CN116254242B - 一种atp磷酸核苷转移酶突变体及产l-组氨酸的谷氨酸棒杆菌 - Google Patents
一种atp磷酸核苷转移酶突变体及产l-组氨酸的谷氨酸棒杆菌 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种ATP磷酸核苷转移酶突变体及产L‑组氨酸的谷氨酸棒杆菌，突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的ATP磷酸核苷转移酶的第56位酪氨酸突变为甲硫氨酸，且第235位苏氨酸突变为脯氨酸得到，谷氨酸棒杆菌由该突变体解除反馈抑制、并结合代谢工程策略和能量工程改造得到。本发明结合L‑组氨酸合成限速酶的半理性改造，模块化代谢工程，以及能量供应工程提高L‑组氨酸的合成，摇瓶发酵L‑组氨酸的产量达到3.10g/L，解决了目前缺少食品安全菌株高效合成组氨酸的问题。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种ATP磷酸核苷转移酶突变体及产L-组氨酸的谷氨酸棒杆菌。
背景技术
L-组氨酸(L-histidine)，分子式C18H32O15，熔点为277℃，易溶于水(25℃水中溶解度为41.9g/L)，略微溶于醇，不溶于醚和氯仿。L-组氨酸对生长、组织修复以及治疗溃疡和胃酸过多等均具有重要的作用，还可以用于治疗心脏病、过敏及风湿性关节炎和贫血等疾病。同时，L-组氨酸可以与β-丙氨酸组成肌肽，可作为治疗肾衰竭、白内障、老年性痴呆症、动脉粥样硬化等疾病的药物，还能有效地阻止其他与衰老相关的疾病以及用作膜保护型的抗溃疡药。在L-组氨酸脱羧酶的作用下，L-组氨酸可以生成组胺，组胺可以用于开发治疗失眠症和嗜睡病等多种神经系统疾病的药物。
许多研究中，将诱变与L-组氨酸类似物筛选方法结合起来，选择具有结构类似物抗性或营养缺乏的突变体菌株。化学和物理诱变等不合理的设计方法可以筛选出高产的菌株，但通过这种方法得到的突变体菌株在长期培养中往往表现出不稳定的遗传性状。通过过表达组氨酸合成途径的操纵子基因，基于模型的代谢流分析等理性手段来改造谷氨酸棒杆菌虽有一定的进展，但是组氨酸的产量仍较低，难以进行工业化生产。
作为GRAS(Generally Regard as Safe)革兰氏阳性宿主，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)已被广泛用于氨基酸、有机酸和蛋白质等多种产品的生物制造且产值超千亿元。相比于大肠杆菌(Escherichia coli)和粘质沙雷菌(Serratiamarcescens)等，谷氨酸棒杆菌不产生内毒素，遗传背景清晰且基因操作技术较为成熟。虽然在谷氨酸棒杆菌中有完整的L-组氨酸合成途径，但是由于关键合成酶HisG会受到终产物L-组氨酸的反馈抑制，导致野生型菌株没有L-组氨酸的积累。此外，L-组氨酸生物合成途径与几个重要的生物合成途径紧密相连，如Embden-Meyerhof-Parnas(EMP)途径、磷酸戊糖(PP)途径和嘌呤核苷酸生物合成途径。多变量模块化代谢工程(MMME)是一种强大的策略，通过过量表达限速酶，取消或敲除竞争途径中的基因，正确引导代谢通量走向感兴趣的途径。作为一种高能量消耗的氨基酸，L-组氨酸是一种高能量消耗的氨基酸。根据能量消耗计算，1mol L-组氨酸的生物合成需要大约9.4mol ATP。因此如何解除组氨酸的反馈抑制，强化组氨酸的代谢通量，优化细胞内ATP水平从而提高组氨酸的发酵产量是一个值得探讨的问题。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种ATP磷酸核苷转移酶突变体及一种高效生物合成L-组氨酸的谷氨酸棒杆菌重组菌株，基于L-组氨酸的Pauly反应的高通量筛选工作流程，以解除L-组氨酸对ATP-PRT的反馈抑制，模块化代谢工程调控组氨酸的代谢合成，合理分配胞内资源，优化ATP的水平提高组氨酸的合成，摇瓶发酵重组菌株，组氨酸产量达到3.10g/L。
本发明的第一个目的是提供一种ATP磷酸核苷转移酶突变体，该突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的ATP磷酸核苷转移酶的第56位酪氨酸突变为甲硫氨酸，且第235位苏氨酸突变为脯氨酸得到，记为HisGT235P-Y56M。
本发明的第二个目的是提供编码上述ATP磷酸核苷转移酶突变体的基因。
进一步地，基因序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第三个目的是提供携带上述基因的载体。
本发明的第四个目的是提供表达上述ATP磷酸核苷转移酶突变体的细胞。
进一步地，所述细胞为细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。
本发明的第五个目的是提供一种产L-组氨酸的谷氨酸棒杆菌，所述谷氨酸棒杆菌表达了编码上述ATP磷酸核苷转移酶突变体的基因。
进一步地，所述谷氨酸棒杆菌还过表达了编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因zwf、编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶组装蛋白的基因opcA、编码6-磷酸葡糖酸内酯酶的基因pgl、编码酮基转移酶的基因tkt、编码醛基转移酶的基因tal和编码肽基脯氨酰异构酶的基因prs，敲除了编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的基因pgi、编码黄素还原酶Frd181和Frd188的基因frd1和frd2、编码AMP核苷酶的基因amn、编码氨基磷酰转移酶的基因purF。
进一步地，所述编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因zwf的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
进一步地，所述编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶组装蛋白的基因opcA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步地，所述编码6-磷酸葡糖酸内酯酶的基因pgl的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步地，所述酮基转移酶的基因tkt的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步地，所述编码醛基转移酶的基因tal的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
进一步地，所述编码肽基脯氨酰异构酶的基因prs的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示。
进一步地，所述编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的基因pgi的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示。
进一步地，编码黄素还原酶Frd181的基因frd1的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示。
进一步地，编码黄素还原酶Frd188的基因frd2的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示。
进一步地，所述编码AMP核苷酶的基因amn的核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示。
进一步地，所述编码氨基磷酰转移酶的基因purF的核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示。
本发明的第六个目的是提供上述ATP磷酸核苷转移酶突变体或产L-组氨酸的谷氨酸棒杆菌在制备L-组氨酸中的应用。
本发明的有益效果：
本发明通过开发了基于L-组氨酸的Pauly反应的高通量筛选工作流程，以解除L-组氨酸对ATP-PRT的反馈抑制。同时，通过模块化工程方法重塑了复杂的代谢网络，使L-组氨酸的生产滴度达到1.21g/L。此外，通过敲除形成H2O2的黄素还原酶和优化细胞内ATP水平，工程菌株的L-组氨酸滴度在摇瓶中进一步提高到3.10g/L，建立了一个高效生物合成L-组氨酸的谷氨酸棒杆菌重组菌株。
附图说明
图1为系统代谢工程改造策略示意图；
图2为能量工程改造策略示意图；
图3为重组菌株L-组氨酸产量；
图4为突变位点筛选流程图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明涉及的方案如下：
本发明通过对源自谷氨酸菌的ATP磷酸核苷转移酶(HisGCg)的半理性设计、模块化代谢工程以及细胞内ATP环境的改善，构建了一个用于L-组氨酸生物合成的谷氨酸菌株。首先为了解除对L-组氨酸的反馈抑制，通过分子模拟技术，对L-组氨酸和HisG进行分子对接模拟，找到两者可能形成化学键的关键靶点；其次，对以上潜在靶点进行饱和突变，构建HisG点突变文库，同时根据L-组氨酸与重氮苯磺酸形成的棕红色偶氮化合物在500nm下吸光值的大小测定L-组氨酸浓度，从而实现对HisG突变文库中高产L-组氨酸菌株的高通量筛选；在分子对接和高通量筛选方法的基础上获得了HisGT235P-Y56M突变体，使L-组氨酸的积累量达到0.83g/L。其次，为了进一步积累L-组氨酸，我们采用了模块化的代谢工程策略。通过基因组多拷贝整合HisGT235P-Y56M突变体，增强磷酸戊糖途径提高前体PRPP的积累，敲除pgi基因完成代谢流的重新分配，将L-组氨酸的产量提高到1.21g/L。此外，我们通过删除两个形成H2O2的黄素还原酶Frd181(由frd1基因编码)和Frd188(由frd2编码)、AMP核苷酶(由amn编码)和氨基磷酰转移酶(由purF编码)来优化ATP供应水平，以实现高效的L-组氨酸合成。最终的菌株中不含质粒、抗生素标记或化学诱导启动子，在摇瓶中产生3.10g/L的L-组氨酸。这里报道的谷氨酸菌株工程为可持续的、大规模的发酵生产L-组氨酸铺平了道路。
下述实施例中涉及的序列如下：
Ptac-HisGT235P-Y56M序列如SEQ ID NO.14所示；
cychisG-1质粒序列如SEQ ID NO.15所示；
cyc-ΔpurF质粒序列如SEQ ID NO.16所示；
HisGT235P-Y56M突变体序列(SEQ ID NO.17)：
MLKIAVPNKGSLSERAMEILAEAGYAGRGDSKSLNVFDEANNVEFFFLRPKDIAIMVAGGQLDLGITGRDLARDSQADVHEVLSLGFGSSTFRYAAPADEEWSIEKLDGKRIATSYPNLVRDDLAARGLSAEVLRLDGAVEVSIKLGVADAIADVVSTGRTLRQQGLAPFGEVLCTSEAVIVGRKDEKVTPEQQILLRRIQGILHAQNFLMLDYNVDRDNLDAATAVTPGLSGPPVSPLARDNWVAVRAMVPRRSANAIMDKLAGLGAEAILASEIRIARI。
实施例1突变体的确定
(a)HisGCg的三维模型是从AlphaFold蛋白质结构数据库(https://alphafold.ebi.ac.uk/)中获得的。在分子对接中，以HisGCg为受体，其分子配体分别为L-组氨酸、PRPP和ATP。所有的分子配体都是从PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的。柔性配体与刚性受体的对接是由Discovery Studio 2016进行的。
(b)首先将HisGCg与L-组氨酸进行分子对接，结果显示HisGCg的L231、T235、R248、M250可能为L-组氨酸的结合靶点，将以上靶点进行饱和突变。通过初筛和复筛得到HisGT235P突变株具有更高的组氨酸合成能力，产量为0.52g/L。
(c)步骤(b)得到的突变体HisGT235P与底物ATP和PRPP进行分子对接，通过Ohm(https://dokhlab.med.psu.edu/ohm/)平台预测，Y56、S11、R49是潜在的突变靶点。接着对以上靶点进行饱和突变，得到一株HisGT235P-Y56M突变体，组氨酸产量为0.83g/L。
具体结果见下表。
可见，突变体HisGT235P-Y56M的组氨酸产量相对于其他突变体有明显提升，下述以该突变体为基础进行代谢及能量改造。
实施例2HisG突变体的构建以及基因组整合表达
(a)以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模版，采用引物hisG-F、hisG-R扩增得到基因HisG；以谷氨酸棒杆菌质粒pJYW4为模版，采用引物pJYW4-hisG-F、pJYW4-hisG-R以扩增得到片段pJYW4-LJ。
(b)将步骤(a)中获得的基因HisG和pJYW4-LJ片段按照等摩尔比配置进行一步融合pcr处理。将连接之后的片段转入谷氨酸棒杆菌ATCC13032感受态内，之后涂板于添加卡那霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养12h，长出的单菌落即为重组菌株CG-HisGCg。
(c)以质粒pJYW4-HisGCg为模版，采用引物T235P-F、T235P-R，扩增得到质粒片段HisGT235P。将得到的片段转入大肠杆菌JM109感受态后进行测序。测序正确的单菌落接入含有卡那霉素抗性的2ml LB液体培养基内37培养16h后利用生工质粒提取试剂盒提取得到质粒pJYW4-HisGT235P。采用引物以质粒pJYW4-HisGT235P为模版，采用引物Y56M-F、Y56M-R，扩增得到质粒片段HisGT235P-Y56M。将得到的片段转入大肠杆菌JM109感受态后进行测序。测序正确的单菌落接入含有卡那霉素抗性的2ml LB液体培养基内37培养16h后利用生工质粒提取试剂盒提取得到质粒pJYW4-HisGT235P-Y56M。
(d)以pJYW4-HisGT235P-Y56M为模板，采用引物yf3-T235P-F1、yf3-T235P-R1、yf3-T235P-F2、yf3-T235P-R2、yf3-T235P-F3、yf3-T235P-R3扩增得到基因片段HisGT235P-1、HisGT235P-2、HisGT235P-3。以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模版，分别采用引物yf3-hisG-LF1、yf3-hisG-LR1、yf3-hisG-RF1、yf3-hisG-RR1、yf3-hisG-LF2、yf3-hisG-LR2、yf3-hisG-RF2、yf3-hisG-RR2、yf3-hisG-LF3、yf3-hisG-LR3、yf3-hisG-RF3、yf3-hisG-RR3扩增得到片段hisG-L1、hisG-R1、hisG-L2、hisG-R2、hisG-L3、hisG-R3。以crt-yf3为模板，分别采用引物Ryf3-hisG-F1、Ryf3-hisG-R1、Ryf3-hisG-F2、Ryf3-hisG-R2、Ryf3-hisG-F3、Ryf3-hisG-R3扩增得到基因片段Rcrt-yf3-1、Rcrt-yf3-2、Rcrt-yf3-3。
(e)将步骤(d)中获得的片段yf3-hisG-LF1、yf3-hisG-LR1、Rcrt-yf3-1与HisGT235P-1基因片段按照等摩尔比配置进行一步融合PCR处理。将连接之后的片段转入肠杆菌JM109感受态后进行测序。测序正确的单菌落接入含有卡那霉素抗性的2ml LB液体培养基内37培养16h后利用生工质粒提取试剂盒提取得到质粒yf3-hisG-1。同理，yf3-hisG-LF2、yf3-hisG-LR2、Rcrt-yf3-2与HisGT235P-2，以及yf3-hisG-LF3、yf3-hisG-LR3、Rcrt-yf3-3与HisGT235P-3以同样的方法连接并转化大肠杆菌JM109，测序正确后得到质粒yf3-hisG-2和质粒yf3-hisG-3。
(f)以质粒yf3-hisG-1为模板，采用引物cychisG-F1、cychisG-R1扩增得到片段cychisG-1。得到的片段转入大肠杆菌JM109感受态后进行测序。测序正确的单菌落接入含有卡那霉素抗性的2ml LB液体培养基内37培养16h后利用生工质粒提取试剂盒提取得到质粒cychisG-1。同理，分别以质粒yf3-hisG-2和yf3-hisG-3为模板，采用引物cychisG-F2、cychisG-R2和cychisG-F3、cychisG-R3扩增得到片段cychisG-2和cychisG-3。转化大肠杆菌测序正确后，得到质粒cychisG-2和质粒cychisG-3。
(g)制备谷氨酸棒杆菌13032感受态，通过电击转化质粒cychisG-1。之后涂板于添加卡那霉素的LBB固体培养基平板上，LBB液体30℃培养48h。测序正确的菌落为CG1。之后制备CG1感受态，依次转入质粒cychisG-2和质粒cychisG-3，分别得到含有HisGT235P-Y56M表达框的两个拷贝和三个拷贝的重组菌株CG2和CG3。
引物序列(5-3)：
hisG-F ttgcggccgccttaagatgttgaaaatcgctgtcccaaacaaa
hisG-R ttaaaactaatggtgatggtgatggtggatgcgggcgatgcggatttcagaagccagg
pJYW4-hisG-F agttttaactacccccgcagaagcggtctgataaaacag
pJYW4-hisG-R tgggacagcgattttcaacatcttaaggcggccgcaattgtta
T235P-F ccagtatccccactggcataacc
T235P-R gatactggtgggccggataagcctggg
Y56M-F gccatcatggttgctggtggccagctcgat
Y56M-R tggccaccagcaaccatgatggcgatatctttagggcg
yf3-T235P-LF1 ctagctgtcaatctagccgctctgcaagagctgttcgg
yf3-T235P-LR1 atcaccacatcgccagcttcggccctaattagctgcggtc
yf3-T235P-RF1 tttttgcgtttctacaaactcgcttgatcgttgtggctgagtt
yf3-T235P-RR1 cggaaactaatcaggcataaggtcgatgaaatccaatccggtgag
yf3-T235P-LF2 acccgagcgaggaatgcgaagctggcgatgtggtgattttg
yf3-T235P-LR2 tcaccacatcgccagcttcgcattcctcgctcgggtttatc
yf3-T235P-RF2 tgcgtttctacaaactcccacatccgctttccttctgaatg
yf3-T235P-RR2 ttcggcgtcacctcaaccaccatcctcatcatgc
yf3-T235P-LF3 ctagctgtcaatctagccgctctgcaagagctgttcgg
yf3-T235P-LR3 agctagctgtcaatctagccctggatgcccaagaaaccgc
yf3-T235P-RF3 attaattccgctagatgacgcttgaactagaacttaagcctgctccc
yf3-T235P-RR3 cttgtatctatcagtgaagcatcaaccaagcctttcttcctcatcgca
yf3-T235P-F1 tctcctatgctccacagttttcccagaagctggcgatgtggtg
yf3-T235P-R1 ctcacccacctcggatagcgtcatctagcggaattaattcatgagc
yf3-T235P-F2 cagctaattagggccgaagctggcgatgtggtgattttg
yf3-T235P-R2 cagccacaacgatcaagcgagtttgtagaaacgcaaaaaggcc
yf3-T235P-F3 ctgtgggagaagaaactctagcagaagctggcgatgtggtg
yf3-T235P-R3 cttaagttctagttcaagcgtcatctagcggaattaattcatgagc
Ryf3-hisG-F1 aaaaacaaaaatcccggcccacctatctacaacagtagaaattcggatccattatacct
Ryf3-hisG-R1
ctgttgtagataggtgggccgggatttttgtttttaatttaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagac
Ryf3-hisG-F2 ggtgaggtctgccacatggcgtgaatctacaacagtagaaattcggatccattatacct
Ryf3-hisG-R2 tcacgccatgtggcagacctcaccaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagac
Ryf3-hisG-F3 cttactggcgctgagcttttggccatctacaacagtagaaattcggatccattatacct
Ryf3-hisG-R3
atggccaaaagctcagcgccagtaagaatttaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagac
实施例3模块化代谢工程强化组氨酸合成代谢流
(a)以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模版，分别采用引物yf3-prs-LF、yf3-prs-LR、yf3-prs-RF、yf3-prs-RR、yf3-ptactkt-LF、yf3-ptactkt-LR、yf3-ptactkt-RF、yf3-ptactkt-RR、yf3-Δpgi-LF、yf3-Δpgi-LR、yf3-Δpgi-RF、yf3-Δpgi-RR扩增得到片段prs-L、prs-R、ptactkt-L、ptactkt-R、Δpgi-L、Δpgi-R。以crt-yf3为模板，分别采用引物Ryf3-prs-F、Ryf3-prs-R、Ryf3-ptactkt-F、Ryf3-ptactkt-R、Ryf3-Δpgi-F、Ryf3-Δpgi-R扩增得到基因片段Rcrt-prs、Rcrt-ptactkt和Rcrt-Δpgi。其中tkt为磷酸戊糖途径操作子的第一个基因，其下基因包括tal、zwf、opcA、pgL。
(b)将步骤(a)中获得的yf3-prs-LF、yf3-prs-LR、和Rcrt-prs基因片段按照等摩尔比配置进行融合PCR连接得到基因片段yf3-prs。得到的片段转入大肠杆菌JM109感受态后进行测序。测序正确的单菌落接入含有卡那霉素抗性的2ml LB液体培养基内37培养16h后利用生工质粒提取试剂盒提取得到质粒yf3-prs。同理，将基因片段ptactkt-L、ptactkt-R和Rcrt-ptactkt，Δpgi-L、Δpgi-R和Rcrt-Δpgi按照同样的操作步骤得到质粒yf3-ptactkt和yf3-Δpgi。
(c)以质粒yf3-prs为模板，采用引物cyc-prs-F、cyc-prs-R扩增得到片段cyc-prs。得到的片段转入大肠杆菌JM109感受态后进行测序。测序正确的单菌落接入含有卡那霉素抗性的2ml LB液体培养基内37培养16h后利用生工质粒提取试剂盒提取得到质粒cyc-prs。同理，以质粒yf3-ptactkt和yf3-Δpgi为模板，分别采用引物cyc-ptactkt-F、cyc-ptactkt-R和cyc-Δpgi-F、cyc-Δpgi-R扩增得到片段cyc-Δpgi。转化大肠杆菌测序正确后，得到质粒cyc-ptactkt和cyc-Δpgi。
(d)制备谷氨酸棒杆菌CG3感受态，通过电击转化质粒cyc-prs。之后涂板于添加卡那霉素的LBB固体培养基平板上，30℃培养液48h。测序正确的菌落为CG4。之后制备CG4感受态，转入依次转入质粒cyc-ptactkt和cyc-Δpgi。之后涂板于添加卡那霉素的LBB固体培养基平板上，LBB液体30℃培养48h。得到过表达tkt操纵子和pgi敲除的重组菌株CG6。
引物序列：
yf3-prs-LF ctagctgtcaatctagccggtcaatggcttggcgatttactc
yf3-prs-LR aaatcaccacatcgccagcaactatcccaccacctcctcaac
yf3-prs-RF gcgatcctccactactgcggcaaaattacctcacatgcctcac
yf3-prs-RR tcttgtatctatcagtgaagcatcaacgaagcctacttgagttccttgga
yf3-ptactkt-LF tgtcaatctagcccaagaaggtggtcagcacagttg
yf3-ptactkt-LR
tttttgtgtggggggtcagagacccccgcattatacgagccgatgattaattgtcaagtgtgaataggcgatagcatggc
yf3-ptactkt-RF
ggctcgtataatgcgggggtctctgaccccccacacaaaaatttaaaaggaggattttttatgaccaccttgacgctgtc
yf3-ptactkt-RR tgtatctatcagtgaagcatcaacctgccatgcagccttcttct
yf3-Δpgi-LF aatctagcctatccagcacggtcccagaatgttcagc
yf3-Δpgi-LR cgttactccgtggactccggtgcgttgatcgctttgtac
yf3-Δpgi-RF aaagcgatcaacgcaccggagtccacggagtaacgacc
yf3-Δpgi-RR atctatcagtgaagcatcaaccaccacaagcgttgggttaag
Ryf3-prs-F aagtaggcttcgttgatgcttcactgatagatacaagagcc
Ryf3-prs-R gtaaatcgccaagccattgaccggctagattgacagctagctcagtc
Ryf3-ptactkt-F gctgcatggcaggttgatgcttcactgatagatacaagagcc
Ryf3-ptactkt-R tgctgaccaccttcttgggctagattgacagctagctcagtc
Ryf3-Δpgi-F cccaacgcttgtggtggttgatgcttcactgatagatacaagagcc
Ryf3-Δpgi-R tgaacattctgggaccgtgctggataggctagattgacagctagc
cyc-prs-F gtttcacatctaccccacttgcccatctacaacagtagaaattcggatccattatacct
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cyc-ptactkt-R taaccaattaacctaagtcgtagattaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagac
cyc-Δpgi-F aaatttactggggtgagcctggcaatctacaacagtagaaattcggatccattatacc
cyc-Δpgi-R tgccaggctcaccccagtaaatttaatttaaataaaacgaaaggctcagtcgaaag
实施例4优化ATP的供应水平
(a)以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模版，分别采用引物yf3-Δfrd1-LF、yf3-Δfrd1-LR、yf3-Δfrd1-RF、yf3-Δfrd1-RR、yf3-Δfrd2-LF、yf3-Δfrd2-LR、yf3-Δfrd2-RF、yf3-Δfrd2-RR、yf3-amn-LF、yf3-amn-LR、yf3-amn-RF、yf3-amn-RR、yf3-purF-LF、yf3-purF-LR、yf3-purF-RF、yf3-purF-RR扩增得到片段Δfrd1-L、Δfrd1-R、Δfrd2-L、Δfrd2-R、Δamn-L、Δamn-R、ΔpurF-L、ΔpurF-R。以crt-yf3为模板，分别采用引物Ryf3-Δfrd1-F、Ryf3-Δfrd1-R、Ryf3-Δfrd2-F、Ryf3-Δfrd2-R、Ryf3-Δamn-F、Ryf3-Δamn-R、Ryf3-ΔpurF-F、Ryf3-ΔpurF-R扩增得到基因片段Rcrt-Δfrd1、Rcrt-Δfrd2、Rcrt-Δamn和Rcrt-ΔpurF。
(b)将步骤(a)中获得的Δfrd1-L、Δfrd1-R和Rcrt-Δfrd1基因片段按照等摩尔比配置进行融合PCR连接得到基因片段yf3-Δfrd1。得到的片段转入大肠杆菌JM109感受态后进行测序。测序正确的单菌落接入含有卡那霉素抗性的2ml LB液体培养基内37培养16h后利用生工质粒提取试剂盒提取得到质粒yf3-Δfrd1。同理，将基因片段Δfrd2-L、Δfrd2-R和Rcrt-Δfrd2，基因片段Δamn-L、Δamn-R和Rcrt-Δamn，基因片段ΔpurF-L、ΔpurF-R和Rcrt-ΔpurF，按照同样的操作步骤得到质粒yf3-Δfrd2、yf3-Δamn、yf3-ΔpurF。
(c)以质粒yf3-Δfrd1为模板，采用引物cyc-Δfrd1-F、cyc-Δfrd1-R扩增得到片段cyc-Δfrd1。得到的片段转入大肠杆菌JM109感受态后进行测序。测序正确的单菌落接入含有卡那霉素抗性的2ml LB液体培养基内37培养16h后利用生工质粒提取试剂盒提取得到质粒cyc-Δfrd1。同理，分别以质粒yf3-Δfrd2、yf3-Δamn和yf3-ΔpurF为模板，采用引物cyc-Δfrd2-F、cyc-Δfrd2-R、cyc-Δamn-F、cyc-Δamn-R、cyc-ΔpurF-F、cyc-ΔpurF-R扩增得到片段cyc-Δfrd2、cyc-Δamn和cyc-ΔpurF。转化大肠杆菌测序正确后，得到质粒cyc-Δfrd2、cyc-Δamn和cyc-ΔpurF。
(d)制备谷氨酸棒杆菌CG6感受态，通过电击转化质粒cyc-Δfrd1。之后涂板于添加卡那霉素的LBB固体培养基平板上，30℃培养液48h。测序正确的菌落为CG7。之后制备CG7感受态，依次转入质粒cyc-Δfrd2、cyc-Δamn和cyc-ΔpurF。之后涂板于添加卡那霉素的LBB固体培养基平板上，30℃培养液48h。最终测序正确的菌落为CG10，在CG7的基础上敲除了Frd2、AMN、PurF。
引物序列：
yf3-Δfrd1-LF agctagctgtcaatctagcccttcttggaaccgctgacgg
yf3-Δfrd1-LR ccgttaggaggctatcaactagtgaaagagttcatccagggagtg
yf3-Δfrd1-RF ccctggatgaactctttcactagttgatagcctcctaacggctgt
yf3-Δfrd1-RR tgtatctatcagtgaagcatcaaggggacggaaagagtaatcgtaaagt
yf3-Δfrd2-LF agctgtcaatctagcctcatgatctccaggaaatcggcg
yf3-Δfrd2-LR caccctgttgaccttgagcccctcacaaaagtggcgag
yf3-Δfrd2-RF gccacttttgtgaggggctcaaggtcaacagggtggg
yf3-Δfrd2-RR tgtatctatcagtgaagcatcaagatggtttgcatcgcaaagatcttca
yf3-amn-LF agctagctgtcaatctagcccggttgaattgatttcacattccaca
yf3-amn-LR gtgaacagaatgtacttctgcagcaccacactatctttctgcacg
yf3-amn-RF gaaagatagtgtggtgctgcagaagtacattctgttcaccaact
yf3-amn-RR tcttgtatctatcagtgaagcatcaaagtgcacccatcattgttaacgg
yf3-purF-LF ctagctgtcaatctagcccaacgaggtcatccacacacattg
yf3-purF-LR aagccaccgaacttggcatctggcatcccattcggc
yf3-purF-RF ggatgccagatgccaagttcggtggctttgtcc
yf3-purF-RR gtatctatcagtgaagcatcaacggttcgtactaggctgatgc
Ryf3-Δfrd1-F cgattactctttccgtccccttgatgcttcactgatagatacaagagcc
Ryf3-Δfrd1-R gtcagcggttccaagaagggctagattgacagctagctcagtc
Ryf3-Δfrd2-F agatctttgcgatgcaaaccatcttgatgcttcactgatagatacaagagcc
Ryf3-Δfrd2-R atttcctggagatcatgaggctagattgacagctagctcagtc
Ryf3-Δamn-F acaatgatgggtgcactttgatgcttcactgatagatacaagagcc
Ryf3-Δamn-R ggaatgtgaaatcaattcaaccgggctagattgacagctagctcagtc
Ryf3-ΔpurF-F cctagtacgaaccgttgatgcttcactgatagatacaagagcc
Ryf3-ΔpurF-R agatgcgactacccagccgcgctcaatttaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagac
cyc-Δfrd1-F aattttcatagcaacccctttccgatctacaacagtagaaattcggatccattatacct
cyc-Δfrd1-R atcggaaaggggttgctatgaaaattaatttaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagac
cyc-Δfrd2-F tccgagcttcagatcgcacacgttatctacaacagtagaaattcggatccattatacct
cyc-Δfrd2-R ataacgtgtgcgatctgaagctcggaaatttaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagac
cyc-Δamn-F agcacgtcaacggtgagtttggggatctacaacagtagaaattcggatccattatacct
cyc-Δamn-R
tagatccccaaactcaccgttgacgtgctaatttaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagac
cyc-ΔpurF-F gagcgcggctgggtagtcgcatctatctacaacagtagaaattcggatccattatacct
cyc-ΔpurF-R agatgcgactacccagccgcgctcaatttaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagac
实施例5谷氨酸棒杆菌的摇瓶发酵培养
将生长在LBB平板上的单个菌落接种到种子培养基中。每个菌株设置三个重复，细胞在50mL的种子培养基中生长。种子培养基含有以下成分：葡萄糖：25.0g/L；玉米浆：20.0g/L；KH2PO4：1.0g/L；(NH4)2SO4，0.5g/L；尿素，1.25g/L；并被调整到最终pH值为7.0。发酵培养基含有以下成分：葡萄糖，100.0g/L；玉米浆，10.0g/L；KH2PO4，1.0g/L；(NH4)2SO4，20.0g/L；MgSO4，0.5g/L；CaCO3，20.0g/L；和FeSO4，0.18g/L,调整到最终pH为7.0。培养16-18小时后，将种子培养的细菌培养基接种到发酵培养基中，初始OD600为1.6，生长120小时。
发酵后，取1mL发酵液于1.5mL管中，在14,000g下离心10分钟。然后，将上清液转移到一个2毫升的液相瓶中。用高效液相色谱法(Agilent-1260)测量L-组氨酸的浓度。使用Hypersil ODS C18柱(Thermo Fisher Scientific)和一个紫外指数(VWD)检测器来测量L-组氨酸的浓度。进样程序：首先抽取7μL硼酸溶液与1μL样品混合，之后加入2μL邻苯二甲醛(o-Phthalaldehyde,OPA)混合，最后加入30μL水，进样1μL。检测方法：使用Agilent 1260高效液相色谱仪测定发酵液中L-组氨酸，以OPA进行发酵液柱前衍生，色谱柱为Agilent C18柱(250mm×4.6mm,5μm)，紫外检测器的检测波长为338nm，柱温40℃。L-组氨酸产量检测结果见图3。
表1梯度洗脱程序
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (9)
1.一种ATP磷酸核苷转移酶突变体，其特征在于：所述ATP磷酸核苷转移酶突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的ATP磷酸核苷转移酶的第56位酪氨酸突变为甲硫氨酸，且第235位苏氨酸突变为脯氨酸得到。
2.编码权利要求1所述的ATP磷酸核苷转移酶突变体的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.携带权利要求2所述基因的载体。
5.表达权利要求1所述的ATP磷酸核苷转移酶突变体的细胞，其特征在于：所述细胞为细菌或真菌。
6.权利要求1所述的ATP磷酸核苷转移酶突变体、权利要求2或3所述的基因、权利要求4所述的载体、权利要求5所述的细胞在制备L-组氨酸中的应用。
7.一种产L-组氨酸的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum），其特征在于：所述谷氨酸棒杆菌表达了编码权利要求1所述的ATP磷酸核苷转移酶突变体的基因。
8.根据权利要求7所述的谷氨酸棒杆菌，其特征在于：所述谷氨酸棒杆菌还过表达了编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因zwf、编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶组装蛋白的基因opcA、编码6-磷酸葡糖酸内酯酶的基因pgl、编码酮基转移酶的基因tkt、编码醛基转移酶的基因tal和编码肽基脯氨酰异构酶的基因prs，敲除了编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的基因pgi、编码黄素还原酶Frd181和Frd188的基因frd1和frd2、编码AMP核苷酶的基因amn和编码氨基磷酰转移酶的基因purF。
9.一种生产L-组氨酸的方法，其特征在于：采用权利要求7或8所述的谷氨酸棒杆菌进行发酵生产。
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