CN112322601B - 磷酸烯醇丙酮酸合成酶的突变体及其在产色氨酸方面的应用 - Google Patents
磷酸烯醇丙酮酸合成酶的突变体及其在产色氨酸方面的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了大肠杆菌编码一种磷酸烯醇丙酮酸合成酶ppsA的突变体及其应用，其中在将原始磷酸烯醇丙酮酸合成酶第419位氨基酸突变为D或者P。通过构建包含所述编码磷酸烯醇丙酮酸合成酶突变体的工程菌生物安全，遗传背景清晰，可以有效的提高大肠杆菌生产芳香族氨基酸的能力，具有较大的应用推广价值。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域和食品领域，具体涉及一种磷酸烯醇丙酮酸合成酶的突变体及其在产色氨酸方面的应用。
背景技术
L-色氨酸是人体和动物生命活动中必需的氨基酸之一。在生物体内，L-色氨酸可以合成5-羟基色胺、烟酸、色素、生物碱、辅酶、吲哚乙酸等重要的生物活性物质，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用。因此，L-色氨酸广泛应用于食品、医药、饲料等方面。据立木信息咨询发布的《中国L-色氨酸市场分析及投资价值调研报告（2018版）》显示：目前，世界市场色氨酸年需求量在20000吨以上，并且以每年10%的速度增长。目前国内的企业如：巨龙、梅花等发酵产量在40~45 g/L，而一些生产氨基酸的国际公司如日本味之素，韩国希杰等目前已达到70g/L的生产能力，我国在此领域已经严重落后国外的先进水平。因此，重视色氨酸的潜在市场需求，提升菌株的发酵性能，开发具有我国自主知识产权的色氨酸高效合成菌株及其发酵技术是一个亟需解决的问题。
目前利用微生物生产 L-色氨酸的方法主要有酶法、微生物转化法和微生物发酵法，其中微生物发酵法是大规模生产 L-色氨酸的首选技术。大肠杆菌具有生长速度快、培养成本低、遗传背景清楚、易实现高密度培养等优点，因而利用大肠杆菌生产L-色氨酸的技术得到广泛地应用。许多研究人员将大肠杆菌进行系统的改造，以葡萄糖为碳源发酵生产色氨酸，并且取得了巨大的进展。目前文献报道的大肠杆菌高产色氨酸工程菌株在5L发酵罐中产量可达52.5 g/L，糖酸转化率达到0.212 g/g。
色氨酸的生产菌株的代谢工程改造策略主要包括以下几部分内容：1. 增加前体PEP和E4P的供给；2.增强莽草酸和分支酸途径；3. 降低其他芳香族氨基酸如苯丙氨酸，酪氨酸等竞争途径通量；4. 解除反馈阻遏和反馈抑制；5. 增强色氨酸外排等。大肠杆菌作为一种最常用的工业生产菌株，其改造策略也是以上述原则出发。
色氨酸生产的代谢途径的优化需要精确控制关键节点及关键酶的表达水平。磷酸烯醇丙酮酸（PEP）既是芳香族氨基酸的重要前体，又是糖酵解途径的一个重要的中间体。因此，在之前的工作中常常通过基因工程手段增加PEP的向色氨酸碳通量来增加色氨酸的产量。但是当过量的碳代谢涌入色氨酸合成途径时，进入三羧酸（TCA）循环的通量将大大减少，从而减少导致细胞生长受到抑制，低细胞密度反过来可能导致低色氨酸产量的降低。因此必须严格控制碳代谢通量在两者中间的分配。另外，据Jim N Burnell报道，DUF299依赖的PpsA酶活性的调节受到DUF299的调控，在胞内高浓度ADP时，ADP不仅会抑制PpsA的活性，还会使丙酮酸脱氢酶复合物的PpsA失活（Burnell, J. N. (2010) Cloning andcharacterization of Escherichia coli DUF299: a bifunctional ADP-dependentkinase--Pi-dependent pyrophosphorylase from bacteria, BMC biochemistry11,1.）。目前的工作常常通过利用不同强度的启动子过表达PpsA不同程度的增加Pyr到PEP的通量。该方法在一些工程菌株中具有一定的效果，但该方法的一个明显的缺点就是并未意识到也没有考虑大肠杆菌内对PpsA的翻译及翻译后的调控，因此很多菌株中通过高水平的过表达PpsA，造成了细胞能量的大量浪费，因此必须在调控水平上对PpsA进行改造从而达到理想的效果。
发明内容
本发明要解决的是目前色氨酸工业生产中存在的产量和转化率偏低的问题。本发明提供的能显著提高芳香族氨酸工程菌株的目标氨基酸产量的方法包括：在芳香族氨基酸工业菌株中对ppsA基因进行突变改变其酶活性及胞内调控机制，例如在在芳香族氨基酸工程菌中利用质粒对上述突变酶进行过表达，或者在芳香族氨基酸工程菌中进行基因组编辑，利用上述酶的突变体更换野生型基因的序列。其中，本发明特别考虑当ppsA基因在工程菌株中过表达以增强PEP对高产芳香族氨基酸的供应时，注意调节ppsA活性的磷酸化/去磷酸化机制的存在，以此来指导对ppsA基因进行改造，以获取不受PSRP调节同时酶活仍然符合要求的突变体，最终完成本发明。
本发明请求保护的突变位点是通过高通量筛选方法筛选的菌株中获得。本发明中ppsA为大肠杆菌来源，并通过基因组编辑技术或者质粒过表达技术转入芳香族氨基酸工程菌株中，实现目标产品产量的提升。
本发明中的工程菌株是指以大肠杆菌或者谷氨酸棒状杆菌等工业菌株，经过适当的培养条件，在适当的培养基中发酵后可以生产L-色氨酸的菌株。目前通过本领域的科研人员掌握的各种常规的改造手段获取的大肠杆菌或者谷氨酸棒状杆菌菌株均为L-色氨酸工程菌株。
本发明首先提供一种磷酸烯醇丙酮酸合成酶的突变体，其特征在于，在如SEQ IDNO：18所示氨基酸序列仅存在下述突变：第419位氨基酸突变为D或者P。
在一个具体实施方式中，其氨基酸序列如SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20所示。
本发明还提供上述磷酸烯醇丙酮酸合成酶的突变体的编码基因。更具体地，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22所示。
本发明进一步提供含有所述的编码基因的工程菌。优选地，所述工程菌为大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌。
在优选实施方式中，所述的编码基因位于质粒或染色体中。
更优选地，所述工程菌的出发菌为芳香族氨基酸生产菌。如此所述工程菌可用于芳香族氨基酸。更优选地，其为苯丙氨酸，色氨酸，和/或酪氨酸生产菌。进一步优选地，所述出发菌中过表达色氨酸操纵子TrpEDCBA，和/或过表达莽草酸脱氢酶YdiB，和/或经历理性设计或者结合高通量筛选的非理性改造等方法解除DAHP合酶AroG/AroF的反馈抑制（例如AroG P150L），和/或敲除色氨酸转录调控因子TrpR，和/或敲除Pta减少乙酸的生成，和/或过表达转酮酶TktA。如此可以进一步提升工程菌生产色氨酸的能力。其中，上述改造策略中，基因的敲除或者弱化包括相关基因在基因组上的缺失或者利用其他方式降低其转录、翻译水平。基因的过表达包括以质粒的形式转入目标菌株中或者在基因组上插入一个或者多个拷贝的形式。
本发明还提供所述的磷酸烯醇丙酮酸合成酶的突变体的编码基因在制备芳香族氨基酸中的应用。其中，所述的芳香族氨基酸为苯丙氨酸，色氨酸，和/或酪氨酸。
在一个优选例中， 所述应用的步骤是：将含有所述突变体编码基因的质粒导入芳香族氨基酸工程菌株中，以替换基因组上野生型酶而获得工程菌，再发酵突变体生产芳香族氨基酸。其中，芳香族氨基酸工业菌例如可以是大肠杆菌W3110野生型菌株的衍生菌如LTrp （为本实验室构建并保存的菌株，其具体的基因信息已经发表Chen, Y., Liu, Y.,Ding, D., Cong, L., and Zhang, D. (2018) Rational design and analysis of anEscherichia coli strain for high-efficiency tryptophan production, J Ind Microbiol Biotechnol.）。优选地，选用重组质粒转化进入工程菌的方法为电转化，此外化学转化方法也可以实现。
本发明中上述酶的突变体，优先的对色氨酸的提升具有保护作用，对其他芳香族氨基酸氨基酸（苯丙氨酸和酪氨酸等）工业菌株的改造均具有明显的提升作用。因此，本发明通过构建包含所述编码磷酸烯醇丙酮酸合成酶突变体的工程菌生物安全，遗传背景清晰，可以有效的提高大肠杆菌生产芳香族氨基酸的能力，具有较大的应用推广价值。
附图说明
图1. pCas-ppsA1/pCas-ppsA2质粒图谱；
图2. p15-ppsA1/p15-ppsA2质粒图谱；
图3. 色氨酸工程菌株和改造菌株发酵产量。
具体实施方式
下面结合具体实例，进一步阐述本发明，但不构成对本发明限制。
实施例1 ppsA突变株和ppsA突变体的筛选
在胞内高浓度ADP时，ADP不仅会抑制PpsA的活性，还会使丙酮酸脱氢酶复合物的PpsA失活，该调控作用发生在PpsA的第419位氨基酸苏氨酸（野生型的氨基酸序列如SEQ IDNO:18所示），因此对该此氨基酸进行了饱和突变，力求能够获得解除该调控的同时并不会造成PpsA的催化能力大幅下降的突变体。通过将PpsA的第419位氨基酸突变后对获得的突变株以色氨酸产量为筛选指标，挑选出能够增加色氨酸产量的突变株。
结果表明，将PpsA的第419位氨基酸苏氨酸突变为D或者P（氨基酸序列分别如SEQID NO:19和SEQ ID NO:20所示），既能够解除上述调控，同时并不没有造成PpsA的催化能力大幅下降。本发明中的ppsA突变株核苷酸序列见序列表的SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示。上述酶的核苷酸全长序列可利用聚合酶链式反应（PCR）方法或者人工合成方法获取。对于PCR法，可以利用本发明中的引物，按照本领域工作人员掌握并且熟知的方法进行扩增。
实施例2 构建pCas-ppsA1和pCas-ppsA2质粒
以pCas-red质粒为模板，以pCas-ppsA-cas-LF、pCas-ppsA-cas-LR为引物，PCR扩增出质粒片段pCas1。以pCas-red质粒为模板，以pCas-ppsA-n20-LF、pCas-ppsA-n20-LR为引物，PCR扩增出质粒片段pCas2。以大肠杆菌w3110基因组为模板，以pCas-ppsA-LF为上游引物，分别以pCas-ppsA-mut-LR1和pCas-ppsA-mut-LR2为引物，PCR扩增片段分别为ppsA-U1，ppsA-U2；以大肠杆菌w3110基因组为模板，分别以pCas-ppsA-mut-LF1和pCas-ppsA-mut-LF2为引物，以pCas-ppsA-LR为引物，PCR扩增片段分别为ppsA-D1和ppsA-D2。按照表1的体系进行吉布森组装，反应条件为50℃，1h。将10 μl连接体系转入DH5α感受态细胞中于30℃过夜培养，挑选阳性克隆后送测序进行验证，构建成功的质粒分别命名为pCas-ppsA1和pCas-ppsA2。其中ppsA1上的突变位点为T419D，ppsA2上的突变位点为T419P。本实施例中所用引物见表2。
表1. 吉布森连接反应体系
表2. 构建pCas-ppsA1和pCas-ppsA2所需引物
实施例3 构建p15-ppsA1和p15-ppsA2质粒
以p15A质粒为模板，以P15-vec-LF、P15-vec-LR为引物，PCR扩增出质粒片段p15-vec。以大肠杆菌W3110基因组为模板，以P15-ppsA-LF1、P15-ppsA-LR1为引物，PCR扩增出质粒片段ppsA-up。以大肠杆菌W3110基因组为模板，分别以P15-ppsA-mut1-LF2和P15-ppsA-mut2-LF2为上游引物，以P15-ppsA-LR2为下游引物，PCR扩增片段分别为ppsA-down1，ppsA-down2；按照表3的体系进行吉布森组装，反应条件为50℃，1h。将10 μl连接体系转入DH5α感受态细胞中于30℃过夜培养，挑选阳性克隆后送测序进行验证，构建成功的质粒分别命名为p15-ppsA1和p15-ppsA2。本实施例中所用引物见表4。
表3. 吉布森连接反应体系
表4. 构建p15-ppsA1和p15-ppsA2所需引物
上述实施例2和实施例3中均构建了含有PpsA突变体的质粒，但实施方式并不相同。实施例2中构建的质粒用于替代大肠杆菌基因组上的ppsA基因，而实施例3中构建的质粒用于在大肠杆菌内以质粒的形式过表达PpsA突变体。
实施例4 构建LTrp-ppsA1，LTrp-ppsA2
分别将pCas-ppsA1及pCas-ppsA2质粒转化入色氨酸出发菌株LTrp中，LTrp菌株由是由大肠杆菌W3110菌株经过诱变后筛选，并且过表达色氨酸操纵子trpEDCAB，敲除trpR并且过表达aroG(S180F)后得到，加入含有氨苄抗生素（100 μg/mL）、四环素抗生素（10 μg/mL）和阿拉伯糖（0.01 g/mL）的培养基后30℃培养诱导red重组酶的表达，过夜培养后转接到新的含有阿拉伯糖和相应抗生素的培养基中继续培养。将诱导后的菌株涂布在固体平板上后挑选菌株进行菌液PCR，将PCR产物进行测序，测序正确的菌株分别命名LTrp-ppsA1和LTrp-ppsA2。
实施例5 构建LTrp-p15-p1，LTrp-p15-p2
分别将p15-ppsA1和p15-ppsA2质粒转化入色氨酸出发菌株LTrp中，加入含有氯霉素抗生素（34 μg/mL）和四环素抗生素（10 μg/mL）的固体LB培养基后37℃过夜培养后，第二天将生长的菌株进行PCR检测，正确的菌株分别命名LTrp-p15-p1，LTrp-p15-p2。
实施例6 色氨酸工业菌株摇瓶发酵及产量检测
将上述构建的色氨酸工业菌株LTrp-ppsA1，LTrp-ppsA2从-80℃冰箱中取出后于LB平板上过夜复苏后挑选单菌落接种于含有四环素抗性（10 μg/mL）LB培养基中，过夜摇菌后按照1:100的比例接种于50 mL含有四环素抗性（10 μg/mL）发酵培养中发酵36h后收集样品。
将上述构建的色氨酸工业菌株LTrp-p15-p1，LTrp-p15-p2从-80℃冰箱中取出后于LB平板上过夜复苏后挑选单菌落接种于含有氯霉素抗生素（34 μg/mL）和四环素抗生素（10 μg/mL）LB培养基中，过夜摇菌后按照1：100的比例接种于50 mL含有氯霉素抗生素（34μg/mL）和四环素抗生素（10 μg/mL）的发酵培养中发酵36h后收集样品。发酵培养基如下：
表5. 发酵培养基配方
发酵结束后，10000rpm离心10min取出上清，利用液相进行检测，检测方法如下：
HPLC水相：去离子水，0.22 μm 孔径的水系微孔过滤膜过滤，超声30 min。
HPLC盐相：色谱级NaH2PO3 6.218 g溶解于1L 去离子水中，用0.22 μm 孔径的水系微孔过滤膜过滤，超声30 min。
HPLC有机相：色谱级甲醇、色谱级乙腈、去离子水体积比为 4.5: 4.5: 1，用0.22μm有机系溶剂微孔过滤膜过滤，超声30 min。
HPLC程序采用梯度洗脱，洗脱程序为：
表6. HPLC梯度洗脱程序
发酵结束后对所有的工程菌株进行色氨酸产量的检测，结果如图3所示和表7。
表7. 色氨酸工程菌株发酵结果
结果表明，LTrp生成了3.025 g/L色氨酸，相较于LTrp菌株，LTrp-ppsA1，LTrp-ppsA2，LTrp-p15-p1和LTrp-p15-p2的色氨酸产量均有所提高，分别生产了3.64 g/L，3.84g/L，4.15 g/L，4.32 g/L色氨酸，表明该改造对大肠杆菌色氨酸工程菌株的色氨酸产量的提升具有明显作用。同时作为对照，对PpsA第419位氨基酸进行了其他突变，结果表明，除前面所述ppsA1和ppsA2外，其他突变都会导致色氨酸产量几乎不变或者不同程度的降低（表8）。
表8 PpsA419位不同突变色氨酸工程菌株发酵结果
上述结果也表明本专利所保护的PpsA的两个突变体PpsAT419D和PpsAT419P对色氨酸的生产确实具有促进作用。相比较LTrp-ppsA1和LTrp-ppsA2而言，LTrp-p15-p1和LTrp-p15-p2在色氨酸产量的提升方面效果比较明显，这可能是由于菌株中PpsA的不同拷贝数决定的。LTrp-p15-p1和LTrp-p15-p2菌中含有质粒的拷贝数为15~50个，而LTrp-ppsA1和LTrp-ppsA2中只在基因组上存在一个拷贝数的PpsA，因此该菌株的色氨酸的产量比另外两株的较低。因此，在其他实施例中建议以质粒的形式过表达PpsA的突变体，从而能够对目标氨基酸的产量提升效果更佳明显。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 磷酸烯醇丙酮酸合成酶的突变体及其在产色氨酸方面的应用
<130> 2020.11.1
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Trp Gly Leu Gly Glu Met Val Val Gln Gly Ala Val Asn Pro Asp Glu
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<210> 21
<211> 2379
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 21
atgtccaaca atggctcgtc accgctggtg ctttggtata accaactcgg catgaatgat 60
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atgggtgttt ccgttccgaa tggtttcgcc acaaccgccg acgcgtttaa ccagtttctg 180
gaccaaagcg gcgtaaacca gcgcatttat gaactgctgg ataaaacgga tattgacgat 240
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cagcctgagc tggaaaacgc catccgcgaa gcctatgcac agctttccgc cgatgacgaa 360
aacgcctctt ttgcggtgcg ctcctccgcc accgcagaag atatgccgga cgcttctttt 420
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tacgatcacc gtggtgtggc gctctccgcc ggtgttcaac ggatggtgcg ctctgacctc 600
gcatcatctg gcgtgatgtt ctccattgat accgaatccg gctttgacca ggtggtgttt 660
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gggtcgaaaa aaatccgcat ggtttacgcg ccgacccagg agcacggcaa gcaggttaaa 840
atcgaagacg taccgcagga acagcgtgac atcttctcgc tgaccaacga agaagtgcag 900
gaactggcaa aacaggccgt acaaattgag aaacactacg gtcgcccgat ggatattgag 960
tgggcgaaag atggccacac cggtaaactg ttcattgtgc aggcgcgtcc ggaaaccgtg 1020
cgctcacgcg gtcaggtcat ggagcgttat acgctgcatt cacagggtaa gattatcgcc 1080
gaaggccgtg ctatcggtca tcgcatcggt gcgggtccgg tgaaagtcat ccatgacatc 1140
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tgggaaccga tcatgaagaa agcatctgcc atcgtcacca accgtggcgg tcgtgattgt 1260
cacgcggcga tcatcgctcg tgaactgggc attccggcgg tagtgggctg tggagatgca 1320
acagaacgga tgaaagacgg tgagaacgtc actgtttctt gtgccgaagg tgataccggt 1380
tacgtctatg cggagttgct ggaatttagc gtgaaaagct ccagcgtaga aacgatgccg 1440
gatctgccgt tgaaagtgat gatgaacgtc ggtaacccgg accgtgcttt cgacttcgcc 1500
tgcctaccga acgaaggcgt gggccttgcg cgtctggaat ttatcatcaa ccgtatgatt 1560
ggcgtccacc cacgcgcact gcttgagttt gacgatcagg aaccgcagtt gcaaaacgaa 1620
atccgcgaga tgatgaaagg ttttgattct ccgcgtgaat tttacgttgg tcgtctgact 1680
gaagggatcg cgacgctggg tgccgcgttt tatccgaagc gcgtcattgt ccgtctctct 1740
gattttaaat cgaacgaata tgccaacctg gtcggtggtg agcgttacga gccagatgaa 1800
gagaacccga tgctcggctt ccgtggcgcg ggccgctatg tttccgacag cttccgcgac 1860
tgtttcgcgc tggagtgtga agcagtgaaa cgtgtgcgca acgacatggg actgaccaac 1920
gttgagatca tgatcccgtt cgtgcgtacc gtagatcagg cgaaagcggt ggttgaagaa 1980
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gtgcaaacct ggttaagcct ggctgaactg aagaaataa 2379
<210> 22
<211> 2379
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<213> Escherichia coli
<400> 22
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Claims (10)
1.一种磷酸烯醇丙酮酸合成酶的突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20所示。
2.如权利要求1所述磷酸烯醇丙酮酸合成酶的突变体的编码基因。
3. 如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：21或SEQID NO：22所示。
4.含权利要求3所述的编码基因的工程菌。
5.如权利要求4所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌为大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌。
6.如权利要求4或5所述的工程菌，其特征在于，所述的编码基因位于质粒或染色体中。
7.如权利要求4或5所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌的出发菌为芳香族氨基酸生产菌。
8.如权利要求7所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌的出发菌为苯丙氨酸，色氨酸，和/或酪氨酸生产菌。
9.如权利要求8所述的工程菌，其特征在于，所述出发菌中过表达色氨酸操纵子TrpEDCBA，和/或过表达莽草酸脱氢酶YdiB，和/或解除DAHP合酶AroG/AroF的反馈抑制，和/或敲除色氨酸转录调控因子TrpR，和/或敲除Pta减少乙酸的生成，和/或过表达转酮酶TktA。
10.如权利要求1所述的磷酸烯醇丙酮酸合成酶的突变体的编码基因在制备芳香族氨基酸中的应用，所述的芳香族氨基酸为色氨酸。
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|---|---|---|---|
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| CN112322601A CN112322601A (zh) | 2021-02-05 |
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