CN112877349A

CN112877349A - 一种重组表达载体、包含其的基因工程菌及其应用

Info

Publication number: CN112877349A
Application number: CN202110096425.7A
Authority: CN
Inventors: 欧阳嘉; 许倩; 张晨; 胡月莉; 郑兆娟
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2021-01-25
Filing date: 2021-01-25
Publication date: 2021-06-01

Abstract

本发明公开一种重组表达载体，所述重组表达载体包含特定的对香豆酰辅酶A连接酶的基因和芪合成酶的基因。包含该重组表达载体的重组表达转化体应用于赤松素生物合成过程中可以有效减少中间代谢物肉桂酰辅酶A及赤松素对肉桂酸转化的抑制，增加底物肉桂酸的消耗，且大幅度提高肉桂酸至赤松素的转化效率。

Description

一种重组表达载体、包含其的基因工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术及生物催化领域，尤其涉及对香豆酰辅酶A、芪合成酶及其编码基因及应用。

背景技术

赤松素，又名银松素、反式-3,5-二羟基二苯乙烯等，属于芪类化合物。在植物属于低分子量的次生代谢产物，主要存在于松木心材中的一种植物多酚，保护植物免受细菌和真菌的侵蚀。近年来，许多研究已证实赤松素有众多的生物活性，如预防心血管疾病、抗氧化、防癌和治疗关节炎等生物活性。据报道，赤松素能够保护动物细胞免受氧化应激，这种作用已在人的视网膜细胞中观察到，添加一定浓度的赤松素可以改善氧化应激后的存活率。也有报道称赤松素可以防止牛主动脉内皮细胞坏死。因此，在保健食品和药品应用方面有着广阔的市场前景。

现阶段获得赤松素的途径主要以植物提取和化学合成为主，赤松素大多数是从松树树心中进行提取，其含量低下，只有1-40mg/g松木，另外因许多结构类似物难以分离，使得提取工艺复杂和成本昂贵。化学合成则面临反应底物昂贵、有毒副产品、副产物分离纯化困难及环境污染的难题。因此，另一种获得赤松素的方法是利用微生物制备，显得十分环境友好，生产周期短，培养成本低，产物提纯渐变，避免了大量的有机溶剂、重金属和强酸强碱的使用。

赤松素的基本骨架是由一分子肉桂酰辅酶A来源的B环和三分子丙二酰辅酶A环化形成的A环组成，其生物合成途径是以L-苯丙氨酸为起点，经苯丙氨酸解氨酶(PAL) 转化为肉桂酸，对香豆酰辅酶A连接酶(4CL)催化肉桂酸生成肉桂酰辅酶A。丙二酰辅酶A是由乙酰辅酶A或丙二酸在丙二酰辅酶A合成酶(ACC)的作用下形成，其在芪合成酶(STS)的催化作用下，与肉桂酰辅酶A缩合生成赤松素。在微生物合成赤松素的研究中，途径设计和构建是成功制备该产物的前提。2003年，研究者(Becker J V W,Armstrong G O,Van d M M J,etal.Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the synthesis of thewine-related antioxidant resveratrol[J].FEMS Yeast Research,2003， 4:79-85.)采用胡杨来源的4CL和葡萄来源的STS在酵母中组装了芪类物质的生物合成途径，首次实现了芪类物质的异源合成。Wang等(Wang S Y,Zhang S W,Xiao A F,et al.Metabolicengineering of Escherichia coli for the biosynthesis of variousphenylpropanoid derivatives[J].Metabolic Engineering,2015,29:153-159.)在大肠杆菌中组装来自三叶草的PAL、拟南芥的4CL和花生的STS，合成了13mg/L赤松素。 Salas-Navarrete(Salas-Navarrete C,Hernández-Chávez G,Flores N,et al.Increasingpinosylvin production in,Escherichia coli,by reducing the expression level ofthe gene, fabI-encoded enoyl-acyl carrier protein reductase[J].ElectronicJournal of Biotechnology, 2018,33:11-16)等过表达天蓝色链霉菌4CL和葡萄STS，成功合成34.89mg/L赤松素。

丙二酰辅酶A是芪类物质和黄酮类物质合成的重要前体，也是微生物脂肪酸合成的代谢节点。内源性代谢途径对胞内的丙二酰辅酶A极具竞争性和支配性，只有微量丙二酰辅酶A参与赤松素的合成。因此，强化赤松素合成前体丙二酰辅酶A的供给受到广泛关注。目前有如下两种方法：(1)生物胞内的乙酰辅酶A羧化酶(ACC)将葡萄糖代谢合成的乙酰辅酶A转化成丙二酰辅酶A，研究者通常在大肠杆菌中过表达谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)或发光光杆状菌(Photorhabdus luminescens) 来源的ACC以提高胞内丙二酰辅酶A水平；(2)丙二酸盐载体蛋白(MatC)将外源添加的丙二酸盐运输至胞内，然后在丙二酸辅酶A合酶(MatB)的催化作用下合成丙二酸辅酶A。研究者在重组菌株中过表达三叶草根瘤菌的matB和matC基因后，胞内丙二酰辅酶A含量显著提高；(3)丙二酰辅酶A是脂肪酸合成的底物，在胞内的丙二酰辅酶A：ACP转酰基酶(FabD)的催化作用下合成丙二酰-ACP，流入脂肪酸合成途径。

发明内容

发明目的：为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提出了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含表达特定的对香豆酰辅酶A连接酶的基因和表达芪合成酶的基因，通过表达对香豆酰辅酶A连接酶和芪合成酶，得到的基因工程菌在赤松素生物合成中可减少了肉桂酰辅酶A及赤松素的下游反馈抑制，增加了底物肉桂酸的消耗，提高了肉桂酸至赤松素的转化率。

为实现上述目的，本发明提出了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含表达对香豆酰辅酶A连接酶的基因和表达芪合成酶的基因，其中，

所述对香豆酰辅酶A连接酶是如下(a)或(b)蛋白质：

(a)具有SEQ NO.1所示的氨基酸序列的蛋白质，具有该氨基酸序列的香豆酰辅酶A，命名为Ptr4CL4，来源于毛果杨(Populus trichocarpa Torr.&Gray)

(b)由SEQ NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残疾的取代和/或缺失和/或添加且具有对香豆酰辅酶A活性的由(a)衍生的蛋白质；

所述芪合成酶是如下(c)或(d)的蛋白质：

(c)具有SEQ NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质，命名为PpSTS，来源于意大利松(Pinus pinea L)；

(d)由SEQ NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有芪合成酶活性的由(c)衍生的蛋白质。

所述表达对香豆酰辅酶A连接酶的基因的核苷酸序列为如下(1)或(2)所述的核苷酸序列：

(1)具有SEQ NO.3所示的核苷酸序列；

(2)编码(a)或(b)所述的蛋白质的核苷酸序列；

所述表达芪合成酶的基因的核苷酸序列为如下(3)或(4)所述的核苷酸序列：

(3)具有SEQ NO.4所示的核苷酸序列；

(4)编码(c)或(d)所述的蛋白质的核苷酸序列。

在一种优选的实施方案中，本发明所述的重组表达载体包含具有SEQ NO.3所示的核苷酸序列的基因和具有SEQ NO.4所示的核苷酸序列的基因，其中，具有SEQ NO.3所示的核苷酸序列的基因编码的对香豆酰辅酶A命名为Ptr4CL4，全长1713bp。其编码序列从第1个碱基起至第1713个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为 TAA。具有SEQ NO.4所示的核苷酸序列的基因编码的芪合成酶命名为PpSTS，全长 1183bp。其编码序列从第1个碱基起至第1183个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。该序列无内含子。

如本领域技术人员所知，由于密码子的简并性，编码氨基酸序列的核苷酸序列不仅仅局限于上述序列。本发明的对香豆酰辅酶A基因及芪合成酶基因的核苷酸序列也可以是编码(b)或(d)所示蛋白质的氨基酸序列的其他任何核苷酸序列。另外，还可以通过适当引入替换、缺失或插入来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对序列表中序列的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。

其中，可通过本领域常规方法将本发明所述核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述的载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等。

优选第，选用质粒pRSFDuet-1。较佳的，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的核酸产物用Promega纯化试剂盒纯化，同时将载体 pRSFDuet-1用分别限制性内切酶NdeI和XhoI、BamHI和HindIII双酶切胶回收，经全式金无缝拼接试剂盒Assembly Mix连接，形成含有本发明的对香豆酰辅酶A、芪合成酶基因的重组表达质粒pRSFDuet-Ppsts-Ptr4cl4。

扩增上述核苷酸序列全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。

本发明进一步提出了上述重组表达载体的重组表达转化体，通过将上述重组表达载转化至宿主细胞中得到。

所述的宿主细胞可为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的本发明的对香豆酰辅酶A、芪合成酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。将前述重组表达质粒pRSFDuet-Ppsts-Ptr4cl4转化至E.coli BL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株，即E.coli BL21(pRSFDuet-Ppsts-Ptr4cl4)。

上述核苷酸序列或上述重组表达载体或重组表达转化体在制备对香豆酰辅酶A、芪合成酶中的应用也是本发明保护的范围。

本发明进一步提出了上述重组表达转化体在赤松素合成上的应用。

本发明将来源于毛果杨及意大利松中克隆得到的对香豆酰辅酶A基因Ptr4cl4、芪合成酶基因Ppsts，可在宿主细胞中表达该基因以生产对香豆酰辅酶A Ptr4cl4，芪合成酶Ppsts，用于赤松素的合成。

具体地发酵方法为：按照1％接种量的重组表达转换体接种到LB培养基中，摇管活化，然后按1％接种量转接至装有LB的锥形瓶中，继续培养，取种子培养液，离心弃上清，将菌泥按初始OD600 0.6～0.8接种至发酵培养基中，并在发酵培养基中加入肉桂酸，同时加入终浓度0.5～1.5mM IPTG诱导培养。

优选地，在发酵同时添加20-100μM浅蓝菌素。

具体地，发酵培养基包含M9盐11.3g/L，酵母提取物5～10g/L，3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)35～45g/L，甘油3～8％(v/v)，大肠杆菌的培养温度为28～45℃，转速150～300rpm，培养时间为8～15h，发酵时间12～72h。

有益效果：本发明通过将表达对香豆酰辅酶A连接酶的基因和表达芪合成酶的基因重组并转化表达，解决了目前下游反馈抑制、STS活力低以及丙二酰辅酶A供应不足的问题，使用Ptr4CL4减少了肉桂酰辅酶A及赤松素的抑制，增加了底物肉桂酸的消耗，大幅度提高了肉桂酸至赤松素转化率。

附图说明

图1为pETDuet-Ptr4cl4质粒双酶切结果图，其中，M：DL 5,000DNA Marker；1：pETDuet-Ptr4cl4；2：pETDuet-Ptr4cl4质粒双酶切产物；

图2为提取质粒双酶切验证实验结果，1：pRSFDuet-Ppsts质粒；2：pRSFDuet-Ptps质粒；3：pRSFDuet-Psps^Q361R质粒；4：pRSFDuet-Ppsts质粒双酶切产物；5：pRSFDuet-Ptps 质粒双酶切产物；6：pRSFDuet-PspsQ361R质粒双酶切产物；M：5000Maker；

图3为pRSFDuet-sts-Ptr4cl4质粒的双酶切产物；其中，pRSFDuet-Ppsts-Ptr4cl4质粒双酶切产物；5-8：pRSFDuet-Ptps-Ptr4cl4质粒双酶切产物；9-12： pRSFDuet-Psps-Ptr4cl4质粒双酶切产物；M：5000Maker；

图4为赤松素和肉桂酸混合样品的色谱图及标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：对香豆酰辅酶A基因的优化及重组表达载体的构建

原始的对香豆酰辅酶A(4-coumarate-CoA ligase family protein[Populustrichocarpa]， GenBank:EEF00197.1)的氨基酸序列来源于从NCBI数据库注释信息中筛选而来。在不改变编码的氨基酸序列的前提下，按照大肠杆菌密码子偏好性，将Ptr4CL4基因进行密码子优化，全基因合成方法合成了对香豆酰辅酶A的全基因序列Ptr4CL4。人工合成的对香豆酰辅酶A基因Ptr4CL4的核苷酸序列如SEQ NO.4中所示。合成的Ptr4CL4基因两端还带有NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点，以便和表达载体进行连接。连接结果如图1所示。采用Ptr4CL4基因序列为模板扩增芪合成酶Ptr4CL4基因，所用引物为：

Ptr4CL4-up：5’-ACATATGATGAGTGTTGCCACCGTGG-3’

Ptr4CL4-dn：5’-AGACTCGAGTTAACTCATGGTGGTT-3’

下划线处分别为NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点。

实施例2：芪合成酶基因的优化及重组表达载体的构建

原始的芪合成酶(stilbene synthase[Pinus pinea]，GenBank:ALN42233.1)的氨基酸序列来源于从NCBI数据库注释信息中筛选而来。在不改变编码的氨基酸序列的前提下，按照大肠杆菌密码子偏好性，将编码该芪合成酶的基因进行密码子优化，全基因合成方法合成了芪合成酶全基因序列Ppsts，其核苷酸序列如SEQ NO.4所示。合成的Ppsts基因两端还带有BamHⅠ和HindⅠⅠⅠ酶切位点，以便和表达载体进行连接。采用 Ppsts基因的核苷酸序列为模板扩增芪合成酶Ppsts基因，所用引物为：

PpSTS-up：5’-CAGGATCCGATGGGCGCTGTTGACT-3’

PpSTS-dn：5’-CGCAAGCTTTTATTGCAGCGGAACA-3’

下划线处分别为BamHⅠ和HindⅠⅠⅠ酶切位点。

实施例3：赤松素合成菌株的构建。

委托滁州通用合成的Ppsts(SEQ NO.4)、Ptps(SEQ NO.5)和Psps^Q361R基因(SEQNO.6)的核苷酸序列长度分别为1182bp、1179bp和1194bp，其中，Ptps和Psps^Q361R基因为另外两种已知的芪合成酶基因，Ptps基因的Genebank登录号为KF998274.1， Psps^Q361R基因的Genebank登录号为P48407.1，其均被分别插在pRSFDuet-1(3829bp) 的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点。提取质粒双酶切验证实验结果如图2所示。以 pETDuet-Ptr4cl4质粒(该质粒委托商业公司制备)为模板进行扩增目的基因Ptr4cl4，所用引物为：

Ptr4CL4-up：5’-ACATATGATGAGTGTTGCCACCGTGG-3’

Ptr4CL4-dn：5’-AGACTCGAGTTAACTCATGGTGGTT-3’

下划线处分别为NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点。

采用BglⅡ和KpnⅠ双酶切pRSFDuet-Ppsts、pRSFDuet-Ptps和pRSFDuet-Psps^Q361R质粒，胶回收后用pEASY-Uni定向重组试剂盒连接目的片段与Ptr4cl4基因，并转化入E.coliTrans T1。挑取转化子质粒，并采用ApaⅠ和EcoRⅠ双酶切，产物大小在4400bp 和2200bp左右，如图3所示。将测序正确的质粒导入表达菌株E.coli BL21(DE3)中，构建重组大肠杆菌E.coli BLPS(pRSFDuet-Psps^Q361R-Ptr4cl4)、E.coli BLPT (pRSFDuet-Ptps-Ptr4cl4)和E.coli BLPP-2(pRSFDuet-Ppsts-Ptr4cl4)，不同STS合成赤松素能力，在含有80mg/L肉桂酸的M9CA培养基中，菌泥按初始OD₆₀₀ 0.6～0.8 接种至发酵培养基发酵48h后均能合成赤松素，E.coli BLPS在48h内合成了0.048 mg/L赤松素，E.coli BLPT和E.coli BLPP-2的赤松素均具有较强的赤松素合成能力，且E.coli BLPP-2的赤松素产量最高(0.444mg/L)，因此本专利涉及的 pRSFDuet-Ppsts-Ptr4cl4合成赤松素的能力最强。

实施例5：重组菌株发酵合成赤松素。

赤松素采用如下方法检测：

色谱柱：Eclipse XDB-C18反相柱(250mm×4.6mm，5μm)，柱温：30℃，流动相 A为100％乙腈、B为1.5％乙酸，采用40％的流动相A等梯度洗脱，流速：1mL/min，紫外检测波长：294nm，进样量：10μL。

赤松素和肉桂酸混合样品的色谱图及标准曲线如图4所示。

将重组菌株按1％接种量接种到5mL LB培养基中，37℃、200rpm摇管活化12h，然后按1％接种量转接至装有20mLLB的锥形瓶中，继续培养11～12h。取种子培养液，离心弃上清，将菌泥按初始D₆₀₀ 0.6～0.8接种至发酵培养基中，其中，发酵培养基成分为：M9盐11.3g/L；酵母提取物10g/L；MOPS 42g/L；甘油5％(v/v)，含80mg/L 肉桂酸，加入终浓度1mMIPTG诱导，在发酵同时添加60μM浅蓝菌素抑制脂肪酸代谢提高胞内丙二酰辅酶A的浓度。30℃、200rpm培养48h后取上清检测赤松素产量，含有Ptr4CL4的重组菌株E.coli BLPP-2的肉桂酸转化率达到93.2％，合成了68.68mg/L 的赤松素，相比于含有Ptr4CL5的重组菌株E.coli BLPP仅合成了9.61mg/L的赤松素，产量提高了615.4％。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种重组表达载体、包含其的基因工程菌及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 570

<212> PRT

<213> 对香豆酰辅酶A连接酶Ptr4CL4的氨基酸序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Met Ser Val Ala Thr Val Glu Pro Pro Lys Pro Glu Leu Ser Pro

1 5 10 15

Pro Gln Asn Gln Asn Ala Pro Ser Ser His Glu Thr Asp His Ile Phe

20 25 30

Arg Ser Lys Leu Pro Asp Ile Thr Ile Ser Asn His Leu Pro Leu His

35 40 45

Ala Tyr Cys Phe Glu Asn Leu Ser Asp Phe Ser Asp Arg Pro Cys Leu

50 55 60

Ile Ser Gly Ser Thr Gly Lys Thr Tyr Ser Phe Ala Glu Thr His Leu

65 70 75 80

Ile Ser Arg Lys Val Ala Ala Gly Leu Ser Asn Leu Gly Ile Lys Lys

85 90 95

Gly Asp Val Ile Met Thr Leu Leu Gln Asn Cys Pro Glu Phe Val Phe

100 105 110

Ser Phe Met Gly Ala Ser Met Ile Gly Ala Val Thr Thr Thr Val Asn

115 120 125

Pro Phe Tyr Thr Pro Gly Glu Ile Phe Lys Gln Phe Ser Ala Ser Arg

130 135 140

Ala Lys Leu Ile Ile Thr Gln Ser Gln His Val Asn Lys Leu Arg Asp

145 150 155 160

Ser Asp Cys His Glu Asn Asn Gln Lys Pro Glu Glu Asp Phe Ile Val

165 170 175

Ile Thr Ile Asp Asp Pro Pro Glu Asn Cys Leu His Phe Asn Val Leu

180 185 190

Val Glu Ala Asn Glu Ser Glu Met Pro Thr Val Ser Ile His Pro Asp

195 200 205

Asp Pro Val Ala Leu Pro Phe Ser Ser Gly Thr Thr Gly Leu Pro Lys

210 215 220

Gly Val Ile Leu Thr His Lys Ser Leu Ile Thr Ser Val Ala Gln Gln

225 230 235 240

Val Asp Gly Glu Ile Pro Asn Leu Tyr Leu Lys Gln Asp Asp Val Val

245 250 255

Leu Cys Val Leu Pro Leu Phe His Ile Phe Ser Leu Asn Ser Val Leu

260 265 270

Leu Cys Ser Leu Arg Ala Gly Ser Ala Val Leu Leu Met Gln Lys Phe

275 280 285

Glu Ile Gly Ser Leu Leu Glu Leu Ile Gln Lys His Asn Val Ser Val

290 295 300

Ala Ala Val Val Pro Pro Leu Val Leu Ala Leu Ala Lys Asn Pro Met

305 310 315 320

Val Ala Asn Phe Asp Leu Ser Ser Ile Arg Val Val Leu Ser Gly Ala

325 330 335

Ala Pro Leu Gly Lys Glu Leu Glu Glu Ala Leu Arg Ser Arg Val Pro

340 345 350

Gln Ala Ile Leu Gly Gln Gly Tyr Gly Met Thr Glu Ala Gly Pro Val

355 360 365

Leu Ser Met Cys Leu Ala Phe Ser Lys Gln Pro Leu Pro Thr Lys Ser

370 375 380

Gly Ser Cys Gly Thr Val Val Arg Asn Ala Glu Leu Lys Val Ile Asp

385 390 395 400

Pro Glu Thr Gly Ser Ser Leu Gly Arg Asn Gln Pro Gly Glu Ile Cys

405 410 415

Ile Arg Gly Ser Gln Ile Met Lys Gly Tyr Leu Asn Asp Ala Glu Ala

420 425 430

Thr Ala Asn Ile Ile Asp Val Glu Gly Trp Leu His Thr Gly Asp Ile

435 440 445

Gly Tyr Val Asp Asp Asp Asp Glu Ile Phe Ile Val Asp Arg Val Lys

450 455 460

Glu Ile Ile Lys Phe Lys Gly Phe Gln Val Pro Pro Ala Glu Leu Glu

465 470 475 480

Ala Leu Leu Val Asn His Pro Ser Ile Ala Asp Ala Ala Val Val Pro

485 490 495

Gln Lys Asp Glu Val Ala Gly Glu Val Pro Val Ala Phe Val Val Arg

500 505 510

Ser Asn Asp Leu Asp Leu Asn Glu Glu Ala Val Lys Asp Tyr Ile Ala

515 520 525

Lys Gln Val Val Phe Tyr Lys Lys Leu His Lys Val Phe Phe Val His

530 535 540

Ser Ile Pro Lys Ser Ala Ala Gly Lys Ile Leu Arg Lys Asp Leu Arg

545 550 555 560

Ala Lys Leu Ala Thr Ala Thr Thr Met Ser

565 570

<210> 2

<211> 362

<212> PRT

<213> 芪合成酶PpSTS的氨基酸序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Gly Arg Cys Leu Arg Arg Leu Pro Gln Thr Ala Thr Cys Arg Trp

1 5 10 15

Leu Arg Lys His Ser Gly His Trp Tyr Ser Lys Ser Ala Glu Cys Ser

20 25 30

Gly Ser Glu Tyr Leu Ser Gly Leu Leu Leu Pro Tyr Tyr Arg Thr Tyr

35 40 45

Arg Thr Glu Arg Val Gln Thr His Leu Thr Cys His Thr Ala Leu Tyr

50 55 60

Val Ser Asp Arg Arg Asn Ser Glu Lys Lys Ser Cys Val Cys Ile Arg

65 70 75 80

Ser Ser Glu Ser Gly Cys Thr Ser Gly Asn Ala Gly Asn Arg Ser Ser

85 90 95

Ala Pro Gly Lys Arg Ser Arg Arg Lys Ser His Ser Gly Met Gly Pro

100 105 110

Glu Lys Pro His Tyr Pro Ser Asp Leu Leu His His His Pro Gly Ser

115 120 125

Ala Gly Cys Arg Leu Arg Ser Cys Gln Asn Ala Gly Pro Ala Ser Glu

130 135 140

Cys Thr Arg Gly Cys Val Pro Ala Trp Leu Leu Arg Arg Arg Tyr Ser

145 150 155 160

Ser Ala Tyr Gly Lys Arg Leu Ser Arg Lys Ser Trp Cys Pro Cys Ala

165 170 175

Gly Tyr Leu Asn His Arg Ser Asp Leu Pro Trp Ser Glu Arg Asn Thr

180 185 190

Ser Gly Pro Gly Trp Ser Gly Pro Val Arg Arg Trp Cys Gln Arg Thr

195 200 205

Asp Cys Gly Arg Arg Ser Asp Ser Ala Gly Lys Ser Met Leu Arg Asn

210 215 220

Cys Val Asp Arg Thr Asp Arg Cys Ser Glu Arg Cys His Trp Arg Ser

225 230 235 240

Ser Ser Gly Ser Asp Leu Pro Ala Glu Arg Cys Ser Ser Gly Ser Asp

245 250 255

Arg Lys Tyr Lys Leu Ser Gly Ser Ile Gln Pro Val Gln Asn Leu Glu

260 265 270

Thr Val Leu Gly Gly Ser Ser Gly Trp Ser Arg Asn Ser Gly Ser Cys

275 280 285

Ser Lys Thr Glu Ser Gly Pro Tyr Gln Thr Asp Ser Asp Pro Ser Cys

290 295 300

Tyr Glu Arg Ile Trp Tyr Glu Gln Arg Met Arg Ala Leu His Ser Gly

305 310 315 320

Ser Asp Pro Gln Ser Gln Ser Ala Lys Trp Leu Gln His Gln Trp Arg

325 330 335

Pro Gly Asn Gly Arg Ser Val Arg Leu Arg Ser Gly Pro Asp His Asn

340 345 350

Arg Gly Ala Glu Lys Cys Ser Ala Ala Ile

355 360

<210> 3

<211> 1713

<212> DNA

<213> 对香豆酰辅酶A连接酶基因的核苷酸序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgatgagtg ttgccaccgt ggaaccgccg aaaccggaac tgagcccgcc gcagaatcag 60

aatgccccga gtagtcatga aaccgatcat atttttcgca gtaaactgcc ggatattacc 120

attagtaatc atctgccgct gcatgcatat tgttttgaaa atctgagcga ttttagcgat 180

cgtccgtgtc tgattagtgg tagtaccggc aaaacctata gctttgcaga aacccatctg 240

attagtcgta aagtggccgc aggtctgagt aatctgggta ttaagaaagg cgatgtgatt 300

atgaccctgc tgcagaattg cccggaattt gtttttagtt ttatgggcgc cagcatgatt 360

ggtgcagtta ccaccaccgt taatccgttt tataccccgg gcgaaatttt taaacagttt 420

agcgcaagtc gtgcaaaact gattattacc cagagccagc atgtgaataa gctgcgtgat 480

agcgattgcc atgaaaataa tcagaaaccg gaagaagatt ttatcgttat taccattgac 540

gatccgccgg aaaattgcct gcattttaat gtgctggttg aagcaaatga aagcgaaatg 600

ccgaccgtga gcattcatcc ggatgatccg gtggcactgc cgtttagtag tggcaccacc 660

ggtctgccga aaggcgttat tctgacccat aaaagcctga ttaccagtgt ggcacagcag 720

gtggatggtg aaattccgaa tctgtatctg aaacaggatg atgtggtgct gtgcgtgctg 780

ccgctgtttc atatttttag tctgaatagt gtgctgctgt gcagtctgcg tgccggtagt 840

gccgtgctgc tgatgcagaa atttgaaatt ggcagtctgc tggaactgat tcagaaacat 900

aatgttagtg ttgccgccgt tgttccgccg ctggttctgg ccctggcaaa aaatccgatg 960

gtggcaaatt ttgatctgag cagcattcgt gtggtgctga gcggtgcagc cccgctgggt 1020

aaagaactgg aagaagccct gcgcagccgc gttccgcagg ctattctggg ccagggttat 1080

ggcatgaccg aagccggtcc ggttctgagc atgtgtctgg cattttctaa acagccgctg 1140

ccgaccaaaa gtggcagctg cggcaccgtt gttcgcaatg ccgaactgaa agttattgat 1200

ccggaaaccg gtagcagcct gggtcgtaat cagccgggcg aaatctgtat tcgtggcagc 1260

cagattatga aaggttatct gaatgatgca gaagcaaccg caaatattat tgatgttgaa 1320

ggttggctgc ataccggtga cattggctat gttgatgatg atgatgaaat ttttatcgtg 1380

gatcgtgtga aagaaattat taagtttaag ggcttccagg tgccgccggc cgaactggaa 1440

gccctgctgg tgaatcatcc gagtattgca gatgcagcag ttgttccgca gaaagatgaa 1500

gtggccggtg aagtgccggt tgcatttgtt gttcgcagta atgatctgga tctgaatgaa 1560

gaagccgtga aagattatat tgccaaacag gttgttttct ataagaaact gcataaagtg 1620

ttcttcgtgc atagtattcc gaaaagcgcc gccggcaaaa ttctgcgcaa agatctgcgc 1680

gccaaactgg caaccgcaac caccatgagt taa 1713

<210> 4

<211> 1183

<212> DNA

<213> 芪合成酶的基因的核苷酸序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatgggcgct gttgacttcg aaggcttccg caaactgcaa cgtgccgatg gcttcgcaag 60

cattctggcc attggtacag caaatccgcc gaatgcagtg gatcagagta cctatccgga 120

cttctacttc cgtattaccg gtaatgaaca taataccgaa ctgaaagata agttcaaacg 180

catctgtgaa cgtagtgcca ttaaacagcg ttatatgtat ctgaccgaag aaattctgaa 240

aaaaaatcct gatgtgtgtg cattcgttga agttccgagt ctggatgcac gtcaggcaat 300

gctggcaacc gaagttccgc gcctggcaaa agaagccgcc gaaaaagcca ttcaggaatg 360

gggccagagt aaaagccgca ttacccatct gatcttctgt agcaccacca ccccggatct 420

gccgggtgcc gacttcgaag ttgccaaaat gctgggcctg catccgagtg ttaaacgcgt 480

gggtgtgttc cagcatggtt gcttcgcagg cggtacagtt ctgcgtatgg caaaagactt 540

agcagaaaat aatcgtggtg cccgtgtgct ggttatctgt agtgaaacca ccgcagtgac 600

cttccgtggt ccgagcgaaa cacatctgga tagcctggtt ggtcaggccc tgttcggcga 660

tggtgccagc gcactgattg tgggcgcaga tccgattccg caggttgaaa aagcatgctt 720

cgaaattgtg tggaccgcac agaccgttgt tccgaatagt gaaggtgcca ttggcggtaa 780

agttcgtgaa gtgggtctga ccttccagct gaaaggtgca gttccggatc tgattagcgc 840

aaatattgaa aattgtctgg ttgaagcatt cagccagttc aaaattagtg attggaataa 900

actgttctgg gtggttcatc cgggtggtcg cgcaattctg gatcgtgttg aagcaaaact 960

gaatctggac cctaccaaac tgattccgac ccgtcatgtt atgagcgaat atggtaatat 1020

gagcagcgca tgcgtgcact tcattctgga tcagacccgc aaagccagtc tgcaaaatgg 1080

ttgcagcacc agtggtgaag gcctggaaat gggcgttctg ttcggcttcg gtccgggcct 1140

gaccattgaa accgtggtgc tgaaaagtgt tccgctgcaa taa 1183

<210> 5

<211> 1179

<212> DNA

<213> Ptps的核苷酸序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggggggcg ttgattttga aggtttcagg aagttgcaga gggcagatgg cttcgcttcg 60

atccttgcta tcggcactgc caatccaccc aatgctgtgg atcagagcac atatccagat 120

tactacttcc gaatcaccgg taacgagcat aacacagagc tcaaggataa gttcaagcga 180

atatgtgaaa ggtcggcaat aagacaaaga tacatgtacc tgacggagga gattctcaag 240

aagaatcccg atgtgtgcgc gtttgtggag gtgccatcgt tggacgcacg gcaggcgatg 300

ttggctatgg aggtgccccg actggcaaaa gaggctgctg aaaaggccat tcacgagtgg 360

gggcagtgca agtctgggat cactcatctc atattttgca gcacaacgac tccggatcta 420

cccggagcag actttgaggt agccaagttg ctcgggctgc acccgagtgt gaagagagtg 480

ggcgtgttcc aacatggctg cttcgccgga ggcaccgttc ttcgactggc gaaagacctt 540

gccgaaaaca atcgaggagc tcgggtgctg gtcatctgca gtgaaaccac cgccgttacc 600

ttccgtggac cctccgagac tcacctggac agcctggtgg ggcaagctct attcggcgac 660

ggtgcgtctg ccctcatcgt gggagctgat cccatccctc aagtggagaa ggcatgtttc 720

gaaatcgttc ggacatccca gacagttgtt cccaacagcg acggagccat cggtgggaag 780

gtgagagaag tcggacttac cttccaactc aaaggggcgg ttccggatct tatctctgcc 840

aacattgaaa actgtctcgt ggaggcgttc agtcaattca aaatatccga ctggaacaag 900

ttgttctggg ttgttcatcc cggaggacgt gccatccttg atcgggtgga ggccaagctc 960

aatctggatc ccacaaaact gatacccacc aggcacgtta tgagcgagta cggaaacatg 1020

tcgagtgcat gcgtccactt catattggat gagacgagga aagcgtctct acgaaacgat 1080

tgttcaacca ccggagaggg attggaaatg ggagtcctgt ttggattcgg gccgggcctc 1140

accatcgaaa cagtggttct caagagcgtt cctctttag 1179

<210> 6

<211> 1189

<212> DNA

<213> PspsQ361R基因的核苷酸序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgtctgtag gaatgggcgt tgatttggaa gctttcagga aatcccagag ggcagatggc 60

ttcgcttcaa tccttgctat cggtacggcc aatcccccca atgttgtgga tcagagcaca 120

tatccagatt actactttcg aaacaccaat aacgaggata acacagacct caaggataag 180

ttcaagcgaa tatgtgaaag gtcggcaata aaaaagagac acatgtacct cacggaggag 240

attctgaaga agaatccgga attgtgcgca ttcttggagg tgccatcact ggacacacgg 300

caggcgatgt tggcggtgga ggtgccccgg ctaggaaaag aggccgctga aaaggcgatt 360

gaggagtggg gacaacccaa gtcgaggatc actcatctca tcttttgcac cacaaccact 420

ccagatttac ccggagccga ctttgaggta gccaagttgc tggggctgca ccccagtgtg 480

aagagagtgg gcgtgttcca acatggctgc ttcgccggag gcaccgttct tcgcctggcg 540

aaagaccttg ccgaaaacaa tcgaggagct cgggtgctgg tcgtgtgcag tgaaaacacc 600

gccgttacct tccgcggacc ctccgagact cacctggatg gcctagtggg cctagctctg 660

ttcggcgatg gtgcggctgc cctcatcgtg ggagctgatc ccatccctca agtggagaag 720

ccctgtttcg aaatcgtttg gacagcccag acagttgttc ccaacagcga cggagcaatc 780

agtgggaagc tgagagaggt gggattgacc ttccaactca aaggcgcggt tccggatctc 840

atctctacca acattgaaaa gtgtctggtg gaggcgttca gtcagttcaa tatctccgac 900

tggaaccagt tgttctggat tgctcatccc ggaggacgtg ccatccttga ccaggtggag 960

gcaagcctca atttggatcc cacaaaactc agagccacca ggcacgttat gagcgagtac 1020

ggaaacatgt ccagtgcgtg cgtccacttc atattggatg agaccaggaa ggcgtctcga 1080

caaaacggat gttcaaccag cggaggggga ttccaaatgg gagtcctctt tggattcggg 1140

ccgggcctca ccgtcgaaac agtcgttctc aagagcattc ctttccctt 1189

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> Ptr4CL4上游引物(Artificial Sequence)

<400> 7

acatatgatg agtgttgcca ccgtgg 26

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> Ptr4CL4下游引物(Artificial Sequence)

<400> 8

agactcgagt taactcatgg tggtt 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> PpSTS上游引物(Artificial Sequence)

<400> 9

caggatccga tgggcgctgt tgact 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> PpSTS下游引物(Artificial Sequence)

<400> 10

cgcaagcttt tattgcagcg gaaca 25

Claims

1.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含表达对香豆酰辅酶A连接酶的基因和表达芪合成酶的基因，其中，

所述对香豆酰辅酶A连接酶是如下（a）或（b）蛋白质：

（a）具有SEQ NO .1所示的氨基酸序列的蛋白质；

（b）由SEQ NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残疾的取代和/或缺失和/或添加且具有对香豆酰辅酶A活性的由（a）衍生的蛋白质；

所述芪合成酶是如下（c）或（d）的蛋白质：

（c）具有SEQ NO .2所示的氨基酸序列的蛋白质；

（d）由SEQ NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有芪合成酶活性的由（c）衍生的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达对香豆酰辅酶A连接酶的基因的核苷酸序列为如下（1）或（2）所述的核苷酸序列：

（1）具有SEQ NO .3所示的核苷酸序列；

（2）编码（a）或（b）所述的蛋白质的核苷酸序列；

所述表达芪合成酶的基因的核苷酸序列为如下（3）或（4）所述的核苷酸序列：

（3）具有SEQ NO .4所示的核苷酸序列；

（4）编码（c）或（d）所述的蛋白质的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述载体为质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体中的任意一种。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述载体为pETDuet-1，pCDFDuet-1和pRSFDuet-1或衍生自上述载体的任意一种。

5.包含权利要求1-4任一项所述的重组表达载体的重组表达转化体，通过将上述重组表达载转化至宿主细胞中得到。

6.根据权利要求5所述的重组表达转化体，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。

7.权利要求6所述的重组表达转化体在赤松素合成上的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，按照1%接种量的重组表达转换体接种到LB培养基中，摇管活化，然后按1%接种量转接至装有LB的锥形瓶中，继续培养，取种子培养液，离心弃上清，将菌泥按初始OD600 0.6~0.8接种至发酵培养基中，并在发酵培养基中加入肉桂酸，同时加入终浓度0.5~1.5 mM IPTG诱导培养。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，在发酵同时添加20-100 μM浅蓝菌素。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，发酵培养基包含M9盐11.3 g/L，酵母提取物5~10 g/L，3-(N-吗啉基)丙磺酸（MOPS）35~45 g/L，甘油3~8% （v/v），大肠杆菌的培养温度为28~45 ºC，转速150~300 rpm，培养时间为8~15 h，发酵时间12~72 h。