CN115948318A

CN115948318A - 利用弱化了rhaB基因的大肠杆菌提高细胞内ATP水平的方法

Info

Publication number: CN115948318A
Application number: CN202211678796.7A
Authority: CN
Inventors: 吴鹤云; 郭金玺; 谢希贤; 蒋帅; 高志强; 帅珍龙
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2022-12-26
Filing date: 2022-12-26
Publication date: 2023-04-11

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用弱化了rhaB基因的大肠杆菌提高细胞内ATP水平的方法。本发明提供的大肠杆菌弱化了rhaB基因的表达，在培养过程中，细胞内能够提供更高的ATP水平。同时，在以大肠杆菌构建的L‑精氨酸、L‑缬氨酸、L‑组氨酸、麦角硫因等生产菌株中，弱化rhaB基因的表达也能够提高生产菌株细胞中ATP水平。

Description

利用弱化了rhaB基因的大肠杆菌提高细胞内ATP水平的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种弱化了rhaB基因的大肠杆菌以及利用其提高细胞内ATP水平的方法。

背景技术

大肠杆菌因其具有遗传背景清晰、生长快速、基因编辑技术成熟等优点，常被作为底盘细胞以生产多种不同的天然产物，其生产的天然产物在医药、工业、食品、化妆品、畜牧业等领域有广泛的应用。工程大肠杆菌在生产不同的天然产物时，一个很重要的影响因素是大肠杆菌菌株细胞内腺苷三磷酸(ATP)的供应量。

ATP是微生物生长、繁殖的基础，其在天然产物转运、天然产物合成及物质分解等多种代谢过程(Xu N,Ye C,Chen X,et al.Genome-scale metabolic modelling commoncofactors metabolism in microorganisms[J].Journal of Biotechnology,2017,251:1-13.)中都有重要的参与。大肠杆菌中大量的酶催化反应都需要ATP的参与；在复杂的代谢网络体系中，ATP可以作为辅因子助力代谢流的分配(Y Chen.ATP regulation strategyand its application in the synthesis of microbial metabolites.[J].Chinesejournal of biotechnology,2020,36(8):1515-1527.)；此外，ATP也具有调控基因的转录和表达、影响全局转录调控因子和信号转导系统的作用。所以，调控大肠杆菌细胞内ATP的含量能够有效促进目标天然产物的高效合成。

调控大肠杆菌细胞内ATP含量的方法有以下几种：1)调控与ATP合成活性有关的组分。该方法主要利用高效的基因编辑技术对底盘微生物中编码与ATP合成活性有关组分的基因进行调控。与ATP合成活性有关的组分共有四种，分别是F₀F₁-ATPase组分：atpF、atpH、atpA、atpG、atpD、atpC这些基因编码F₀F₁-ATPase复合物的亚基，增强这些基因会激活糖酵解途径；糖原合成组分：glgA、glgB编码糖原合成组分，失去其中的一个基因，会因为中断旁路葡萄糖的消耗而进一步促进糖酵解途径；嘧啶核糖核苷酸从头生物合成的有关组分：缺失嘧啶核糖核苷酸从头生物合成的有关基因，可能上调有关ATP在内的从头核苷酸的合成；磷酸转移酶系统：缺失有关磷酸转移酶系统的有关基因，可通过糖酵解激活葡萄糖激酶来上调ATP的合成。2)敲除底盘微生物中多余耗能基因。该方法主要利用高效的基因编辑技术对底盘微生物中多余耗能基因进行敲除，以达到节省ATP消耗的目的。有研究表明，同时敲除ysaA、ydaS、ybiX可将生产色氨酸菌株内的ATP水平提高到323％(CN105695381A)。

发明内容

针对现有技术不足，本发明目的是提供一种通过进行了基因修饰的大肠杆菌调控细胞内ATP水平的方法。

为了实现上述目的，本发明采取如下的技术方案：

第一方面，本发明提供一种大肠杆菌，其已经过修饰而弱化了rhaB基因的表达。

第二方面，本发明提供一种提高细胞内ATP水平的方法，包括：在培养基中培养如上所述的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌已经过修饰而弱化了rhaB基因的表达，使其与未经过修饰的大肠杆菌相比培养后细胞内ATP水平提高。

本发明的有益效果如下：

rhaB基因编码鼠李糖激酶RhaB，该酶参与鼠李糖代谢反应中的第二步，其催化鼠李糖转化为鼠李糖-1-磷酸，该步反应过程伴随着ATP的消耗。然而，针对rhaB基因表达强度的弱化对提升大肠杆菌细胞内ATP含量的影响还未有研究，特别的，目前还未有关于利用弱化rhaB基因表达强度的大肠杆菌在生产天然产物时，能够提高工程菌株细胞内ATP含量的报道。本发明提供的大肠杆菌弱化了rhaB基因的表达，在培养过程中，细胞内能够提供更高的ATP水平。同时，在以大肠杆菌构建的L-精氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、麦角硫因等生产菌株中，弱化rhaB基因的表达也能够提高生产菌株细胞中ATP水平。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

第一方面，本发明提供一种大肠杆菌，其已经过修饰而弱化了rhaB基因的表达，使其与未经修饰的大肠杆菌相比所述rhaB基因的表达水平降低，例如，降低了50％，60％，70％，80％，90％，100％。

第二方面，本发明提供一种提高细胞内ATP水平的方法，包括：在培养基中培养如上所述的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌已经过修饰而弱化了rhaB基因的表达，使其与未经过修饰的大肠杆菌相比培养后细胞内ATP水平提高，例如，提高了150％或更多，200％或更多，300％或更多。

根据本发明，可以使rhaB基因缺失或失活。

根据本发明，还可以使rhaB基因连接弱启动子控制其表达，例如BBa-J23113、BBa-J23114、BBa-J23117等。

根据本发明，所述大肠杆菌可以是任意的大肠杆菌，例如常见的E coli MG1655、Ecoli W3110、E coli BL21、E.coli BW25113等，以及在其基础上进行过定向或不定向改造得到的大肠杆菌。

根据本发明，所述rhaB基因不限于NCBI GeneID:948399所示的核苷酸序列，还可以包括作为NCBI GeneID:948399所示序列的突变体核苷酸序列或与NCBI GeneID:948399所示序列同源、且编码鼠李糖激酶(NCBI Protein_ID：NP_418340.1)的突变体的基因。所述rhaB基因可以是由于遗传密码的简并性所致的变体核苷酸序列。

根据本发明，所述大肠杆菌的培养可以采用本领域常规方法进行。培养基可以是合成的或天然的培养基，例如含有碳源、氮源、硫源、无机离子和需要的其它有机和无机组分的典型培养基。

所述大肠杆菌可以在需氧条件下进行培养，持续16至72小时，或20至48小时，或26至30小时；培养温度可以控制在30至45℃，或30至37℃内；且pH可以调节在5.0至8.0之间，或6.0至7.5之间，或6.8至7.2之间。可以通过使用无机或有机酸性或碱性物质，以及氨气调节pH。

根据本发明，优选的发酵培养基组成为：葡萄糖20-40g/L，酵母提取物1-3g/L，蛋白胨2-3g/L，K₂HPO₄ 3-6g/L，MgSO₄·7H₂O 1-2g/L，FeSO₄·7H₂O 15-20mg/L，MnSO₄·7H₂O15-20mg/L，V_B1、V_B3、V_B5、V_B12、V_H各1-3mg/L其余为水，pH 7.0-7.2。

其他所涉及的分子生物学、基因工程等具体操作手段根据本领域人员容易获得的技术手册、教科书或文献报道均可以实现，不必在此详细描述操作过程。

以下将通过具体的实施例对本发明进行更详细描述。

实施例1：

将大肠杆菌中rhaB基因的本源启动子替换为弱启动子BBa-J23117的方法：

1基因编辑的方法

本发明采用的基因编辑方法参照文献(Li Y,Lin Z,Huang C,et al.Metabolicengineering of Escherichia coli using CRISPR–Cas9 meditated genomeediting.Metabolic engineering,2015,31:13-21.)进行。其中pREDCas9携带gRNA表达质粒pGRB的消除系统，λ噬菌体的Red重组系统及Cas9蛋白表达系统，奇霉素抗性(工作浓度：100mg/L)，32℃培养；pGRB以pUC18为骨架，包括启动子J23100，gRNA-Cas9结合区域序列和终止子序列，氨苄青霉素抗性(工作浓度：100mg/L)，37℃培养。

该方法的具体步骤如下：

1.1pGRB质粒构建

构建质粒pGRB的目的是为了转录相应的gRNA，从而与Cas9蛋白形成的复合体，并通过碱基配对和PAM识别目的基因靶位点，实现目的DNA双链断裂。采用包含靶序列的DNA片段与线性化的载体片段重组的方法构建pGRB质粒。

1.1.1靶序列设计

使用CRISPR RGEN Tools设计靶序列(PAM:5’-NGG-3’)

1.1.2包含靶序列的DNA片段的制备

设计引物：5’-线性化载体末端序列(15bp)-酶切位点-靶序列(不包括PAM序列)-线性化载体末端序列(15bp)-3’及其反向互补的引物，通过单链DNA的退火制备包含靶序列的DNA片段。反应条件：预变性95℃，5min；退火30-50℃，1min。退火体系如下表：

1.1.3线性载体的制备

载体的线性化采用反向PCR扩增的方法。

1.1.4重组反应

所用重组酶均为

II One Step Cloning Kit系列的酶，重组条件：37℃，30min。重组体系如下表：

1.1.5质粒的转化

取10μL反应液，加入到100mL DH5α化转感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴20min，42℃热激45-90s，立即冰浴2-3min，加入900μL SOC，于37℃复苏1h。8000rpm离心2min，弃部分上清，留200μL左右将菌体重悬后涂布到含有100mg/L氨苄青霉素的平板，将平板倒置，于37℃过夜培养。待平板长出单菌落后通过菌落PCR鉴定，挑选阳性重组子。

1.1.6克隆鉴定

将PCR阳性菌落接种至含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中过夜培养后保菌，提取质粒，酶切鉴定。

1.2重组DNA片段的制备

用于启动子替换的重组片段由rhaB基因的上下游同源臂组成(上游同源臂-下游同源臂)。利用引物设计软件primer5，以rhaB基因的上下游序列为模板，设计上下游同源臂引物(扩增长度约400-500bp)通过PCR的方法分别扩增上下游同源臂和目的基因片段后，再经过重叠PCR制备重组片段。PCR扩增体系如下表：

重叠PCR的体系如下表：

注：模板由上下游同源臂的扩增片段和目的基因等摩尔组成，且总量不超过10ng。

PCR反应条件(宝生物PrimeSTAR HS酶)：预变性(95℃)5min；然后进行30轮循环：变性(98℃)10s，退火((Tm-3/5)℃)15s，72℃延伸(此酶活力1min延伸约1kb)；72℃继续延伸10min；维持(4℃)。

1.3质粒和重组DNA片段的转化

1.3.1pREDCas9的转化

利用电转的方法将pREDCas9质粒电转至出发菌株的电转感受态中，将菌体复苏培养后涂布于含奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。抗性平板上生长单菌落用鉴定引物进行菌落PCR,筛选阳性重组子。

1.3.2含pREDCas9的目的菌株电转化感受态制备

32℃培养至OD₆₀₀＝0.1～0.2时，添加0.1M的IPTG(使其终浓度为0.1mM)，继续培养至OD₆₀₀＝0.6～0.7时进行感受态制备。添加IPTG的目的是使pREDCas9质粒上的重组酶诱导表达。感受态制备所需培养基及制备过程参照常规标准操作。

1.3.3pGRB和重组DNA片段的转化

将pGRB和供体DNA片段同时电转化至含有pREDCas9的电转感受态细胞中。将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。利用专门设计的鉴定引物，进行菌落PCR验证，筛选阳性重组子并保菌。

1.4质粒的消除

1.4.1pGRB的消除

将阳性重组子置于含有0.2％阿拉伯糖的LB培养基中过夜培养，适量稀释后涂布于含有奇霉素抗性的LB平板上，32℃过夜培养。对点含有氨苄青霉素和奇霉素抗性的LB平板，挑选氨苄青霉素平板不生长，奇霉素抗性平板生长的单菌落保菌。

1.4.2pREDCas9质粒的消除

将阳性重组子转接到无抗性的LB液体培养基中，42℃过夜培养，适量稀释后涂布于无抗性的LB平板上，37℃过夜培养。对点含有奇霉素抗性和无抗性的LB平板，挑选奇霉素抗性平板不生长，无抗性平板生长的单菌落保菌。

2.菌株构建过程中使用的引物见下表：

3.P_rhaB::P_BBa-J23117启动子替换

以大肠杆菌基因组为模板，根据其rhaB基因(NCBI GeneID:948399)的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-rhaB-S、UP-rhaB-A)和下游同源臂引物(DN-rhaB-S、DN-rhaB-A)，其中上下游同源臂之间包含BBa-J23117启动子，并PCR扩增其上下游同源臂片段。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得P_rhaB::P_BBa-J23117启动子替换片段(上游同源臂-下游同源臂)。构建pGRB-rhaB：使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-rhaB-S和gRNA-rhaB-A的退火制得。分别制备大肠杆菌标准菌株MG1655-control、L-精氨酸工程菌株ARG10、L-缬氨酸工程菌株VXR05、麦角硫因工程菌株EGT12、L-组氨酸工程菌株E.coli WHY3-1的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，依次构建具有弱化rhaB基因表达强度的菌株MG1655-117、ARG10-117、VXR05-117、EGT12-117、E.coli WHY3-1-117。验证P_rhaB::P_BBa-J23117启动子替换片段构建成功。

实施例2：

利用弱化了rhaB基因的大肠杆菌发酵培养的方法如下：

斜面培养：取-80℃保藏菌种划线接种于活化斜面，37℃培养12h，并传代一次；

摇瓶种子培养：用接种环刮取一环斜面种子接种于装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中，九层纱布封口，37℃，200rpm培养7-10h；

摇瓶发酵培养：按种子培养液体积10-15％的接种量接种到装有发酵培养基的500mL三角瓶中(终体积为30mL)，九层纱布封口，37℃，200r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在7.0-7.2；补加60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行；

斜面培养基组成为：葡萄糖1g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，NaCl5g/L，琼脂20g/L，其余为水，pH 7.0-7.2；

种子培养基组成为：葡萄糖20g/L，酵母提取物2g/L，蛋白胨2g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，FeSO₄·7H₂O 15mg/L，MnSO₄·7H₂O 15mg/L，V_B1、V_B3、V_B5、V_B12、V_H各1mg/L其余为水，pH 7.0-7.2。

发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，酵母提取物3g/L，蛋白胨2g/L，K₂HPO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，FeSO₄·7H₂O 15mg/L，MnSO₄·7H₂O 15mg/L，V_B1、V_B3、V_B5、V_B12、V_H各1mg/L其余为水，pH 7.0-7.2。

实施例3：

对E coli MG1655进行修饰而弱化了rhaB基因的表达，培养并检测其胞内ATP水平。

采用实施例1的方法对出发菌株MG1655-control进行基因编辑，并将修饰后弱化了rhaB基因的菌株命名为MG1655-117。采用实施例2的培养方法对MG1655-117和出发菌株MG1655-control进行同步对照的摇瓶发酵培养，并使用碧云天增强型ATP检测试剂盒测定发酵24h后细胞内ATP含量(如表1所示)。

表1MG1655-117菌株摇瓶发酵后细胞内ATP含量

表1结果显示，弱化rhaB基因表达强度可促使MG1655-117细胞内ATP的含量从0.14μM/L/OD₆₀₀提高到0.30μM/L/OD₆₀₀，细胞内ATP的含量提高了114％。结果显示，弱化大肠杆菌中rhaB基因表达强度可以显著提高原始工程菌株细胞内ATP水平。

实施例4：

对L-精氨酸生产菌ARG10(专利公开号：CN110964683A)进行修饰而弱化了rhaB基因的表达，培养并检测其胞内ATP水平。

采用实施例1的方法对出发菌株ARG10进行基因编辑，并将修饰后弱化了rhaB基因的菌株命名为ARG10-117。采用实施例2的培养方法对ARG10-117和出发菌株ARG10进行同步对照的摇瓶发酵培养，并使用碧云天增强型ATP检测试剂盒测定发酵24h后细胞内ATP含量(如表2所示)。

表2ARG10-117菌株摇瓶发酵后细胞内ATP含量

表2结果显示，弱化rhaB基因表达强度可促使ARG10-117中细胞内ATP的含量从0.018μM/L/OD₆₀₀提高到0.084μM/L/OD₆₀₀，细胞内ATP的含量提高了367％。结果显示，弱化大肠杆菌中rhaB基因表达强度可以显著提高生产L-精氨酸的工程菌株细胞内ATP水平。

实施例5：

对L-缬氨酸生产菌VXR05(专利公开号：CN110607268A)进行修饰而弱化了rhaB基因的表达，培养并检测其胞内ATP水平。

采用实施例1的方法对出发菌株VXR05进行基因编辑，并将修饰后弱化了rhaB基因的菌株命名为VXR05-117。采用实施例2的培养方法对VXR05-117和出发菌株VXR05进行同步对照的摇瓶发酵培养，并使用碧云天增强型ATP检测试剂盒测定发酵24h后细胞内ATP含量(如表3所示)。

表3VXR05-117菌株摇瓶发酵后细胞内ATP含量

表3结果显示，弱化rhaB基因表达强度可促使VXR05-117中细胞内ATP的含量从0.012μM/L/OD₆₀₀提高到0.015μM/L/OD₆₀₀，细胞内ATP的含量提高了25％。结果显示，弱化大肠杆菌中rhaB基因表达强度可以显著提高生产L-缬氨酸的工程菌株细胞内ATP水平。

实施例6：

对麦角硫因生产菌EGT12(专利公开号：CN112251392A)进行修饰而弱化了rhaB基因的表达，培养并检测其胞内ATP水平。

采用实施例1的方法对出发菌株EGT12进行基因编辑，并将修饰后弱化了rhaB基因的菌株命名为EGT12-117。采用实施例2的培养方法对EGT12-117和出发菌株EGT12进行同步对照的摇瓶发酵培养，并使用碧云天增强型ATP检测试剂盒测定发酵24h后细胞内ATP含量(如表4所示)。

表4EGT12-117菌株摇瓶发酵后细胞内ATP含量

表4结果显示，弱化rhaB基因表达强度可促使EGT12-117中细胞内ATP的含量从0.031μM/L/OD₆₀₀提高到0.067μM/L/OD₆₀₀，细胞内ATP的含量提高了116％。结果显示，弱化大肠杆菌中rhaB基因表达强度可以显著提高生产麦角硫因的工程菌株细胞内ATP水平。

实施例7：

对L-组氨酸生产菌E.coli WHY3-1(专利公开号：CN111321102A)进行修饰而弱化了rhaB基因的表达，培养并检测其胞内ATP水平。

采用实施例1的方法对出发菌株E.coli WHY3-1进行基因编辑，并将修饰后弱化了rhaB基因的菌株命名为E.coli WHY3-1-117。采用实施例2的培养方法对E.coli WHY3-1-117和出发菌株E.coli WHY3-1进行同步对照的摇瓶发酵培养，并使用碧云天增强型ATP检测试剂盒测定发酵24h后细胞内ATP含量(如表5所示)。

表5E.coli WHY3-1-117菌株摇瓶发酵后细胞内ATP含量

表5结果显示，弱化rhaB基因表达强度可促使E.coli WHY3-1-117中细胞内ATP的含量从0.016μM/L/OD₆₀₀提高到0.062μM/L/OD₆₀₀，细胞内ATP的含量提高了288％。结果显示，弱化大肠杆菌中rhaB基因表达强度可以显著提高生产L-组氨酸的工程菌株细胞内ATP水平。

虽然本发明已经以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和原理的情况下，可以对这些实施例进行各种形式和细节的变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物所限定。

Claims

1.一种提高大肠杆菌细胞内ATP水平的方法，包括：在培养基中培养所述大肠杆菌，其中所述大肠杆菌已经过修饰而弱化了rhaB基因的表达，使其与未经过修饰的大肠杆菌相比培养后细胞内ATP水平提高。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述rhaB基因缺失或失活。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述rhaB基因连接了弱启动子使其弱化了表达。

4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述rhaB基因编码氨基酸序列如NCBI Protein_ID：NP_418340.1所示的蛋白质或其突变体。

5.一种大肠杆菌，其已经过修饰而弱化了rhaB基因的表达。