CN111315876A - Atp磷酸核糖基转移酶突变体以及使用该突变体生产l-组氨酸的方法 - Google Patents

Atp磷酸核糖基转移酶突变体以及使用该突变体生产l-组氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种ATP磷酸核糖基转移酶(HisG)蛋白和使用该蛋白生产组氨酸的方法。

Description

ATP磷酸核糖基转移酶突变体以及使用该突变体生产L-组氨 酸的方法
[技术领域]
本公开涉及一种ATP磷酸核糖基转移酶变体以及使用该变体生产组氨酸的方法。
[背景技术]
L-组氨酸是20种标准氨基酸之一，从营养的角度来看，其大部分对成年人不是必需的，但对于成长中的儿童，被列为必需氨基酸。此外，L-组氨酸参与重要的生理过程，例如抗氧化、免疫调节等，因此被用于医疗行业(例如，用于治疗胃溃疡的药剂、用于心血管药剂的原料、氨基酸液，等)。
组氨酸主要存在于血红蛋白中，主要通过使用血粉为原料的蛋白质水解提取方法生产。但是，其具有效率低、环境污染等缺点。另一方面，L-组氨酸可以通过微生物发酵生产，但是尚未实现大规模工业化生产。这是因为L-组氨酸的生物合成与核苷酸合成前体即PRPP竞争，并且具有复杂的生物合成过程和需要高能量的调节机制。
通过诱变和突变选择方法以及通过遗传修饰调节菌株代谢的方法，已经改善了用于发酵方法中的微生物的L-组氨酸生产率。近来，已知通过使用若干步骤由PRPP生物合成来完成使用微生物的组氨酸生产。然而，参与组氨酸生物合成的第一酶，ATP磷酸核糖基转移酶，被终产物(即组氨酸或其衍生物)反馈抑制，这在工业上大规模生产L-组氨酸中是一个问题(国际专利公开号WO2014-029376)。
[发明内容]
[技术问题]
本发明人为改善被L-组氨酸抑制的ATP磷酸核糖基转移酶付出了巨大的努力，结果，本发明人发现向微生物中引入新开发的ATP磷酸核糖基转移酶变体能够以高产率生产L-组氨酸，从而完成本公开。
[技术方案]
本公开的一个目的是提供一种ATP磷酸核糖基转移酶变体，其具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列中的位置215用精氨酸取代天冬酰胺的取代、位置233用组氨酸取代甘氨酸的取代，和位置235用谷氨酰胺取代苏氨酸的取代。
本公开的另一个目的是提供编码ATP磷酸核糖基转移酶变体的多核苷酸。
本公开的又一个目的是提供一种包含编码ATP磷酸核糖基转移酶变体的多核苷酸的载体。
本公开的又一个目的是提供一种经转化以包含ATP磷酸核糖基转移酶变体和蛋白质的微生物。
本公开的又一个目的是提供一种生产组氨酸的方法，包括：在培养基中培养微生物；和从培养的微生物或培养基中回收组氨酸。
[有益效果]
本公开提供了使用ATP磷酸核糖基转移酶(HisG)蛋白有效生产组氨酸的方法。
[最佳模式]
在下文中，将详细描述本公开。同时，本文公开的每个解释和示例性实施方案可以应用于其他解释和示例性实施方案。即，本文公开的各种因素的所有组合均属于本公开的范围。此外，本公开的范围不应由下文提供的具体公开限制。
为了实现上述目的，本公开的一个方面提供了一种ATP磷酸核糖基转移酶变体，其具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列中位置215用精氨酸取代天冬酰胺的取代、位置233用组氨酸取代甘氨酸的取代，和位置235用谷氨酰胺取代苏氨酸的取代。
如本文所用，术语“ATP磷酸核糖基转移酶(HisG)”是指催化化学反应的糖基转移酶家族酶，尤其是属于戊糖基转移酶家族。该酶的通用名称是1-(5-磷酸-D-核糖基)-ATP：二磷酸磷酸-α-D-核糖基转移酶。该酶催化以下反应：1-(5-磷酸-D-核糖基)-ATP+二磷酸ATP+5-磷酸-α-D-核糖1-二磷酸。该酶催化组氨酸生物合成的第一步。
在本公开中，ATP磷酸核糖基转移酶可以与“HisG”或“HisG蛋白”互换使用。磷酸核糖基转移酶的序列可从已知数据库，即NCBI的GenBank获得。例如，ATP磷酸核糖基转移酶可以是源自棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)的ATP磷酸核糖基转移酶，但不限于此。例如，ATP磷酸核糖基转移酶可以具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列，但不限于此。例如，ATP磷酸核糖基转移酶可具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列或与SEQ ID NO：13的序列具有80％或更高的同源性或同一性的氨基酸序列，但不限于此。具体地，ATP磷酸核糖基转移酶可以包括与SEQ ID NO：13和1具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性或同一性的多肽。另外，显而易见的是，具有一部分序列缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的辅助蛋白也可以用作本公开的ATP磷酸核糖基转移酶，只要氨基酸序列具有上述同源性或同一性，并且具有与蛋白质相对应的作用。
具体地，本公开的ATP磷酸核糖基转移酶变体可以是这样的变体，其中在具有SEQID NO：13的氨基酸序列的棒状杆菌来源的ATP磷酸核糖基转移酶中，从N末端开始位置233位的甘氨酸氨基酸残基、位置235的苏氨酸氨基酸残基、位置215的天冬酰胺氨基酸残基被其他氨基酸取代。例如，位置233的甘氨酸氨基酸残基可以被组氨酸取代；位置235的苏氨酸氨基酸残基可以被谷氨酰胺取代；或者位置215的天冬酰胺氨基酸残基可以被精氨酸取代。
具体地，ATP磷酸核糖基转移酶变体可以由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。在本公开中，ATP磷酸核糖基转移酶变体可以包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有80％或更高的同源性或同一性的氨基酸序列，但不限于此。具体地，本公开的ATP磷酸核糖基转移酶变体可以包括SEQ ID NO：1的多肽和与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性或同一性的多肽。另外，显然，具有一部分序列缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的辅助蛋白也可以包括在本公开的范围内，只要该氨基酸序列具有上述同源性或同一性，并且具有与蛋白质相对应的作用。
另外，基于密码子简并性，很明显，由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质、或可以翻译成与上述蛋白质具有同源性或同一性的蛋白质的多核苷酸也可以被包括在本公开的范围内。另外，编码具有由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质的活性的蛋白质的任何序列也非限制性地包括在本公开的范围内，这样的序列可以通过在严格条件下与可以从已知基因序列制备的一个或多个探针杂交来确定，所述已知基因序列例如，上述核苷酸序列的全部或部分的互补序列。术语“严格条件”是指使多核苷酸之间特异性杂交成为可能的条件。此类条件在参考文献中具体描述(例如，J.Sambrook等人，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory press，Cold SpringHarbor，New York，1989；F.M.Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.，New York)。例如，条件可以包括在具有高同源性、同源性或同一性为80％或更高、特别是85％或更高、更特别是90％或更高、甚至更特别是95％或更高、甚至更特别是97％或更高、最特别是99％或更高的基因之间进行杂交，而在具有低于上述同源性或同一性的基因之间不进行杂交；或者在常规洗涤条件下进行一次杂交、特别是两次或三次杂交，对于Southern杂交，所述常规洗涤条件为60℃、1×SSC和0.1％SDS，特别是盐浓度和温度对应于60℃、0.1×SSC和0.1％SDS，更特别地，68℃、0.1×SSC和0.1％SDS。
即，尽管在本公开中被描述为“具有特定SEQ ID NO的氨基酸序列的蛋白质或多肽”，但是该蛋白质或多肽可以与由相应的SEQ ID NO的氨基酸序列组成的多肽具有相同或相应的活性。在这种情况下，很明显在本公开中也可以使用具有部分序列的缺失、修饰、取代、保守取代或添加的氨基酸序列的任何蛋白质。例如，在与修饰的多肽具有相同或相应的活性的情况下，不排除在氨基酸序列的上游或下游添加序列，这不改变其功能，可能天然发生的突变、其沉默突变或保守构造，甚至当存在序列添加或突变时，它显然也属于本公开的范围。
术语“保守取代”是指一个氨基酸被具有相似结构和/或化学性质的另一氨基酸取代。通常可以基于所涉及残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来进行这种氨基酸取代。例如，带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；带负电荷的(酸性)氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸；芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；疏水性氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。
因此，在本公开中，除“具有特定SEQ ID NO的氨基酸序列的蛋白质或多肽”之外，“变体”还可包括一个或多个氨基酸的保守取代和/或修饰。例如，一些变体可以包括其中一个或多个部分已被去除的变体，例如N-末端前导序列或跨膜结构域被去除。其他变体可以包括其中一部分已经从N-末端和/或C-末端去除的变体。另外，变体可以包括其他修饰，包括删除或添加对多肽的性质和二级结构影响最小的氨基酸。例如，多肽可以与蛋白质N-末端的信号(或前导)序列缀合，该信号(或前导)序列在翻译时或翻译后参与蛋白质的转移。另外，多肽还可以与另一序列或接头缀合以鉴定、纯化或合成多肽。如本文所用，术语“变体”可以指变体、修饰、修饰的蛋白质、修饰的多肽、突变体、突变蛋白、趋异等，并且不受限制，只要该术语指修饰即可。
杂交需要两个核酸具有互补序列，尽管碱基之间的错配是可能的，这取决于杂交的严格性。术语“互补的”用于描述相互可杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于DNA，腺苷与胸腺嘧啶互补，而胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开还可以包括与整个序列以及基本上相似的核酸序列互补的分离的核酸片段。
具体地，可以使用包括杂交步骤的杂交条件以及使用上述条件在55℃的Tm值下检测具有同源性或同一性的多核苷酸。另外，Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，并且可以由本领域普通技术人员根据预期目的适当地调节。
适合于多核苷酸杂交的严格性取决于多核苷酸的长度和互补性，并且相关的变量是本领域众所周知的(参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51，11.7-11.8)。
同源性或同一性是指与给定的氨基酸序列或核苷酸序列的匹配程度，并且可以表示为百分比。
术语“同源性”和“同一性”通常可以彼此互换使用。
保守的多核苷酸或多肽序列的序列同源性或同一性可以通过标准比对算法确定，并且可以与所使用的程序建立的默认空位罚分一起使用。通常预期基本上同源或相同的序列在中度或高度严格性下、在序列全长或序列全长的至少约50％、约60％、约70％、约80％或约90％上杂交。还考虑了含有非杂交多肽中密码子的简并密码子的多核苷酸。
可以使用已知的计算机算法确定任何两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性，例如“FASTA”程序(Pearson等人，(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85]：2444：using default parameters in 2444)。或者，可以使用Needleman-Wunsch算法(Needleman and Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48∶443-453)，该算法在EMBOSS软件包的Needleman程序中执行((EMBOSS：The European Molecular Biology Open SoftwareSuite，Rice等人，2000，Trends Genet.16：276-277)(5.0.0版本或之后的版本)(GCG程序包(Devereux，J.，等人，Nucleic Acids Research 12：387(1984))，BLASTP，BLASTN，FASTA(Atschul，[S.][F.，][ET AL，J MOLEC BIOL 215]：403(1990)；Guide to Huge Computers，Martin J.Bishop，[ED.，]Academic Press，San Diego，1994，和[CARILLO ETA/.](1988)SIAM J Applied Math 48：1073)。例如，可以使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BLAST或ClustalW确定同源性、相似性或同一性。
多核苷酸或多肽序列的同源性、相似性或同一性可以通过使用例如GAP计算机程序(例如，Needleman等人，(1970)，J Mol Biol.48：443)，如所公开的(例如Smith和Waterman，Adv.Appl.Math(1981)2∶482)，比较序列信息来确定。总之，GAP程序将同源性、相似性或同一性定义为数值，该数值通过用相似比对的符号(即核苷酸或氨基酸)数除以两个序列中较短序列的符号总数而获得。GAP程序的默认参数可以包括(1)一元比较矩阵(对于相同的，其含有的值为1；对于非相同的，值为0)；以及Gribskov等人(1986)，Nucl.AcidsRes.14∶6745的加权比较矩阵，如Schwartz和Dayhoff，编辑，Atlas of Protein Sequenceand Structure，National Biomedical Research Foundation，第353-358页，1979所公开；(2)对于每个空位，3.0的罚分，对于每个空位中的各符号加0.10的罚分(或10的空位开放罚分和0.5的空位延伸罚分)；和(3)末端空位无罚分。因此，如本文所用，术语“同源性”或“同一性”是指序列之间的相关性。
本公开的另一方面提供了编码ATP磷酸核糖基转移酶变体的多核苷酸，或包含该多核苷酸的载体。
如本文所用，术语“多核苷酸”是指由链中共价键合的核苷酸单体组成的核苷酸聚合物，其实例是具有预定或更长长度的DNA或RNA链。具体地，多核苷酸是指编码修饰的多肽的多核苷酸片段。
在本公开中，编码ATP磷酸核糖基转移酶的氨基酸序列的基因是hisG基因，其可以具体地源自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。基于遗传密码简并性，编码相同氨基酸序列及其变体的核苷酸序列属于本公开的范围，并且具体地，它们可以由SEQID NO：2表示，但不限于此。
另外，关于修饰的多肽，基于遗传密码简并性，编码相同氨基酸及其变体的核苷酸序列也属于本公开的范围。
本公开的另一方面提供了包含编码ATP磷酸核糖基转移酶变体的多核苷酸的宿主细胞，和用包含编码ATP磷酸核糖基转移酶变体的多核苷酸的载体转化的微生物。具体地，可以通过转化来进行引入，但不限于此。
具体地，与包含野生型ATP磷酸核糖基转移酶的微生物相比，在包含本公开的ATP磷酸核糖基转移酶变体的微生物中，组氨酸的生产能力得到改善，而不抑制宿主细胞的生长。因此，可以从这些微生物以高产率获得组氨酸。
如本文所用，术语“载体”是指包含编码靶蛋白的多核苷酸的核苷酸序列的DNA构建体，其中靶蛋白可操作地连接至合适的控制序列，从而使其可以在合适的宿主中表达。控制序列包括能够启动转录的启动子、用于控制转录的任何操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合结构域的序列以及控制转录和翻译终止的序列。在用合适的宿主细胞转化后，载体可以与宿主基因组无关地复制或发挥功能，或者可以整合入宿主基因组本身。
对本公开中使用的载体没有特别限制，只要其能够在宿主细胞中复制即可，并且可以使用本领域已知的任何载体。常规载体的实例可包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A和Charon21A可以用作噬菌体载体或粘粒载体；pBR型、pUC型、pBluescriptII型、pGEM型、pTZ型、pCL型和pET型可用作质粒载体。对本公开中可用的载体没有特别限制，可以使用任何已知的表达载体。具体地，可以使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118或pCC1BAC载体。
在一个实施方案中，可以通过用于染色体插入的载体用修饰的多核苷酸替换在染色体中编码靶蛋白的多核苷酸。可以通过本领域已知的任何方法(例如，同源重组)将多核苷酸插入染色体中，但是该方法不限于此。
如本文所用，术语“转化”是指将包含编码靶蛋白的多核苷酸的载体引入宿主细胞的过程，从而使该多核苷酸编码的蛋白质在宿主细胞中表达。对于转化的多核苷酸，所述转化的多核苷酸是否插入宿主细胞的染色体中并且位于其中、或位于染色体的外部，并不重要，只要它可以在宿主细胞中表达，两种情况均包括。另外，多核苷酸包括编码靶蛋白的DNA和RNA。多核苷酸可以以任何形式插入，只要可以将其引入宿主细胞并在其中表达。例如，可以将多核苷酸以表达盒的形式引入宿主细胞，所述表达盒是包括自我表达所需的所有必需元件的基因构建体。表达盒通常可以包括与多核苷酸可操作地连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合结构域和翻译终止信号。表达盒可以是能够自我复制的表达载体的形式。另外，可以将多核苷酸原样引入宿主细胞中并且可操作地连接至其在宿主细胞中表达所必需的序列，但是多核苷酸不限于此。
另外，如本文所用，术语“可操作地连接”是指启动子序列和上述基因序列之间的功能性连接，所述启动子序列起始并介导编码本公开的靶蛋白的多核苷酸的转录。
如本文所用，术语“组氨酸生产的微生物”或“具有组氨酸生产率的微生物”是指天然具有组氨酸生产能力的微生物或向其不具有组氨酸生产能力的亲本菌株提供组氨酸生产能力的微生物。
组氨酸生产的微生物可以是细胞或微生物，其包括编码修饰的多肽的多核苷酸或通过转化包含编码修饰的多肽的多核苷酸的载体，能够表达修饰的多肽的多核苷酸。为了本公开的目的，宿主细胞或微生物可以是能够生产L-组氨酸的任何微生物，其包括ATP磷酸核糖基转移酶变体。例如，微生物可以是微生物菌株，例如埃希氏菌属(Escherichia sp.)、沙雷氏菌属(Serratia sp.)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)、肠杆菌属(Enterobacteriasp.)、沙门氏菌属(Salmonella sp.)、链霉菌属(Streptomyces sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、短杆菌属(Brevibacterium sp.)或棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)，特别地，可以是棒状杆菌属的微生物，并且更特别地可以是谷氨酸棒状杆菌，但是该微生物不限于此。
如本文所用，术语“生产组氨酸的棒状杆菌属的组氨酸生产的微生物”是指天然地或通过修饰具有组氨酸生产能力的棒状杆菌属的微生物。已知组氨酸包含在棒状杆菌属的微生物的培养物中。然而，其组氨酸生产能力非常低，并且尚未揭示参与生产的基因或机制。因此，本公开中的“具有组氨酸生产能力的棒状杆菌属的微生物”是指天然微生物本身或其中插入了参与组氨酸生产机制的外源基因或内源基因活性被增强或失活以具有改善的组氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物。
如本文所用，“棒状杆菌属的微生物”可以具体地是谷氨酸棒状杆菌、氨化棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、泌乳短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、热氨基棒状杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)、高效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)等，但不限于此。更具体地，棒状杆菌属的微生物可以是谷氨酸棒状杆菌，即使暴露于高浓度的组氨酸也几乎不影响其细胞生长和存活。
本公开的另一方面提供了一种生产组氨酸的方法，其包括：培养本公开中所述的微生物；和从培养的微生物或培养基中回收组氨酸。
在该方法中，培养微生物的步骤可以通过本领域已知的分批培养、连续培养和分批补料培养进行，但不特别限于此。在此，对培养条件没有特别限制，但是可以通过使用碱性化学物质(例如氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化学物质(例如磷酸或硫酸)来维持最佳pH(例如，pH 5至9，特别是pH 6至8，最特别是pH 6.8)。另外，可通过向细胞培养物中添加氧或含氧体混合物来维持好氧条件。培养温度可以维持在20℃至45℃，特别是25℃至40℃，并且可以进行约10小时至160小时的培养，但是条件不限于此。培养物产生的组氨酸可以分泌到培养基中或保留在细胞中。
另外，用于培养的培养基可以包含糖和碳水化合物(例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)，油类和脂类(例如大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)，脂肪酸(例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)，醇(例如甘油和乙醇)和有机酸(例如乙酸)单独或组合作为碳源；以及含氮有机化合物(例如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米溶液、豆粕粉和尿素)或无机化合物(例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)单独或组合作为氮源；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或与其对应的含钠盐单独或组合作为磷源；但是这些不限于此。另外，培养基可包含必需的促进生长的物质，例如其他金属盐(例如硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸和维生素。
可以通过使用本领域已知的合适方法根据培养方法来进行用于回收在本公开的培养步骤中生产的组氨酸的方法，以从培养基中收集靶氨基酸。例如，可以使用离心、过滤、阴离子交换色谱法、结晶和HPLC，并且可以通过使用本领域已知的合适方法从培养基或微生物中回收靶组氨酸。
[具体实施方式]
以下，将结合示例性实施方案详细描述本公开。然而，本文公开的示例性实施方案仅出于说明目的，并且不应被解释为限制本公开的范围。
实施例1：ATP磷酸核糖基转移酶(HisG)变体的设计
在棒状杆菌属微生物的ATP磷酸核糖基转移酶(HisG)中，当组氨酸、嘌呤型核苷酸等的浓度增加时，作为底物的ATP竞争性或非竞争性地结合ATP磷酸核糖基转移酶的调节结构域，从而使其活性减弱。基于此，设计了在结构上增强其活性同时防止组氨酸与ATP磷酸核糖基转移酶结合的变体。
具体地，设计了ATP磷酸核糖基转移酶变体(N215R/G233H/T235Q，SEQ ID NO：1)，其中从谷氨酸棒状杆菌ATP磷酸核糖基转移酶的N-末端，在位置233的甘氨酸氨基酸残基被组氨酸取代，在位置235的苏氨酸氨基酸残基被谷氨酰胺取代，在位置215的天冬酰胺氨基酸残基被精氨酸取代。编码SEQ ID NO：1的ATP磷酸核糖基转移酶变体的核苷酸序列是SEQID NO：2。
实施例2：克隆hisG基因、以及构建用于制备无标记菌株的用于染色体插入的载体
实施例2-1：克隆HisG基因，其中引入了N215R变异和G233H和T235Q变异，并构建用于染色体插入的载体
分离野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体基因，然后使用SEQ ID NO：3和4的引物对(表1)通过聚合酶链反应获得hisG基因片段。在此，在95℃变性5分钟后，在以下条件下进行PCR共25个循环：在95℃变性30秒，在52℃退火30秒，在72℃聚合90秒。之后，在72℃下进行聚合反应7分钟。结果，获得了多核苷酸(约850bp)。将如此获得的hisG基因片段连接至TOPO载体，并将构建的载体命名为pTOPO-hisG。
[表1]
SEQ ID NO： 引物 序列(5′-3′)
3 Xba1-Cgl-hisG-F GGGTCTAGACCCAAACAAAGGCTCGC
4 Xba1-Cgl-hisG-R GGGTCTAGAGCAAGGTTGGCAACAACC
使用制备的pTOPO-hisG载体作为模板，使用表1和2中所述的引物进行PCR。围绕用于引入hisG基因变异的待修饰区域，分别对5′和3′末端进行初次PCR，然后进行第二次PCR以组合两个PCR片段。
具体地，使用Xba1-Cgl-hisG-F(SEQ ID NO：3)和Cgl-hisG-G233H/T235Q-R(SEQID NO：8)引物通过PCR扩增模板的5′末端。使用Cgl-hisG-G233H/T235Q-F(SEQ ID NO：7)和Xba1-Cgl-hisG-R(SEQ ID NO：4)引物通过PCR扩增模板的3′末端。使用Xba1-Cgl-hisG-F(SEQ ID NO：3)和Xba1-Cgl-hisG-R(SEQ ID NO：4)引物、使用通过PCR获得的两个PCR片段作为模板进行第二次PCR。通过第二次PCR获得的hisG_G233H/T235Q基因的片段被限制性内切酶XbaI(New England Biolabs，Beverly，MA)切割。通过使用T4连接酶(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)将切割的基因片段与线性载体连接来构建重组载体，其中用于染色体插入的pDC载体已经用限制酶XbaI消化。所构建的载体被命名为pDC-hisG_G233H/T235Q。
为了进一步引入N215R变异，再次进行了第二次PCR。具体地，使用pDC-hisG_G233H/T235Q为模板，使用Cgl13032 hisG N215R-F(SEQ ID NO：5)和Cgl-hisG-G233H/T235Q-R(SEQ ID NO：8)引物通过PCR扩增5′末端；使用Cgl-hisG-G233H/T235Q-F(SEQ IDNO：7)和Cgl13032 hisG N215R-R(SEQ ID NO：6)引物通过PCR扩增3′末端。使用Xba1-Cgl-hisG-F(SEQ ID NO：3)和Xba1-Cgl-hisG-R(SEQ ID NO：4)引物、使用两个扩增的PCR片段作为第二次PCR的模板进行第二次PCR。将通过第二次PCR获得的基因片段用限制酶XbaI切割，并将切割的基因片段连接至线性载体，其中已经用限制酶XbaI消化了用于染色体插入的pDC载体。之后，将所得产物插入到pDC载体中。构建的载体被命名为pDC-hisG_N215R/G233H/T235Q。通过序列分析证实hisG变异是否被引入到如此构建的载体中。
实施例2-2：克隆其中引入已知HisG的基因，并构建用于染色体插入的载体
为了比较其中引入了已知的HisG修饰基因(N215K/L231F/T235A)的微生物与其中引入了本公开的变异的微生物的组氨酸生产能力，构建了已知修饰基因的载体(Biochimie.2012Mar；94(3)：829-38)。
为了构建其中引入了HisG修饰基因(N215K/L231F/T235A)的载体，以与实施例2-1同样的方式，使用引物SEQ ID NO：9和12和SEQ ID NO：10和11中的各引物、使用pTOPO模板载体作为模板进行PCR扩增(表2)。使用两个扩增的PCR片段作为第二次PCR的模板，使用引物Xba1-Cgl-hisG-F(SEQ ID NO：3)和Xba1-Cgl-hisG-R(SEQ ID NO：4)进行第二次PCR。用限制酶XbaI切割从第二次PCR获得的基因片段，并将切割的基因片段连接至线性载体，其中用于染色体插入的pDC载体已经用限制酶XbaI消化。之后，将得到的产物插入到PDC载体中。这样构建的载体被命名为pDC-hisG_N215K/L231F/T235A。
[表2]
Figure GDA0002485961730000141
实施例3：选择插入HisG修饰基因的菌株
实施例3-1：选择插入HisG修饰基因的野生型菌株
通过电穿孔用在实施例2中构建的包含HisG修饰基因的hisG_N215R/G233H/T235Q载体转化野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032。之后，从含有卡那霉素(25mg/L)的选择培养基中选择显示抗性的菌株。进行第二次重组过程(交叉)以选择将修饰基因插入染色体的菌株。使用引物Xba1-Cgl-hisG-F(SEQ ID NO：3)和Xba1-Cgl-hisG-R(SEQ ID NO：4)进行PCR。通过PCR产物的序列分析确认通过基因组上插入的DNA片段hisG_N215R/G233H/T235Q插入了hisG修饰基因的菌株，并将其命名为ATCC13032-161。
实施例3-2：选择具有L-组氨酸生产能力的菌株，向其中插入包含HisG修饰基因的载体
谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032不能产生组氨酸。因此，为了测量酶的活性并确认L-组氨酸的生产能力，将具有L-组氨酸生产能力的菌株HCJ-86(KCCM11795P)用作宿主细胞。
HCJ-86如下获得。在野生型谷氨酸棒状杆菌活化培养基中培养并失活16小时后，将活化的菌株接种到121℃下灭菌15分钟的种子培养基中，然后培养14小时。之后，回收培养基(5mL)。回收的培养基用柠檬酸缓冲液(100mM)洗涤，加入N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)至终浓度为200mg/L，然后将所得物处理20分钟。之后，将所得物用磷酸盐缓冲液(100mM)洗涤。通过在基本培养基上涂抹用NTG处理的菌株来计算死亡率，发现死亡率为85％。
选择一种变体，其对1，2，4-三唑-3-丙氨酸(例如，L-组氨酸的衍生物)具有抗性，并且具有L-组氨酸生产能力。该变体命名为HCJ-86。HCJ-86变体已于2015年12月22日保藏在韩国微生物培养中心，根据布达佩斯条约该中心为国际保藏机构，保藏号为KCCM11795P。HCJ-86的hisG基因的序列分析显示该序列与野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的序列相同。因此，证实了hisG基因没有变异。
通过电穿孔用实施例2中构建的含有HisG修饰基因的pDC-hisG_G233H/T235Q、pDC-hisG_N215R/G233H/T235Q和pDC-hisG_N215K/L231F/T235A载体转化谷氨酸棒状杆菌HCJ-86。之后，从含有卡那霉素(25mg/L)的选择培养基中选择表现抗性的菌株。进行第二次重组过程(交叉)以选择其中将修饰基因插入染色体的菌株。使用引物Xba1-Cgl-hisG-F(SEQ ID NO：3)和Xba1-Cgl-hisG-R(SEQ ID NO：4)进行PCR。获得了其中通过插入到基因组上的DNA片段hisG_G233H/T235Q、hisG_N215R/G233H/T235Q和hisG_N215K/L231F/T235A修饰的hisG基因的菌株，并通过PCR产物的序列分析加以证实。这些分别被命名为HCJ-96、HCJ-161和HCJ-162。
其中，HCJ-161已于2017年2月27日保藏在韩国微生物培养中心，根据布达佩斯条约该中心为国际保藏机构，保藏号为KCCM11982P。
另外，分析了进行第二次重组过程(交叉)的菌株的序列，以选择仅具有hisG_N215R DNA片段的菌株，并将其命名为HCJ-163。
为了构建具有hisG_N215R/L231F/T235A修饰的菌株，通过电穿孔用pDC-hisG_N215K/L231F/T235A载体转化HCJ-161菌株。此后，主要从含有卡那霉素(25mg/L)的选择培养基中选择表现抗性的菌株。分析进行了第二次重组过程(交叉)的菌株的序列，然后从已经在hisG基因中发生重组的菌株中第二次选择含有hisG_N215R/L231F/T235A修饰的菌株。选择的菌株被命名为HCJ-164。
为了制备具有hisG_N215K/G233H/T235Q修饰的菌株，通过电穿孔用pDC-hisG_G233H/T235Q载体转化HCJ-162菌株。之后，主要从含有卡那霉素(25mg/L)的选择培养基中选择表现抗性的菌株。分析进行了第二次重组过程(交叉)的菌株的序列，然后从已经在hisG基因中发生重组的菌株中第二次选择含有hisG_N215K/G233H/T235Q修饰的菌株。选择的菌株被命名为HCJ-165。每个菌株和ATP磷酸核糖基转移酶(HisG)修饰性状示于下表3中。
[表3]
菌株 HisG修饰性状
HCJ-96 HisG(G233H/T235Q)
HCJ-161 HisG(N215R/G233H/T235Q)
HCJ-162 HisG(N215K/L231F/T235A)
HCJ-163 HisG(N215R)
HCJ-164 HisG(N215R/L231F/T235A)
HCJ-165 HisG(N215K/G233H/T235Q)
实施例4：测定ATP磷酸核糖基转移酶的活性
实施例4-1：获得ATP磷酸核糖基转移酶
将实施例3中选择的谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032和菌株HCJ-96、HCJ-161、HCJ-162、HCJ-163、HCJ-164和HCJ-165各自接种到含有种子培养基(25mL)的转角烧瓶(250mL)中，并在200rpm摇动下于30℃培养20小时，以获得种子培养液。之后，将种子培养液(1mL)接种到含有生产培养基(24mL)的转角烧瓶(250mL)中，并在200rpm、30℃下培养45小时。培养后，对获得的细胞进行超声处理并离心，并将由此获得的上清液用于评估ATP磷酸核糖基转移酶的活性。同时，实施例4-1中使用的培养基组成示于下表4中。
[表4]
Figure GDA0002485961730000171
实施例4-2：测量ATP磷酸核糖基转移酶的活性
测量在实施例4-1中获得的ATP磷酸核糖基转移酶变体的活性和野生型ATP磷酸核糖基转移酶变体的活性。参照现有文献报告(Biochimie.2012Mar；94(3)：829-38)中描述的条件进行这些酶活性的评估。
为了评估酶的活性，将上清液定量以给出相同的浓度。这些酶用作样品酶，反应条件如下：将反应组合物混合到定量的蛋白质(0.05mg)中，得到总量为500μL，然后在30℃、290nm的UV波长下测量90秒。对于具有低活性的野生型ATP磷酸核糖基转移酶，使用上清蛋白(0.3mg)并在290nm的UV波长下测量30分钟以进行活性评估。用于测量酶活性的反应溶液组合物如下：
[表5]
Figure GDA0002485961730000172
测量的结果证实，与野生型ATP磷酸核糖基转移酶相比，ATP磷酸核糖基转移酶变体具有增强的活性。特别是，具有N215R/G233H/T235Q变异的ATP磷酸核糖基转移酶变体的活性是野生型酶活性的160倍(表6)。
[表6]
ATP磷酸核糖基转移酶(HisG)的活性
酶的类型 活性(U/mg)
HisG 0.013
HisG(G233H/T235Q) 1.381
HisG(N215R/G233H/T235Q) 2.082
HisG(N215K/L231F/T235A) 0.387
HisG(N215R) 0.021
HisG(N215R/L231F/T235A) 0.408
HisG(N215K/G233H/T235Q) 1.3
实施例4-3：测量组氨酸对ATP磷酸核糖基转移酶变体活性的抑制程度
测量了L-组氨酸对ATP磷酸核糖基转移酶和实施例4-1中获得的ATP磷酸核糖基转移酶变体的活性的抑制程度。具体地，使用实施例4-2中所述的方法在包含L-组氨酸(0mM、50mM或100mM)的实施例4-2的反应组合物溶液中测量这些酶的活性。测定的结果证实，在50mM和100mM的L-组氨酸浓度下，野生型酶的活性被完全抑制。然而，ATP磷酸核糖基转移酶变体的活性较少受L-组氨酸抑制。特别地，即使在含有L-组氨酸(100mM)的组合物溶液中，具有N215R/G233H/T235Q变异的ATP磷酸核糖基转移酶变体也显示出最高的活性(表7)。
[表7]
L-组氨酸抑制ATP磷酸核糖基转移酶(HisG)活性
Figure GDA0002485961730000181
Figure GDA0002485961730000191
实施例5：测量其中引入了ATP磷酸核糖基转移酶变体的L-组氨酸生产菌株产生L- 组氨酸的能力
测量实施例3中选择的菌株的L-组氨酸生产能力，以证实具有增加活性的ATP磷酸核糖基转移酶变体对L-组氨酸生产的影响。
将谷氨酸棒状杆菌亲本菌株ATCC 13032和变体ATCC13032-161、HCJ-96、HCJ-161、HCJ-162、HCJ-163、HCJ-164和HCJ-165各自接种到含有种子培养基(25mL)的转角烧瓶(250mL)中，在30℃下、以200rpm摇动，培养20小时，得到种子培养液。之后，将种子培养液(1mL)接种到含有生产培养基(24mL)的转角烧瓶(250mL)中，并在30℃下、在200rpm下培养45小时以生产L-组氨酸。培养完成后，使用高效液相色谱法(HPLC)测量L-组氨酸的生产量。详细的分析方法和浓度示于下表8。
[表8]
Figure GDA0002485961730000192
[表9]
Figure GDA0002485961730000201
结果证实野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032没有以任何方式产生L-组氨酸，用本公开的ATP磷酸核糖基转移酶变体转化的ATCC13032-161产生了L-组氨酸(0.5g/L)。另外，HCJ-161产生L-组氨酸(2.3g/L)，其量比亲本菌株HCJ-86产生L-组氨酸的量高43.75％(表9)。证实了HCJ-86、HCJ-96、HCJ-162、HCJ-163和HCJ-164菌株均产生1.6g/L至1.9g/L水平的组氨酸，并且具有ATP磷酸核糖基转移酶变体(N215R/G233H/T235Q)的HCJ-161菌株显示最高的酶活性和L-组氨酸生产能力。结果证实了通过使用本公开的ATP磷酸核糖基转移酶变体(N215R/G233H/T235Q)可以高效和高产率地生产L-组氨酸。
虽然已经参考特定的说明性实施方案描述了本公开，但是本公开所属领域的技术人员将理解，在不脱离本公开的技术主旨或实质特征的情况下，可以以其他特定形式来实现本公开。因此，上述实施方案在所有方面都被认为是说明性的而不是限制性的。此外，本公开的范围由所附权利要求而不是详细描述来限定，并且应当理解，从本公开的含义和范围及其等同物得出的所有修改或变化都包括在所附权利要求的范围内。
Figure GDA0002485961730000211
Figure IDA0002377842060000011
Figure IDA0002377842060000021
Figure IDA0002377842060000031
Figure IDA0002377842060000041
Figure IDA0002377842060000051
Figure IDA0002377842060000061
Figure IDA0002377842060000071
Figure IDA0002377842060000081

Claims (8)

1.一种ATP磷酸核糖基转移酶变体，其具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列中的用精氨酸取代位置215处天冬酰胺的取代、用组氨酸取代位置233处甘氨酸的取代，和用谷氨酰胺取代位置235处苏氨酸的取代。
2.根据权利要求1所述的ATP磷酸核糖基转移酶变体，其中所述ATP磷酸核糖基转移酶变体由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。
3.一种多核苷酸，其编码权利要求1所述的ATP磷酸核糖基转移酶变体。
4.一种载体，其包含编码权利要求1所述的ATP磷酸核糖基转移酶变体的多核苷酸。
5.一种生产组氨酸的棒状杆菌(Corynebacterium)属微生物，其中所述微生物包含权利要求1所述的ATP磷酸核糖基转移酶变体或所述微生物被权利要求4所述的载体转化。
6.根据权利要求5所述的微生物，其中所述棒状杆菌属的微生物是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
7.一种生产组氨酸的方法，其包括：
在培养基中培养权利要求5所述的生产组氨酸的棒状杆菌属微生物，和
从培养的微生物或培养基中回收组氨酸。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述棒状杆菌属微生物是谷氨酸棒状杆菌。
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