Takishi Utagawa, Production of Arginine by fermentation, J. Nutr. 134:2854S-2857S (2004)). Mais tarde foi descoberto que a L-Arginina pode ser produzida em pequenas quantidades por cepas silvestres assimiladoras de hidrocarboneto de Corynebacterium e Brevibacterium (Patentes US n^os 3.222.258 e 3.440.141) e suas cepas mutantes produziram em quantidades ainda maiores de carboidratos (Patente Britânica No. 1.278.917).

[004] Entre os mutantes reguladores de vários

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3/22 microrganismos, a Corynebacterium glutamicum apresentou maior produção de L-arginina (Hajime Yoshida, Kazumi Araki and Kiyoshi Nakayama, Arginine Production by Arginine Analog-resistant Mutants of Microorganisms, Agric. Biol. Chem., 45 (4), 959-963 (1981)). Alguns dos mutantes de produção de arginina mais típicos são do gênero Corynebacterium resistente à 2-tiazolalanina (Patente US n^o3.723.249 e Patente US n°3.878.044) e canavanina (Patente US n°3.849.250; Patente do Reino Unido No. 1.351.518). Os mutantes do gênero Bacillus (Patente US n°3.734.829, Patente US n°4.086.137 e Patente US n^o 4.430.430) e Escherichia (Patente US n°4.430.430, Patente US n°6.897.048) também são observados produzir arginina em quantidades substanciais.

[005] A produção de L-arginina em uma quantidade satisfatória através da fermentação microbiana foi em primeiro lugar relatada por Kisumi et al, 'Production of LArginine by Arginine Hydroxamate-Resistant Mutants of Bacillus subtilis, Appl. Microbiol. 22, 987 (1971). O suprimento de oxigênio é conhecido por ter uma influência importante sobre a produção de aminoácidos aeróbicos por microrganismos (Takishi Utagawa, Production of Arginine by fermentation, J. Nutr. 134:2854S-2857S (2004)). O crescimento sob condições anaeróbicas muitas vezes leva à formação de subprodutos tóxicos tais como ácido acético e etanol, que por sua vez fortemente inibem a produção de Larginina (J. Gong, J. Ding, H. Huang, Q. Chen, Kinetic study and modeling on L-arginine fermentation, Chin. J. Biotech. 9 (1) 9-18 (1993)).

[006] O bagaço de mandioca (Manihot esculenta) tem

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4/22 sido utilizado para a produção de L- ( + )-ácido láctico por Lactobacillus casei e Lactobacillus delbrueckii (Rojan P. John, K. Madhavan Nampoothiri and Ashok Pandey, Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol 34, p 263-272 (2006); Rojan P. John, K. Madhavan Nampoothiri and Ashok Pandey, Solid state fermentation for L-lactic acid production from agro wastes using Lactobacillus delbrueckii, „ Process Biochemistry,V01.41 p: 759-763 (2006) . Foi também utilizado na produção de ácido giberélico (A. Tomasini 1, C. Fajardo and J. Barrios-Gonza'lez, Gibberellic acid production using different solid-state fermentation systems, Vol 13.p203-206 (1997)) e ácido cítrico por SSF (Flavera Camargo Prado, Luciana Porto de Souza Vandenberghe and Carlos Ricardo Soccol, Relation between Citric Acid Production by Solid-State Fermentation from Cassava Bagasse and Respiration of Aspergillus niger LPB Semi-Pilot Scale, Brazilian archives of Biology and Technology, Vol. 48, Special n. : pp. 29-36 (2005)). Recentemente, Ubaid et al relataram o uso para a produção de ácido gama linolênico (Syed Ubaid et al., Enrichment of y-linolenic acid in the lipd extracted from Mucor zychae MTCC5420, Food Research International, Volume 42, issue 4, May 2009, Pages 449453) .

[007] Similarmente, o pó das sementes de jaca tem sido usado na produção de pigmentos (Sumathy Babitha, Carlos R. Soccol and Ashok Pandey, Jackfruit Seed — A Novel Substrate for the Production of Monascus Pigments through Solid-State Fermentation, Food Technol. Biotechnol, 44 (4) 465-471 (2006)) e na produção de polihidroxibutirato

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5/22 (Ramadas NV, Soccol CR, Pandey A Appl Biochem Biotechnol, A Statistical Approach for Optimization of Polyhydroxybutyrate Production by Bacillus sphaericus NCIM 5149 under Submerged Fermentation Using Central Composite Design, Appl.Biochem.Biotechnol. (2009)).

[008] Algumas das desvantagens do processo de fermentação existente de arginina incluem, por exemplo, a falta de culturas do tipo silvestre capazes de produção de arginina ao contrário do caso de glutamato, onde a C. glutamicum silvestre é capaz de produzir grandes quantidades. Também tem sido difícil produzir mutantes auxotróficos aptos para a produção de arginina, e existe uma necessidade com relação à engenharia genética para a melhora de cepa adequada para a produção de arginina. Além disso, os custos de produção da produção de arginina são relativamente altos devido ao uso de glicose pura como a única fonte de carbono. Em consequência, alternativas de baixo custo para aumentar o rendimento utilizando as cepas disponíveis são desejáveis.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [009] O seguinte relatório descritivo particularmente descreve e verifica a natureza desta invenção e a maneira em que ela deve ser executada. A produção microbiana de L-arginina usando um meio de produção contendo os hidrolisados de substratos agro-residuais, que são amiláceos por natureza como o pó de semente de jaca ou o bagaço de mandioca, como a fonte de carbono principal que não foram experimentados anteriormente para a produção de aminoácidos como arginina usando Corynebacterium

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6/22 glutamicum.

[0010] É um aspecto de uma forma de realização da presente invenção fazer uso de hidrolisados produzidos de materiais agro-residuais localmente disponíveis para substituir açúcares puros para desenvolver cepas de Corynebacterium glutamicum capazes de produzir aminoácido. É um aspecto adicional de uma forma de realização da presente invenção desenvolver um bio processo adequado para a produção de L-arginina usando os hidrolisados de materiais agro-residuais como a principal fonte de carbono e fermentação da fonte de carbono na presença de Corynebacterium glutamicum. É um aspecto adicional de uma forma de realização da invenção purificar a arginina a partir da substância líquida de fermentação após a fermentação.

[0011] Em conformidade com um aspecto de uma forma de realização, é fornecido um método de produção de arginina mediante a fermentação de agro-resíduos compreendendo submeter os agro-resíduos à fermentação na presença de pelo menos um dentre Corynebacterium glutamicum ATCC 21831 ou Corynebacterium glutamicum ATCC 21493 para produzir uma substância líquida fermentada contendo arginina, e recuperação da arginina a partir da substância líquida fermentada.

[0012] De acordo com outro aspecto de uma forma de realização, é fornecido um método de produzir L-arginina a partir de materiais agro-residuais contendo amido, selecionados de bagaço de mandioca, pó de semente de jaca, e suas misturas, compreendendo a hidrólise enzimática dos materiais agro-residuais preferivelmente de tal modo que a

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7/22 partir de 55 a 85%, de preferência de 60% a 75%, e ainda mais preferivelmente de 65 a 68% do substrato agro-residual é convertido em açúcares redutores; a fermentação dos açúcares redutores (de preferência como a única fonte de carbono) na presença de pelo menos um de Corynebacterium glutamicum ATCC 21831 ou Corynebacterium glutamicum ATCC 21493 para produzir uma substância líquida fermentada contendo arginina, e a recuperação da arginina a partir da substância líquida fermentada.

[0013] Estes e outros aspectos e vantagens da presente invenção serão facilmente evidentes a partir da Descrição Detalhada que se segue.

DESCRIÇÃO DETALHADA [0014] As seguintes definições e normas de procedimento não limitativas devem ser consideradas na revisão da descrição desta invenção aqui apresentada. Os títulos (tais como Fundamentos e Sumário) e subtítulos

(tais como Composições e Métodos) aqui usados	destinam-
se apenas	à	organização	geral	dos tópicos	dentro	da
divulgação	da	invenção,	e não se destinam a	limitar	a
divulgação	da	invenção ou	qualquer	um dos seus aspectos.	Em

particular, o assunto divulgado nos Fundamentos pode incluir os aspectos da tecnologia dentro do escopo da invenção, e não pode constituir uma recitação da técnica anterior. O assunto divulgado no Sumário não é uma divulgação exaustiva ou completa de todo o escopo da invenção, ou de qualquer uma de suas formas de realização. A classificação ou debate de um material dentro de uma seção deste relatório descritivo como tendo uma utilidade

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8/22 particular (por exemplo, como sendo um ingrediente ativo ou portador) é feita por conveniência, e nenhuma inferência deve ser estabelecida em que o material deve necessária ou exclusivamente funcionar em conformidade com a sua classificação inclusa quando ele for utilizado em qualquer composição dada.

[0015] A citação aqui de referências não constitui uma admissão de que essas referências são da técnica anterior ou possuem qualquer relevância para a capacidade de obter patente da invenção aqui divulgada. Qualquer debate do conteúdo de referências citadas na introdução destina-se apenas para fornecer um resumo geral das afirmações feitas pelos autores das referências, e não constitui uma admissão quanto à exatidão do conteúdo de tais referências.

[0016] A descrição e exemplos específicos, embora indicando as formas de realização da invenção, se destinam apenas aos propósitos de ilustração e não se destinam a limitar o escopo da invenção. Além disso, a recitação de múltiplas formas de realização tendo os aspectos mencionados não se destina a excluir outras formas de realização tendo aspectos adicionais, ou outras formas de realização que incorporam diferentes combinações dos aspectos mencionados. Os Exemplos Específicos são fornecidos para fins ilustrativos de como produzir e usar as composições e métodos desta invenção e, a não ser que expressamente mencionado de outra maneira, não se destinam a ser uma representação de que as formas de realização fornecidas da presente invenção foram ou não foram produzidas ou testadas.

[0017] Como aqui usado, as palavras preferidas e

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9/22 preferivelmente referem-se às formas de realização da invenção que proporcionam certos benefícios, sob certas circunstâncias. No entanto, outras formas de realização também podem ser preferidas, sob as mesmas ou outras circunstâncias. Além disso, a recitação de uma ou mais formas de realização preferidas não implica que outras formas de realização não são úteis, e não se destina a excluir outras formas de realização do escopo da invenção. Além disso, as composições e os métodos podem compreender, consistir essencialmente em, ou consistir nos elementos aqui descritos.

[0018] Como utilizado em todas as partes, as faixas são utilizadas como uma forma abreviada para descrever cada um e todos os valores que estão dentro da faixa. Qualquer valor dentro da faixa pode ser selecionado como o término da faixa. Além disso, todas as referências aqui citadas são por meio desta incorporadas por referência em suas totalidades. No caso de conflito em uma definição na presente divulgação e aquela de uma referência citada, a presente divulgação regula.

[0019] A não ser que de outra maneira especificada, todas as porcentagens e quantidades aqui expressas e em outro lugar no relatório descritivo devem ser compreendidas de se referir às porcentagens em peso. As quantidades fornecidas se baseiam no peso ativo do material. A recitação de um valor específico neste documento quer referindo-se às respectivas quantidades dos componentes, quer outros aspectos das formas de realização, destina-se a indicar que o valor, mais ou menos um grau de variabilidade, é responsável por erros nas

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10/22 medições. Por exemplo, uma quantidade de 10% pode incluir 9,5% ou 10,5%, supondo que o grau de erro na medição será observado e compreendido por aqueles tendo habilidade usual na técnica.

[0020] A expressão agro-residuos significa qualquer resíduo resultante do processamento de produtos agrícolas. Várias formas de agro-residuos são descritas, por exemplo, PRODUCTS FROM WASTE (INDUSTRIAL AND AGRO WASTE), National Institute of Industrial Research, (2003); GarciaReyes Refugio, et al., Contribution of agro-waste material main components (hemicelluloses, cellulose, and lignin) to the removal of chromium (III) from aqueous solution, J. of Chem. Tech. & Biotech., Vol. 84, No. 10, 1522-1538 (Oct. 10, 2009). Nas formas de realização preferidas, os agro-residuos incluem bagaço, celulose, lignina, hemicelulose, pó de sementes, bagaço de mandioca, ou pó das sementes de jaca.

[0021] A presente invenção inclui um método de produção de arginina mediante a fermentação de agro-residuos compreendendo submeter o agro-resíduo à fermentação na presença de pelo menos um de Corynebacterium glutamicum ATCC 21831 ou Corynebacterium glutamicum ATCC 21493, de preferência em uma temperatura dentro da faixa de 20°C a 50 °C e um pH dentro da faixa de 5 a 8, durante um período de 12 horas a 2 semanas, para produzir uma substância líquida fermentada contendo arginina, e recuperação da arginina da substância líquida fermentada.

[0022] A utilização de materiais de agro-residuos como a fonte de carbono principal para várias produções metabólicas microbianas tais como enzimas, ácidos orgânicos

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11/22 como o ácido láctico, pigmentos foram relatados. Embora não pretendendo ser limitado por qualquer teoria, os presentes inventores acreditam que os processos biotecnológicos para a produção de aminoácidos a partir de tais matérias-primas de pouco valor podem ser melhorados ainda mais para tornálos competitivos com os processos quimicamente derivados. Por exemplo, dois substratos foram selecionados pelos inventores, levando-se em conta o seu elevado teor de amido e uso anterior bem-sucedido em vários bioprocessos - bagaço de jaca e mandioca.

[0023] A Jaca (Artocarpus heterophyllus) é uma das frutas tropicais mais populares cultivadas na Ásia. A maior de todas as frutas produzidas em árvores, a jaca contém de 100 a 300 sementes em uma única fruta. As sementes representam cerca de 10 a 15% da massa total da fruta e possuem altos teores de carboidrato e proteína (S. Kumar, A R. Singh, A R. Abidi, R.G. Upadhyay, A. Singh„ Proximate composition of jackfruit seeds, J. Food Sci. Technol. 25 141-152 (1988)).

[0024] As sementes normalmente são descartadas ou cozidas no vapor e consumidas como um lanche ou utilizadas em alguns pratos locais. As sementes são secas e transformadas em pó para obter o pó ou farinha de sementes de jaca. Os açúcares obtidos a partir da farinha após a hidrólise do amido podem ser eficazmente utilizados na produção fermentativa de compostos orgânicos. O amido da semente de jaca teve uma faixa de temperatura de gelatinização mais estreita e exigiu menos energia de gelatinização em comparação com os amidos modificados que

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12/22 por sua vez reduzem o custo da hidrólise de amido. As propriedades físico-químicas das sementes de jaca estão descritas na Tabela 1 abaixo.

Tabela 1: Composição físico-química da semente de jaca

Parâmetro	Espécie Artocarpus heterophyllus Lam.
Umidade	2,78
Cinza	6,72
Proteína Bruta	20,19
Gordura Bruta	11,39
Fibra Bruta	7,10
Carboidrato	51 , 82

Fonte: Ibironke Adetolu Ajayi, Comparative study of the chemical composition and mineral element content of Artocarpus heterophyllus and Treculia fricana seeds and seed Oils, Bioresource Technology, Vol 99 (1 1) , 5125-5129 (2007).

[0025] A mandioca (Manihot esculenta Cranz), cultura de raiz tropical, é a terceira fonte mais importante de calorias nos trópicos, arroz e milho. A mandioca ocupa o quarto lugar entre as principais culturas alimentares no mundo e é consumida por mais de 800 milhões de pessoas [Elkholy H, Eltantawy A, The world of cassava production: an overview, Journal of Root Crops, 26: 1-5 (2000)). O processamento industrial de tubérculos de mandioca é principalmente executado para isolar a farinha e o amido, que gera resíduos mais líquidos e negociados (o processamento para a farinha gera resíduos sólidos, enquanto que para o amido gera resíduos mais líquidos). Os resíduos sólidos incluem a casca marrom, casca interna, raízes

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13/22 inutilizáveis, bagaço e refugo de farinha, entre os quais o bagaço é o principal resíduo. 0 processamento ao redor de 250 a 300 t de tubérculos frescos resulta em cerca de 280 t de bagaço de mandioca úmido. 0 bagaço de mandioca é composto de material de raiz fibroso e contém amido em que o processo fisicamente não pode ser executado. Fracas condições de processamento podem resultar em concentrações ainda mais elevadas de amido no bagaço de mandioca. A composição físico-química do bagaço de mandioca é mostrada na Tabela 2 abaixo.

Tabela 2: Composição físico-química do bagaço de mandioca

Composição

Socco .1994Ϊ Oereda 11994) Sterzíl???) Varrienberghe í199b· I

Umidade	5,02	9,52	10,70	11,20
Proteína		0,32	1,60	1,61
Lipídeos		0,83	0,53	0,54
Fibras	50,55	14,88	22,20	21,10
Cinza	1,10	0,66	1,50
Carboidrato	40,50	63,85	63,40	63,00
Fonte:	Pandey A,	Soccol	C . R. , Nigam	P. ,

Soccol V T,

Vandenberghe LPS,

Mohan R, Biotechnology potential of agro-industrial residues, II: cassava bagasse, [0026]

A arginina, de preferência L-arginina, pode ser produzida através da fermentação de agro-resíduos tais como aqueles descritos acima, isoladamente ou em combinação, na presença de microrganismos para produzir uma mistura contendo Arginina, e depois opcionalmente separar a arginina

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14/22 da mistura. Os micro-organismos adequados incluem aqueles selecionados do grupo consistindo de Brevibacterium lactofermentum ATCC 21798, Brevibacterium lactofermentum

ATCC 21799, Brevibacterium lactofermentum ATCC 21800,

Brevibacterium lactofermentum

ATCC 21801, Brevibacterium lactofermentum ATCC

21086,

Brevibacterium flavum ATCC

21475, Brevibacterium flavum

ATCC 21127, Brevibacterium flavum ATCC 21 128,

Brevibacterium flavum ATCC

21129,

Brevibacterium flavum

ATCC 21474, Brevibacterium flavum

ATCC

21493,

Brevibacterium flavum

ATCC

21406,

Brevibacterium flavum ATCC

21605,

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 19355, Corynebacterium acetoacidophilum

ATCC 21476, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 21407,

Corynebacterium glutamicum ATCC 21831,

Corynebacterium glutamicum ATCC 13286, Corynebacterium glutamicum ATCC

21659,

Corynebacterium glutamicum

ATCC

21339,

Corynebacterium acetoglutamicum ATCC

21491, e suas misturas.

[0027]

Os micro-organismos preferidos para uso na presente invenção são as cepas mutantes de

Corynebacterium glutamicum, particularmente mutantes resistentes análogos a arginina, designados como

Corynebacterium glutamicum

ATCC 21831 (Patente US no

3.849.250, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade) e Corynebacterium glutamicum ATCC 21493 (Brevibacterium flavum ATCC 21493) (Patente US no. 196.326, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade) da American Type Culture Collection. As culturas de preferência são mantidas em meio de LBG (caldo Luria

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Bertani suplementado com glicose) e são subcultivadas a cada duas semanas.

[0028] É preferível na presente invenção que o meio de cultura empregado seja um meio natural compreendido de quantidades preferidas de fontes de carbono, fontes de nitrogênio, sais inorgânicos e pequenas quantidades de nutrientes inorgânicos secundários necessários para o crescimento das cepas utilizadas. As fontes de carbono preferidas na presente invenção incluem glicose ou hidrolisados de amido de qualquer material contendo amido, de preferência bagaço de mandioca ou pó de semente de jaca, obtido por sua hidrólise enzimática usando enzimas de sacarificação de amido adequadas. As enzimas de sacarificação de amido são conhecidas na técnica. As enzimas de sacarificação de amido adequadas incluem aquelas descritas em, por exemplo, Sasaki, et al., Screening of Microorganisms for Raw Starch Saccharifying Enzyme Production, Agric. Biol. Chem., 50(6), 1661-1664 (1986), Achi, et al., Production of a raw starch saccharifying amylsase by Bacillus alvei grown on different agricultural substrates, World J. Microbiol. And Biotech., 8, 206-207 (1991), estes incluem, por exemplo, amilases, glicoamilases, pululanases, Corticium rolfsii AHU 9627, e outros mais. O processo de hidrólise pode ser otimizado para cada substrato usando as técnicas conhecidas no ofício, juntamente com as normas aqui fornecidas. Em uma forma de realização preferida, a fermentação de hidrolisados de amido de bagaço de mandioca e/ou pó de semente de jaca fornece um maior rendimento do que a fermentação de açúcares puros tais como

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16/22 dextrose, usando os mesmos microrganismos de fermentação.

[0029] Como fontes de nitrogênio, os sais de nitrogênio inorgânicos como cloreto de amônio e outras fontes convencionais de nitrogênio orgânico como Nz amina, hidrolisado de caseína, substância líquida da maceração de milho, etc., podem ser usados. Os sais inorgânicos de monohidrogênio fosfato de potássio, dihidrogênio de potássio, sulfato de magnésio, sulfato ferroso, sulfato manganoso, carbonato de cálcio, etc., podem ser preferivelmente utilizados. Quantidades vestigiais de várias substâncias como a biotina adicionadas ao meio sempre invenção exigirem o acima.

[0030] 0 cultivo de condições aeróbicas criadas e tiamina também podem ser que as cepas utilizadas na preferência é realizado nas pela estimulação ou agitação.

Por exemplo, o cultivo das células em uma escala de laboratório pode ser realizado efetuado de forma aeróbica em frascos Erlenmeyer de 250 ml sob condições submersas em um agitador rotativo com agitação apropriada. Aqueles versados na técnica serão capazes de dimensionar o processo para produzir quantidades comerciais de arginina. A temperatura para a incubação pode estar dentro de 20°C a 50°C, mais preferivelmente de 25°C a 40°C, ainda mais preferivelmente de 27°C a 36°C, e o mais preferível de 30°C a 32°C. É preferível que o pH da fermentação esteja dentro da faixa de 4 a 9, de preferência de 5 a 8, mais preferivelmente de 5,5 a 7,5, ainda mais preferivelmente de 6 a 7, e o mais preferível o pH é mantido próximo da neutralidade. A suplementação em nível baixo (1 a 5 unidades)

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17/22 de antibiótico beta-lactama como a penicilina também é preferível para aumentar o efluxo de aminoácido. Geralmente, a fermentação dura um período de 12 horas a 2 semanas, de preferência de 1 dia a 10 dias, e o mais preferível de 2 a 6 dias para acumular quantidades suficientes de arginina, dependendo da condição de cultura e do nível de açúcar inicial.

[0031] Após a fermentação, a arginina presente na substância líquida de fermentação pode ser separada, por exemplo, mediante a remoção das células microbianas e quaisquer outros precipitados por métodos convencionais tais como um tratamento de resina de troca iônica, ou precipitação. A determinação qualitativa de arginina acumulada no caldo de cultura (substância líquida de fermentação) pode ser executada por TLC e a quantificação por HPLC após a derivatização de cloreto de dansila. A purificação e recuperação parciais de arginina podem ser padronizadas com resina de troca catiônica fortemente acídica tal como Amberlite.

[0032] As pessoas com habilidade usual na técnica irão observar que os processos aqui descritos também podem produzir aminoácidos adicionais, tais como, por exemplo, ácido glutâmico, e outros L-aminoácidos básicos ou Laminoácidos acídicos tais como lisina.

[0033] Tendo descrito de uma forma geral esta invenção, uma compreensão adicional pode ser obtida por referência a certos exemplos específicos que são aqui fornecidos para fins de ilustração.

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18/22

FORMAS DE REALIZAÇÃO ESPECÍFICAS DA INVENÇÃO

Exemplo 1:

[0034] Um material usado na inoculação de

Corynebacterium glutamicum ATCC 21831 de 18 horas foi inoculado em um meio de fermentação com uma composição contendo hidrolisado de pó de semente de jaca equivalente para dextrose a 6%, K2HOP4 a 0,05%, KH2PO4 0,05%, (NH4)2SO4 a 3%, MgSO4.7 H2O a 0,025%, FeSO4.7 H20 a 0,001%, MgSO4.4 H2O a 0,001%, NZ-amina a 0,5%, 50 pg/l de Biotina, 2 mg/l de tiamina, 500 pl de substância líquida da maceração de milho e CaCO3 a 2%. O pH foi mantido neutro. A incubação foi realizada durante um total de 120 horas a 32°C com agitação, resultando em um acúmulo de arginina final de 2,27 mg/ml. A quantidade de arginina produzida ao longo do período de 120 horas foi determinada em intervalos de 24, 48, 72, 96 e 120 horas. Os resultados são mostrados na Tabela 3 abaixo:

Tabela 3. - Produção de arginina por C. glutamicum ATCC

21831 em hidrolisado de semente de jaca

Tempo (horas)	24	48	72	96	120
Concentração de Arginina (mg/ml)	1,05	2,05	2,10	2,15	2,27

Exemplo 2:

[0035] Uma cepa mutante de produção de L-Arginina de Corynebacterium glutamicum (ATCC 21831) foi cultivada em um meio composto de dextrose a 0,5%, cloreto de sódio a 0,5%, extrato de levedura a 0,5%, peptona a 0,5%, hidrolisado de enzima caseína a 0,2% com agitação durante 18 horas para se obter a cultura de semente para a fermentação. O meio de fermentação (25 ml) foi dispensado

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19/22 em um frasco Erlenmeyer de 250 ml, inoculado com 5% da cultura de semente e incubado a 32°C em um agitador rotativo. O meio de fermentação foi composto de hidrolisado de bagaço de mandioca equivalente a dextrose a 8%, K2HOP4 a 0,05%, KH2PO4 0,05%, (NH4)2SO4 a 3%, MgSO4.7 H2O a 0,025%, FeSO4.7 H20 a 0,001%, MgSO4.4 H2O a 0,001%, NZ-amina a 0,5%, 50 pg/l de Biotina, 2 mg/l de tiamina, 500 pl de substância líquida da maceração de milho e CaCO3 a 2%. O pH foi mantido neutro. Durante o curso da incubação um antibiótico de lactama foi suplementado no meio de fermentação. Após 48 horas de incubação, a quantidade de L-arginina que foi acumulada na substancia líquida de fermentação foi de 1,63 mg/ml, que representou a concentração máxima de L-arginina. A quantidade de arginina produzida ao longo do período de 120 horas foi determinada em intervalos de 24, 48, 72, 96 e 120 horas. Os resultados são mostrados na Tabela 4 abaixo:

Tabela 4. Produção de Arginina por C. glutamicum ATCC

21831 em hidrolisado de bagaço de mandioca

Tempo (horas)	24	48	72	96	120
Concentração de Arginina (mg/ml)	0,87	1,63	1,10	1,10	1,41

Exemplo 3:

[0036] Para a produção de L-arginina mediante a fermentação submersa utilizando uma cepa mutante de Corynebacterium glutamicum, especificamente Corynebacterium glutamicum ATCC 21493, o material usado na inoculação foi preparado por agitação a 3 0°C durante 18 horas em um meio composto de dextrose a 0,5%, cloreto de sódio a 0,5%, extrato de levedura a 0,5%, peptona a 0,5%, hidrolisado de enzima

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20/22 caseína a 0,2%. 5% do material usado na inoculação assim obtido é transferido para bateladas de 25 ml do meio de fermentação. O meio de fermentação acima referido é um meio aquoso natural composto de hidrolisado em pó de semente de jaca equivalente a dextrose a 6%, K2HOP4 a 0,05%, KH2PO4 0,05%, (NH4)2SO4 a 3%, MgSO4.7 H2O a 0,025%, FeSO4.7 H20 a 0,001%, MgSO4.4 H2O a 0,001%, NZ-amina a 0,5%, 50 pg/l de Biotina, 2 mg/l de tiamina, 500 pl de substância líquida da maceração de milho e CaCO3 a 2%.

[0037] A fermentação foi realizada a 32°C durante 96 horas. Um antibiótico de lactama foi suplementado nos estágios iniciais de incubação. Após a incubação durante 96 horas, um máximo de 1,93 mg/ml de L-arginina foi acumulado na substância líquida de fermentação. A quantidade de arginina produzida ao longo do período de 120 horas foi determinada em intervalos de 24, 48, 72, 96 e 120 horas. Os resultados são mostrados na Tabela 5 abaixo:

Tabela 5. - Produção de Arginina por C. glutamicum ATCC

21493 em hidrolisado de semente de jaca

Tempo (horas)	24	48	72	96	120
Concentração de Arginina (mg/ml)	0,15	0,65		1,93	1,72

Exemplo 4:

[0038] A Tabela 6 abaixo mostra uma comparação da produção máxima de L-arginina produzido pela fermentação com C. glutamicum ATCC 21831 em diferentes meios de produção sob as condições definidas mencionados para a cepa, e como descrito acima nos Exemplos 1 e 2. Os inventores

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21/22 surpreendentemente descobriram que a produção de arginina foi maior em meio à base de hidrolisado, em comparação com o meio normal, onde a dextrose pura é usada como fonte de carbono.

Tabela 6. - Produção de L-Arginina por C. glutamicum

ATCC 21831 em diferentes meios.

Meios	Normal (dextrose pura)	Hidrolisado de Bagaço de mandioca	Hidrolisado semente de jaca
Concentração de Arginina (mg/ml)	0,45	1 , 63	2,27

[0039] As formas de realização aqui descritas fornecem vantagens únicas para a produção de arginina, assim como um rendimento inesperadamente superior de arginina a partir de agro-resíduos de pouco valor, quando se compara com o rendimento a partir de uma fonte de carbono puro tal como dextrose. Em vantagem é a utilização ou reciclagem de resíduos agro-residuais como bagaço de mandioca ou de sementes de jaca, que de outra forma teria permanecido inutilizado e/ou descartado. Outra vantagem é a utilização de um método alternativo para reduzir o uso de açúcares refinados dispendiosos como dextrose para o propósito de fermentação. Ainda outra vantagem é a produção relativamente mais elevada de arginina no meio com base em hidrolisado, quando se compara com o meio de dextrose mais caro.

[0040] A invenção foi descrita acima com referência aos Exemplos ilustrativos, mas deve ficar entendido que a

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22/22 invenção não é limitada às formas de realização divulgadas. Alterações e modificações que poderiam ocorrer para uma pessoa de habilidade na técnica após a leitura do relatório descritivo também estão dentro do escopo da invenção, que é definido nas reivindicações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de produção de L-arginina mediante a fermentação de agro-residuos caracterizado por compreender:

submeter os agro-residuos à fermentação na presença de pelo menos um Corynebacterium glutamicum ATCC 21831 ou Corynebacterium glutamicum ATCC 21493, para produzir uma substância líquida fermentada contendo arginina; e recuperar a arginina da substância líquida fermentada;

em que o agro-resíduo compreende uma fonte de carbono produzida por hidrólise de bagaço de mandioca, pó de semente de jaca, e suas misturas, com uma enzima de sacarificação de amido.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da fermentação ser fermentação aeróbica. 3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da fermentação ser conduzida em uma temperatura dentro da faixa de 20°C a 50° C. 4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato da temperatura ser de 30°C a 32° C. 5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da fermentação ser conduzida em um pH dentro da faixa de 5 a 8 . 6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato do pH ser de 6 a 7 . 7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da fermentação ser conduzida durante um período de tempc > de : 12 horas a 2 semanas. 8. Método, de acordo com a reivindicação 7,

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2/2 caracterizado pelo fato do período de tempo ser de 2 dias a

6 dias.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ainda compreender adicionar um antibiótico de β-lactama durante a fermentação.

10 . Método, de acordo com a reivindicação 1, caracteri zado pelo fato da hidrólise enzimática dos agro- resíduos converter de 55 a 85% do agro-resíduo em açúcares redutores ^. 11. Método, de acordo com a reivindicação 1,

caracterizado por ainda compreender adicionar um antibiótico de lactama durante o processo de fermentação.