KR20190065984A - L-히스티딘 생산능이 강화된 미생물 및 이를 이용한 히스티딘 생산방법 - Google Patents

L-히스티딘 생산능이 강화된 미생물 및 이를 이용한 히스티딘 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 L-히스티딘 생산능이 강화된 미생물 및 이를 이용한 히스티딘 생산방법에 관한 것이다.

Description

L-히스티딘 생산능이 강화된 미생물 및 이를 이용한 히스티딘 생산방법{Microorganisms with enhanced ability to produce L-histidine and methods for producing L-histidine using the same}
본 출원은 L-히스티딘 생산능이 강화된 미생물 및 이를 이용한 히스티딘 생산방법에 관한 것이다.
L-히스티딘은 20개의 표준 아미노산들 가운데 하나의 아미노산으로, 영양학적인 관점에서 볼 때 성인에게는 많은 양이 요구되지 않지만, 성장기 어린이들에게는 해당하는 필수 아미노산으로 분류된다. 또한, L-히스티딘은 항산화와 면역 조절 등 중요한 생리적 과정에 관여하여 위장 궤양 치료제, 순환기계 치료제의 원료 및 아미노산 수액 제제 등 의학 산업에 사용된다.
히스티딘은 특히 헤모글로빈에 많이 들어 있어서, 주로 혈분을 원료로 하는 단백질 가수 분해 추출법을 통해 주로 생산된다. 그러나, 이는 낮은 효율과 환경 오염 등의 단점을 지니고 있다. 반면, 미생물 발효법을 통하여 L-히스티딘을 생산 하는 것은 가능하나, 대규모 공업화는 아직 이루어 지지 않았다. 이는 L-히스티딘의 생합성이 뉴클레오티드 합성 전구체인 PRPP와 경쟁 관계를 가지며, 고 에너지를 요구하는 복잡한 생합성 과정 및 조절 메커니즘을 가지고 있기 때문이다.
발효법에 사용되는 미생물의 L-히스티딘 생산능은 종래에는 돌연변이 유발 및 돌연변이체 선발 방법, 유전자 개량을 통한 균주의 신진대사를 조절하는 방법으로 개선시켰다. 최근 미생물을 이용한 히스티딘의 생산은 PRPP로부터 여러 단계를 거쳐 생합성 된다고 알려져 있으나, 히스티딘 생합성에 관여하는 효소들중 첫번째 효소인 ATP 포스포리보실 전이효소는 최종 산물인 L-히스티딘 또는 이의 유도체에 의한 피드백 저해가 발생하여 공업적으로 L-히스티딘을 대량생산하는데 문제점이 있다 (국제공개특허 제WO2014-029376호). 이러한 복잡한 생합성 과정 및 조절 메커니즘으로 인하여 L-히스티딘을 미생물 배양을 통해 생산하기 위해서는 미생물 대사와 관련된 다양한 시각에서의 접근이 필요하였다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 세포 밖으로 배출된 글리신을 유입시켜 이용 가능한 미생물을 개발하기 위해 코리네박테리움 암모니아게네스 유래 글리신 트랜스포터 cycA를 도입하였으며, 그 결과 높은 수율로 L-히스티딘을 생산하는 미생물을 완성하였다.
본 출원의 목적은 글리신 트랜스포터 활성이 강화된, L-히스티딘을 생산하는 코리네박테리움속 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 본 출원의 미생물을 포함하는 L-히스티딘 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 본 출원의 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 L-히스티딘 제조방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
본 출원의 하나의 양태는 글리신 트랜스포터 활성이 강화된, L-히스티딘 생산용 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
본 출원의 용어 "글리신 트랜스포터(glycine transporter)" 는 세포 내로 글리신을 유입하는 기능을 갖는 단백질이라면 제한 없이 포함되며, 구체적으로는 D-세린/D-알라닌/글리신 트랜스포터(D-serine/D-alanine/glycine transporter)일 수 있다. 상기 글리신 트랜스포터는 D-세린/D-알라닌/글리신 트랜스포터 또는 글리신 유입 단백질과 혼용되어 사용될 수 있다.
상기 "D-세린/D-알라닌/글리신 트랜스포터(D-serine/D-alanine/glycine transporter)"는, 세린, 알라닌 및 글리신 수송에 모두 관여할 수 있는 단백질로, 공지의 데이터 베이스인 NCBI Genbank 등에서 D-Serine/D-Alanine/glycine transporter 서열을 검색하여 그 정보를 얻을 수 있다. 상기 트랜스포터는 구체적으로 CycA, AapA 일 수 있고, 보다 구체적으로는 CycA 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 "CycA 단백질"은 세린, 알라닌 및 글리신 유입(uptake)에 관여하는 단백질을 의미한다. CycA 단백질은 cycA 유전자에 의해 코딩되며, cycA 유전자는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 크렙시엘라 뉴모니에(Klebsialla pneumoniae), 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 및 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) 등의 미생물에 존재하는 것으로 알려져 있다.
본 출원의 목적상, 본 출원의 CycA 단백질은 히스티딘 생산능을 강화할 수 있는 것이면 어느 것이든 포함될 수 있다. 구체적으로 상기 CycA 단백질은 코리네박테리움속 또는 에스케리키아속 미생물 유래일 수 있고, 보다 구체적으로는 코리네박테리움 암모니아게네스 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)는 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes)와 동종으로, 코리네박테리움 스테이셔니스(Corynebacterium stationis), 브레비박테리움 스테이셔니스(Brevibacterium stationis)와 동일 분류군(taxon)으로 분류되었다(International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 60: 874-879). 또한 상기 브레비박테리움 암모니아게네스는 코리네박테리움 스테이셔니스로 변경되어 명명된 바 있다.
따라서, 본 출원에서 용어 코리네박테리움 암모니아게네스, 브레비박테리움 암모니아게네스, 코리네박테리움 스테이셔니스, 브레비박테리움 스테이셔니스는 서로 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원의 CycA 단백질은 서열번호 1 또는 이와 70% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 CycA 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 상동성 또는 동일성을 가지며, 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지더라도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
더불어, 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 염기서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드로서, 세린, 알라닌 및 글리신 유입 활성을 갖는 폴리펩티드도 제한 없이 포함될 수 있다.
즉, 본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드', '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 폴리펩타이드' 또는 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드'라고 기재되어 있더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단 그리고/또는 C-말단에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.
상기 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들면, 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 알지닌, 라이신, 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 글루탐산 및 아스파르트산을 포함하고; 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신을 포함하고, 소수성 아미노산은 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판을 포함한다.
본 출원에서 용어 "폴리뉴클레오티드"는 DNA 또는 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 폴리뉴클레오티드에서 기본 구성 단위인 뉴클레오티드는 천연 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체도 포함할 수 있다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990) 참조).
상기 폴리뉴클레오티드는 본 출원의 CycA 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 본 출원의 CycA 단백질과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 구체적으로 예를 들어, 서열번호 1 또는 서열번호 1과 70% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2 또는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
또한, 코돈 축퇴성 (codon degeneracy)에 의해 서열번호 1 또는 서열번호 1과 70% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 이와 상동성 또는 동일성을 가지는 단백질로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 포함될 수 있음은 자명하다. 또는 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 유전자끼리, 70% 이상, 80% 이상, 구체적으로는 85% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 폴리뉴클레오티드가 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 폴리뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
본 출원에서 용어 "상동성(homology)" 또는 "동일성(identity)"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다. 보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
상기 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 상동성 또는 동일성은 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST[참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]나 Pearson에 의한 FASTA(참조: Methods Enzymol., 183, 63, 1990)을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 또한, 임의의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
본 출원의 용어 "단백질의 활성 강화" 는 미생물이 가진 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 활성이 향상되는 것을 의미한다. 상기 활성 강화는 외래의 단백질을 도입하는 것과, 내재적인 단백질의 활성 강화를 모두 포함할 수 있다. 즉, 특정 단백질의 내재적 활성이 있는 미생물에 외래 단백질을 도입하는 것과, 내재적 활성이 없는 미생물에 상기 단백질을 도입하는 것도 포함한다. 상기 "단백질 도입"은 특정 단백질의 활성이 미생물 내로 도입되어 발현되도록 변형되는 것을 의미한다. 이는 해당 단백질의 활성 강화로도 표현될 수 있다.
본 출원의 용어 "내재적"은 자연적, 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 미생물의 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주가 본래 가지고 있던 상태를 의미한다.
본 출원에서 활성 강화는,
1) 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가,
2) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형,
3) 상기 단백질의 활성이 강화되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형,
4) 상기 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 도입, 또는
5) 이의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 1) 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동 가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터에 본원의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결되어 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터에 상기 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결되어 숙주세포 내에 도입됨으로써 상기 숙주세포의 염색체 내 상기 폴리뉴클레오티드의 카피수를 증가시키는 방법으로 수행될 수 있다.
다음으로, 2) 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현조절 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 가지는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현조절 서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터가 연결될 수 있는데, 상기 강력한 프로모터의 예로는 CJ7 프로모터(대한민국 등록특허 제0620092호 및 WO2006/065095), lysCP1 프로모터(WO2009/096689), EF-Tu 프로모터, groEL 프로모터, aceA 혹은 aceB 프로모터 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다. 아울러, 3) 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다.
또한, 4) 외래 폴리뉴클레오티드 서열의 도입은, 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 단백질을 암호화하는 외래 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 내로 도입하여 수행될 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한 없이 사용될 수 있다. 또한 도입된 상기 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화하여 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 상기 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 단백질이 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
마지막으로, 5) 상기 1) 내지 4)의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법은, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가, 이의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형, 염색체 상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 및 상기 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 변형 중 하나 이상의 방법을 함께 적용하여 수행될 수 있다.
본 출원의 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 변이된 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 출원의 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
본 출원의 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 출원의 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원의 벡터를 형질전환 시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 용어 "L-히스티딘을 생산하는 미생물"은 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 자연적으로 L-히스티딘 생산능을 가지고 있는 미생물 또는 L-히스티딘의 생산능이 없는 모균주에 L-히스티딘의 생산능이 부여된 미생물을 의미할 수 있다. 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 L-히스티딘 생산을 위하여 유전적 변이가 일어나거나 활성을 강화시킨 미생물 일 수 있다.
예를 들어, 상기 L-히스티딘을 생산하는 미생물은 글리신 트랜스포터 활성이 강화된 미생물일 수 있다. 또는 이에 추가로 히스티딘 생합성 효소의 피드백 제한이 억제되거나, 히스티딘 생합성 경로에 관여하는 효소를 강화 또는 억제하거나, 히스티딘 생합성에 영향을 미치지 않는 효소 또는 단백질의 활성이 불활성화 되어 히스티딘 생합성 경로로의 대사를 원활하게 함으로써 히스티딘을 생산하는 미생물일 수 있다.
구체적으로, CycA 단백질의 활성이 강화되거나, 추가적으로 HisG 폴리펩티드가 변이되어 히스티딘 생합성 경로의 피드백 제한을 억제시키거나, hisE, hisG, hisA, hisF, hisI, hisD, hisC, hisB, hisN을 포함하는 히스티딘 생합성경로의 효소군을 코딩하는 유전자 중 하나 이상의 발현을 강화시킨 미생물일 수 있다. 또한, 히스티딘 분해 경로의 효소를 불활성화키거나, 히스티딘 생합성 경로상의 중간체, 보조인자, 또는 에너지원을 소모하는 경로상의 단백질 또는 효소의 활성을 불활성화시키거나, 목적산물인 히스티딘을 유입하는 단백질을 불활성화시킨 미생물일 수 있다. 예를 들어 감마-아미노부티레이트 퍼미아제(gamma-aminobutyrate permease, NCgl1108)가 불활성화된 미생물 일 수 있다.
또한, 이에 추가적으로, 미생물의 생장 또는 히스티딘 생합성과 연관되지 않는 단백질 또는 효소의 활성을 불활성화 시킨 미생물일 수 있다. 보다 구체적으로, 미생물의 생장 및 L-히스티딘의 생합성에 영향을 미치지 않는 포밀테트라하이드로포레이트 디포밀라아제(Formyltetrahydrofolate deformylase, PurU), 또는 트랜스포사제(Transposase, NCgl2131)의 활성을 약화시킨 미생물일 수 있다.
본 출원의 용어"단백질 활성의 불활성화"는 효소 또는 단백질의 발현이 천연의 야생형 균주, 모균주 또는 해당 단백질이 비변형된 균주에 비하여 전혀 발현이 되지 않거나 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없거나 감소된 것을 의미한다. 이때, 상기 감소는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 변이, 발현조절서열의 변형, 유전자 일부 또는 전체의 결손 등으로 단백질의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 단백질의 활성에 비해 감소한 경우와, 이를 암호화하는 유전자의 발현 저해 또는 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 단백질의 활성 정도가 천연형 균주 또는 변형전의 균주에 비하여 낮은 경우, 이들의 조합 역시 포함하는 개념이다. 본 출원에 있어서, 상기 불활성화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 1) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 2) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 발현이 감소하도록 발현 조절 서열의 변형, 3) 상기 단백질의 활성이 제거 또는 약화되도록 단백질을 암호화하는 상기 유전자 서열의 변형, 4) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입; 5) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열을 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착을 불가능하게 만드는 방법; 6) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터를 부가하는 방법(Reverse transcription engineering, RTE) 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
다만 이는 한 가지 예에 불과하며, 이에 제한되지 않고, 다양한 공지의 L-히스티딘 생합성경로의 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 증진시키거나 분해경로의 효소를 불활성화시키거나, 히스티딘 생합성 경로상의 중간체, 보조인자, 또는 에너지원을 소모하는 경로상의 효소를 불활성화 시킨 미생물일 수 있다. 상기의 L-히스티딘을 생산하는 미생물은 공지의 다양한 방법을 적용하여 제조될 수 있다.
본 출원의 목적상 본 출원의 미생물은 상기 글리신 트랜스포터를 포함하고 L-히스티딘을 생산할 수 있는 미생물이라면 모두 가능하다.
본 출원에서 상기 "L-히스티딘을 생산할 수 있는 미생물"은 "L-히스티딘을 생산하는 미생물", "L-히스티딘 생산능을 갖는 미생물", "L-히스티딘 생산용 미생물"과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원의 히스티딘을 생산하는 미생물은 글리신 분해 단백질의 활성이 추가로 강화된 것일 수 있다. 상기 "히스티딘을 생산하는 미생물", "단백질의 활성 강화"는 전술한 바와 같다.
본 출원의 용어 "글리신 분해 단백질"은 글리신 분해 경로에 직접 또는 간접적으로 관여하는 단백질로,"글리신 분해 시스템(glycine cleavage system; GCV)"을 구성하는 각각의 단백질, 또는 상기 단백질의 복합체(complex) 또는 상기 글리신 분해 시스템 자체를 의미하는 것으로 사용될 수 있다.
구체적으로, 상기 글리신 분해 단백질은 글리신 분해 시스템을 구성하는 T-단백질(GcvT), P-단백질(GcvP), L-단백질(GcvL), H-단백질(GcvH) 및 상기 글리신 분해 시스템의 조효소인 LipB, LipA로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다(John E. Cronan, Microbiology and Molecular Biology Reviews., 13 April 2016). 상기 글리신 분해 단백질은 코리네박테리움 속 미생물 유래, 구체적으로 코리네박테리움 암모니아게네스 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 GcvP 단백질은 서열번호 26, GcvT 단백질은 서열번호 27, GcvH는 서열번호 28, LipA 단백질은 서열번호 29, LipB 단백질은 서열번호 30 또는 상기 서열번호와 각각 70% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 GcvP 단백질은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 26의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 상동성 또는 동일성에 대한 설명은 GcvT, GcvH, LipA, LipB에 대해서도 동일하다. 또한, 상기 상동성 또는 동일성을 가지며, 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지더라도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
더불어, 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 염기서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드로서, 글리신 분해 활성을 갖는 폴리펩티드도 제한 없이 포함될 수 있다.
상기 상동성 또는 동일성은 전술한 바와 같다.
본 출원에서 용어 "L-히스티딘을 생산하는 코리네박테리움 속 (the genus of Corynebacterium) 미생물"이란, L-히스티딘을 생산하는 미생물로써, 미생물의 속이 코리네박테리움 속에 속하는 미생물을 의미할 수 있다. 상기 L-히스티딘을 생산하는 미생물은 전술한 바와 같다. 구체적으로, 본 출원에서 L-히스티딘 생산능을 가지는 코리네박테리움속 미생물이란 본 출원의 글리신 트랜스포터의 활성이 강화되거나, 또는 상기 글리신 트랜스포터를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되어, 향상된 L-히스티딘 생산능을 가지게 된 코리네박테리움속 미생물을 의미할 수 있다. 또한 이에 추가적으로 글리신 분해 단백질의 활성이 강화되거나, 또는 상기 글리신 분해 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되어, 향상된 L-히스티딘 생산능을 가지게 된 코리네박테리움속 미생물을 의미할 수 있다. 상기 "향상된 L-히스티딘 생산능을 가지게 된 코리네박테리움 속 미생물"은 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물보다 L-히스티딘 생산능이 향상된 미생물을 의미한다. 상기 '비변형 미생물'은 천연형 코리네박테리움 속 균주 자체이거나, 상기 글리신 트랜스포터를 코딩하는 유전자를 포함하지 않는 미생물, 또는 상기 글리신 트랜스포터를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되지 않은 미생물을 의미한다.
본 출원에서 "코리네박테리움 속 미생물"은 모든 코리네박테리움 속 미생물을 포함할 수 있다. 구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스Cxorynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있고, 더욱 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 L-히스티딘 생산용 미생물을 포함하는, L-히스티딘 생산용 조성물을 제공한다.
상기 L-히스티딘 생산용 조성물은 본 출원의 L-히스티딘을 생산하는 미생물에 의해 L-히스티딘을 생산할 수 있는 조성물을 의미할 수 있다. 상기 조성물은 상기 L-히스티딘을 생산하는 미생물을 포함하며, 상기 균주를 이용하여 히스티딘을 생산할 수 있는 추가적인 구성을 제한없이 포함할 수 있다. 상기 히스티딘을 생산할 수 있는 추가적인 구성은 예를 들어, 발효용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제, 또는 배지의 구성 성분을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 부형제로는, 예를 들어, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 미생물 배양하는 단계를 포함하는 L-히스티딘 제조방법을 제공한다.
본 출원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 코리네박테리움속 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용될 수 있으며, 구체적으로는 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 또는 혐기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 당 알코올, 글리세롤 등과 같은 알코올; 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산; 피루브산, 락트산, 아세트산, 시트르산과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있고, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다.
그 외에 상기 배지에는 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서, 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다.
배양물의 온도는 25℃ 내지 40℃일 수 있으며, 보다 구체적으로는 28℃ 내지 37℃일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 원하는 유용 물질의 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 1 시간 내지 100 시간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 L-히스티딘 제조방법은 상기 배양 단계 이후 상기 미생물, 상기 배지,이의 배양물, 배양물의 상등액, 배양물의 추출물 및 상기 미생물의 파쇄물 중에서 선택된 하나 이상의 물질로부터 L-히스티딘을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 회수 단계는 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적 물질인 L-히스티딘을 회수할 수 있다. 예를 들어, 상기 L-히스티딘의 회수는 침전, 원심분리, 여과, 크로마토그래피 및 결정화 등의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있다.
본 출원의 L-히스티딘 생산용 미생물은 우수한 히스티딘 생산능을 갖는바, 효율적인 L-히스티딘의 대량 생산에 활용될 수 있다.
이하 본 출원을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 히스티딘 고생산능 인공돌연변이주 제작
L-히스티딘의 고생산능을 가지는 인공돌연변이주를 얻기 위해 하기와 같은 방법을 사용하여 미생물의 변이를 유도하였다.
구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래로 NTG 처리를 통해 만들어진 히스티딘 생산균주 KCCM11795P(대한민국 출원특허 10-2016-0030092)균주를 이용하여 돌연변이주를 수득하였다. KCCM11795P 균주를 활성화 배지에서 16시간 동안 배양하여 활성화된 균주를 종배지에 접종하여 14시간 동안 배양한 후, 배양액 5 ㎖를 회수하였다. 회수한 배양액을 100 mM 시트르산 완충용액(citric buffer)으로 세척한 후, NTG(N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)를 최종농도 200 mg/L가 되게 첨가한 후, 20분 동안 처리하고, 100 mM 인산 완충용액(phosphate buffer)으로 세척하였다. NTG로 처리된 균주를 최소배지에 도말하여 사멸율을 계산해본 결과 사멸율은 85%였다.
L-히스티딘의 유도체에 해당하는 1, 2, 4-트리아졸-3-알라닌(TRA)에 대한 내성 변이주를 구하기 위해서, NTG가 처리된 균주를 1, 2, 4-트리아졸-3-알라닌이 각각 0.2 g/L, 0.5 g/L, 1 g/L 농도로 첨가된 최소배지에 도말 하고, 30℃에서 5일간 배양하여 세 가지 농도에서 찾은 변이주 중 히스티딘 생산능이 가장 높아진 1, 2, 4-트리아졸-3-알라닌 내성 인공돌연변이주를 획득하였고, 본 균주를 CA14-0682로 명명 하였다.
<활성화배지>
육즙 1%, 폴리펩톤 1%, 소듐클로라이드 0.5%, 효모엑기스 1%, 한천 2%, pH 7.2
<종배지>
포도당 5%, 박토펩톤 1%, 소듐클로라이드 0.25%, 효모엑기스 1%, 요소 0.4%, pH 7.2
<최소배지>
포도당 1.0%, 황산암모늄 0.4%, 황산마그네슘 0.04%, 인산제1칼륨 0.1%, 요소 0.1%, 티아민 0.001%, 비오틴 200 ㎍/L, 한천 2%, pH 7.0
선별된 CA14-0682 균주의 L-히스티딘 생산능 및 L-글리신 생성량을 확인하기 위하여 아래와 같은 방법으로 배양하였다. 종 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30 ℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30 ℃에서 24시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC에 의해 L-히스티딘 및 L-글리신 생산량을 측정하였다.
<생산배지>
포도당 5%, 황산암모늄 2%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.05%, CSL(옥수수 침지액) 2.0%, 비오틴 200 ㎍/L, 탄산칼슘, pH 7.2,
CA14-0682 균주의 L-히스티딘 및 L-글리신 생산량
OD 사용한 포도당
(g/L) 		히스티딘 생산량 (g/L) 글리신 생산량 (g/L)
KCCM11795P 110.2 100 2.99 1.41
CA14-0682 50.1 100 14.25 6.99
배양 결과를 통해 고농도 TRA에 대한 내성을 갖는 인공돌연변이주 CA14-0682 균주가 15% 수준 수율의 L-히스티딘 생산능을 갖는 것을 확인하였다.
상기 CA14-0682균주는 한국미생물보존센터(KCCM)에 안전 기탁하여 KCCM 80179로 기탁번호를 부여받았다.
실시예 2. 코리네박테리움 암모니아게네스 유래 글리신 트랜스포터(CycA(Cam)) 도입 벡터 제작
코리네박테리움 글루타미쿰 염색체 내에 코리네박테리움 암모니아게네스 유래 CycA 단백질(이하, CycA(Cam), 서열번호 1)을 암호화하는 유전자 cycA(이하, cycA(cam), 서열번호 2)를 삽입하기 위해 코리네박테리움 글루타미쿰에서 purU를 삽입 site로 이용하였다(Journal of Biotechnology 104, 5-25 Jorn Kalinowski et al, 2003). purU 결손 및 타겟 유전자 삽입 벡터를 제작하기 위해 ATCC13032의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 3 와 서열번호 4, 서열번호 5 과 서열번호 6의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 각각 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 각각 1606bp의 del-purU(서열번호 7)와 1625bp의 del-purU(서열번호 8)의 DNA 단편을 수득하였다. 수득한 DNA산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제한 후 pDZ(대한민국 등록 특허 제10-0924065호) 벡터와 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 클로닝함으로써 purU 결손 및 타겟 유전자 삽입용 벡터 pDZΔpurU을 제작하였다.
프로모터와 연결된 형태의 cycA(Cam) DNA 단편(이하, Pn-cycA(Cam))을 수득하기 위해 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 염색체를 주형으로 하여 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 90초를 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 1970bp의 Pn-cycA(cam) DNA 단편을 수득하였으며, 이 증폭산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다(서열번호 11). 수득한 DNA산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제한 후 상기 제작된 pDZΔpurU 벡터와 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 클로닝함으로써 cycA(Cam)도입 벡터 pDZΔpurU::Pn-cycA(Cam)을 제작하였다.
실시예 3. CA14-0682 균주 유래 글리신 트랜스포터 도입 균주 제작 및 히스티딘 생산능 평가
상기 실시예 2에서 제작된 벡터 pDZΔpurU::Pn-cycA(cam)을 CA14-0682 균주에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상의 purU 유전자가 Pn-cycA(cam) 형태로 치환되어 있는 균주를 제작하였으며, 이를 CA14-0682 ΔpurU::Pn-cycA(cam)로 명명하였다.
제작된 CA14-0682ΔpurU 균주, CA14-0682ΔpurU::Pn-cycA(Cam)균주의 L-히스티딘 생산능 및 L-글리신 생성량을 확인하고자 실시예 1에서 수행한 방법으로 배양하였다.
CA14-0682 유래 cycA(cam) 도입균주의 L-히스티딘 및 L-글리신 생산량
OD 사용한
포도당
(g/L) 		히스티딘 생산량 (g/L) 글리신 생산량 (g/L)
CA14-0682 50.2 100 14.85 7.41
CA14-0682ΔpurU 50.1 100 14.88 7.42
CA14-0682ΔpurU::Pn-cycA(Cam) 49.7 100 15.49 6.51
평가 결과 모균주 CA14-0682 균주는 L-히스티딘 14.85 g/L, L-글리신 7.41 g/L 수준의 생성능을 나타내었고, purU 결손 균주는 L-히스티딘 생산능이 모균주 대비 동등수준인 반면 CA14-0682ΔpurU::Pn-cycA(Cam)균주는 L-히스티딘 생산능이 4.3% 증가되고, L-글리신 생산량이 13.8% 감소되었다. 이를 통해 세포 밖의 L-글리신을 글리신 유입 유전자 도입을 통해 세포 안으로 유입시키면 L-히스티딘 생성능이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. CycA(Cam) 과발현 재조합 벡터 제작
세포내 cycA(Cam)을 더욱 강하게 발현시키기 위하여 cycA(Cam) 과발현 재조합 벡터를 제작하였다. 공지된 코리네박테리움 속 미생물 유래의 프로모터 pcj7(대한민국 등록특허 제10-0620092호)와 공지된 세린 하이드록시메틸트렌스퍼라제를 코딩하는 유전자 glyA의 프로모터(이하, PglyA)를 사용하였다.
pcj7 프로모터 DNA 단편을 수득하기 위해 pcj7을 포함하는 p117-cj7-gfp를 주형으로 하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 반응은 서열번호 12및 서열번호 13의 프라이머를 사용하여 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 30초를 28회 반복한 후, 72℃에서 1분간 중합반응을 수행하였다. 이로부터 증폭된 PCR 결과물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 350bp 크기의 pcj7 단편을 수득하였다.
5'에 pcj7 서열 일부를 포함하는 cycA(Cam) DNA 단편을 수득하기 위해 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 염색체를 주형으로 하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 반응은 서열번호 14및 서열번호 10의 프라이머를 사용하여 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 30초를 28회 반복한 후, 72℃에서 1분간 중합반응을 수행하였다. 이로부터 증폭된 PCR 결과물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 1647bp 크기의 5'에 pcj7 서열 일부를 포함하는 cycA(Cam) 단편을 수득하였다.
위에서 수득한 pcj7 단편과 cycA(Cam) 단편을 주형으로 하고, 서열번호 12및 서열번호 10의 프라이머를 사용하여 융합(sewing) PCR을 실시하였다. PCR 반응은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 1964bp의 pcj7-cycA(Cam) 유전자 단편을 수득하였으며, 이 증폭산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다(서열번호 15). 수득한 DNA산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제한 후 상기 제작된 pDZΔpurU 벡터와 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 클로닝함으로써 purU 유전자를 pcj7-cycA(Cam) 유전자로 치환시키는 벡터 pDZΔpurU::pcj7-cycA(Cam)을 제작하였다.
또한, PglyA DNA단편을 수득하기 위해 ATCC13032의 염색체를 주형으로 하여 PCR을실시하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 반응은 서열번호 16및 서열번호 17의 프라이머를 사용하여 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 30초를 28회 반복한 후, 72℃에서 1분간 중합반응을 수행하였다. 이로부터 증폭된 PCR 결과물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 340bp 크기의 PglyA 단편을 수득하였다.
5'에 PglyA 서열 일부를 포함하는 cycA(Cam) DNA 단편을 수득하기 위해 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 염색체를 주형으로 하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 반응은 서열번호 18및 서열번호 10의 프라이머를 사용하여 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 30초를 28회 반복한 후, 72℃에서 1분간 중합반응을 수행하였다. 이로부터 증폭된 PCR 결과물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 1647bp 크기의 5'에 PglyA 서열 일부를 포함하는 cycA(Cam) 단편을 수득하였다.
위에서 수득한 PglyA 단편과 cycA(Cam) 단편을 주형으로 하고, 서열번호 16 및 서열번호 10의 프라이머를 사용하여 융합(sewing) PCR을 실시하였다. PCR 반응은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 1963bp의 PglyA-cycA(Cam) 유전자 단편을 수득하였으며, 이 증폭산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다(서열번호 19). 수득한 DNA산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제한 후 상기 제작된 pDZΔpurU 벡터와 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 클로닝함으로써 purU 유전자를 PglyA-cycA(Cam) 유전자로 치환시키는 벡터 pDZΔpurU::PglyA-cycA(Cam)을 제작하였다.
실시예 5. 대장균 유래 글리신 트랜스포터(CycA(Eco)) 도입 벡터 제작
한편, 코리네박테리움 암모니아게네스 유래 CycA 단백질과 그 활성을 비교하기 위해 기공지된 대장균 K-12 유래의 CycA 단백질(이하 CycA(Eco), 서열번호 20)(Microbiology, 141(Pt 1); 133-40, 1995)을 암호화하는 유전자 cycA(이하, cycA(Eco), 서열번호 21)를 pcj7과 작동 가능하도록 연결하여 도입하기 위한 벡터를 제작하였다.
pcj7 프로모터 DNA 단편을 수득하기 위해 pcj7을 포함하는 p117-cj7-gfp를 주형으로 하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 반응은 서열번호 12및 서열번호 22의 프라이머를 사용하여 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 30초를 28회 반복한 후, 72℃에서 1분간 중합반응을 수행하였다. 이로부터 증폭된 PCR 결과물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 350bp 크기의 pcj7 단편을 수득하였다.
5'에 pcj7 서열 일부를 포함하는 cycA(Eco) 유전자 단편을 수득하기 위해 대장균 K-12 W3110 염색체를 주형으로 하여 서열번호 23 및 서열번호 24의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 1659bp의 cycA(Eco) 유전자 단편을 수득하였으며, 이 증폭산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다.
상기 pcj7 단편과 cycA(Eco) 단편을 주형으로 하고, 서열번호 12 및 서열번호 24의 프라이머를 사용하여 융합(sewing) PCR을 실시하였다. PCR 반응은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 90초를 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 1985bp의 pcj7-cycA(Eco) 유전자 단편을 수득하였다(서열번호 25). 이 증폭산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제한 후 pDZΔpurU 벡터에 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 purU 유전자를 pcj7-cycA(Eco) 유전자로 치환시키는 벡터 pDZΔpurU::pcj7-cycA(Eco)를 제작하였다.
실시예 6. CA14-0682 균주 유래 cycA(Cam) 또는 cycA(Eco) 과발현 균주 제작 및 히스티딘 생산능 비교
CA14-0682 균주를 모균주로 cycA(Cam) 또는 cycA(Eco) 과발현 균주를 제작하기 위하여 제작된 벡터4종(pDZΔpurU, pDZΔpurU::pcj7-cycA(Cam), pDZΔpurU::PglyA-cycA(Cam), pDZΔpurU::pcj7-cycA(Eco))을 각각 전기천공법으로 CA14-0682 균주에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상의 purU 결실 및 pcj7-cycA(Cam) 또는 PglyA-cycA(Cam) 또는 pcj7-cycA(Eco) 형태로 치환되어 있는 균주를 얻었다. 상기 과정을 통해 균주 4종 (CA14-0682ΔpurU, CA14-0682ΔpurU::pcj7-cycA(Cam), CA14-0682ΔpurU::PglyA-cycA(Cam), CA14-0682ΔpurU::pcj7-cycA(Eco))을 제작하였다.
제작된 4종 균주의 L-히스티딘 생산능 및 L-글리신 생성량을 확인하기 위하여 실시예 1과 동일한 방법으로 배양하였다
CA14-0682 유래 cycA 도입균주의 L-히스티딘 및 L-글리신 생산량
OD 사용한
포도당
(g/L) 		히스티딘 생산량 (g/L) 글리신 생산량 (g/L)
CA14-0682 50.3 100 15.11 7.46
CA14-0682ΔpurU 50.5 100 15.05 7.42
CA14-0682ΔpurU::pcj7_cycA(Cam) 40.1 100 16.18 5.99
CA14-0682ΔpurU::PglyA_cycA(Cam) 44.7 100 16.14 5.89
CA14-0682ΔpurU::pcj7_cycA(Eco) 51.3 100 15.01 7.25
평가 결과 대장균 유래 cycA가 도입된 CA14-0682ΔpurU::pcj7-cycA(Eco) 균주의 경우 Gly 유입능이 거의 없고 모균주 대비 동등 수준 이하의 히스티딘 생산능을 나타냈다. 반면, 코리네박테리움 암모니아게네스 유래 cycA가 강화 도입된 CA14-0682ΔpurU::pcj7-cycA(Cam) 균주와 CA14-0682ΔpurU::PglyA_cycA(Cam) 균주의 경우 Gly생산능이 감소하고, 히스티딘 생산능이 모균주 대비 각각 7.1%, 6.8% 증가됨을 확인할 수 있었다. 이를 통해 코리네박테리움 글루타미쿰 내에 도입된 코리네박테리움 암모니아게네스 유래 cycA가 대장균 유래 cycA보다 더 높은 글리신 유입능을 갖고 유입된 글리신을 통해 히스티딘 생산능 증가에 더 큰 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한, cycA(Cam)를 도입한 경우 glyA 프로모터를 통해 발현 시킬 경우 Cellmass 확보에 좀 더 유리함을 확인하였다. 상기 CA14-0682ΔpurU::PglyA-cycA(Cam) 균주를 CA14-0682-cycA(Cam) 균주로 명명하였다.
실시예 7. 코리네박테리움 암모니아게네스 유래 글리신 분해 시스템 도입 벡터 제작
앞서 히스티딘 생산능 증가에 글리신 트랜스포터의 활성이 영향을 미침을 확인하였으므로, 세포내로 유입된 글리신의 세포내 이용능을 더욱 증가시키는 경우의 히스티딘 생산능을 확인하고자 하였다. 구체적으로는 글리신 분해 시스템(Glycine Cleavage System,이하 GCV system)을 도입하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 내에는 GCV system을 구성하는 단백질 6종 중 L-단백질, LipB, LipA을를 코딩하는 유전자만 알려져 있을 뿐 나머지 -3종 단백질을 코딩하는 유전자는 알려진 바 없다. 따라서 코리네박테리움 암모니아게네스 유래 GCV system을 도입하기 위하여 P-단백질(서열번호 26), T-단백질(서열번호 27), H-단백질(서열번호 28), LipA(서열번호 29), LipB(서열번호 30)를 코딩하는 유전자(gcvP(서열번호 31), gcvT(서열번호 32), gcvH(서열번호 33), lipA(서열번호 34), lipB(서열번호 35)) 도입 벡터를 제작하였다. 상기 유전자들은 코리네박테리움 암모니아게네스 염색체 내에 2쌍의 오페론(gcvP-gcvT, gcvH-lipB-lipA)을 형성하고 있다(이하, gcvPT, gcvH-lipBA). GCV system을 도입하기 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰의 트렌스포존을 코딩하는 유전자 중 NCgl2131 유전자를 삽입 site로 사용하였다(Journal of Biotechnology 104, 5-25 Jorn Kalinowski et al, 2003). NCgl2131 유전자를 gcv 시스템 유전자들로 치환하기 위하여 NCgl2131 결손 및 타겟 유전자 삽입 벡터를 제작하였다. 벡터를 제작하기 위해 ATCC13032의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 36 와 서열번호 37, 서열번호 38 과 서열번호 39의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 각각 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 각각 531bp의 del-N2131L(서열번호 40)와 555bp의 del-N2131R(서열번호 41)의 DNA 단편을 수득하였다. 수득한 DNA산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제한 후 pDZ 벡터와 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 클로닝함으로써 NCgl2131유전자결손 및 타겟 유전자 삽입용 벡터 pDZΔN2131을 제작하였다.
프로모터와 연결된 형태의 gcvPT 유전자 단편(이하, Pn_gcvPT(cam))을 수득하기 위해 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 염색체를 주형으로 하여 서열번호 42 및 서열번호 43의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 5분을 28회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 프로모터를 포함한 4499bp의 Pn_gcvPT(Cam) 유전자 단편을 수득하였으며, 이 증폭산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다(서열번호 44).
프로모터와 연결된 형태의 gcvH-lipBA 유전자 단편(이하, Pn_gcvH-lipBA(Cam))을 수득하기 위해 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 염색체를 주형으로 하여 서열번호 45 및 서열번호 46의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 28회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 프로모터를 포함한 3053bp의 Pn_gcvH-lipBA(Cam) 유전자 단편을 수득하였으며, 이 증폭산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다 (서열번호 47).
상기 수득한 Pn_gcvPT(Cam) 단편, Pn_gcvH-lipBA(Cam) 단편을 주형으로 하고, 서열번호 42 및 서열번호 46의 프라이머를 사용하여 융합(sewing) PCR을 실시하였다. PCR 반응은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 10분을 28회 반복한 후, 72℃에서 12분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 8259bp의 Pn_gcvPT(Cam)_Pn-gcvH-lipBA(Cam) 유전자 단편을 수득하였으며, 이 증폭산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 제작된 pDZΔN2131 벡터와 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 클로닝함으로써 NCgl2131 유전자를 Pn_gcvPT(Cam)-Pn_gcvH-lipBA(Cam) 유전자로 치환시키는 벡터 pDZΔN2131::GCV(Cam)을 제작하였다.
실시예 8. CA14-0682 균주 유래 글리신 분해 시스템 및 글리신 트랜스포터 도입 균주 제작 및 히스티딘 생산능 평가
상기 실시예 7에서 제작된 벡터 pDZΔN2131, pDZΔN2131::GCV(Cam)을 CA14-0682 균주와 CA14-0682-cycA(Cam) 균주에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 NCgl2131 유전자 결실 균주(CA14-0682-cycA(Cam)ΔN2131), 글리신 분해 시스템 단독 도입 균주 및 글리신 분해 시스템과 글리신 트랜스포터가 모두 도입된 균주 2종(CA14-0682ΔN2131::GCV(Cam), CA14-0682-cycA(Cam)ΔN2131::GCV(Cam))을 제작하였다. 제작된 CA14-0682-cycA(Cam)ΔN2131, CA14-0682ΔN2131::GCV(Cam) 균주, CA14-0682-cycA(Cam) ΔN2131::GCV(Cam) 균주의 L-히스티딘 생산능 및 L-글리신 생성량을 확인하고자 실시예 1에서 수행된 방법으로 배양하였다.
CA14-0682 유래 cycA(cam) 및 글리신 분해시스템 도입균주의 L-히스티딘 및 L-글리신 생산량
OD 사용한
포도당 (g/L) 		히스티딘
생산량 (g/L) 		글리신
생산량 (g/L)
CA14-0682 53.6 100 15.05 7.47
CA14-0682- cycA(Cam)ΔN2131 45.1 100 16.19 6.68
CA14-0682ΔN2131::GCV(Cam) 48.9 100 16.52 4.72
CA14-0682-cycA(Cam)ΔN2131::GCV(Cam) 42.3 100 17.11 2.31
평가 결과 글리신 유입자 cycA(Cam)만 도입된 CA14-0682-cycA(Cam)ΔN2131 균주의 경우 CA14-0682 균주 대비 히스티딘 생성량은 7.6% 증가되고, 글리신 생성량은 10.6% 감소되었으며, 표3의 CA14-0682ΔpurU::PglyA_cycA(Cam)(CA14-0682-cycA(Cam)로 명명)균주 결과와 동등수준으로 확인되었다. 글리신 분해 시스템이 도입된 CA14-0682ΔN2131::GCV(Cam)균주의 경우 CA14-0682 균주 대비 히스티딘 생성량은 9.8% 증가되고 글리신 생성량이 36.8% 감소되었다. 반면, CA14-0682-cycA(Cam)ΔN2131 균주에 추가적으로 GCV가 도입된 CA14-0682-cycA(Cam)ΔN2131::GCV(Cam) 균주는 히스티딘 생성량은 13.7% 증가되고 글리신 생성량은 모균주 대비 69.1% 감소되었다. 따라서 글리신 유입자 또는 글리신 분해 유전자만 도입되어도 히스티딘 생산성 증가 및 글리신 생산량 감소에 효과가 있지만 글리신 분해 시스템과 함께 도입되면 세포 내 생성되는 글리신이 분해되면서 히스티딘 생성능이 더욱 크게 증가됨을 확인하였다.
실시예 9. 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 L-히스티딘 생산 균주 제작
다음으로, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서 CycA 도입 및 GCV system 도입의 효과를 확인하기 위해, 먼저 야생형의 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주로부터 L-히스티딘 생산균주를 개발하였다.
실시예 9-1: HisG 폴리펩티드 변이 도입
먼저, L-히스티딘 생합성 경로의 첫번째 효소인 HisG 폴리펩티드의 피드백 제한(Feedback inhibition)을 해소하기 위해 HisG의 N-말단으로부터 233번째와 235번째 아미노산을 각각 글리신(Glycine)에서 히스티딘(histidine)(이하, G233H 변이), 쓰레오닌(Threonine)에서 글루타민(Glutamine)(이하, T235Q)로 동시에 치환하였다 (서열번호 48) (ACS Synth. Biol., 2014, 3 (1), pp 21-29).
구체적으로, hisG 폴리펩티드 변이를 삽입하기 위한 벡터를 제작하기 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 49과 서열번호 50의 프라이머를 이용하여 hisG 폴리펩티드의 233번, 235번 잔기 업스트림 (Upstream) 지역(이하, G233H,T235Q-5')을, 서열번호 51와 서열번호 52의 프라이머를 이용하여 hisG 폴리펩티드의 233번, 235번 잔기 다운스트림 (Downsteam) 지역(이하, G233H,T235Q-3')의 유전자 단편을 PCR을 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
증폭된 G233H,T235Q-5' 단편과 G233H,T235Q-3' 단편을 pDZ와 깁슨 어셈블리 (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) 방법을 이용하여 클로닝함으로써 hisG 폴리펩티드 변이 도입 벡터 pDZ-hisG(G233H, T235Q)를 제작하였다.
제작된 pDZ-hisG(G233H, T235Q) 벡터를 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 HisG 폴리펩티드의 233번, 235번 아미노산이 각각 글라이신에서 히스티딘, 쓰레오닌에서 글루타민으로 교체된 균주를 얻었다. 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 53와 서열번호 54을 이용한 PCR 법과 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였으며, 이를 CA14-0011 로 명명하였다.
실시예 9-2: 히스티딘 생합성 경로 강화
다음으로, L-히스티딘 생합성 경로 강화를 위해, 총 4개의 오페론(operon)으로 분리되어 있는 생합성 유전자들을 프로모터가 치환된 형태의 cluster로 제작하여 도입하였다. 구체적으로, 총 4개의 오페론(operon)(hisE-hisG, hisA-impA-hisF-hisI, hisD-hisC-hisB, cg0911-hisN)으로 분리되어 있는 생합성 유전자들을 기존에 공지된 바 있는 합성 프로모터 3종(lysCP1(대한민국 등록특허 제10-0930203호), pcj7, 또는 SPL13(대한민국 등록특허 제10-1783170 B1)) 또는 gapA 유전자 프로모터와 작동 가능하게 연결하고 각 오페론을 clustering하여 한꺼번에 도입하였다. 삽입 부위는 감마-아미노부티레이트 퍼미아제를 코딩하는 Ncgl1108 유전자(Microb Biotechnol. 2014 Jan;7(1):5-25)를 사용하였다.
구체적인 실험 방법은 다음과 같다. NCgl1108 유전자 결손 벡터를 제작하기 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 55와 서열번호 56의 프라이머를 이용하여 NCgl1108 업스트림 (Upstream) 지역(이하, N1108-5')을, 서열번호 57과 서열번호 58의 프라이머를 이용하여 Ncgl1108 다운스트림 (Downsteam) 지역(이하, N1108-3')의 유전자 단편을 PCR을 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 증폭된 N1108-5' 단편과 N1108-3' 단편을 pDZ와 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 NCgl1108 결손 벡터 pDZΔN1108 벡터를 제작하였다.
제작된 pDZ-ΔNCgl1108 벡터를 CA14-0011 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 NCgl1108 유전자가 파쇄된 균주를 얻었다. 유전자가 파쇄된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 59과 서열번호 60를 이용한 PCR 법과 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였으며, 이를 CA14-0736 로 명명하였다.
히스티딘 생합성 cluster 강화를 위해 4개의 오페론 유전자군과 치환할 프로모터 부분을 확보하고자 하였다. lysCP1 프로모터 단편과 hisE-hisG 단편, gapA 프로모터 단편과 hisA-impA-hisF-hisI 단편, SPL13 단편과 hisD-hisC-hisB 단편, pcj7 단편과 cg0911-hisN 단편을 수득하였다.
lysCP1 DNA단편을 수득하기 위해 KCCM10919P 균주(대한민국 등록특허 제10-0930203호)의 염색체를 주형으로 하여 PCR을실시하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 반응은 서열번호 61 및 서열번호 62의 프라이머를 사용하여 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 30초를 28회 반복한 후, 72℃에서 1분간 중합반응을 수행하였다. 이로부터 증폭된 PCR 결과물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 lysCP1 단편을 수득하였다.
hisE-hisG 유전자 단편을 수득하기 위해 CA14-0011 균주의 염색체를 주형으로 PCR을 실시하였다. PCR 반응은 서열번호 63 및 서열번호 64의 프라이머를 사용하여 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 이로부터 증폭된 PCR 결과물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 hisE-hisG 단편을 수득하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 유래 gapA 유전자의 프로모터 DNA 단편(이하, PgapA)을 수득하기 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 염색체를 주형으로 PCR을 실시하였다. PCR 반응은 서열번호 65 및 서열번호 66의 프라이머를 사용하여 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 이로부터 증폭된 PCR 결과물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 PgapA 단편을 수득하였다.
hisA-impA-hisF-hisI 유전자 단편을 수득하기 위해 CA14-0011 균주의 염색체를 주형으로 PCR을 실시하였다. PCR 반응은 서열번호 67 및 서열번호 68의 프라이머를 사용하여 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 이로부터 증폭된 PCR 결과물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 hisA-impA-hisF-hisI 단편을 수득하였다.
SPL13 DNA 단편을 수득하기 위해 SPL13 DNA를 주형으로 PCR을 실시하였다. PCR 반응은 서열번호 69 및 서열번호 70의 프라이머를 사용하여 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 이로부터 증폭된 PCR 결과물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 SPL13 DNA 단편을 수득하였다.
pcj7 프로모터 DNA 단편을 수득하기 위해 pcj7을 포함하는 p117-cj7-gfp를 주형으로 하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 반응은 서열번호 71 및 서열번호72 의 프라이머를 사용하여 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 30초를 28회 반복한 후, 72℃에서 1분간 중합반응을 수행하였다. 이로부터 증폭된 PCR 결과물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 pcj7 단편을 수득하였다.
hisD-hisC-hisB 유전자 단편을 수득하기 위해 CA14-0011 균주의 염색체를 주형으로 PCR을 실시하였다. PCR 반응은 서열번호 73 및 서열번호 74의 프라이머를 사용하여 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 5분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 이로부터 증폭된 PCR 결과물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 hisD-hisC-hisB 유전자 단편을 수득하였다.
cg0911-hisN 유전자 단편을 수득하기 위해 CA14-0011 균주의 염색체를 주형으로 PCR을 실시하였다. PCR 반응은 서열번호 75 및 서열번호 76의 프라이머를 사용하여 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 5분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 이로부터 증폭된 PCR 결과물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 cg0911-hisN 유전자 단편을 수득하였다.
수득한 lysCP1 DNA 단편, hisE-hisG DNA 단편, PgapA DNA 단편, hisA-impA-hisF-hisI DNA 단편, SPL13 DNA 단편, hisD-hisC-hisB DNA 단편, pcj7 DNA 단편, cg0911-hisN DNA 단편을 pDZ-ΔNcgl1108 벡터와 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 L-히스티딘 생합성 강화 cluster 도입벡터 pDZ-ΔNcgl1108::lysCP1_hisEG-PgapA_hisA-impA-hisFI-SPL13_HisDCB-pcj7_cg0911-hisN을 제작하였다.
제작된 pDZ-ΔNcgl1108::lysCP1_hisEG-PgapA_hisA-impA-hisFI-SPL13_hisDCB-pcj7_cg0911-hisN 벡터를 CA14-0011 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 생합성 유전자가 삽입된 균주를 얻었다. 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 59과 서열번호 60를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였으며, 이를 CA14-0737 로 명명하였다.
상기 CA14-0737균주를 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제 기탁하여 KCCM 12411P로 기탁번호를 부여받았다.
실시예 10. CA14-0737 균주 유래 글리신 트랜스포터 및 글리신 분해 시스템 도입 균주 제작
상기 제작된 벡터 4종(pDZΔpurU, pDZΔpurU::PglyA-cycA(Cam), pDZΔpurU::pcj7-cycA(Cam) pDZΔpurU::pcj7-cycA(Eco)을 CA14-0737 균주에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 purU 유전자 결실 균주, cycA(Cam) 도입 균주, cycA(Eco) 도입 균주를 제작하였으며, 이를 CA14-0737ΔpurU, CA14-0737ΔpurU::PglyA-cycA(Cam), CA14-0737ΔpurU::pcj7-cycA(Cam), CA14-0737ΔpurU::pcj7-cycA(Eco)을 제작하였다. 제작된 CA14-0737ΔpurU, CA14-0737ΔpurU::PglyA-cycA(Cam), CA14-0737ΔpurU::pcj7-cycA(Cam), CA14-0737ΔpurU::pcj7-cycA(Eco) 균주의 L-히스티딘 생산능 및 L-글리신 생성량을 확인하고자 실시예 1에서 수행된 방법으로 배양하였다.
CA14-0737 유래 cycA 도입균주의 L-히스티딘 및 L-글리신 생산량
OD 사용한
포도당
(g/L) 		히스티딘 생산량 (g/L) 글리신
생산량 (g/L)
CA14-0737 88.4 100 4.11 2.21
CA14-0737ΔpurU 87.9 100 4.20 2.24
CA14-0737ΔpurU::PglyA-cycA(Cam) 87.4 100 4.93 1.90
CA14-0737ΔpurU::pcj7-cycA(Cam) 84.1 100 4.97 1.95
CA14-0737ΔpurU::pcj7-cycA(Eco) 88.9 100 4.29 2.20
평가 결과 대장균 유래 cycA가 도입된 CA14-0737ΔpurU::pcj7-cycA(Eco) 균주의 경우 Gly 유입능이 거의 없어 모균주 대비 동등 수준의 히스티딘 생산능을 나타냈다. 반면, 코리네박테리움 암모니아게네스 유래 cycA가 강화 도입된 CA14-0737ΔpurU::pcj7-cycA(Cam) 균주의 경우 히스티딘 생산능은 모균주 대비 20.9% 증가되고 글리신 생성량은 11.8% 감소됨을 확인할 수 있었다. cycA(Cam)을 glyA 프로모터를 통해 발현 시킨 균주 또한 히스티딘 생산능은 20% 증가되고, 글리신 생성량이 14% 감소되었다. 이를 통해 코리네박테리움 글루타미쿰 내에 도입된 코리네박테리움 암모니아게네스 유래 cycA가 대장균 유래 cycA보다 더 높은 글리신 유입능을 갖고 유입된 글리신을 통해 히스티딘 생산능 증가에 더 큰 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 이 중 CA14-0737ΔpurU::PglyA-cycA(Cam) 균주를 CA14-0737-cycA(Cam)으로 명명하였다.
실시예 7에서 제작된 벡터 pDZΔN2131, pDZΔN2131::GCV(Cam)을 CA14-0737 균주와 CA14-0737-cycA(Cam) 균주에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 NCgl2131 유전자 결실 균주(CA14-0737-cycA(Cam)ΔN2131), 글리신 분해 시스템 단독 도입 균주 및 글리신 분해 시스템과 글리신 트랜스포터가 모두 도입된 균주 2종(CA14-0737ΔN2131::GCV(Cam), CA14-0737-cycA(Cam) ΔN2131::GCV(Cam))을 제작하였다. 제작된 CA14-0737-cycA(Cam) ΔN2131 균주, CA14-0737ΔN2131::GCV(Cam) 균주, CA14-0737-cycA(Cam) ΔN2131::GCV(Cam) 균주의 L-히스티딘 생산능 및 L-글리신 생성량을 확인하고자 실시예 1에서 수행된 방법으로 배양하였다.
CA14-0737 유래 cycA(cam) 및 글리신 분해시스템 도입균주의 L-히스티딘 및 L-글리신 생산량
OD 사용한
포도당 (g/L) 		히스티딘
생산량 (g/L) 		글리신
생산량 (g/L)
CA14-0737 88.1 100 4.15 2.17
CA14-0737-cycA(Cam)ΔN2131 75.1 100 4.89 1.48
CA14-0737ΔN2131::GCV(Cam) 78.2 100 5.42 0.94
CA14-0737-cycA(Cam)ΔN2131::GCV(Cam) 71.3 100 5.97 0.46
평가 결과 글리신 트랜스포터 cycA(Cam)만 도입된 CA14-0737-cycA(Cam) ΔN2131 균주의 경우 모균주 대비 히스티딘 생성량은 17.8% 증가되고, 글리신 생성량이 13% 감소되었고, 글리신 트랜스포터 cycA(cam)과 GCV가 동시에 도입된 CA14-0737-cycA(Cam) ΔN2131::GCV(Cam) 균주는 히스티딘 생성량은 43.9% 증가되고 글리신 생성량은 모균주 대비 78.8% 감소되었다. 글리신 분해 시스템이 도입된 CA14-0737ΔN2131::GCV(Cam)균주의 경우 모균주 대비 히스티딘 생성량은 30.6% 증가되고 글리신 생성량이 56.7% 감소되었으나 여전히 배양액에 글리신은 축적되고, 히스티딘 생산성 또한 cycA(Cam)과 동시에 도입된 균주 대비 낮은 것을 확인하였다. 따라서 글리신 트랜스포터 또는 글리신 분해 시스템만 도입되도 히스티딘 생산성 증가 및 글리신 생산량 감소에 효과가 있지만 글리신 트랜스포터와 글리신 분해 시스템이 함께 도입되면 세포 내 생성되는 글리신이 분해되면서 히스티딘 생성능이 더욱 크게 증가됨을 확인하였다. CA14-0737-cycA(Cam) 균주는 CA14-0777로 명명하고, CA14-0737-cycA(Cam)ΔN2131::GCV(Cam) 균주는 CA14-0809로 명명하여, 상기 2종의 균주를 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제 기탁하여 각각 KCCM12488P, KCCM12489P 로 기탁번호를 부여받았다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM12411P 20181127 한국미생물보존센터(국외) KCCM12488P 20190415 한국미생물보존센터(국외) KCCM12489P 20190415
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Microorganisms with enhanced ability to produce L-histidine and methods for producing L-histidine using the same <130> KPA181624-KR <160> 76 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 476 <212> PRT <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 1 Met Ala Ser Tyr Asp Pro Gly His Ser Gln Val Lys Asn Thr Gly Val 1 5 10 15 Glu Leu Asp Ser His Val Glu Ser Asp His Leu Gln Arg Gly Leu Ser 20 25 30 Asn Arg His Ile Gln Leu Ile Ala Ile Gly Gly Ala Ile Gly Thr Gly 35 40 45 Leu Phe Met Gly Ser Gly Lys Thr Ile Ser Leu Ala Gly Pro Ser Val 50 55 60 Ile Leu Val Tyr Gly Ile Ile Gly Phe Met Leu Phe Phe Val Met Arg 65 70 75 80 Ala Met Gly Glu Leu Leu Leu Ser Asn Leu Asn Tyr Lys Ser Leu Arg 85 90 95 Asp Ala Val Ser Asp Ile Leu Gly Pro Thr Ala Gly Phe Val Cys Gly 100 105 110 Trp Thr Tyr Trp Phe Cys Trp Ile Val Thr Gly Met Ala Asp Val Val 115 120 125 Ala Ile Thr Gly Tyr Thr Gln Tyr Trp Trp Pro Asp Ile Ala Leu Trp 130 135 140 Ile Pro Gly Ala Leu Thr Ile Leu Leu Leu Leu Gly Leu Asn Leu Val 145 150 155 160 Ala Val Arg Leu Phe Gly Glu Leu Glu Phe Trp Phe Ala Ile Ile Lys 165 170 175 Leu Val Ala Ile Thr Ala Leu Ile Leu Val Gly Ala Val Met Val Ile 180 185 190 Ser Arg Phe Gln Ser Pro Asp Gly Asp Ile Ala Ala Val Ser Asn Leu 195 200 205 Ile Asp His Gly Gly Phe Phe Pro Asn Gly Ile Thr Gly Phe Leu Ala 210 215 220 Gly Phe Gln Ile Ala Ile Phe Ala Phe Val Gly Val Glu Leu Ala Gly 225 230 235 240 Thr Ala Ala Ala Glu Thr Lys Asp Pro Glu Lys Asn Leu Pro Arg Ala 245 250 255 Ile Asn Ser Ile Pro Ile Arg Ile Val Val Phe Tyr Ile Leu Ala Leu 260 265 270 Ala Val Ile Met Met Val Thr Pro Trp Asp Lys Val His Ser Asp Ser 275 280 285 Ser Pro Phe Val Gln Met Phe Ala Leu Ala Gly Leu Pro Ala Ala Ala 290 295 300 Gly Ile Ile Asn Phe Val Val Leu Thr Ser Ala Ala Ser Ser Ala Asn 305 310 315 320 Ser Gly Ile Phe Ser Thr Ser Arg Met Leu Phe Gly Leu Ala Arg Glu 325 330 335 Gly Gln Ala Pro Lys Arg Trp Gly Ile Leu Ser Arg Asn Gln Val Pro 340 345 350 Ala Arg Gly Leu Leu Phe Ser Val Ala Cys Leu Val Pro Ser Leu Ala 355 360 365 Ile Leu Tyr Ala Gly Ala Ser Val Ile Asp Ala Phe Thr Leu Ile Thr 370 375 380 Thr Val Ser Ser Val Leu Phe Met Val Val Trp Ser Leu Ile Leu Ala 385 390 395 400 Ala Tyr Leu Val Phe Arg Arg Lys Phe Pro Glu Arg His Ala Ala Ser 405 410 415 Lys Phe Lys Val Pro Gly Gly Ala Phe Met Cys Trp Val Val Leu Ala 420 425 430 Phe Phe Ala Phe Met Val Val Val Leu Thr Phe Glu Asn Asp Thr Arg 435 440 445 Ser Ala Leu Met Val Thr Pro Ile Trp Phe Val Ile Leu Leu Ala Gly 450 455 460 Trp Phe Ile Ser Gly Gly Val Lys Arg Ala Arg Lys 465 470 475 <210> 2 <211> 1431 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 2 atggcatctt atgatcccgg gcattcacag gttaaaaata caggagtaga actcgactct 60 cacgtggagt cagaccatct ccaacgcggt cttagcaacc gacatatcca gttgattgcc 120 attggcggtg ctatcggcac cggactattt atgggatcgg gcaaaaccat ctcccttgct 180 ggtccttccg taatcttggt gtatggcatc atcggtttta tgctcttctt cgtcatgcgg 240 gcgatgggtg agcttttgct ctcgaacctc aactacaagt cattgcgtga tgccgtctcg 300 gacatcctcg ggcctaccgc tggtttcgta tgcggctgga cctactggtt ctgctggatt 360 gtcacaggca tggctgatgt cgtggctatt accggctaca cccaatactg gtggccagat 420 atcgcgctgt ggatacctgg agcattgacg attttattac tgctcgggtt aaatctcgtg 480 gcagtccgcc tctttggtga gttggaattt tggttcgcaa tcatcaagct ggtggctatt 540 actgcgctca tcctcgtcgg cgcggtgatg gttatttcgc gcttccaatc cccagacggc 600 gacattgcgg ctgtttccaa cctgatcgac catggcggct tcttcccgaa cggaatcacg 660 ggcttcctcg ccggattcca gattgctatc ttcgccttcg tcggcgtgga gcttgccggt 720 accgcggctg cagaaaccaa agacccagaa aagaatcttc ctcgcgcgat taactcgatt 780 cctattcgta tcgtcgtgtt ctacatcctg gctcttgcgg tcatcatgat ggttacccca 840 tgggacaagg tccacagtga ctccagccca tttgtgcaga tgtttgccct ggctggactg 900 ccggcggcag caggcattat taacttcgtg gtgctgacat ctgctgcttc atccgcgaac 960 agtggtattt tctccacatc acgcatgctg ttcggtctgg ctcgcgaagg ccaagcgccc 1020 aagcgttggg gcatcttgtc ccgtaaccaa gtcccagccc gcggcctgct gttctcagta 1080 gcgtgcctgg tcccgagcct ggcaatcttg tacgccggcg ccagcgtcat tgacgccttt 1140 acgttgatta ccaccgtgtc ttctgtgctg ttcatggtgg tatggagcct gatcctcgcg 1200 gcgtaccttg tcttccgccg caagttccca gaacgccatg cagcatccaa gttcaaggtc 1260 ccaggcgggg cgtttatgtg ctgggttgtt ctcgctttct tcgcgtttat ggtcgttgta 1320 ctgacctttg aaaatgacac tcggtccgct ttgatggtca ccccaatctg gttcgtgatc 1380 ctcttggccg gctggttcat ctccggcgga gtcaagcgcg ctaggaagtg a 1431 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 agctcggtac ccggggatcc ccaatgccac ctgctgttcc 40 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ctcgagacta gttcaggcgc agcgctcgga cg 32 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 actagtctcg agtggaggac cgggtgctgg tt 32 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ttgcatgcct gcaggtcgac tgatggcctc ccttgaccag 40 <210> 7 <211> 1606 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> del-purU <400> 7 agctcggtac ccggggatcc ccaatgccac ctgctgttcc agaaccatcg cgggaaactc 60 atccaacagc gcctgggcaa cactcacgca gcgcctcccc ttcaccacat gcacctctgg 120 cattttgtgg cgcacgactt ttcccaaaag gacagtcaca tggctcgctc ccctcgggac 180 gctaatttcc gccgttcgag gttcatccaa cagggagtat cctctcacaa tcagtgcagt 240 gaatcccctg attacaccgt tgggaaatct ccgcaatagc gcatctgcca ccacaaccgg 300 attttccgca tattccttct taatccaaaa cgttcccact actcttgtgt actttgcaga 360 gaactgtctt ctattcattt catgctggac atcttcaaat ctaattggct tcatgcttaa 420 gttagactgt gattccgccg attcggttcc ctcccgttta aggcgcccaa ttctccaaat 480 gagctctagt gtcagttcct cgccttcaag ctcttaaaac ggcacacaaa gcatcaaata 540 ttttgcatgc aaggctattt ttcagcccct ttcaccccac cccaggagtc tgtgagttcc 600 ctgatcaact actcaccaca acgagcagcc tcgcagcaga atcggtctga tttttgcatc 660 ccaaggcctc taaagcggga aaatccacca cagatctcaa cattcctgca ggttgtggtg 720 gatttttgca ttgccccgaa gcccgacccc cgaatcgaac ttcgaaccct cttaaccgcc 780 ctcaattacc catcagtccc gattagaacg ccaaactact ccggcgcacc ctccaaaatg 840 gctcccgcat tagaagttcc aatgcgagta gcccctgctt caacaaacgc caccgcatct 900 tcccaagttt tcaccccacc ggcagcctta attccaaccc ttccccgaga agccgaagcc 960 atcacccgaa cagcctcaac agttgcccct cccgctgggt ggaatcccgt ggaagtttta 1020 gcgaagtcag caccagcagc aatcaacgca ttcactgcag tcacaattgc ttcatcactc 1080 acaacagctg tttcgaggat gaatttcagc accacaggag atggaacagc ctccctgatt 1140 gccacaattt cctgcagcaa cctattggca tctccctctt tcactaccgc aatatccaaa 1200 acaacatcta cttcggaagc tccggactgt acggcaaggc gcgcttcggc ggctttcacc 1260 aacgcggggg ttttgccgtg cgggaatcct gcgacggtgg ccactcgaat tccagcttct 1320 tgggcttttg cagttaggtt gaccatgctg ttggggacac agatcgtgcc gactcccagc 1380 tcaattgcgg aatctataaa tgcggccagt tcggagttgg ttacttctgg tccgaggagg 1440 gtgtagtcaa ggatttgggc catggtggag cgggaaatcg tcatatccat accctactta 1500 gacctgactt agtgtgggaa aatttccagg gtagaatgca acgaatgacc ccgagttctc 1560 ctgaagttcg taatcgtccg agcgctgcgc ctgaactagt ctcgag 1606 <210> 8 <211> 1625 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> del-purU <400> 8 actagtctcg agtggaggac cgggtgctgg tttacggtaa ccgcacggtt gtctttgatt 60 aaggcttttt gcttttcgac gcgaccctaa acaaatgaga cctacccgag ggtaggtctc 120 atttgttttg tgtttagtct gtggtggttt cgcgtagttt ttcttgctta ataaacagca 180 agagaagcag cgcgatgccg atcagtggca tcatcacgta gaacactggg atgagtgcgt 240 cgttgtagga accggcgaac gcatcgtgga gcgcggttgg caattgattg acgattgccg 300 gcgtcaattc gttggagtcc agtccgcctt gggctgccat ggcggcttgt tcttctggtg 360 aaagttgtgc catggctgct ggcattcttt cttccatgag ggttcccaag ttgccaacga 420 acatgccacc gaccagcgcg gatccgagtg aggaaccgat ttgacggaag aagttgttca 480 cagcggttgc ggatccgacc accgcggttg gcagggtgtt ctgaacgatc aggaccagaa 540 cctgcatggc tagacccagg ccgacgccga ggacgaagag gtagattccg atctgccaca 600 gggtggtgga cacttccatt cgggcaaaga agatcagtgc cacgaaggta accaccatgc 660 cgattggtgg gaagagtttg tactttcctg tgttggagat gcggatacca gtccagatgg 720 aggtacccat catgccgacc atcattggga tcagcatgta gccggcttcg gtggcgttga 780 ttccgtggac catctggagg taggtcggaa ggtagccgat gatgccgaac attgcgatac 840 ccaggatcag gcctgcaatg gtggtgagcg tgaagttgcg gttttggaag aaggacattg 900 gaaccaatgg atcttttgcg cgcagttcca caacaaccag cagtgcagcg gcaacgatgg 960 tggtgatgat cagtccaatg atgattggat cagaccactc gtactgggat ccaccccagg 1020 tggtgaacag gatcaggctg gttgcggcaa cgatcatgaa gaaagtgccc aggtaatccc 1080 agcggaactt gacgctcttc tttggaatgt ccaggaagta aatggcgaca ccgatggcga 1140 tgattcccag tgggatgttc atccagaatg cccagcgcca gcctggtcct tcggtgaacc 1200 agccaccgag tagtgggcca agaactgcag agagtccgaa gactccaccc atgacaccca 1260 tgtagcggcc acgttcacgt gctggaacaa cgtccgcgat gattgcctgc gagaggatca 1320 tcagtccacc gccaccgatg ccctgtacgg cacggccgac gatcaaccag gtcatatttc 1380 ctgcaagccc gccgatgacg gagccgatca ggaagatgcc gagggctccg atgaagagac 1440 ctttacgtcc aaccaggtcg ccgagctttc cgtagatcgg cagcatgatg gtttcggcaa 1500 gtaggtatgc ggtgatgacc cacatcatgt ggtcaacgcc gccgagttca ccgacgattg 1560 ttggcagggc tgtgccgaaa atcatctggt caagggaggc catcagtcga cctgcaggca 1620 tgcaa 1625 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 agcgctgcgc ctgaactagt tgccacggtg tttacttaca 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gtcctccact cgagactagt actatctcga agttgtcagc 40 <210> 11 <211> 1970 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pn-cycA(cam) <400> 11 agcgctgcgc ctgaactagt tgccacggtg tttacttaca acggcgatac aattgaaccg 60 caaatggctg ctgagattgc ggaactatcc tgggtatcgc cggatcagcc tgatgttgtg 120 cttgcgcctt tgctcgctga ttttgtcttt cccgccatta attccaaggt gtcttgacgg 180 cactcttatc tccgaacacg cgaagcctag tgtctccaca aaggggttgg agagctagtg 240 gtagtttttc tatcaaatag taggtacgtg cgagagcgcg cagtgacgct ctaccattta 300 agctcctact ttcccattag caagacaggt agattatggc atcttatgat cccgggcatt 360 cacaggttaa aaatacagga gtagaactcg actctcacgt ggagtcagac catctccaac 420 gcggtcttag caaccgacat atccagttga ttgccattgg cggtgctatc ggcaccggac 480 tatttatggg atcgggcaaa accatctccc ttgctggtcc ttccgtaatc ttggtgtatg 540 gcatcatcgg ttttatgctc ttcttcgtca tgcgggcgat gggtgagctt ttgctctcga 600 acctcaacta caagtcattg cgtgatgccg tctcggacat cctcgggcct accgctggtt 660 tcgtatgcgg ctggacctac tggttctgct ggattgtcac aggcatggct gatgtcgtgg 720 ctattaccgg ctacacccaa tactggtggc cagatatcgc gctgtggata cctggagcat 780 tgacgatttt attactgctc gggttaaatc tcgtggcagt ccgcctcttt ggtgagttgg 840 aattttggtt cgcaatcatc aagctggtgg ctattactgc gctcatcctc gtcggcgcgg 900 tgatggttat ttcgcgcttc caatccccag acggcgacat tgcggctgtt tccaacctga 960 tcgaccatgg cggcttcttc ccgaacggaa tcacgggctt cctcgccgga ttccagattg 1020 ctatcttcgc cttcgtcggc gtggagcttg ccggtaccgc ggctgcagaa accaaagacc 1080 cagaaaagaa tcttcctcgc gcgattaact cgattcctat tcgtatcgtc gtgttctaca 1140 tcctggctct tgcggtcatc atgatggtta ccccatggga caaggtccac agtgactcca 1200 gcccatttgt gcagatgttt gccctggctg gactgccggc ggcagcaggc attattaact 1260 tcgtggtgct gacatctgct gcttcatccg cgaacagtgg tattttctcc acatcacgca 1320 tgctgttcgg tctggctcgc gaaggccaag cgcccaagcg ttggggcatc ttgtcccgta 1380 accaagtccc agcccgcggc ctgctgttct cagtagcgtg cctggtcccg agcctggcaa 1440 tcttgtacgc cggcgccagc gtcattgacg cctttacgtt gattaccacc gtgtcttctg 1500 tgctgttcat ggtggtatgg agcctgatcc tcgcggcgta ccttgtcttc cgccgcaagt 1560 tcccagaacg ccatgcagca tccaagttca aggtcccagg 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tgggcgtacc tgtcccgcga gtgaggtctt acgcgcggga 300 ttcgtcttgt gaaaggttag ctgacctgat ggcatcttat gatcccgggc attcacaggt 360 taaaaataca ggagtagaac tcgactctca cgtggagtca gaccatctcc aacgcggtct 420 tagcaaccga catatccagt tgattgccat tggcggtgct atcggcaccg gactatttat 480 gggatcgggc aaaaccatct cccttgctgg tccttccgta atcttggtgt atggcatcat 540 cggttttatg ctcttcttcg tcatgcgggc gatgggtgag cttttgctct cgaacctcaa 600 ctacaagtca ttgcgtgatg ccgtctcgga catcctcggg cctaccgctg gtttcgtatg 660 cggctggacc tactggttct gctggattgt cacaggcatg gctgatgtcg tggctattac 720 cggctacacc caatactggt ggccagatat cgcgctgtgg atacctggag cattgacgat 780 tttattactg ctcgggttaa atctcgtggc agtccgcctc tttggtgagt tggaattttg 840 gttcgcaatc atcaagctgg tggctattac tgcgctcatc ctcgtcggcg cggtgatggt 900 tatttcgcgc ttccaatccc cagacggcga cattgcggct gtttccaacc tgatcgacca 960 tggcggcttc ttcccgaacg gaatcacggg cttcctcgcc ggattccaga ttgctatctt 1020 cgccttcgtc ggcgtggagc ttgccggtac cgcggctgca gaaaccaaag acccagaaaa 1080 gaatcttcct cgcgcgatta actcgattcc 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Corynebacterium ammoniagenes <400> 29 Met Leu Arg Ile Glu Lys Lys Asn Ala Glu Ser Pro Ile Glu Gln Lys 1 5 10 15 Pro Arg Trp Ile Arg Asn Gln Val Arg Thr Gly Pro Gly Tyr Glu Asp 20 25 30 Met Lys Lys Arg Val Ala Gly Ala Gly Leu His Thr Val Cys Gln Glu 35 40 45 Ala Gly Cys Pro Asn Ile His Glu Cys Trp Glu Ser Arg Glu Ala Thr 50 55 60 Phe Leu Ile Gly Gly Asp Arg Cys Thr Arg Arg Cys Asp Phe Cys Asp 65 70 75 80 Ile Ala Thr Gly Lys Pro Gln Ala Leu Asp Thr Asp Glu Pro Arg Arg 85 90 95 Val Ser Glu Asn Ile Gln Glu Met Asn Leu Asn Tyr Ala Thr Ile Thr 100 105 110 Gly Val Thr Arg Asp Asp Leu Pro Asp Glu Gly Ala Trp Leu Tyr Ala 115 120 125 Glu Val Val Arg Lys Ile His Glu Lys Asn Pro His Thr Gly Val Glu 130 135 140 Asn Leu Thr Pro Asp Phe Ser Gly Lys Pro Asp Leu Leu Gln Glu Val 145 150 155 160 Phe Glu Ala Arg Pro Glu Val Phe Ala His Asn Leu Glu Thr Val Pro 165 170 175 Arg Ile Phe Lys Arg Ile Arg Pro Ala Phe Arg Tyr Glu Arg Ser Leu 180 185 190 Asp Val Leu Gln Gln Ala His Asp Phe Gly Leu Ile Thr Lys Ser 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gcccaggctc gttcggtgca gacattgtca ttggttcctc ccaacgcttt 780 ggtgtgccgc tcttctttgg tggcccacac gctgctttca tggcagtaac tgacaagcta 840 aagcgtcaga tgccaggccg tttggtcggc gtatcggtcg attctgaggg ccgtcctgct 900 taccgcttgg cgctgcagac tcgtgaacag cacatccgcc gtgaacgcgc gacgtcaaat 960 atttgtaccg cgcaggcact tctggccaac gtggctgcca tgtacgccgt ctaccacggt 1020 ccagaaggct tgaaggagat tgctaaccac gtgcactcct tggctgcttc ctttgccggt 1080 gcagttacta ctcagggtct gaagattact tcctcggagt tcttcgacac cgttaccgtt 1140 gccggcgttg atgccgcatc cattaagttc agcttggaaa aggccggata cctggtgcgc 1200 accattggcg aggataaggt ttctgtctcc ttcggtgagt ccgcaaccca aggcgatgtt 1260 actgtcttgg cggacgcctt tggtgccgct gcagtagata atgcagattt cccactgcct 1320 gaagcactca cccgcaccac cgaggtgctc acccacgaaa tctttaactc cattcactcc 1380 gaaacccaga tgatgcgtta cctgcgcaag ctcggtgata aggatctggc tctagatcgc 1440 accatgattc ctttgggctc atgcaccatg aagctcaacc caaccgcagc catggaaccg 1500 atcacctggc cagaattcgc caatgttcac ccttactccc ctgaatacgc aacccagggc 1560 tggcgtgagc tcattgaaga 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aggcgttact gcagcagacg ttgccaagcg tttgatcgac 2460 tttggcttcc acgctcctac cctcgcattc ccagtggctg gcaccttgat ggtggaacct 2520 actgagtctg aggatattgc tgaactggat cgtttcattg aagcaatgcg caccatccgt 2580 gcggagattc aggaaatcat cgatggcaag atcgcatatg aagattcggt catccgccac 2640 gcaccttaca ccgcaccgtc agtctcaagc gatgattggg agtactcctt tagccgtgaa 2700 aaggccgcat ggccagttcc ttcactgcgt ttgaacaagt acttcccacc ggtacgccgc 2760 ctggatgaag cttacggcga ccgcaacctg gtgtgctcct gcccaccgcc agaggcattc 2820 gacttcgatg ccgacaccga ttccaccgag gaggcttaa 2859 <210> 32 <211> 1104 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 32 atgtcagaac tacgccagtc cccactgcac gcagagcacg aaaagctcgg cgcatccttt 60 accgcttttg gcccttggaa tatgccacta aagtacggca aggagctcga tgagcaccac 120 gcagtgcgta atgcagtcgg catgtttgac ctctcgcaca tgggtgagat ttgggtcaac 180 ggcccagacg ccgctgcatt tttgtcctat gcgctgatct ccaacatgga gaccgtgaaa 240 aatggcaagg cgaagtactc catgattgtt gctgaagacg gcggcatcat cgatgaccta 300 atttcctacc gtttctccga taccaagttc ttggtagtgc caaacgctgg caacactgat 360 gtggtttggg aagcttttaa tcagcgcatt gaaggcttcg atgtagaact caacaatgag 420 tccttggatg ttgcgatgat tgccctgcag ggccccaatg ctgccaaggt tctagttgaa 480 caggttgctg aagagtccaa ggaagaagta gaaaaccttc cttactatgc cgcaaccatg 540 gccaaagtcg cagacgttga caccatcgtc gcgcgcaccg gctacaccgg cgaagacggc 600 ttcgagctga tgatctacaa cgccgatgcg accaagctct ggcagctttt catcgaccaa 660 gatggtgtta ctccatgcgg tttagcttca cgcgattcct tgcgcttgga agctggcatg 720 cctttgtacg gcaatgagct ttcccgcgat atcacccctg tcgaggcagg catgggtgtg 780 gcgtttaaga agaagaccgc tgacttcgtc ggcgccgagg tcctgcgtca acgcttggaa 840 gaaggcccta agcaagttat caaggctttg acctcctctg agcgccgtgc agcgcgcacc 900 ggtgctgaaa tctatgccgg cgagcagttg gtaggcaccg taacttcggg tcagccatcg 960 ccgacgctgg gacaccctat tgccctggca ctggtagata ctgcagcaaa cctcgaagaa 1020 ggcgcagaag tagaagtgga tattcgcggc aagcgttacc ccttcaccgt taccaagacg 1080 cctttctata gccgcgagaa gtaa 1104 <210> 33 <211> 390 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 33 atggctaacc tacctgcaga atttacttac tccgaagacc acgagtggat taacgccgct 60 caggacgcaa tcgttggcaa aactgttcgc atcggcatca cttctgttgc cgcagaccgt 120 cttggtgagg ttgtcttcgc tgagcttcca gcagttggcg atagcgtcac tgcaggtgaa 180 acctgtggtg aggttgaatc caccaagtcc gtttctgacc tgtacagccc tgtcaccggt 240 accgtgaccg ctgtgaacga gacagtgcac gatgattatg aaatcatcaa caatgatcct 300 ttcggtgaag gttggctgtt tgaggtcgag gttgaagaac tcggcgaggt tatgaccgct 360 gatgaatacg cggcagaaaa cggcatctaa 390 <210> 34 <211> 1062 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 34 atgctccgca ttgaaaagaa gaatgcggag tcacccattg agcagaagcc gaggtggatc 60 cgcaaccagg tccgcactgg ccctggttat gaggacatga aaaagcgtgt tgctggcgct 120 ggcctgcaca ctgtctgcca ggaggcaggc tgtcctaata tccacgaatg ctgggagtcc 180 cgagaagcca ccttccttat cggcggtgac cgttgtactc gccgttgtga cttctgcgat 240 attgccactg gtaagccgca ggcattggac accgatgagc cgcgtcgcgt ttcggaaaac 300 atccaagaga tgaatctgaa ctacgccacg atcactggtg ttacccgtga tgaccttcca 360 gatgagggcg catggctata tgctgaagtg gttcgtaaga tccacgagaa gaaccctcac 420 acgggtgtag 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ctcggcgccc ataaatttca ct 32 <210> 38 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 gcgccgagta ctctatgccg agaagttgaa ca 32 <210> 39 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 gcctgcaggt cgactctaga ctgggcatca cactattttt 40 <210> 40 <211> 531 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> del-N2131L <400> 40 gtacccgggg atcctctaga caaagccgaa gagaagttgg cttgacggac ccgaaattcc 60 agctgatttt gacgatcctg atgcacccgg caggtggcct ggcgaaaagt tggggcttcc 120 tcaagaaggg gccggctctc tgtcctcagt ggctcgtcgt atcggcgggg tctgcgtgga 180 ctggggtgtt tcctgggtta ttgctattgt gctgtccaat ttcacggatg tgctgggcga 240 tgtagcgaca tccacgctca ttattttcgt gatcctgggt tggcttaccg gttggatctt 300 tgctcgcacc ccaggtcatg ccgtgtttgg catgggcctt gcgcgtgtgg atgcagagga 360 acgtgtgggc tggtggcgtg cgctggttcg cccactgctg acgatcttga ttctgcctgc 420 cgtgatggtg gatgctgacg gccgtgggct ccacgacaag gcaacgggaa ctgcagttat 480 ccgcgggtaa tttgtcttga gtgaaattta tgggcgccga gtactctatg c 531 <210> 41 <211> 555 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> del-N2131R <400> 41 gcgccgagta ctctatgccg agaagttgaa cagcaatctt gcagcaactc ctcagtattc 60 acaccagccc caatggacac aaaaacatca gccccagaat cgcccctaag ggcctcaaat 120 acacgatctg gaccaactag tcatcgggaa aacccaaccc cttaaatcgc cttctgcgct 180 taaggggtca atgctagata agtaggaaca acaacgtttg ggcggccagg atctttgcga 240 tcatcgccag cggatacaca gaggtataac ccatggcagg gagctcgttg cgggaggcat 300 ctgacacata actcagcaca gcagggtggg tttgcgtacc ggcgaggatg ccagcggttt 360 caccgaaggg gattttcatc agtttgtggc caacgaacag caccgtgatg gagatgaaca 420 aagtgagcag cgcaccgaag ccgatgatgg tgagtgattg ggggtcgctg atcgctgatc 480 gaaatcctgc gcccgctgag gtaccgatgg cagccaaaaa tagtgtgatg cccagtctag 540 agtcgacctg caggc 555 <210> 42 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 gaaatttatg ggcgccgagt caggatgcaa ttgccatccg 40 <210> 43 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 gccattagcg tgttacttct cgcggctata ga 32 <210> 44 <211> 4499 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pn_gcvPT(Cam) <400> 44 gaaatttatg ggcgccgagt caggatgcaa ttgccatccg tcagatgtgc tacttgccat 60 ttacctacga ccaccaggtt gtagatggtg cagatgcagg tcgcttcatc accaccatca 120 aggaccgcct tgaaaccggt aacttcgaat ctgacttggc tctctaagtc cagtttcaga 180 atgtacggta gcttctagcc gtttgagtta gaagcaaaag ccaccatgta gaaatttcta 240 catggtggct ttgtggtttt ctcatctcta agttctcatt ttcgggggta taaaaaacta 300 acaaatccgc attgcagtct tcacattttc ttcaaatctg gcgttcatgc tggttataac 360 agcgctttcg caggagccat tacaaccggc ggctaggcgt gggtagaaaa gcaatgaaaa 420 gccggggcta gccatataat gaggaatgtt gactgccttc gtgcggtcgc tttagcaagc 480 ctggacaaat gtatcgttcc tccaaaggag tttgacactt atggatttca ttgcccgcca 540 ccttgggcca gatgccacag aatctaagga catgctggcg cgtgtgggtt atgacagcgt 600 agaagcgctt gtcacctcag caatccccca gtccattagc atcacggatg cgcttaatat 660 gccgcaggca ttgagtgaga ccgacgcaca agccaagctt cgcgcttacg ctgataaaaa 720 tgtcgtgctg aagtctttct acggccaggg ctactcagac accatcaccc ctgctgttat 780 tcgccgcggt ttggtagaag acgctggttg gtacaccgct tataccccat accagccaga 840 aatttcccag ggtcgccttg agtcgctgct gaacttccag accatggttc aagacctcac 900 cggcttgcct attgcgaatg cttctttgct ggatgaggca tcggcagttg ctgaggccgt 960 gggtttgatg tctcgtgcgg tcaagaaggg ccgccgcgta ctgctcgacg cccgtttgca 1020 cccacaggtt ctcaccgtgg cggcggagcg tgcccgagca attgacctcg aagttgagat 1080 tgctgacttg agcaacggcg tggttggcga agacctcgtc ggcgcagtag ttgcctacac 1140 cggtacggag ggcgatattt ttgacccacg tgctgttatc gaagaaatcc atggccgcgg 1200 cggacttgtt tccgtcgcgg ctgacttgtt gtccttgctg cttctggaag gcccaggctc 1260 gttcggtgca gacattgtca ttggttcctc ccaacgcttt ggtgtgccgc tcttctttgg 1320 tggcccacac gctgctttca tggcagtaac tgacaagcta aagcgtcaga tgccaggccg 1380 tttggtcggc gtatcggtcg attctgaggg ccgtcctgct taccgcttgg cgctgcagac 1440 tcgtgaacag cacatccgcc gtgaacgcgc gacgtcaaat atttgtaccg cgcaggcact 1500 tctggccaac gtggctgcca tgtacgccgt ctaccacggt ccagaaggct tgaaggagat 1560 tgctaaccac gtgcactcct tggctgcttc ctttgccggt gcagttacta ctcagggtct 1620 gaagattact tcctcggagt tcttcgacac cgttaccgtt gccggcgttg atgccgcatc 1680 cattaagttc agcttggaaa aggccggata cctggtgcgc accattggcg aggataaggt 1740 ttctgtctcc ttcggtgagt ccgcaaccca aggcgatgtt actgtcttgg cggacgcctt 1800 tggtgccgct gcagtagata atgcagattt cccactgcct gaagcactca cccgcaccac 1860 cgaggtgctc acccacgaaa tctttaactc cattcactcc gaaacccaga tgatgcgtta 1920 cctgcgcaag ctcggtgata aggatctggc tctagatcgc accatgattc ctttgggctc 1980 atgcaccatg aagctcaacc caaccgcagc catggaaccg atcacctggc cagaattcgc 2040 caatgttcac ccttactccc ctgaatacgc aacccagggc tggcgtgagc tcattgaaga 2100 gttggaaggc tggttggctg agctgaccgg ctacgccaag gtttctatcc aaccaaacgc 2160 tggttcccag ggcgagctag ctggtctttt ggctatccgc cgctaccacg tcgcaaatgg 2220 tgacaccaac cgcgatatcg tgttgattcc tgcgtccgcg cacggcacca acgctgcctc 2280 cgcgaccctg gcaaatctgc gcgttgttgt ggttaagacc gccgaagacg gctccatcga 2340 tctggaagat ctcgatgcga agatcgccaa gcatggtcag aacatggccg gaatcatgat 2400 cacctaccca tccactcacg gcgtctttga cccagaggtt cgtgaagtct gcgacaagat 2460 ccatgccgct ggcggccagg tctacattga tggcgcaaac atgaatgctt tgactggttg 2520 ggctcagccg ggcaagttcg gtggcgatgt ctcgcacttg aacctgcaca agactttcac 2580 cattccgcac ggcggtggcg gcccaggtgt tggaccaatt ggtgtcgctg agcacctcat 2640 tccattcctg ccaacggatg ctgcagctga tgagctggat cctgctaacc caaccccagt 2700 agaacagggc gttccaatta ctgcttcgca gtttggttcc gctggtgttc tgccgattac 2760 ctgggcatac atcgcaatga ccggtggcga gggtctaacc tccgctactg cacacgccat 2820 cttgggtgct aactaccttg cgcgcgaact ctccgattcc ttcccaattc tgttcaccgg 2880 taatgaaggt cttgttgcgc acgagtgcat tttggatctg cgcgcgctaa ccgatgcctc 2940 aggcgttact gcagcagacg ttgccaagcg tttgatcgac tttggcttcc acgctcctac 3000 cctcgcattc ccagtggctg gcaccttgat ggtggaacct actgagtctg aggatattgc 3060 tgaactggat cgtttcattg aagcaatgcg caccatccgt gcggagattc aggaaatcat 3120 cgatggcaag atcgcatatg aagattcggt catccgccac gcaccttaca ccgcaccgtc 3180 agtctcaagc gatgattggg agtactcctt tagccgtgaa aaggccgcat ggccagttcc 3240 ttcactgcgt ttgaacaagt acttcccacc ggtacgccgc ctggatgaag cttacggcga 3300 ccgcaacctg gtgtgctcct gcccaccgcc agaggcattc gacttcgatg ccgacaccga 3360 ttccaccgag gaggcttaaa tcaatgtcag aactacgcca gtccccactg cacgcagagc 3420 acgaaaagct cggcgcatcc tttaccgctt ttggcccttg gaatatgcca ctaaagtacg 3480 gcaaggagct cgatgagcac cacgcagtgc gtaatgcagt cggcatgttt gacctctcgc 3540 acatgggtga gatttgggtc aacggcccag acgccgctgc atttttgtcc tatgcgctga 3600 tctccaacat ggagaccgtg aaaaatggca aggcgaagta ctccatgatt gttgctgaag 3660 acggcggcat catcgatgac ctaatttcct accgtttctc cgataccaag ttcttggtag 3720 tgccaaacgc tggcaacact gatgtggttt gggaagcttt taatcagcgc attgaaggct 3780 tcgatgtaga actcaacaat gagtccttgg atgttgcgat gattgccctg cagggcccca 3840 atgctgccaa ggttctagtt gaacaggttg ctgaagagtc caaggaagaa gtagaaaacc 3900 ttccttacta tgccgcaacc atggccaaag tcgcagacgt tgacaccatc gtcgcgcgca 3960 ccggctacac cggcgaagac ggcttcgagc tgatgatcta caacgccgat gcgaccaagc 4020 tctggcagct tttcatcgac caagatggtg ttactccatg cggtttagct tcacgcgatt 4080 ccttgcgctt ggaagctggc atgcctttgt acggcaatga gctttcccgc gatatcaccc 4140 ctgtcgaggc aggcatgggt gtggcgttta agaagaagac cgctgacttc gtcggcgccg 4200 aggtcctgcg tcaacgcttg gaagaaggcc ctaagcaagt tatcaaggct ttgacctcct 4260 ctgagcgccg tgcagcgcgc accggtgctg aaatctatgc cggcgagcag ttggtaggca 4320 ccgtaacttc gggtcagcca tcgccgacgc tgggacaccc tattgccctg gcactggtag 4380 atactgcagc aaacctcgaa gaaggcgcag aagtagaagt ggatattcgc ggcaagcgtt 4440 accccttcac cgttaccaag acgcctttct atagccgcga gaagtaacac gctaatggc 4499 <210> 45 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 cgcgagaagt aacacgctaa tggcgcattg aa 32 <210> 46 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 tcaacttctc ggcatagagt ttagcggatg ctagcagtaa 40 <210> 47 <211> 3053 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pn_gcvH-lipBA(Cam) <400> 47 cgcgagaagt aacacgctaa tggcgcattg aatcgccggc cgatatttca gggcttgtac 60 gaaaacggca tcatcgaagc agatggcacc caagttgaag tcgacactat catttgggcg 120 attggctttc gtcccagcct ggcgcacttg gacccgctga acctttataa cgagaagggc 180 gggatcaaca ttgagggcac aaaggtaaag ggaaagaaga atcttcacct aattggctat 240 ggcccttccc aatccacagt aggagctaac cgggcaggtc gagctgccgt catcagcatt 300 gcccgcgacc tgaaatctgg cacctaggca ctgctcaatg tccgatggga gcaaactctt 360 aacccccgaa ggggcaatat caacgtgcga tagtggcatg taaagtgctt cgctgcgcta 420 aagtgaaagc gatacttcaa cccatgcacc tattcgctgc attcccggcg gatcaggcac 480 gtcaatgaaa ggatagttcc tatggctaac ctacctgcag aatttactta ctccgaagac 540 cacgagtgga ttaacgccgc tcaggacgca atcgttggca aaactgttcg catcggcatc 600 acttctgttg ccgcagaccg tcttggtgag gttgtcttcg ctgagcttcc agcagttggc 660 gatagcgtca ctgcaggtga aacctgtggt gaggttgaat ccaccaagtc cgtttctgac 720 ctgtacagcc ctgtcaccgg taccgtgacc gctgtgaacg agacagtgca cgatgattat 780 gaaatcatca acaatgatcc tttcggtgaa ggttggctgt ttgaggtcga ggttgaagaa 840 ctcggcgagg ttatgaccgc tgatgaatac gcggcagaaa acggcatcta agcctttttt 900 acttttcaca cctttaagcg cggagcagtt tgccccaagt actacactgg gaaaacatga 960 ctgctccgcg tgacccgttt ttccccgctg atcgttctat tcgcgcttct actgccccgg 1020 tagaggtgag acgtttaggt cgtatggatt atcaagaagc ctgggactat caagcagaag 1080 tcgcagcgca gcgcgcacgt gacgaagttg cagacacgtt gctggtcgtt gagcaccccg 1140 ctgtgtatac ggcgggcaag cgcacgcagc ccgaagatat gcccaccaac ggtcttccgg 1200 ttatcaatgt tgatcgtggc ggccggatta cctggcacgg cgagggccag ttggtggtct 1260 acccgattat caagttggca gagcctgtcg atgtcgtcga ttatgtccgc cgtctggaag 1320 aagctgttat tcataccgtt cgggaaatgg gggtaacaac tgctgggcgt atcgatggtc 1380 gctcaggcgt gtgggtgcca tcgactaccg ctgcgaaaga cccggcagca tcgcaccgag 1440 accgcaagat tgcggcctta ggcatccgca ttacgcgtgg ggttaccatg catggtctgg 1500 cgctcaattg cgacaatatc ttggactact acgagcacat tattgcctgc ggtattgatg 1560 atgccgatat caccaccctg gcgctagagc tgggccgcga cgtcaccgta gatgatgcgg 1620 ttgagccctt gctcattgcg cttgacgatg ccttggccgg ccgcatggtc gtcgccgacc 1680 acactttcgc atctgcccca gaccccatca aattagctaa tgagaaagcg cgccaagcac 1740 gcgcgcagtc ttccttgact gatcatgcag gctcttaagt agtgccccct attcgggcag 1800 cgatgtccat tcttggaata tttcaggaac cggtgggatt gaaggaatta aggccttaag 1860 cgcacccatc aacggggtca aaaatacgag gtcagtatca taattagttg aatttaaaat 1920 cacacaacac gtagggtgga atttgtgact attaagcctg aaggacgcaa gatgctccgc 1980 attgaaaaga agaatgcgga gtcacccatt gagcagaagc cgaggtggat ccgcaaccag 2040 gtccgcactg gccctggtta tgaggacatg aaaaagcgtg ttgctggcgc tggcctgcac 2100 actgtctgcc aggaggcagg ctgtcctaat atccacgaat gctgggagtc ccgagaagcc 2160 accttcctta tcggcggtga ccgttgtact cgccgttgtg acttctgcga tattgccact 2220 ggtaagccgc aggcattgga caccgatgag ccgcgtcgcg tttcggaaaa catccaagag 2280 atgaatctga actacgccac gatcactggt gttacccgtg atgaccttcc agatgagggc 2340 gcatggctat atgctgaagt ggttcgtaag atccacgaga agaaccctca cacgggtgta 2400 gaaaacctca ccccggactt ctccggcaag ccagacctgc tgcaggaagt cttcgaggct 2460 cgccctgagg ttttcgctca caacttggaa accgttcctc gtattttcaa gcgtatccgc 2520 ccggcattcc gttatgagcg ttctctggat gttttgcagc aggcacacga cttcggcctg 2580 atcaccaagt cgaacttgat cttgggcatg ggtgaaactg aggaagagat tcaggaagct 2640 ctacgcgata tgcgctctgt gggcactgac atcattacca ttacgcagta cctgcgtcct 2700 ggtcctcgtt tccacccaat tgagcgttgg gttcgccctg aggagttcat tgcgcactcc 2760 gagtacgcca aggaattggg ctttaccgtt atgtctggtc ctttggttcg ttcttcttac 2820 cgcgcgggca agctctacac ccaggcgatg aaggcacgtg gctgggagct gccagaaaat 2880 ctcaagcacc tggaagaaac ttctgatggc gcaaccgctc aggaagcttc gtcgctgttg 2940 aagaagtacg gcccttccga ggaaacgcca gttacttccc gcatggcaaa gacgcctgtg 3000 ggtgcagata aatttactgc tagcatccgc taaactctat gccgagaagt tga 3053 <210> 48 <211> 281 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C.gl HisG variant <400> 48 Met Leu Lys Ile Ala Val Pro Asn Lys Gly Ser Leu Ser Glu Arg Ala 1 5 10 15 Met Glu Ile Leu Ala Glu Ala Gly Tyr Ala Gly Arg Gly Asp Ser Lys 20 25 30 Ser Leu Asn Val Phe Asp Glu Ala Asn Asn Val Glu Phe Phe Phe Leu 35 40 45 Arg Pro Lys Asp Ile Ala Ile Tyr Val Ala Gly Gly Gln Leu Asp Leu 50 55 60 Gly Ile Thr Gly Arg Asp Leu Ala Arg Asp Ser Gln Ala Asp Val His 65 70 75 80 Glu Val Leu Ser Leu Gly Phe Gly Ser Ser Thr Phe Arg Tyr Ala Ala 85 90 95 Pro Ala Asp Glu Glu Trp Ser Ile Glu Lys Leu Asp Gly Lys Arg Ile 100 105 110 Ala Thr Ser Tyr Pro Asn Leu Val Arg Asp Asp Leu Ala Ala Arg Gly 115 120 125 Leu Ser Ala Glu Val Leu Arg Leu Asp Gly Ala Val Glu Val Ser Ile 130 135 140 Lys Leu Gly Val Ala Asp Ala Ile Ala Asp Val Val Ser Thr Gly Arg 145 150 155 160 Thr Leu Arg Gln Gln Gly Leu Ala Pro Phe Gly Glu Val Leu Cys Thr 165 170 175 Ser Glu Ala Val Ile Val Gly Arg Lys Asp Glu Lys Val Thr Pro Glu 180 185 190 Gln Gln Ile Leu Leu Arg Arg Ile Gln Gly Ile Leu His Ala Gln Asn 195 200 205 Phe Leu Met Leu Asp Tyr Asn Val Asp Arg Asp Asn Leu Asp Ala Ala 210 215 220 Thr Ala Val Thr Pro Gly Leu Ser His Pro Gln Val Ser Pro Leu Ala 225 230 235 240 Arg Asp Asn Trp Val Ala Val Arg Ala Met Val Pro Arg Arg Ser Ala 245 250 255 Asn Ala Ile Met Asp Lys Leu Ala Gly Leu Gly Ala Glu Ala Ile Leu 260 265 270 Ala Ser Glu Ile Arg Ile Ala Arg Ile 275 280 <210> 49 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 tcgagctcgg tacccatcgc catctacgtt gctgg 35 <210> 50 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 tcgagctcgg tacccatcgc catctacgtt gctgg 35 <210> 51 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 gtgccagtgg ggatacctgt gggtgggata agcctggggt tactg 45 <210> 52 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 aaccccaggc ttatcccacc cacaggtatc cccactggca cgcga 45 <210> 53 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 ctctagagga tccccgggac gtggttgatg gtggt 35 <210> 54 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 tcgagctcgg tacccatcgc catctacgtt gctgg 35 <210> 55 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 gagtctagaa gtactcgaga tgctgacctc gtttc 35 <210> 56 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 agcatctcga gtacttctag actcgcacga aaaag 35 <210> 57 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 ctctagagga tcccctttgg gcagagctca aattc 35 <210> 58 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 gcatgggctt gctgctcgag ttcagggtag ttgactaaag 40 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 agtttcgtaa cccaccttgc 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 60 cgcttctcaa tctgatgaga 20 <210> 61 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 gtcagcatct cgagtgctcc ttagggagcc atctt 35 <210> 62 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 62 gtcaaatgtc ttcacatgtg tgcacctttc gatct 35 <210> 63 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 63 gaaaggtgca cacatgtgaa gacatttgac tcgct 35 <210> 64 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 64 tcgtttttag gcctcctaga tgcgggcgat gcgga 35 <210> 65 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 65 atcgcccgca tctaggaggc ctaaaaacga ccgag 35 <210> 66 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 66 gacagttttg gtcatgttgt gtctcctcta aagat 35 <210> 67 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 67 tagaggagac acaacatgac caaaactgtc gccct 35 <210> 68 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 68 tgaagcgccg gtaccgctta cagcaaaacg tcatt 35 <210> 69 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 69 cgttttgctg taagcggtac cggcgcttca tgtca 35 <210> 70 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 70 agtgacattc aacattgttt tgatctcctc caata 35 <210> 71 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 71 gaggagatca aaacaatgtt gaatgtcact gacct 35 <210> 72 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 72 cgctgggatg tttctctaga gcgctccctt agtgg 35 <210> 73 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 73 aagggagcgc tctagagaaa catcccagcg ctact 35 <210> 74 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 74 agtcatgcct tccatgagtg tttcctttcg ttggg 35 <210> 75 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 75 cgaaaggaaa cactcatgga aggcatgact aatcc 35 <210> 76 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 76 cgagtctaga agtgcctatt ttaaacgatc cagcg 35

Claims (11)

  1. 글리신 트랜스포터의 활성이 강화된, L-히스티딘을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 글리신 트랜스포터는 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) 유래인, 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 글리신 트랜스포터 단백질은 CycA 단백질인, 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 글리신 트랜스포터는 서열번호 1 또는 이와 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 글리신 분해 단백질의 활성이 추가로 강화된, 미생물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 글리신 분해 단백질은 GcvP, GcvT, GcvH, LipB 및 LipA로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질인, 미생물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 글리신 분해 단백질은 코리네박테리움 암모니아게네스 유래인, 미생물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 GcvP는 서열번호 26, GcvT 단백질은 서열번호 27, GcvH는 서열번호 28, LipA 단백질은 서열번호 29, LipB 단백질은 서열번호 30 또는 상기 서열번호와 각각 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 미생물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 L-히스티딘을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인, 미생물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 한 항의 미생물을 포함하는 L-히스티딘 생산용 조성물.
  11. 제1항 내지 제9항 중 한 항의 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
    상기 미생물 및 배지에서 L-히스티딘을 회수하는 단계를 포함하는, L-히스티딘 제조방법.

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