CN112779198A - 一种提高l-组氨酸产量的方法 - Google Patents

一种提高l-组氨酸产量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种提高L‑组氨酸产量的方法。本发明通过使用操作条件安全、温和、可控性强的ARTP诱变方法，获得了突变率更高的突变库，结合L‑组氨酸结构类似物筛选，经过十次传代后，获得了稳定的L‑组氨酸高产突变株，进一步分析了诱变后高产菌株的L‑组氨酸合成相关基因的突变情况，比对筛选得到能够促进L‑组氨酸产量提高的5‑磷酸核糖‑1‑焦磷酸合成相关基因Prs和ATP转磷酸核糖基酶编码基因hisG突变体，在生产L‑组氨酸的宿主菌中表达Prs和hisG基因中的一种或两种，能够有效提高L‑组氨酸的产量。为进一步代谢工程改造粘质沙雷氏菌或其他菌株生产L‑组氨酸奠定了基础。

Description

一种提高L-组氨酸产量的方法
技术领域
本发明涉及代谢工程技术领域，尤其涉及一种提高L-组氨酸产量的方法。
背景技术
L-组氨酸，又名α-氨基-β-咪唑基丙酸，是分子中含有咪唑核的碱性氨基酸。在营养学的范畴里，组氨酸被认为是婴幼儿必需的氨基酸。L-组氨酸具有多种生理功能，对生长、组织修复以及治疗溃疡和胃酸过多等均具有重要的作用，还可以作为添加剂用于治疗过敏、风湿性关节炎以及贫血等疾病，因此，其被广泛应用于医药食品等行业。
生产组氨酸的方法主要有蛋白水解法、化学合成法和微生物发酵法。其中水解蛋白质是组氨酸生产最为传统的方法，但是，这种方法主要取决于富含天然蛋白质的资源(如血粉或大豆)的可用性，很难满足人们对组氨酸日益增长的需求；而通过化学合成法生产组氨酸容易产生外消旋混合物，通常被认为是“非天然”化合物，难以获得食品药品监督管理局的批准，也较难被消费者接受；微生物发酵法是目前生产L-组氨酸的主流方法，因此L-组氨酸高产菌的选育成为当前的研究热点。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种提高L-组氨酸产量的方法，通过使用操作条件安全、温和、可控性强的ARTP诱变方法，获得了突变率更高的突变库，结合L-组氨酸结构类似物筛选，经过十次传代后，获得了稳定的L-组氨酸高产突变株，进一步分析了诱变后高产菌株的L-组氨酸合成相关基因的突变情况，比对筛选得到能够促进L-组氨酸产量提高的突变基因。
本发明的第一个目的是提供一种提高L-组氨酸产量的方法，所述方法是在生产L-组氨酸的宿主菌中表达5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成基因Prs和/或ATP转磷酸核糖基酶编码基因hisG，所述的5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成基因Prs的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，ATP转磷酸核糖基酶编码基因hisG的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，所述的生产L-组氨酸的宿主菌为肠杆菌科菌株。
进一步地，所述的肠杆菌科菌株为大肠杆菌或粘质沙雷氏菌。
进一步地，所述的大肠杆菌为E.coli BL21。
进一步地，表达5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成基因Prs和/或ATP转磷酸核糖基酶编码基因hisG是通过质粒表达或基因组表达。
进一步地，所述的质粒表达，是将5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成基因Prs或ATP转磷酸核糖基酶编码基因hisG连接到pET28a载体上进行表达；或者是将5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成基因Prs和ATP转磷酸核糖基酶编码基因hisG同时连接到pETDuet载体上进行表达。
本发明的第二个目的是提供一种L-组氨酸产量提高的重组菌，所述的重组菌表达了5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成基因Prs和/或ATP转磷酸核糖基酶编码基因hisG，所述的5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成基因Prs的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，ATP转磷酸核糖基酶编码基因hisG的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，所述的重组菌是以大肠杆菌或粘质沙雷氏菌为宿主菌，以pET28a或pETDuet为载体。
本发明的第三个目的是提供一种所述的重组菌发酵生产L-组氨酸的方法，是将所述的重组菌接种至发酵培养基中，在28～32℃进行培养。
进一步地，所述的发酵培养基为葡萄糖35～45g/L，酵母粉1～3g/L，(NH4)2SO4 14～18g/L，K2HPO4.3H2O 0.5～0.7g/L，FeSO4.7H2O 0.004～0.006g/L，MnSO4.5H2O 0.004～0.006g/L，CaCO325～35g/L。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明通过使用操作条件安全、温和、可控性强的ARTP诱变方法，获得了突变率更高的突变库，结合L-组氨酸结构类似物筛选，经过十次传代后，获得了稳定的L-组氨酸高产突变株，进一步分析了诱变后高产菌株的L-组氨酸合成相关基因的突变情况，比对筛选得到能够促进L-组氨酸产量提高的5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成基因Prs和L-组氨酸合成的操纵子基因hisG突变体，在生产L-组氨酸的宿主菌中表达Prs和hisG基因中的一种或两种，能够有效提高L-组氨酸的产量。为进一步代谢工程改造粘质沙雷氏菌或其他菌株生产L-组氨酸奠定了基础。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
图1为ARTP对S.marcescens ATCC 31026的致死率曲线；
图2为6-MP抗性突变株的筛选结果；
图3为L-组氨酸产生菌S.marcescens P12遗传稳定性；
图4为S.marcescens P12与S.marcescens ATCC 31026的Prs基因的序列比对；
图5为S.marcescens P12与S.marcescens ATCC 31026的hisG基因的序列比对；
图6为在E.coli BL21中分别表达诱变前后hisG基因的L-组氨酸产量；
图7为在E.coli BL21中分别表达诱变前后Prs基因的L-组氨酸产量；
图8为在E.coli BL21中分别表达诱变前后Prs及hisG基因的L-组氨酸产量。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明中，5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成基因Prs突变前的碱基序列如SEQ ID NO.6所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，突变后的碱基序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
ATP转磷酸核糖基酶编码基因hisG突变前的碱基序列如SEQ ID NO.8所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，突变后的碱基序列如SEQ ID NO.7所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
采用高效液相色谱法(HPLC)对发酵液中L-组氨酸浓度进行定量分析，以邻苯二甲醛进行发酵液柱前衍生，色谱柱为Agilent C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，紫外检测器的检测波长为338nm，柱温40℃，进样量1μL。具体的梯度洗脱程序如下表所示。
表1
Figure BDA0002879606940000031
实施例1：S.marcescens ATCC 31026的临界致死6-MP浓度的确定
将诱变前的S.marcescens ATCC 31026的单菌落接种到2mL LB培养基(酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L)，37℃，220r/min，培养10-12h，离心菌体，用无菌生理盐水洗涤2-3次后，再用无菌生理盐水梯度稀释十万倍，然后取100μL菌液分别涂布到含1.5mg/mL MET及不同浓度的6-MP抗性的平板(葡萄糖5.0g/L，牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5.0g/L，氯化钠2.5g/L，琼脂20g/L，pH调至7.0，121℃灭菌15min)，确定6-MP的临界致死浓度为1.5mg/mL，故选用1.5mg/mL作为实验浓度。如表2所示。
表2
Figure BDA0002879606940000041
注：++表示有较多单菌落；+表示有少量单菌落；-表示无单菌落
实施例2：利用ARTP诱变S.marcescens ATCC 31026
选择S.marcescens ATCC 31026进行ARTP诱变，首先是制备菌悬液，S.marcescensATCC 31026单菌落接LB培养基至14mL摇菌管，37℃，220r/min，过夜培养后，按1％接种量转接至LB摇瓶，37℃，220r/min，培养4-6h。离心收集培养好的菌体，无菌生理盐水洗涤2-3次后，再用无菌生理盐水适量稀释成OD600值在0.6-0.8的菌悬液，取10μL菌悬液涂在载玻片上处理。ARTP诱变处理的参数为：载片处于气流端口2mm处，功率为120W，气流量为10SLM，作用时间为35s。
将经过ARTP诱变处理后的菌悬液涂布到MET(1.5mg/mL)、6-MP(1.5mg/mL)抗性平板上，30℃培养36h后，获得三十个单菌落。
实施例3：发酵合成L-组氨酸
将获得的三十株诱变后的菌株S.marcescens P1--30挑取单菌落接种至500mL锥形瓶，装液量为500mL，30℃，220r/min，培养18h，种子培养基的配方为：葡萄糖25g/L，玉米浆20g/L，尿素1.25g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，硫酸镁0.5g/L，pH调至7.0，121℃灭菌15min，其中葡萄糖分开灭菌(115℃，15min)；以10％的接种量吸取种子培养基1.5mL接入250mL锥形瓶，装液量15mL,30℃，220r/min，培养72h，发酵培养基的配方为：葡萄糖130g/L，硫酸铵35g/L，玉米浆15g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，硫酸镁0.5g/L，碳酸钙20g/L(分消)，pH调至7.0，115℃灭菌，15min。
液相分析发酵液上清中L-组氨酸产量，得到四株高产菌株，如图2中的S.marcescens P5、S.marcescens P12、S.marcescens P20、S.marcescens P23。在这些突变株中，选择L-组氨酸产量最高的突变株S.marcescens P12进行传代培养，如图3，结果表明菌体生长良好，平均产酸5.3g/L，得到了稳定高产突变株，可进行进一步研究。
实施例4：L-组氨酸合成相关基因的扩增与比对
根据本发明所测得的S.marcescens ATCC 31026，设计如表1中所示引物。使用上述引物以S.marcescens P12基因组为模板，PCR扩增出Prs基因、hisLGDCBHAFI基因簇，片段长度分别为939bp、7287bp。将扩增获得的片段与S.marcescens ATCC 31026对应基因进行比对，发现Prs、hisG基因均有氨基酸发生突变，如图4、图5所示。
表3
Figure BDA0002879606940000051
实施例5：Prs及hisG相关质粒的构建及转化
为了验证本发明中的突变后基因Prs及hisG在大肠杆菌中能否提高L-组氨酸产量，使用突变前的Prs及hisG基因构建质粒pET28a-Prs、pET28a-hisG，利用突变后的Prs及hisG基因构建质粒pET28a-Prs’、pET28a-hisG’。以S.marcescens ATCC 3102、S.marcescens P12的基因组和pET28a质粒为模板，使用表4中引物，经PCR扩增分别获取、hisG、hisG’、Prs、Prs’序列和相应的线性化质粒，进一步通过Gibson组装获取重组质粒pET28a-hisG、pET28a-hisG’、pET28a-Prs，pET28a-Prs’，42℃热激90s后，分别将其转化至E.coli BL21感受态细胞中，获得菌株E.coli B1、E.coli B2、E.coli B3、E.coli B4。
表4
Figure BDA0002879606940000052
实施例6：大肠杆菌发酵合成L-组氨酸
将菌株E.coli B1、E.coli B2、E.coli B3、E.coli B4挑取单菌落接种于2mL液体LB培养基(酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L)中，37℃、220r/min过夜培养。按4％(V/V)将种子液接种于含有15mL发酵培养基(葡萄糖40g/L，酵母粉2g/L，(NH4)2SO4 16g/L，K2HPO4.3H2O 0.6g/L，FeSO4.7H2O 0.005g/L，MnSO4.5H2O 0.005g/L，CaCO3 30g/L)的250mL摇瓶中，30℃、220r/min培养72h。液相分析发酵液上清中L-组氨酸产量，结果如图6及图7所示。发酵结果表明在E.coli BL21中表达诱变前的hisG序列，产量为0.2g/L，而表达诱变后的hisG序列，可将产量提高为1.5g/L；在E.coli BL21中表达诱变前的Prs序列，产量为0.4g/L，而表达诱变后的hisG序列，可将产量提高为1g/L。
实施例7：Prs及hisG双基因表达质粒的构建及转化
为了验证本发明中的突变后基因Prs及hisG在大肠杆菌中共同表达能否进一步提高L-组氨酸产量，使用突变前的Prs及hisG基因构建质粒pETDuet-Prs-hisG，利用突变后的Prs及hisG基因构建质粒pETDuet-Prs’-hisG’。以S.marcescens ATCC 3102、S.marcescensP12的基因组和pETDuet质粒为模板，使用表5中引物，经PCR扩增分别获取、hisG、Prs、hisG’、Prs’序列和相应的线性化质粒，进一步通过Gibson组装获取重组质粒pETDuet-Prs-hisG、pETDuet-Prs’-hisG’，42℃热激90s后，分别将其转化至E.coli BL21感受态细胞中，获得菌株E.coli B5、E.coli B6。
表5
Figure BDA0002879606940000061
实施例8：大肠杆菌发酵合成L-组氨酸
将菌株E.coli B5、E.coli B6挑取单菌落接种于2mL液体LB培养基(酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L)中，37℃、220r/min过夜培养。按4％(V/V)将种子液接种于含有15mL发酵培养基(葡萄糖40g/L，酵母粉2g/L，(NH4)2SO4 16g/L，K2HPO4.3H2O 0.6g/L，FeSO4.7H2O 0.005g/L，MnSO4.5H2O 0.005g/L，CaCO3 30g/L)的250mL摇瓶中，30℃、220r/min培养72h。液相分析发酵液上清中L-组氨酸产量，结果如图8所示。发酵结果表明在E.coliBL21中同时表达诱变前的Prs及hisG序列，产量为1.2g/L，而表达诱变后的Prs及hisG序列，可将产量提高为3.5g/L。
以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种提高L-组氨酸产量的方法
<160> 26
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 312
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 1
Met Lys Leu Phe Ala Gly Asn Ala Thr Pro Glu Leu Ala Gln Arg Ile
1 5 10 15
Ala Asn Arg Leu Tyr Thr Ser Leu Gly Asp Ala Ala Val Gly Arg Phe
20 25 30
Ser Asp Gly Glu Val Ser Val Gln Ile Asn Glu Asn Val Arg Gly Gly
35 40 45
Asp Ile Phe Ile Ile Gln Ser Thr Cys Ala Pro Thr Asn Asp Asn Leu
50 55 60
Met Glu Leu Val Val Met Val Asp Ala Leu Arg Arg Ala Ser Ala Gly
65 70 75 80
Arg Ile Thr Ala Val Ile Pro Tyr Phe Gly Tyr Ala Arg Gln Asp Arg
85 90 95
Arg Val Arg Ser Ala Arg Val Pro Ile Thr Ala Lys Val Val Ala Asp
100 105 110
Phe Leu Ser Ser Val Gly Val Asp Arg Val Leu Thr Val Asp Leu His
115 120 125
Ala Glu Gln Ile Gln Gly Phe Phe Asp Val Pro Val Asp Asn Val Phe
130 135 140
Gly Ser Pro Ile Leu Leu Glu Asp Met Leu Gln Gln Asn Leu Glu Asn
145 150 155 160
Pro Ile Val Val Ser Pro Asp Ile Gly Gly Val Val Arg Ala Arg Ala
165 170 175
Ile Ala Lys Leu Leu Asn Asp Thr Asp Met Ala Ile Ile Asp Lys Arg
180 185 190
Arg Pro Arg Ala Asn Val Ser Gln Val Met His Ile Ile Gly Asp Val
195 200 205
Ala Gly Arg Asp Cys Val Leu Val Asp Asp Met Ile Asp Thr Gly Gly
210 215 220
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<210> 2
<211> 312
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 2
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1 5 10 15
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180 185 190
Arg Pro Arg Ala Asn Val Ser Gln Val Met His Ile Ile Gly Asp Val
195 200 205
Ala Gly Arg Asp Cys Val Leu Val Asp Asp Met Ile Asp Thr Gly Gly
210 215 220
Thr Leu Cys Lys Ala Ala Glu Ala Leu Lys Glu Arg Gly Ala Lys Arg
225 230 235 240
Val Phe Ala Tyr Ala Thr His Pro Ile Phe Ser Gly Asn Ala Ala Asp
245 250 255
Asn Ile Lys Asn Ser Val Ile Asp Glu Val Ile Val Cys Asp Thr Ile
260 265 270
Pro Leu Ser Asp Glu Ile Lys Ser Leu Pro Asn Val Arg Thr Leu Thr
275 280 285
Leu Ser Gly Met Leu Ala Glu Ala Ile Arg Ala Ile Ser Asn Glu Glu
290 295 300
Ser Ile Ser Ala Met Phe Glu His
305 310
<210> 3
<211> 298
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 3
Met Leu Asp Lys Thr Arg Leu Ile Thr Met Gln Lys Ser Gly Arg Leu
1 5 10 15
Ser Asp Glu Ser Gln Glu Leu Leu Ala Arg Cys Gly Ile Lys Ile Asn
20 25 30
Leu Gln Gln Gln Arg Leu Ile Ala Phe Ala Glu Asn Met Pro Ile Asp
35 40 45
Ile Leu Arg Val Arg Asp Asp Asp Ile Pro Gly Leu Val Met Asp Gly
50 55 60
Val Val Asp Leu Gly Ile Ile Gly Glu Asn Val Leu Glu Glu Glu Leu
65 70 75 80
Leu Ser Arg Arg Ala Gln Gly Glu Asp Pro Arg Tyr Phe Thr Leu Arg
85 90 95
Arg Leu Asp Phe Gly Gly Cys Arg Leu Ser Leu Ala Thr Pro Leu Asp
100 105 110
Ala Glu Tyr Ala Gly Pro Gln Ser Leu Gln Asp Ala Arg Ile Ala Thr
115 120 125
Ser Tyr Pro His Leu Leu Lys Gln Tyr Leu Asp Lys Gln Gly Val Arg
130 135 140
Phe Lys Ser Tyr Leu Leu Asn Gly Ser Val Glu Val Ala Pro Arg Ala
145 150 155 160
Gly Leu Ala Asp Ala Ile Cys Asp Leu Val Ser Thr Gly Ala Thr Leu
165 170 175
Glu Ala Asn Gly Leu Arg Glu Val Glu Val Ile Tyr Arg Ser Lys Ala
180 185 190
Cys Leu Ile Gln Arg Asp Gly Glu Met Pro Glu Ala Lys Gln Gln Leu
195 200 205
Ile Asp Arg Leu Met Thr Arg Ile Gln Gly Val Ile Gln Ala Arg Glu
210 215 220
Ser Lys Tyr Ile Met Leu His Ala Pro Ser Glu Lys Leu Asp Glu Ile
225 230 235 240
Val Ala Leu Leu Pro Gly Ala Glu Arg Pro Thr Ile Leu Pro Leu Ala
245 250 255
Gly Ala Gln Asn Arg Val Ala Met His Met Val Ser Ser Glu Thr Leu
260 265 270
Phe Trp Glu Thr Met Glu Lys Leu Lys Ala Leu Gly Ala Ser Ser Ile
275 280 285
Leu Val Leu Pro Ile Glu Lys Met Met Glu
290 295
<210> 4
<211> 299
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 4
Met Leu Asp Lys Thr Arg Leu Arg Ile Ala Met Gln Lys Ser Gly Arg
1 5 10 15
Leu Ser Asp Glu Ser Gln Glu Leu Leu Ala Arg Cys Gly Ile Lys Ile
20 25 30
Asn Leu Gln Gln Gln Arg Leu Ile Ala Phe Ala Glu Asn Met Pro Ile
35 40 45
Asp Ile Leu Arg Val Arg Asp Asp Asp Ile Pro Gly Leu Val Met Asp
50 55 60
Gly Val Val Asp Leu Gly Ile Ile Gly Glu Asn Val Leu Glu Glu Glu
65 70 75 80
Leu Leu Ser Arg Arg Ala Gln Gly Glu Asp Pro Arg Tyr Phe Thr Leu
85 90 95
Arg Arg Leu Asp Phe Gly Gly Cys Arg Leu Ser Leu Ala Thr Pro Leu
100 105 110
Asp Ala Glu Tyr Ala Gly Pro Gln Ser Leu Gln Asp Ala Arg Ile Ala
115 120 125
Thr Ser Tyr Pro His Leu Leu Lys Gln Tyr Leu Asp Lys Gln Gly Val
130 135 140
Arg Phe Lys Ser Cys Leu Leu Asn Gly Ser Val Glu Val Ala Pro Arg
145 150 155 160
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Ile Cys Asp Leu Val Ser Thr Gly Ala Thr
165 170 175
Leu Glu Ala Asn Gly Leu Arg Glu Val Glu Val Ile Tyr Arg Ser Lys
180 185 190
Ala Cys Leu Ile Gln Arg Asp Gly Glu Met Pro Glu Ala Lys Gln Gln
195 200 205
Leu Ile Asp Arg Leu Met Thr Arg Ile Gln Gly Val Ile Gln Ala Arg
210 215 220
Glu Ser Lys Tyr Ile Met Leu His Ala Pro Ser Glu Lys Leu Asp Glu
225 230 235 240
Ile Val Ala Leu Leu Pro Gly Ala Glu Arg Pro Thr Ile Leu Pro Leu
245 250 255
Ala Gly Ala Gln Asn Arg Val Ala Met His Met Val Ser Ser Glu Thr
260 265 270
Leu Phe Trp Glu Thr Met Glu Lys Leu Lys Ala Leu Gly Ala Ser Ser
275 280 285
Ile Leu Val Leu Pro Ile Glu Lys Met Met Glu
290 295
<210> 5
<211> 939
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
atgaagcttt ttgctggtaa cgccaccccg gaactagcac aacgtattgc caaccgtttg 60
tacaccagcc ttggtgacgc cgctgtaggt cgttttagcg acggcgaagt gagcgtgcaa 120
atcaacgaaa atgtacgcgg cggtgatatt ttcatcatcc agtccacctg tgccccgacc 180
aacgacaacc tgatggaact ggttgtgatg gtcgacgccc tgcgtcgcgc ctccgcaggt 240
cgtattaccg ccgttatccc ttacttcggc tatgcccgcc aggatcgccg cgtgcgttcc 300
gcgcgtgtgc caatcaccgc caaggttgtc gccgatttcc tctccagcgt aggggttgac 360
cgcgttctga cggtggatct gcatgctgag cagattcaag gcttcttcga cgtaccggta 420
gacaacgtgt tcggcagccc gatcctgctg gaagacatgc tgcagcaaaa tctggaaaac 480
ccgatcgtgg tttctccgga tatcggcggc gtggtgcgtg cccgcgctat cgccaaactg 540
ctgaacgaca ccgatatggc catcatcgac aaacgtcgcc cgcgcgcgaa cgtttctcag 600
gtgatgcaca tcatcggtga cgtggcaggc cgcgattgcg tgctggtcga cgacatgatc 660
gacaccggcg gcaccttgtg taaagcggct gaagcgttga aagaacgcgg tgccaagcgc 720
gtattcgcct acgcgacgca cccgatcttc tccggcaacg ccgtggacaa catcaagaac 780
tcggtgattg atgaagtgat cgtctgcgac accattccgc tgtcgccgga aatcaaggca 840
ctgaaaaacg ttcgcactct gaccctgtcc ggcatgctgg ctgaagccat ccgccgcatc 900
agcaacgaag agtcgatctc tgcgatgttc gagcattga 939
<210> 6
<211> 939
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 6
atgaagcttt ttgctggtaa cgccaccccg gaactagcac aacgtattgc caaccgtttg 60
tacaccagcc ttggtgacgc cgctgtaggt cgttttagcg acggcgaagt gagcgtgcaa 120
atcaaccaaa atgtacgcgg cggtgatatt ttcatcatcc agtccacctg tgccccgacc 180
aacgacaacc tgatggaact ggttgtgatg gtcgacgccc tgcgtcgcgc ctccgcaggt 240
cgtattaccg ccgttatccc ttacttcggc tatgcccgcc aggatcgccg cgtgcgttcc 300
gcgcgtgtac ccatcaccgc caaggtggtt gccgatttcc tctccagcgt aggggttgac 360
cgcgttctga cggtggatct gcatgctgag cagattcaag gcttcttcga cgtaccggta 420
gacaacgtgt tcggcagccc gatcctgctg gaagacatgc tgcagctgaa tctggataac 480
ccgatcgtgg tttccccgga catcggcggc gtagtgcgtg ctcgcgccat cgccaaactg 540
ctgaacgaca ccgacatggc catcatcgac aaacgccgcc cgcgcgcgaa cgtttctcag 600
gtgatgcaca tcatcggtga cgtggcaggc cgcgactgcg tgctggtcga cgacatgatc 660
gacaccggcg gtaccttgtg taaagcggct gaagcgttga aagaacgcgg tgccaagcgc 720
gtattcgcct acgcgacgca cccgatcttc tccggcaacg ccgcggacaa catcaagaac 780
tcggtgattg atgaagtgat cgtctgcgac accattccgc tgtcggatga aatcaagtca 840
ctgccgaacg ttcgcactct gaccctgtcc ggcatgctgg ctgaagccat ccgcgccatc 900
agcaacgaag agtcgatctc tgcgatgttc gagcattga 939
<210> 7
<211> 900
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 7
atgctggaca agacacgttt acggatcaca atgcagaagt cgggccgcct gagcgatgaa 60
tcccaggaat tgctggcgcg ctgcggcatc aagattaacc tgcagcagca gcgtctgatc 120
gccttcgccg aaaacatgcc gatcgatatc ctgcgcgtgc gcgacgacga cattccgggt 180
ctggtgatgg acggcgtggt cgatctcggc atcatcggcg agaacgtgct ggaagaagag 240
ctgctcagcc gccgcgcaca gggtgaagac ccgcgctact tcaccctgcg ccgcctcgat 300
ttcggcggct gccgcctgtc gctggccacc ccgctcgacg ccgaatacgc cggcccgcaa 360
agcctgcagg acgcccgcat cgccacttct tacccgcacc tgctgaagca atacctcgac 420
aaacagggcg tgcgcttcaa atcttacctg ctgaacggct cggtggaagt ggcgccgcgc 480
gccggcctgg ccgacgccat ctgcgatctg gtctctaccg gcgccacgct ggaggccaac 540
ggcctgcgcg aagtggaggt gatctaccgc tccaaagctt gcctgatcca gcgcgacggc 600
gaaatgcctg aagccaaaca gcagctgatt gaccgcctga tgacccgcat tcagggcgtg 660
atccaggcgc gcgaatccaa atacatcatg ctgcacgcgc cgagcgagaa actggatgag 720
atcgtcgcgc tgctgccggg cgccgaacgc ccgaccattc tgccgctggc cggtgcgcag 780
aaccgcgtgg cgatgcacat ggtcagcagc gaaaccctgt tctgggaaac catggaaaaa 840
ctgaaagcgc tcggcgccag ctcgattctg gtgctgccga ttgaaaagat gatggagtaa 900
<210> 8
<211> 900
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 8
atgctggaca agacacgttt acggatcgca atgcagaagt cgggccgcct gagcgatgaa 60
tcccaggaac tgctggcacg ctgcggcatc aagatcaacc tgcagcagca gcgtctgatc 120
gccttcgccg aaaacatgcc gatcgatatc ctgcgcgtgc gcgacgacga catcccgggc 180
ctggtgatgg acggcgtggt cgatctcggc atcatcggcg agaacgtgct ggaagaagag 240
ctgctcagcc gccgcgccca gggtgaagac ccgcgttact tcaccctgcg ccgcctcgat 300
ttcggcggct gccgcctgtc gctggccacc ccgctcgacg ccgaatacgc cggcccgcaa 360
agcctgcagg acgcccgcat cgccacctct tatccgcacc tgctgaagca atacctcgac 420
aaacaaggcg tgcgcttcaa atcttgcctg ctgaacggct cggtggaagt cgcgccgcgc 480
gccggcctgg ccgacgccat ctgcgatctg gtctctaccg gcgccacgct ggaggccaac 540
ggcctgcgcg aagtggaggt gatctaccgc tccaaagctt gcttgatcca gcgcgacggc 600
gaaatgcctg aagccaaaca gcagctgatt gaccgcctga tgacccgcat tcagggcgtg 660
atccaggcgc gcgaatccaa atacatcatg ctgcacgcgc cgagcgagaa gctggacgag 720
atcgtcgcgc tgctgccggg cgccgaacgc ccgaccattc tgccgctggc cggcgcgcag 780
aatcgcgtgg cgatgcacat ggtcagcagc gaaaccctgt tctgggaaac catggaaaaa 840
ctgaaagcgc tcggcgccag ctcgattctg gtgctgccga ttgaaaagat gatggagtaa 900
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 9
atgaagcttt ttgctggtaa cgcc 24
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 10
tcaatgctcg aacatcgcag agatc 25
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 11
atgacacgcg ttcagttcaa cc 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 12
tcacgctttt ttctgatgcc gc 22
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 13
ggcagcagcc atcatcatca tca 23
<210> 14
<211> 45
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 14
ggtatatctc cttcttaaag ttaaacaaaa ttatttctag agggg 45
<210> 15
<211> 43
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 15
ctttaagaag gagatatacc atgctggaca agacacgttt acg 43
<210> 16
<211> 49
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 16
tgatgatgat ggctgctgcc ttactccatc atcttttcaa tcggcagca 49
<210> 17
<211> 45
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 17
ctttaagaag gagatatacc atgaagcttt ttgctggtaa cgcca 45
<210> 18
<211> 44
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 18
tgatgatgat ggctgctgcc tcaatgctcg aacatcgcag agat 44
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 19
ttaacctagg ctgctgccac c 21
<210> 20
<211> 44
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 20
ggtatatctc cttcttaaag ttaaacaaaa ttatttctag aggg 44
<210> 21
<211> 44
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 21
ctttaagaag gagatatacc atgaagcttt ttgctggtaa cgcc 44
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 22
tcaatgctcg aacatcgcag aga 23
<210> 23
<211> 51
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 23
tgcgatgttc gagcattgat gcttaagtcg aacagaaagt aatcgtattg t 51
<210> 24
<211> 44
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 24
atgtatatct ccttcttata cttaactaat atactaagat gggg 44
<210> 25
<211> 43
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 25
tataagaagg agatatacat atgctggaca agacacgttt acg 43
<210> 26
<211> 47
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 26
ggcagcagcc taggttaatt actccatcat cttttcaatc ggcagca 47

Claims (10)

1.一种提高L-组氨酸产量的方法，其特征在于，所述方法是在生产L-组氨酸的宿主菌中表达5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成基因Prs和/或ATP转磷酸核糖基酶编码基因hisG，所述的5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成基因Prs的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，ATP转磷酸核糖基酶编码基因hisG的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的生产L-组氨酸的宿主菌为肠杆菌科菌株。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的肠杆菌科菌株为大肠杆菌或粘质沙雷氏菌。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的大肠杆菌为E.coli BL21。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，表达5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成基因Prs和/或ATP转磷酸核糖基酶编码基因hisG是通过质粒表达或基因组表达。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的质粒表达，是将5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成基因Prs或ATP转磷酸核糖基酶编码基因hisG连接到pET28a载体上进行表达；或者是将5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成基因Prs和ATP转磷酸核糖基酶编码基因hisG同时连接到pETDuet载体上进行表达。
7.一种L-组氨酸产量提高的重组菌，其特征在于，所述的重组菌表达了5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成基因Prs和/或ATP转磷酸核糖基酶编码基因hisG，所述的5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成基因Prs的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，ATP转磷酸核糖基酶编码基因hisG的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
8.根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于，所述的重组菌是以大肠杆菌或粘质沙雷氏菌为宿主菌，以pET28a或pETDuet为载体。
9.一种权利要求7所述的重组菌发酵生产L-组氨酸的方法，其特征在于，是将所述的重组菌接种至发酵培养基中，在28～32℃进行培养。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基为葡萄糖35～45g/L，酵母粉1～3g/L，(NH4)2SO4 14～18g/L，K2HPO4.3H2O 0.5～0.7g/L，FeSO4.7H2O 0.004～0.006g/L，MnSO4.5H2O 0.004～0.006g/L，CaCO3 25～35g/L。
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