JP2007135602A - Ｌ−グルタミン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

【課題】発酵法によるＬ−グルタミン酸の優れた製造法を提供する。
【解決手段】界面活性剤に対する耐性を付与するタンパク質（ＤＴＳＲタンパク質）の温度感受性変異体をコードするＤＮＡを保持し、野生型ＤＴＳＲタンパク質を保持せず、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌を、液体培地で培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積させ、Ｌ−グルタミン酸を該培地から採取することを含む、Ｌ−グルタミン酸の製造方法であって、前記コリネ型細菌の生育至適温度で培養を開始し、培養の途中で培養温度を３３〜４０℃に上昇させることを特徴とする前記製造方法。
【選択図】 なし

Description

本発明は、温度感受性ｄｔｓＲ遺伝子に関し、詳しくは、コリネ型細菌の界面活性剤に対する耐性に関与するタンパク質であって、温度感受性変異を有するタンパク質をコードする遺伝子に関する。また、この遺伝子を保持し、Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸の生産能を有するコリネ型細菌及びこのコリネ型細菌を用いる発酵法によるＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸の製造方法に関する。

従来、Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸は、これらのアミノ酸生産能を有するブレビバクテリウム属やコリネバクテリウム属に属するコリネ型細菌を用いて発酵法により工業生産されている。この方法では、コリネ型細菌は生育にビオチンを要求する一方、培地中に過剰量のビオチンが存在すると、Ｌ−グルタミン酸が蓄積しないことが知られている。従って、従来のＬ−グルタミン酸の製造法においては、ビオチン濃度を制限した培地で培養するか、あるいはビオチンを充分量含有する培地を用いる場合には、培養の初発または途上でビオチン作用抑制物質として界面活性剤またはラクタム系抗生物質を培地に含有させて培養するかのいずれかの方法が採用されている。しかしながら、特に培地の炭素源として廃糖蜜等の安価ではあるが過剰量のビオチンを含有する原料を使用する場合、培地に添加することが必要なビオチン作用抑制物質が製造コスト高の原因となっていた。

これに対し、本発明者らは、コリネバクテリウム属細菌に由来し、該細菌に界面活性剤に対する耐性を付与するタンパク質（ＤＴＳＲ蛋白）をコードする遺伝子（ｄｔｓＲ遺伝子）の存在を突き止め、この遺伝子が破壊されたコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌は、野生株がほとんどＬ−グルタミン酸を生成しない量のビオチンが存在する条件においても著量のＬ−グルタミン酸を生成すること、及び、Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌は、ｄｔｓＲ遺伝子を増幅するとＬ−リジンを生産する能力が増強されることを見出している（特許文献１）。

また、本発明者らは、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌に、ビオチン作用抑制物質に対する温度感受性を付与することにより、ビオチン存在下でも安定してＬ−グルタミン酸を発酵生産することができること、及び、このようなビオチン作用抑制物質に対する温度感受性株にＬ−リジン生産性を付与することにより、ビオチン存在下でも、安定してＬ−リジンとＬ−グルタミン酸を同時に発酵生産することができることを見出している。そして、コリネ型細菌にビオチン作用抑制物質に対する温度感受性を付与する手段の一つとして、温度感受性変異型ＤＴＳＲ蛋白をコードする変異型ｄｔｓＲ遺伝子を用いた遺伝子置換を開示している（特許文献２）。
ＷＯ９５／２３２２４号国際公開パンフレット ＷＯ９６／０６１８０号国際公開パンフレット

上記したように、コリネ型細菌を用いた発酵法によるアミノ酸の製造において、ｄｔｓＲ遺伝子の有効な利用法が開発されている。本発明は、さらにｄｔｓＲ遺伝子を有効に利用するために、温度感受性変異型ＤＴＳＲ蛋白をコードする新規な変異型ｄｔｓＲ遺伝子を提供することを課題とする。

本発明者は、すでに取得されているｄｔｓＲ遺伝子に変異処理を行い、温度感受性変異
を有するＤＴＳＲ蛋白をコードする新規な変異型ｄｔｓＲ遺伝子を取得することに成功し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列、または配列番号２記載のアミノ酸配列の１３９番目のＬｅｕ残基がＰｒｏを除く他のアミノ酸残基に変化した配列を有し、温度感受性ＤＴＳＲ活性を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列、または配列番号２記載のアミノ酸配列の１３９番目のＬｅｕ残基がＰｒｏを除く他のアミノ酸残基に変化した配列において、さらに、１３９番目のアミノ酸残基以外の位置における１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、温度感受性ＤＴＳＲ活性を有するタンパク質。

上記ＤＮＡとして具体的には、下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡが挙げられる。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３５９〜１９８７からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３５９〜１９８７からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、温度感受性ＤＴＳＲ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

以下、上記のいずれかのＤＮＡを、「本発明の遺伝子」又は「変異型ｄｔｓ遺伝子」、これらのＤＮＡがコードするタンパク質を「変異型ＤＴＳＲタンパク質」ということがある。

また、本発明は、本発明の遺伝子を保持し、野生型ＤＴＳＲタンパク質を保持せず、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌、及び、このコリネ型細菌を、液体培地で培養し、培地中に、Ｌ−グルタミン酸を生成蓄積させ、Ｌ−グルタミン酸を該培地から採取することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造方法を提供する。

さらに、本発明は、Ｌ−リジン生産能をさらに有する上記コリネ型細菌、並びに、このコリネ型細菌を、液体培地で培養し、培地中に、Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸を生成蓄積させ、Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸を該培地から採取することを特徴とするＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸の製造方法を提供する。

尚、本発明においてＤＴＳＲ活性とは、ＤＴＳＲタンパク質が有する活性であって、具体的には、コリネ型細菌細胞中で界面活性剤に対する耐性に関与する活性をいう。ＤＴＳＲタンパク質は、例えば、コリネ型細菌の界面活性剤変異株（野生型のコリネ型細菌の生育に影響を与えない濃度の界面活性剤が存在する培地中で、生育が悪くなったコリネ型細菌に属する変異株）の細胞中に存在させたときに、界面活性剤に対する感受性を失わせる活性を有する。

また、温度感受性ＤＴＳＲ活性とは、コリネ型細菌の最適生育温度（３１．５℃）ではＤＴＳＲ活性を示すが、３３ないし３７℃以上、好ましくは３４℃以上ではＤＴＳＲ活性が低下する性質をいう。

また、本発明にいうコリネ型細菌とは、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bargey's Manual of Determinative Bacteriology）第８版５９９頁（１９７４）に定義されている一群の微生物であり、好気性、グラム陽性、非抗酸性、胞子形成能を有しない桿菌であり、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが
現在コリネバクテリウム属細菌として統合されたブレビバクテリウム属細菌（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)）を含み、またコリネバクテリウム属細菌と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリウム属細菌を含む。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の遺伝子は、野生型コリネ型細菌由来のｄｔｓＲ遺伝子を含む組換えＤＮＡを変異剤処理し、これをコリネ型細菌に属する界面活性剤感受性変異株に導入し、組換えＤＮＡが導入されていない変異株が生育できない濃度の界面活性剤を含む培地において、３１．５℃では生育するが、これよりも高い温度、例えば３５℃では生育しない株を選択し、得られた株より前記組換えＤＮＡを回収することによって得られる。

野生型コリネ型細菌由来のｄｔｓＲ遺伝子は、ＷＯ９５／２３２２４号国際公開パンフレットに記載されている方法にしたがって取得することができる。以下に、コリネ型細菌の界面活性剤感受性変異株を利用して野生型ｄｔｓＲ遺伝子を取得する方法、及びこの野生型ｄｔｓＲ遺伝子を用いて変異型ｄｔｓＲ遺伝子を取得する方法を説明する。

コリネ型細菌の野生株から、例えば斎藤らの方法（H. Saito and K. Miura Biochem. Biophys. Acta 72, 619 (1963)）に従い染色体ＤＮＡを回収する。回収した染色体ＤＮＡを制限酵素を用いて切断し、コリネ型細菌で機能するベクターに連結し、各種組換えＤＮＡを得る。

前記コリネ型細菌で機能するベクターとは、例えばコリネ型細菌で自律複製できるプラスミドである。具体的に例示すれば、以下のものがあげられる。

（１）ｐＡＭ ３３０ 特開昭５８−６７６９９号公報参照
（２）ｐＨＭ １５１９ 特開昭５８−７７８９５号公報参照
（３）ｐＡＪ ６５５ 特開昭５８−１９２９００号公報参照
（４）ｐＡＪ ６１１ 同 上
（５）ｐＡＪ １８４４ 同 上
（６）ｐＣＧ １ 特開昭５７−１３４５００号公報参照
（７）ｐＣＧ ２ 特開昭５８−３５１９７号公報参照
（８）ｐＣＧ ４ 特開昭５７−１８３７９９号公報参照
（９）ｐＣＧ １１ 同 上

界面活性剤感受性変異株としては、例えば界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテートの場合、０．１〜１mg/dlの濃度のポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート添加された培地で、生育が野生株と比較して悪い変異株が挙げられる。尚、野生型のコリネ型細菌は０．１〜１mg/dlの濃度の上記界面活性剤が添加された培地中でも生育に大きな変化はみられない。このような界面活性剤感受性変異株としては、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＪ１１０６０が挙げられる。同株は通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-0046 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に寄託されており、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−３６７８が付与されている。

上記のようにして得られる各種組換えＤＮＡをコリネ型細菌の界面活性剤感受性変異株に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Duncan, C.H., Wilson,
G.A. and Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Chang, S. and Choen, S.N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward, J.M. and Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J.B. and Fink, G.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)）も応用できる。本発明の実施例で用いた形質転換の方法は、電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）である。

次に、形質転換株を、一旦、界面活性剤を含まないＭ−ＣＭ２Ｇ寒天プレート（グルコース５ｇ、ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、ＤＬ−メチオニン０．２ｇ、寒天１５ｇ及びクロラムフェニコール４ｍｇを純水１Ｌに含む。ｐＨ７．２）に塗布して数万個のコロニーを形成させる。当該コロニーを３０ｍｇ／Ｌの界面活性剤（Tween 40）を含むＭ−ＣＭ２Ｇプレートにレプリカし、界面活性剤含有Ｍ−ＣＭ２Ｇプレート上で良好な生育を示すものを取得することにより、界面活性剤感受性を失った株を取得できる。

界面活性剤感受性が失われた形質転換株より組換えＤＮＡを、野生型コリネ型細菌の染色体ＤＮＡと同様にして調製、ベクターに連結されている野生型コリネ型細菌の染色体ＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、ｄｔｓＲ遺伝子が含まれていることを確認する。
以上のようにして、ｄｔｓＲ遺伝子を取得することができる。

また、ｄｔｓＲ遺伝子は、すでに報告されているｄｔｓＲ遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、コリネ型細菌染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲによってｄｔｓＲ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅することによっても、取得することができる。さらに、ｄｔｓＲ遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションによって、コリネ型細菌染色体ライブラリーをスクリーニングすることによっても、ｄｔｓＲ遺伝子を取得することができる。

なお、ｄｔｓＲ遺伝子を含むプラスミドｐＤＴＲ６を保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＤＴＲ６（プライベートナンバーＡＪ１２９６７）株は、１９９４年２月２２日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-0046 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４１６８として寄託され、１９９５年２月９日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４９９４が付与されている。

変異型ｄｔｓＲ遺伝子は、野生型ｄｔｓＲ遺伝子を含むＤＮＡに変異処理を施すことによって得ることができる。具体的には、野生型ｄｔｓＲ遺伝子を含む組換えＤＮＡを、次亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン等の化学薬剤によって変異処理する（Shortle, D. and Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 270(1978)）。変異処理した組換えＤＮＡを、上記と同様にしてコリネ型細菌の界面活性剤感受性変異株に導入し、形質転換体を得る。この形質転換体から、形質転換されていない変異株が生育できない濃度の界面活性剤、例えば３０ｍｇ／Ｌのポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテートを含む培地において、３１．５℃では生育するが３３ないし３７℃以上では生育しない株を選択する。選択された株より前記組換えＤＮＡを回収すれば、変異型ｄｔｓＲ遺伝子を得ることができる。

上記のようにして得られる本発明の遺伝子の例として、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９株由来のｄｔｓＲ遺伝子に変異処理を施して得られた変異型ｄｔｓＲ遺伝子の塩基配列を、配列表の配列番号１に示す。また、変異型ｄｔｓＲ
遺伝子がコードする変異型ＤＴＳＲタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。尚、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９株由来の野生型ＤＴＳＲタンパク質は、配列番号２に示すアミノ酸配列において１３９番目のアミノ酸残基がＰｒｏ残基であるアミノ酸配列を有する。また、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９株の野生型ｄｔｓＲ遺伝子は、配列番号１において７７４番目の塩基がＣである塩基配列を有する。

本発明により、温度感受性を有する変異型ＤＴＳＲタンパク質のアミノ酸配列、及び変異型ＤＴＳＲタンパク質をコードする変異型ｄｔｓＲ遺伝子の塩基配列が明らかとなったので、野生型ｄｔｓＲ遺伝子に、部位特異的変異法（Kramer, W. and Frits, H. J., Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)）によって変異を導入することによっても、変異型ｄｔｓＲ遺伝子を取得することができる。すなわち、野生型ｄｔｓＲ遺伝子では、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１３９番目のコドンはＰｒｏ残基をコードしているが、これを、Ｐｒｏ以外のアミノ酸残基、好ましくはＬｅｕ残基をコードするコドンに置換すればよい。Ｐｒｏ以外のアミノ酸残基としては、１３９番目のＰｒｏ残基をそのアミノ酸残基に変化させたときに、変異型ＤＴＳＲタンパク質が温度感受性ＤＴＳＲ活性を有するものであれば特に制限されないが、好ましくはＬｅｕ残基が挙げられる。

本発明の遺伝子は、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号３５９〜１９８７で表される塩基配列を有するＤＮＡの他に、配列番号２に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、及び配列番号２に示すアミノ酸配列において、１３９番目のＬｅｕ残基が、Ｐｒｏを除く他のアミノ酸残基に変化した配列をコードするＤＮＡを含む。また、上記ＤＮＡに、配列番号２に記載のアミノ酸配列における１３９番目のアミノ酸残基以外の位置において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を生じる変異が加わっても、コードされるタンパク質が温度感受性ＤＴＳＲ活性を有する限り、そのようなＤＮＡは本発明の遺伝子に含まれる。

配列番号２に記載のアミノ酸配列における１３９番目のアミノ酸残基以外の位置において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、１３９番目のアミノ酸残基がＰｒｏ以外のアミノ酸残基に変化したＤＴＳＲタンパク質をコードするｄｔｓＲ遺伝子、具体的には配列番号１に示す塩基配列を有するｄｔｓＲ遺伝子を保持するコリネ型細菌を突然変異処理し、得られる変異株から、配列表の配列番号１に示す塩基配列において塩基番号３５９〜１９８７で表される塩基配列の少なくとも一部を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを単離することによって、取得され得る。また、同種変異体または対立遺伝子変異体としても単離され得る。

突然変異処理としては、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。

上記の「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは温度が完全にマッチしたハイブリッドのＴｍ〜（Ｔｍ−３０）℃、好ましくはＴｍ〜（Ｔｍ−２０）℃の範囲で、かつ１×ＳＳＣ、好ましくは０．１×ＳＳＣに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。

また、１３９番目のアミノ酸残基以外の位置における１若しくは数個のアミノ酸残基の
置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むＤＴＳＲタンパク質をコードするＤＮＡは、部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加又は逆位を起こすように塩基配列を改変することによって得られる。

上記のようにして得られるＤＮＡのうち、温度感受性ＤＴＳＲ活性を有し、かつ、１３９番目のアミノ酸残基以外の部位において変異が生じたＤＴＳＲタンパク質をコードするものを選択することによって、変異を導入することができる位置、又は変異が生じた位置を決定することができる。導入される変異の位置は、温度感受性ＤＴＳＲ活性に実質的に影響のない限り、特に制限されない。また、導入される変異の数は、タンパク質の立体構造における変異されるアミノ酸の位置や種類によっても異なり、温度感受性ＤＴＳＲ活性に実質的に影響のない限り、特に制限されないが、通常、１〜２０個、好ましくは１〜１０個である。

本発明の遺伝子は、Ｌ−グルタミン酸の製造に好適に利用することができる。例えば、本発明の遺伝子を保持し、野生型ＤＴＳＲタンパク質を保持せず、かつ、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌は、界面活性剤に対する温度感受性を有する。このようなコリネ型細菌は、３１．５℃程度で培養して生育させた後に、培養温度を３３ないし３７℃以上にシフトさせると、過剰量のビオチンを含有する培地中にて界面活性剤の非存在下でも、Ｌ−グルタミン酸を生産することができる。

従って、本発明により、本発明の遺伝子を保持し、野生型ＤＴＳＲタンパク質を保持せず、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌（以下、本発明のＬ−グルタミン酸生産菌ともいう）、及び、このコリネ型細菌を、液体培地で培養し、培地中に、Ｌ−グルタミン酸を生成蓄積させ、Ｌ−グルタミン酸を該培地から採取することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造方法も提供される。

本発明のＬ−グルタミン生産菌は、本発明の遺伝子を含む組換えＤＮＡを、既に確立している相同組換えの手法（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press (1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. Bacteriol., 162, 1196(1985)）等により、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌の染色体上の野生型ｄｔｓＲ遺伝子と置換することによって、取得することができる。Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌は、公知のものを使用できる（例えば、ＷＯ９６／０６１８０号国際公開パンフレット参照）。

本発明において上記Ｌ−グルタミン酸生産菌の培養に用いられる液体培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類、生育因子等を含有する通常の栄養培地が用いられる。上記Ｌ−グルタミン生産菌は、過剰量のビオチンを含有する液体培地で培養してもビオチン作用抑制物質を培地に含有させることなくＬ−グルタミン酸を生産する能力を有する。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物等の炭水化物、エタノール、グリセロール等のアルコール類、酢酸等の有機酸類が使用される。窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、アンモニア、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー等が使用される。栄養要求性を有するＬ−グルタミン生産菌を用いる場合には、それらの要求物質を標品もしくはそれを含有する天然物として添加する。

発酵は、振とう培養、通気撹拌培養等による好気条件下にて、培養液のｐＨを５〜９の間に保持しつつ２〜７日間行う。ｐＨの調節には、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガス、アンモニア水等を用いる。培養温度は２４〜３７℃であるが、３１．５℃付近で培養
を開始し、培養の途中で３３〜４０℃、好ましくは３７℃付近に温度を上昇させることによりさらに良好な結果が得られる。すなわち、生育至適温度付近にて菌を十分増殖させた後、培養途中で温度を上昇させることにより、ビオチン作用抑制物質を添加することなく、Ｌ−グルタミン酸の生産が開始され、培養液中にＬ−グルタミン酸が著量、生成蓄積される。

培養液中に生成蓄積したＬ−グルタミン酸を採取する方法は常法によって行えばよく、例えばイオン交換樹脂法、晶析法等によることができる。具体的には、Ｌ−グルタミン酸を陰イオン交換樹脂により吸着、分離させるか、または中和晶析させればよい。

上記Ｌ−グルタミン酸生産菌は、さらにＬ−リジン生産能を有するものであってもよい。このようなコリネ型細菌（以下、本発明のＬ−リジン生産菌ともいう）を、液体培地で培養し、培地中に、Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸を生成蓄積させ、Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸を該培地から採取することによりＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸を製造できる。

本発明のＬ−リジン生産菌は、上記のように相同組換えの手法等により、本発明の遺伝子を含む組換えＤＮＡを、Ｌ−リジン及びＬ−グルタミンの両方の生産能を有するコリネ型細菌の染色体上の野生型ｄｔｓＲ遺伝子と置換することによって、取得することができる。Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸の生産能を有するコリネ型細菌は、公知のものを使用できる（例えば、ＷＯ９６／０６１８０号国際公開パンフレット参照）。あるいは、本発明のＬ−グルタミン生産菌に、特公昭４８−２８０７８号公報などに記載の方法に従ってＬ−リジン生産能を付与することによっても本発明のＬ−リジン生産菌を取得することができる。

本発明のＬ−リジン生産菌の培養に用いられる液体培地としては、本発明のＬ−グルタミン酸生産菌の培養に用いられるのと同様の炭素源、窒素源、無機塩類、生育因子等を含有する通常の栄養培地が用いられる。本発明のＬ−リジン生産菌は、過剰量のビオチンを含有する液体培地で培養してもビオチン作用抑制物質を培地に含有させることなくＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸を生産する能力を有する。

発酵は、振とう培養、通気撹拌培養等による好気条件下にて、培養液のｐＨを５〜９の間に保持しつつ２〜７日間行う。ｐＨの調節には、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガス、アンモニア水等を用いる。培養温度は２４〜３７℃であるが、３１．５℃付近で培養を開始し、培養の途中で３３〜４０℃、好ましくは３４℃付近に温度を上昇させることによりさらに良好な結果が得られる。すなわち、３１．５℃付近では主としてＬ−リジンを生成するが、培養途中で温度を上昇させることによりＬ−グルタミン酸の生成される割合が増加する。これを利用して最終的に得られる培養液中のＬ−リジンとＬ−グルタミン酸の比率を望ましいものに制御することができる。

培養液中に生成蓄積したＬ−リジンとＬ−グルタミン酸を採取する方法は常法でよく、例えばイオン交換樹脂法、晶析法等によることができる。イオン交換樹脂法では、培養液からまず陽イオン交換樹脂によりＬ−リジンを吸着、分離させ、ついでＬ−グルタミン酸は陰イオン交換樹脂により吸着、分離させるかまたは中和晶析させる。Ｌ−リジンとＬ−グルタミン酸を混合物として用いる場合にはもちろんこれらのアミノ酸を相互に分離することは不要である。

本発明のＬ−グルタミン酸生産菌及びＬ−リジン生産菌においては、グルタミン酸生合成系遺伝子の発現を強化することにより、Ｌ−グルタミン酸生産性を向上させることができる。細胞中で強化されたグルタミン酸生合成系遺伝子の例としては、解糖系のホスフォ
フルクトキナーゼ（ＰＦＫ、特開昭６３−１０２６９２号）、アナプレロティック経路のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ、特開昭６０−８７７８８号、特開昭６２−５５０８９号）、ＴＣＡ回路のクエン酸合成酵素（ＣＳ、特開昭６２−２０１５８５号、特開昭６３−１１９６８８号）、アコニット酸ヒドラターゼ（ＡＣＯ、特開昭６２−２９４０８６号）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ、特開昭６２−１６６８９０号、特開昭６３−２１４１８９号）、アミノ化反応を触媒するグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ、特開昭６１−２６８１８５号）等の遺伝子がある。

さらに、本発明のＬ−リジン生産菌においては、リジン生合成系遺伝子を強化することによって、Ｌ−リジン生産性を向上させることができる。細胞中で強化されたリジン生合成系遺伝子の例としては、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼαサブユニット蛋白質又はβサブユニット蛋白質をコードする遺伝子（WO94/25605国際公開パンフレット）、コリネホルム細菌由来の野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（特開昭60-87788号公報）、コリネホルム細菌由来の野生型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子（特公平6-55149号公報）等が知られている。

以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。

＜１＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９(コリネバクテリウム属細菌の野生株）の染色体ＤＮＡの調製
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９をＴ−Ｙ培地（Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎ（Ｄｉｆｃｏ）１％、Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ）０．５％、ＮａＣｌ０．５％（ｐＨ７．２））１００ｍｌに接種し、温度３１．５℃で８時間培養し、培養物を得た。この培養物を3,000r.p.m.で１５分間、遠心分離処理し湿潤菌体０．５ｇを得た後、該菌体から斎藤、三浦の方法（Biochem. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)）により染色体ＤＮＡを得た。次いで、この染色体ＤＮＡ ６０μｇ 及び制限酵素 Sau3AＩ、３ユニットを１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄及び１ｍＭ ジチオスレイトール含有（ｐＨ ７．４））におのおの混合し、温度３７℃で３０分間反応させた。反応終了液を常法により、フェノール抽出処理し、エタノール沈澱処理してSau3AＩで消化されたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡ断片 ５０μｇ を得た。

＜２＞プラスミドベクターＤＮＡを利用したブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
ＡＴＣＣ１３８６９の遺伝子ライブラリーの作製
エシェリヒア・コリとコリネバクテリウム属細菌の双方の菌体内で自律複製可能なプラスミドベクターＤＮＡ（ｐＳＡＣ４）２０μｇ 及び制限酵素BamHＩ２００ユニットを５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ硫酸マグネシウム含有（ｐＨ７．４））に混合し、温度３７℃で２時間反応させて消化液を得、該液を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱処理した。この後、プラスミドベクター由来のＤＮＡフラグメントが再結合することを防止するため、Molecular Cloning 2nd edition（J.Sambrook, E.F.Fritsch and T.Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p1.56 (1989)）の方法で バクテリアルアルカリホスファターゼ（Bacterial Alkaline Phosphatase）処理により、ＤＮＡ断片の脱リン酸化を行い、常法によりフェノール抽出処理し、更にエタノール沈澱処理を行った。

このBamHＩで消化されたｐＳＡＣ４を１μｇ、＜１＞で得られたSau3AＩで消化されたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡ断片を１μg、及び２ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造（株）製）を、６６ｍＭ塩化マグ
ネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール及び１０ｍＭ ＡＴＰを含有する６６ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加し、温度１６℃で１６時間反応し、ＤＮＡを連結させた。次いで該ＤＮＡ混合物で、常法によりエシェリヒア・コリ ＤＨ５を形質転換し、これを１７０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬ寒天培地上にまき、約20,000個のコロニーを得、遺伝子ライブラリーとした。

＜３＞遺伝子ライブラリーＤＮＡによるブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１１０６０の形質転換
上記で述べた約20,000個のコロニーより、組換えＤＮＡの回収を行なった。回収の方法は上記に示した斎藤、三浦の方法に従った。

５０のバッチに分けた組換えＤＮＡ混合物を電気パルス法を用いた形質転換の常法（特開平２−２０７７９１号公報）に従い、界面活性剤に対する感受性が上昇した変異株ＡＪ１１０６０株に導入した。形質転換体をグルコース添加寒天Ｌ培地上に接種し、３１．５℃で静置培養を行ない、約20,000個の形質転換体を出現させた。次にこれらの形質転換体を界面活性剤３０ｍｇ／ｌを含む同プレートにレプリカし、この中で界面活性剤に対して耐性を示し上記プレート上で生育可能であった株を数株得た。

上記で得られた数株からそれぞれ組換えＤＮＡを抽出し、同ＤＮＡを用いてＡＪ１１０６０株を再形質転換した。ここでも界面活性剤に対して耐性を示した株を得た。これらの株の１株が保持していた組換えＤＮＡをｐＤＴＲ６と命名した。ｐＤＴＲ６を導入したＡＪ１１０６０菌は、３ｇ／Ｌの界面活性剤を添加した液体培地での生育阻害が抑制されていた（ＷＯ９５／２３２２４号国際公開パンフレット参照）。

＜４＞変異型ｄｔｓＲ遺伝子の取得
ｐＤＴＲ６プラスミドを、文献 Shortle, D. and Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 270(1978)に記載の方法に従い、試験管内でヒドロキシルアミン処理し、これをＡＪ１１０６０に上記の電気パルス法を用いて導入した。形質転換体約２００００株をＭ−ＣＭ２Ｇ寒天培地に２５℃にて３０時間培養しコロニーを形成させた。これを３０ｍｇ／ｌの界面活性剤を含む同プレート培地に２枚ずつレプリカし３１．５℃および３５℃において２０時間培養した。その後、３１．５℃では生育するが３５℃では生育しなかった株を１株取得した。この１株から常法によりプラスミドを抽出し、ｐＤＴＲ−１１７を取得した。

＜５＞変異型ｄｔｓＲ遺伝子の塩基配列決定
上記で得られたｐＤＴＲ−１１７をエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９に導入した。得られたエシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＤＴＲ−１１７をトリプトン１％、酵母エキス０．５％及びＮａＣｌ ０．５％からなる培地２０ｍｌに温度３７℃で２４時間前培養し、得られた培養液２０ｍｌを上記と同じ組成の培地１ｌに接種し、温度３７℃で３時間培養したのち、０．２ｇのクロラムフェニコールを添加し、更に同一温度で２０時間培養を行い、培養液を得た。次いで、この培養液を3,000r.p.m.で１０分間遠心処理して湿潤菌体２ｇを得、これを２０ｍｌの２５％ショ糖を含有する３５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁したのち、更にこれにリゾチーム（シグマ社製）１０ｍｇ、０．２５Ｍ
ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）８ｍｌ及び２０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液８ｍｌを各々添加し、温度６０℃で３０分間保温処理し、溶菌液を得た。この溶菌液に、５Ｍ ＮａＣｌ溶液１３ｍｌを添加し、温度４℃で１６時間処理した後、15,000r.p.m.で３０分間遠心分離した。得られた上清液を、常法によりフェノール抽出処理及びエタノール沈澱処理を行いＤＮＡを沈澱させた。

この沈澱物を減圧乾燥処理した後、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７．５）６ｍｌに溶解し、さらにこれに塩化セシウム６ｇ及びエチジウムブロマイド（１９ｍｇ／ｍｌ）０．２ｍｌを添加し、39,000r.p.m.で４２時間超遠心分離機を用いて平衡密度勾配遠心分離処理を行い、ＤＮＡを単離した。又更に、ｎ−ブタノールを使用してエチジウムブロマイドを除去した後、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析を行い純化された組換えＤＮＡ ｐＤＴＲ−１１７を約５００μｇを得た。

ｐＤＴＲ−１１７のクローン化断片の塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定は、Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオケミカル社製）を用い
Sangerの方法に従って行った。決定された塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列を配列表配列番号１に示す。アミノ酸配列は配列番号２にも示す。

その結果、このクローン化ＤＮＡ断片は、ｄｔｓＲ遺伝子のコード領域全長を含み、野生型ｄｔｓＲ遺伝子ではＣ（シトシン）である７７４番目の塩基がＴ（チミン）に置換されていることが判明した。この塩基の置換により、コードされるＤＴＳＲタンパク質は、野生型ではＰｒｏ残基である１３９番目のアミノ酸残基が、Ｌｅｕ残基に置換されている。

＜６＞遺伝子置換による変異型ｄｔｓＲ遺伝子導入株の作製
変異型ｄｔｓＲ遺伝子置換株は特開平５−７４９１号に示される温度感受性プラスミドを用いた相同組換え法により取得した。具体的には上記のｐＤＴＲ−１１７をＸｂａＩ及びＫｐｎＩにより消化してｄｔｓＲ遺伝子を含む断片を取得し、ｐＨＳＧ３９８（宝酒造（株）製）をＸｂａＩおよびＫｐｎＩ切断処理したものと、上記の方法で結合させ、ｐＨＳＧＸ−Ｋ−１１７を取得した。

次に、コリネ型細菌で自己複製可能なプラスミドから取得した自己複製能が温度感受性になった変異型の複製起点を持つプラスミドｐＨＳＣ４（特開平５−７４９１号）を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで消化し、複製起点を含む遺伝子断片を取得し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ平滑末端化キット（宝酒造（株）製、Blunting kit）を用いて平滑末端化した後、ＫｐｎＩリンカー（宝酒造（株）製）を用いて、ｐＨＳＧＸ−Ｋ−１１７のＫｐｎＩ認識部位に導入し、プラスミドｐＫＴＣＸ−Ｋ−１１７を作製した。尚、ｐＨＳＣ４を保持するエシェリヒア・コリ ＡＪ１２５７１は、１９９０年１０月１１日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-0046 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１１７６３として寄託され、１９９１年８月２６日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ ＢＰ−３５２４の受託番号で寄託されている。

この２つのプラスミドを、各々ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９に電気パルス法を用いて導入し、特開平５−７４９１号に記載の方法で染色体上のｄｔｓＲ遺伝子を変異型に置換した。具体的にはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９／ｐＫＴＣＸ−Ｋ−１１７をＭ−ＣＭ２Ｇ液体培地で２５℃にて６時間振とう培養した後、５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＭ−ＣＭ２Ｇ培地上に撒き、３４℃でコロニーを形成した株をプラスミド組み込み株として取得した。次にこの株から３４℃でクロラムフェニコールに対して感受性になった株をレプリカ法により取得した。この感受性株から３４℃において界面活性剤に対する耐性を失った株としてＮｏ．１１７株を取得した。この株は染色体上のｄｔｓＲ遺伝子が変異型に置換されている。

＜７＞Ｎｏ．１１７株のＬ−グルタミン酸生産性
上記項目＜６＞で取得したＮｏ．１１７株、並びに、ＷＯ９６／０６１８０号国際公開
パンフレットに記載のＮｏ．１１株、Ｎｏ．７７株及びＮｏ．２１株について、ＷＯ９６／０６１８０号国際公開パンフレットに記載の実施例２と同様にしてＬ−グルタミン酸の生産性を評価した。具体的には、以下の様に評価を行った。

ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９または上記各株を表１に示す組成の種培養培地に接種し、３１．５℃で２４時間振とう培養して種培養を得た。表１に示す組成の本培養培地を５００ml容ガラス製ジャーファーメンターに３００mlずつ分注し加熱殺菌した後、上記種培養を４０ml接種した。撹拌速度を８００〜１３００rpm、通気量を１／２〜１／１vvmとし、培養温度３１．５℃にて培養を開始した。培養液のｐＨはアンモニアガスで７．５に維持した。培養を開始してから８時間後に培養温度を３７℃にシフトした。培養温度のシフトを行わず、３１．５℃のまま培養を継続した場合を比較対象とした。

いずれも２０〜４０時間でグルコースが完全に消費された時点で培養を終了し、培養液中に生成蓄積されたＬ−グルタミン酸の量を測定した。

その結果、表２に示すようにＮｏ．１１７株のＬ−グルタミン酸収率は特に上昇していた。

本発明により、界面活性剤に対する温度感受性変異を有する変異型ＤＴＳＲタンパク質をコードする変異型ｄｔｓＲ遺伝子が提供される。この変異型ＤＴＳＲタンパク質を保持し、野生型ＤＴＳＲタンパク質を保持しないコリネ型細菌は、界面活性剤に対する温度感受性を有し、Ｌ−グルタミン酸の生産等に利用できる。

Claims (3)

1. 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡを保持し、野生型ＤＴＳＲタンパク質を保持せず、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌を、液体培地で培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積させ、Ｌ−グルタミン酸を該培地から採取することを含む、Ｌ−グルタミン酸の製造方法であって、前記コリネ型細菌の生育至適温度で培養を開始し、培養の途中で培養温度を３３〜４０℃に上昇させることを特徴とする前記製造方法。
   （Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列、または配列番号２記載のアミノ酸配列の１３９番目のＬｅｕ残基がＰｒｏを除く他のアミノ酸残基に変化した配列を有し、温度感受性ＤＴＳＲ活性を有するタンパク質。
   （Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列、または配列番号２記載のアミノ酸配列の１３９番目のＬｅｕ残基がＰｒｏを除く他のアミノ酸残基に変化した配列において、１３９番目のアミノ酸残基以外の位置における１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、温度感受性ＤＴＳＲ活性を有するタンパク質。
2. 前記ＤＮＡが、下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである請求項１記載の製造方法。
   （ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３５９〜１９８７からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
   （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３５９〜１９８７からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、温度感受性ＤＴＳＲ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
3. 前記ＤＮＡが、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする請求項１記載の製造方法。