优选实施方案详述
优选地,所述赤松素或衍生物在内源丙二酸单酰辅酶A是其底物的酶催化反应中产生,优选地,由肉桂酰辅酶A产生所述赤松素。
所述赤松素或衍生物优选由肉桂酰辅酶A产生,优选通过茋合酶产生,所述茋合酶优选由编码所述酶的核酸在所述微生物中表达,其中所述核酸不是该微生物中天然存在的。
一般来说,在本文中,除非上下文表明为其他含义,否则提及赤松素时包括其寡聚衍生物或糖苷结合衍生物。
因此,在某些优选的实施方案中,所述茋合酶为白藜芦醇合酶(EC2.3.1.95),所述白藜芦醇合酶来自属于落花生属(Arachis)的植物,例如A.glabatra、落花生(A.hypogaea);属于大黄属(Rheum)的植物,例如圆叶大黄(R.tataricum);属于葡萄属(Vitus)的植物,例如美国葡萄(V.labrusca)、河岸葡萄(V.riparaia)、欧洲葡萄(V.vinifera);或者以下任何属的植物:松属(Pinus)、云杉属(Piceea)、百合属(Lilium)、桉属(Eucalyptus)、爬山虎属(Parthenocissus)、白粉藤属(Cissus)、蝶花百合属(Calochortus)、蓼属(Polygonum)、买麻藤属(Gnetum)、木菠萝属(Artocarpus)、假山毛榉属(Nothofagus)、刺葵属(Phoenix)、羊茅属(Festuca)、薹草属(Carex)、藜芦属(Veratrum)、羊蹄甲属(Bauhinia)或老虎刺属(Pterolobium)。
所述茋合酶可以是在以肉桂酰辅酶A作为底物时转换率高于(例如至少1.5或至少2的因数)在以4-香豆酰辅酶A作为底物时转换率的酶。因此,在另一些优选的实施方案中,所述茋合酶是赤松素合酶,其合适地来自树木,例如松属、桉属、云杉属或橙桑属(Maclura)物种。特别地,所述茋合酶可以是来自以下植物的赤松素合酶(EC 2.3.1.146):属于松属的植物,例如欧洲赤松、北美乔松、赤松、火炬松(P.taeda);属于云杉属的植物,或者桉属的任一植物。
优选地,所述肉桂酸可在酶催化的产生氨的反应中从L-苯丙氨酸产生,适当时所述肉桂酸通过苯丙氨酸氨裂合酶从L-苯丙氨酸产生。
在一些优选的实施方案中,所述L-苯丙氨酸氨裂合酶是来自植物或微生物的L-苯丙氨酸氨裂合酶(EC 4.3.1.5)。所述植物可属于拟南芥属(Arabidopsis),例如拟南芥(A.thaliana);属于芸苔属(Brassica)的植物,例如欧洲油菜(B.napus)、芜青(B.rapa);属于柑橘属(Citrus)的植物,例如柑橘(C.reticulata)、克莱蒙柑橘(C.clementinus)、柠檬(C.limon);属于菜豆属(Phaseolus)的植物,例如荷包豆(P.coccineus)、菜豆(P.vulgaris);属于松属(Pinus)的植物,例如北美短针松(P.banksiana)、加州山松(P.monticola)、海岸松(P.pinaster)、欧洲赤松(P.sylvestris)、火炬松(P.taeda);属于杨属(Populus)的植物,例如小叶杨(P.balsamifera)、P.deltoides、加杨(P.Canadensis)、P.kitakamiensis、欧洲山杨(P.tremuloides);属于茄属(Solanum)的植物,例如马铃薯(S.tuberosum);属于李属(Prunus)的植物,例如欧洲甜樱桃(P.avium)、桃(P.persica);属于葡萄属(Vitus)的植物,例如葡萄(Vitus vinifera);属于玉蜀黍属(Zea)的植物,例如玉蜀黍(Z.mays);或者其他植物属,例如藿香属(Agastache)、凤梨属(Ananas)、天门冬属(Asparagus)、布氏兰属(Bromheadia)、簕竹属(Bambusa)、甜菜属(Beta)、桦木属(Betula)、黄瓜属(Cucumis)、山茶属(Camellia)、辣椒属(Capsicum)、决明属(Cassia)、长春花属(Catharanthus)、鹰嘴豆属(Cicer)、西瓜属(Citrullus)、咖啡属(Coffea)、南瓜属(Cucurbita)、狗牙根属(Cynodon)、胡萝卜属(Daucus)、石斛属(Dendrobium)、石竹属(Dianthus)、洋地黄属(Digitalis)、薯蓣属(Dioscorea)、桉属(Eucalyptus)、Gallus、银杏属(Ginkgo)、大豆属(Glycine)、大麦属(Hordeum)、向日葵属(Helianthus)、番薯属(Ipomoea)、莴苣属(Lactuca)、紫草属(Lithospermum)、百脉根属(Lotus)、番茄属(Lycopersicon)、苜蓿属(Medicago)、苹果属(Malus)、木薯属(Manihot)、苜蓿属(Medicago)、日中花属(Mesembryanthemum)、烟草属(Nicotiana)、木犀榄属(Olea)、稻属(Oryza)、豌豆属(Pisum)、鳄梨属(Persea)、欧芹属(Petroselinum)、蝴蝶兰属(Phalaenopsis)、刚竹属(Phyllostachys)、小立碗藓属(Physcomitrella)、云杉属(Picea)、梨属(Pyrus)、栎属(Quercus)、萝卜属(Raphanus)、地黄属(Rehmannia)、悬钩子属(Rubus)、高粱属(Sorghum)、Sphenostylis、繁缕属(Stellaria)、铅笔花属(Stylosanthes)、小麦属(Triticum)、车轴草属(Trifolium)、小麦属(Triticum)、越桔属(Vaccinium)、豇豆属(Vigna)、百日草属(Zinnia)。所述微生物可以是属于蘑菇属(Agaricus)的真菌,例如双孢蘑菇(A.bisporus);属于曲霉属(Aspergillus)的真菌,例如米曲霉(A.oryzae)、构巢曲霉(A.nidulans)、烟曲霉(A.fumigatus);属于黑粉菌属(Ustilago)的真菌,例如U.maydis;属于红细菌属(Rhodobacter)的细菌,例如荚膜红细菌(R.capsulatus);属于链霉菌属(Streptomyces)的细菌,例如S.maritimus;属于光杆状菌属(Photorhabdus)的细菌,例如发光光杆状菌(P.luminescens);属于红酵母(Rhodotorula)的酵母,例如深红酵母(R.rubra)。
由于如上文所述,为了产生赤松素,我们需要通过PAL酶产生肉桂酸并将其转化成赤松素,而不是通过底物广泛的PAL从酪氨酸产生香豆酸或是通过C4H酶转化肉桂酸来生产香豆酸,因此由于本发明的微生物优选具有偏好以苯丙氨酸(因此产生肉桂酸)而不是酪氨酸(将产生香豆酸)作为底物的PAL。因此,该PAL的Km(苯丙氨酸)/Km(酪氨酸)比值优选小于1:1,优选小于1:5,例如小于1:10。一般地,Km是产生最高产物形成速率(Vmax)一半的底物(分别为苯丙氨酸或酪氨酸)摩尔浓度。
C4H的存在对于赤松素产生没有帮助,但也无需禁止,只要肉桂酸不将肉桂酸从赤松素产生过多地转向形成白藜芦醇的方向即可。因此,优选地,不存在C4H产生,或者使得Kcat(PAL)/Kcat(C4H)大于2,优选大于4。一般地,在每种情况下,Kcat是Vmax/[酶],其中[酶]是相关酶的浓度。
例如,拟南芥苯丙氨酸氨裂合酶PAL2及其同源物PAL1的典型Km值在使用苯丙氨酸作为底物时约为60μM(Cochrane等,2004),在使用酪氨酸为底物时则高于1000μM(Watts等,2006)。拟南芥PAL2的催化转换率Kcat在将苯丙氨酸转化成肉桂酸时为192mol/mol酶PAL2(Cochrane等,2004),而将酪氨酸转化成香豆酸时Kcat很小。具有以上动力学特性的PAL特异性地以苯丙氨酸作为底物,并仅仅从苯丙氨酸形成肉桂酸,从酪氨酸形成香豆酸的水平检测不到。
C4H所催化的羟化酶反应的典型转换率在天然酵母CPR活性支持该反应时为25摩尔香豆酸产物/摩尔酶/分钟(Urban等,1994)。C4H的活性可受限于NADPH的可用性,如果过表达细胞色素P450羟化酶(CPR)则这种活性可提高。如果CPR如文献所示例的那样过表达5至20倍(Mizutani等1998,Urban等,1994),则C4H反应将肉桂酸转化成香豆酸的催化转换率分别提高到125摩尔香豆酸产物/摩尔酶/分钟和530摩尔香豆酸产物/摩尔酶/分钟。
组合反应PAL-C4H-CPR的结果将取决于催化数和每种酶的存在量,特别是支持为C4H供给电子(NADPH)的CPR的量。使用天然CPR活性时,高效的PAL将给出约192摩尔肉桂酸/摩尔PAL/分钟,其后C4H酶将约25摩尔这种肉桂酸/摩尔C4H/分钟转化成香豆酸。因此,使用天然CPR活性,该组合反应PAL-C4H-CPR的主要产物将是肉桂酸(167摩尔肉桂酸/摩尔PAL酶/分钟和25摩尔香豆酸/摩尔C4H酶/分钟)。如果以高水平过表达,则越高的CPR活性将导致越高的C4H活性/摩尔C4H酶,最终导致纯的香豆酸。在Mizutani的论文(Mizutani等,1998)中,过表达仅5倍的CPR会导致125摩尔香豆酸/摩尔C4H/分钟,而从所述PAL每分钟仅产生67摩尔肉桂酸。因此,为了(不期望的)纯香豆酸产生,CPR必须至少过表达约8倍。
对于带有若干PAL/TAL和C4H的重组或天然微生物的情况,可以制备细胞提取物,并测量表观催化转换率和Km值作为表观酶PAL、TAL或C4H的总和(或总和酶)。从这些估计的整体特性中将有可能确定该生物主要产生香豆酸还是肉桂酸,并因此确定当在该生物中表达4CL和VST时结果将是哪种产物:白藜芦醇还是赤松素。在此,转换率将表示为摩尔产物/(摩尔总蛋白/时间),而不是使用纯酶时的摩尔产物/(摩尔纯酶/时间)。因此,对于PAL而言小于1:1的优选比值Km(苯丙氨酸)/Km(酪氨酸)可适用于存在多于一种PAL时的总和PAL活性,大于2的优选比值Kcat(PAL)/Kcat(C4H)可适用于存在多于一种PAL和/或C4H活性时的PAL和/或C4H总和活性(通过CPR调节)。
优选地,所述微生物不含有外源C4H,即未经遗传修饰以提供C4H酶的表达。所存在的任何C4H产生都将是该生物天然的。任选地,所述无外源C4H的微生物还可缺乏内源C4H。内源C4H的缺乏可以是由于通过遗传工程或基因沉默方法缺失了天然C4H能力,或者仅仅是因为该生物由于该酶不是其代谢的一部分而天然地缺乏C4H基因。
同时,从上文可以看出,CPR的存在对于赤松素的产生没有帮助,其过表达一般不是期望的,尽管并不禁止。因此,所述微生物优选地不具有内源性CPR、不具有外源性CPR或没有天然CPR过表达,或者降低了天然CPR的表达。
适当时,所述L-苯丙氨酸氨裂合酶通过编码所述酶的对该微生物来说非天然的核酸在所述微生物中表达。
优选地,肉桂酰辅酶A在以ATP和辅酶A为底物、ADP为产物的酶催化反应中形成,适当时,肉桂酰辅酶A在4-香豆酸辅酶A连接酶(也称为4-香豆酰辅酶A连接酶)所催化的反应中形成。已知的4-香豆酸辅酶A连接酶接受4-香豆酸或肉桂酸作为底物,并产生相应的辅酶A衍生物。通常,无论是以4-香豆酸作为底物还是以肉桂酸作为底物显示更高的活性,这些酶都称为“4-香豆酸辅酶A连接酶”。然而,我们在本文中将具有这种底物偏好性的酶称为“肉桂酸辅酶A连接酶”(或肉桂酰辅酶A连接酶)。一种这样的酶描述于例如Aneko等,2003。
所述4-香豆酸辅酶A连接酶或肉桂酸辅酶A连接酶可以是来自植物、微生物或线虫的4-香豆酸辅酶A连接酶/肉桂酸辅酶A连接酶(EC6.2.1.12)。所述植物可以是以下植物:属于冷杉属(Abies)的植物,例如百山祖冷杉(A.beshanzuensis)、日本冷杉(B.firma)、杉松(B.holophylla);属于拟南芥属(Arabidopsis)的植物,例如拟南芥(A.thaliana);属于芸苔属(Brassica)的植物,例如欧洲油菜(B.napus)、芜青(B.rapa)、甘蓝(B.oleracea);属于柑橘属(Citrus)的植物,例如甜橙(C.sinensis);属于落叶松属(Larix)的植物,例如欧洲落叶松(L.decidua)、落叶松(L.gmelinii)、西藏红杉(L.griffithiana)、喜玛拉雅红杉(L.himalaica)、日本落叶松(L.kaempferi)、北美落叶松(L.laricina)、四川红杉(L.mastersiana)、美国西部落叶松(L.occidentalis)、红杉(L.potaninii)、信件落叶松(L.sibirica)、怒江红杉(L.speciosa);属于菜豆属(Phaseolus)的植物,例如P.acutifolius、荷包豆(P.coccineus);属于松属(Pinus)的植物,例如华山松(P.armandii)、北美短叶松(P.banksiana)、海岸松(P.pinaster);属于杨属(Populus)的植物,例如小叶杨(P.balsamifera)、毛白杨(P.tomentosa)、欧洲山杨(P.tremuloides);属于茄属(Solanum)的植物,例如马铃薯(S.tuberosum);属于葡萄属(Vitus)的植物,例如葡萄(Vitusyinifera);属于玉蜀黍属(Zea)的植物,例如玉蜀黍(Z.mays);或者其他植物属,例如藿香属(Agastache)、紫穗槐属(Amorpha)、银杉属(Cathaya)、雪松属(Cedrus)、番红花属(Crocus)、羊茅属(Festuca)、大豆属(Glycine)、胡桃属(Juglans)、油杉属(Keteleeria)、紫草属(Lithospermum)、黑麦草属(Lolium)、百脉根属(Lotus)、番茄属(Lycopersicon)、苹果属(Malus)、苜蓿属(Medicago)、日中花属(Mesembryanthemum)、烟草属(Nicotiana)、长苞铁杉属(Nothotsuga)、稻属(Oryza)、天竺葵属(Pelargonium)、欧芹属(Petroselinum)、小立碗藓属(Physcomitrella)、云杉属(Picea)、李属(Prunus)、金钱松属(Pseudolarix)、黄杉属(Pseudotsuga)、玫瑰属(Rosa)、悬钩子属(Rubus)、Ryza、甘蔗属(Saccharum)、碱蓬属(Suaeda)、盐芥属(Thellungiella)、小麦属(Triticum)、铁杉属(Tsuga)。所述微生物可以是:属于曲霉属(Aspergillus)的丝状真菌,例如黄曲霉(A.flavus)、构巢曲霉(A.nidulans)、米曲霉(A.oryzae)、烟曲霉(A.fumigatus);属于脉孢霉属(Neurospora)的丝状真菌,例如粗糙脉孢霉(N.crassa);属于亚罗酵母属(Yarrowia)的真菌,例如解脂亚罗酵母(Y.lipolytics);属于球腔菌属(Mycosphaerella)的真菌,例如M.graminicola;属于分枝杆菌属(Mycobacterium)的细菌,例如牛分枝杆菌(M.bovis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis);属于奈瑟氏菌属(Neisseria)的细菌,例如脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis);属于链霉菌属(Streptomyces)的细菌,例如天蓝色链霉菌(S.coelicolor);属于红细菌属(Rhodobacter)的细菌,例如荚膜红细菌(R.capsulatus);属于钩口线虫属(Ancylostoma)的线虫,例如锡兰钩口线虫(A.ceylanicum);属于隐杆线虫属(Caenorhabditis)的线虫,例如秀丽隐杆线虫(C.elegans);属于血矛线虫属(Haemonchus)的线虫,例如捻转血矛线虫(H.contortus);属于蚯蚓属(Lumbricus)的线虫,例如L.rubellus;属于根结线虫属(Meilodogyne)的线虫,例如北方根结线虫(M.hapla);属于类圆线虫属(Strongyloidus)的线虫,例如鼠类圆线虫(S.rattii)、粪类圆线虫(S.stercoralis);属于Pristionchus属的线虫,例如P.pacificus。
尽管所述微生物可以是天然存在的,但优选向所述微生物中重组引入编码所述代谢途径中相应酶的至少一种基因序列的至少一个拷贝。
作为引入编码所述酶的编码序列的补充或替代,可以提供不在所述生物中与所述编码序列天然关联的一种或多种表达信号,例如启动子序列。因此,任选地将编码L-苯丙氨酸氨裂合酶的基因序列的至少一个拷贝与不在所述生物中与所述基因序列天然关联的表达信号有效连接。
表达信号包括位于编码序列上游(5′非编码序列)、其中或下游(3′非编码序列)的核苷酸序列,其影响相关联编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译。这样的序列可包括启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。
任选地,将编码4-香豆酸辅酶A连接酶或肉桂酸辅酶A连接酶(天然与否均可)的基因序列的至少一个拷贝与不在所述生物中与所述基因序列天然关联的表达信号有效连接。
任选地,将编码茋合酶(可以是白藜芦醇合酶)(天然与否均可)的基因序列的至少一个拷贝与不在所述生物中与所述基因序列天然关联的表达信号有效连接。
任选地,将编码赤松素合酶(天然与否均可)的基因序列的至少一个拷贝与不在所述生物中与所述基因序列天然关联的表达信号有效连接。
在一些方面中,本发明提供所述类型的经代谢改造的微生物,其具有有效的代谢途径,其中第一代谢物在第一酶所催化的反应中转化成第二代谢物,所述反应步骤产生氨;其中第二代谢物在第二酶所催化的ATP和辅酶A为底物、ADP为产物的反应中转化成第三代谢物;其中所述第三代谢物在第三酶所催化的以内源性丙二酸单酰辅酶A为底物的反应中转化成第四代谢物。
上述微生物包括这样的微生物:包含与表达信号有效连接的编码苯丙氨酸氨裂合酶的异源DNA序列的一个或多个拷贝;包含与表达信号有效连接的编码4-香豆酸辅酶A连接酶或肉桂酸辅酶A连接酶的异源DNA序列的一个或多个拷贝;以及包含与表达信号有效连接的编码茋合酶(可以是白藜芦醇合酶)的异源DNA序列的一个或多个拷贝。
或者,上述微生物包括这样的微生物:包含与表达信号有效连接的编码苯丙氨酸氨裂合酶的异源DNA序列的一个或多个拷贝;包含与表达信号有效连接的编码4-香豆酸辅酶A连接酶或肉桂酸辅酶A连接酶的异源DNA序列的一个或多个拷贝;以及包含与表达信号有效连接的编码赤松素合酶的异源DNA序列的一个或多个拷贝。
在本文中,术语“微生物”指微观生物,包括细菌;微观真菌,包括酵母。
更具体地,所述微生物可以是真菌,更具体地为属于曲霉属(Aspergillus)的丝状真菌,例如黑曲霉(A.niger)、泡盛曲霉(A.awamori)、米曲霉(A.oryzae)、构巢曲霉(A.nidulans);属于酵母属(Saccharomyces)的酵母,例如酿酒酵母(S.cerevisiae)、S.kluyveri、S.bayanus、少孢酵母(S.exiguus)、S.sevazzi、葡萄汁酵母(S.uvarum);属于克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的酵母,例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、K.marxianus var.marxianus、K.thermotolerans;属于假丝酵母属(Candida)的酵母,例如产朊假丝酵母(C.utilis)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、白色假丝酵母(C.albicans)、解脂假丝酵母(C.lipolytics)、C.versatilis;属于毕赤酵母属(Pichia)的酵母,例如树干毕赤酵母(P.stipidis)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、P.sorbitophila;或者其他酵母属,例如隐球菌属(Cryptococcus)、德巴利酵母属(Debaromyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia)、亚罗酵母属(Yarrowia)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)。就其他微生物而言,合适的丝状真菌的非穷举性列表如下:属于青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)、镰孢霉属(Fusarium)、梭孢霉属(Fusidium)、赤霉属(Gibberella)、毛霉属(Mucor)、被孢霉属(Mortierella)、木霉属(Trichoderma)的物种。
就细菌而言,合适细菌的非穷举性列表如下:属于芽孢杆菌属(Bacillus)的物种、属于埃希氏菌属(Escherichia)的物种、属于乳杆菌属(Lactobacillus)的物种、属于乳球菌属(Lactococcus)的物种、属于棒杆菌属(Corynebacterium)的物种、属于醋菌属(Acetobacter)的物种、属于不动杆菌属(Acinetobacter)的物种、属于假单胞菌属(Pseudomonas)的物种等。
本发明的优选微生物可以为酿酒酵母、黑曲霉、米曲霉、大肠杆菌、乳酸乳杆菌(L.lactis)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。
所构建和改造的微生物可使用公知方法进行培养,包括恒化器(chemostat)、分批培养、补料分批培养等。
因此,本发明包括用于产生赤松素的方法,包括使微生物细胞在基本不存在肉桂酸外部来源的情况下接触碳底物,所述细胞能在该条件下产生赤松素,其中所述微生物可选自真菌和细菌,尤其是酵母。
这样产生的赤松素可任选地分离或纯化,合适的方法包括使用正己烷进行溶剂提取,其后用100%乙醚、丙酮、甲醇和水依次提取,以及在使用正己烷/乙酸乙酯(2/1)体系的硅胶柱上进行层析纯化(Suga等1993)。
所述碳底物任选地选自由以下构成的可发酵碳底物:单糖、寡糖和多糖(例如葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、蔗糖、乳糖、赤藓糖、苏糖和/或核糖)。作为补充或替代,所述碳底物可选自非发酵碳底物,包括乙醇、乙酸、甘油和/或乳酸。作为补充或替代,所述非发酵碳底物可选自氨基酸,并可以是苯丙氨酸。
在另一个方面中,本发明包括用于通过异源表达编码苯丙氨酸氨裂合酶、4-香豆酸辅酶A连接酶和白藜芦醇合酶的核苷酸序列来产生赤松素的方法,以及通过异源表达编码苯丙氨酸氨裂合酶、4-香豆酸辅酶A连接酶和赤松素合酶的核苷酸序列来产生赤松素的方法。
赤松素(包括这样产生的赤松素)可在食品(例如乳制品或饮料如啤酒或葡萄酒)中作为营养物。因此,本发明包括含有通过微生物产生的赤松素的食品。
本发明还包括包含微生物细胞和至少1.5mg/g赤松素(基于干重)的微生物组合物。例如,可以提供含有赤松素(或这样产生的赤松素)的酵母或含有酵母或来源于酵母的制剂,以供人或动物消费,例如为干燥形式,适当时为单位经口剂型,例如含有酵母的片剂或胶囊剂,其中可含有如至少0.5g所述酵母,例如1-3g。
本文提及的任何野生型酶均可被其突变体形式替换,所述突变体形式适当时与所提及的野生型酶具有至少50%、更优选至少60%、更优选至少70%、更优选至少80%、更优选至少90%或至少95%的氨基酸同源性,而同时当然仍保留野生型的所需酶活性。这可包括保留野生型的任何底物偏好性,例如对苯丙氨酸相对于酪氨酸的偏好性,或者对肉桂酸相对于香豆酸的偏好性,或者对肉桂酰辅酶A相对于香豆酰辅酶A的偏好性。编码本文提及酶的任何野生型编码序列均可被编码相同的酶但密码子使用(codon usage)经过调整的序列替换。这对上文讨论的野生型酶及突变体形式均适用。编码野生型酶的突变体形式的核苷酸序列优选与编码相应野生型酶的野生型核苷酸序列具有至少50%、更优选至少60%、更优选至少70%、更优选至少80%、更优选至少90%或至少95%的同源性程度。
酶的突变体形式可以具有与野生型酶相比没有大改变的酶活性水平,或者可以选择成具有更高的活性水平。可以根据已知的实践进行野生型酶的保守性氨基酸替换。具有提高活性的酶可通过本领域已知的定向演化技术来开发,酶中的随机改变可通过诸如以下的方法来产生:在适当的测试生物如大肠杆菌或酿酒酵母中在编码该酶的序列中引入随机基因改变,随后表达,并通过筛选期望的特性来选择提高的突变体,或者通过施加在该条件下表达提高活性的生物将具有存活优势的自选择条件来选择。
本文中提及的不存在或基本不存在或缺乏物质(如肉桂酸)供应包括基本不存在可代谢成该物质或是该物质进一步代谢之直接产物的其衍生物,例如肉桂酸酯(包括硫酯),例如肉桂酰辅酶A。特别的,缺乏肉桂酸暗示缺乏肉桂酰辅酶A。
根据本发明产生的赤松素可以是顺式或反式赤松素,预期它们分别由顺式肉桂酸和反式肉桂酸形成。或者,可以通过包括异构化的方法由反式肉桂酸形成顺式赤松素。但预期反式形式通常是主要的。
本发明将通过以下非限制性实施例进行进一步描述和举例说明。
实施例
实施例1
分离编码PAL、4CL、RES和VST1的基因
使用表1所述引物,通过PCR从拟南芥cDNA(BioCat,Heidelberg,Germany)中分离苯丙氨酸氨裂合酶(PAL2)(Cochrane等,2004;SEQID NO:1、2)、4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL1)(Hamberger和Hahlbrock2004;Ehlting等,1999;SEQ ID NO:3、4)。在若干拟南芥同源物中选择PAL2和4CL1,因为它们分别具有有利于通向肉桂酸和肉桂酰辅酶A的动力学参数(Cochrane等,2004;Hamberger和Hahlbrock 2004;Ehlting等,1999)。
使用www.entelechon.com的在线服务反翻译工具,对夹自圆叶大黄(Rheum tataricum)的白藜芦醇合酶(RES)编码序列(Samappito等2003;SEQ ID NO:5、6)进行用于酿酒酵母表达的密码子优化,得到序列SEQ ID NO:7、8。用于装配合成基因的寡核苷酸在MWG Biotech构建,使用下述来自Martin等(2003)的稍加修改的方法操作,通过PCR装配合成基因。
*SEQ ID No11-16
将来自MWG的用于装配合成基因的引物溶于milliQ水至浓度为100pmole/μl。将每种引物5μl的等分试样与总混合物(totalmix)组合,接着用milliQ水稀释10倍。每50μl使用5μl稀释的总混合物作为模板并与融合DNA聚合酶(Finnzymes)合并,通过PCR装配所述基因。PCR程序如下:首先98℃ 30秒,接着为98℃ 10秒、40℃ 1分钟和72℃ 1分钟/1000碱基对的30个循环,最后72℃ 5分钟。对于得到的PCR反应,将20μl在1%琼脂糖凝胶上纯化。结果为PCR弥散带,从琼脂糖凝胶上切下期望大小附近的区域,使用QiaQuick凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化。最后使用表1中外部引物的PCR获得了所需的RES基因。使用Quickchange定点诱变II试剂盒(Stratagene,La Jolla,CA)校正点突变。
由GenScript Corporation(Piscataway,NJ)合成编码葡萄(Vitisvinifera)白藜芦醇合酶的VST1基因(Hain等1993)。使用该氨基酸序列(SEQ ID NO:10)作为模板来产生用于酿酒酵母表达的经密码子优化的合成基因(SEQ ID NO:9)。将合成VST1基因递送并插入大肠杆菌pUC57载体,侧翼为BamH1和Xho1限制性位点。通过BamH1/Xho1限制性处理从pUC57载体中纯化该合成基因,并使用QiaQuick凝胶提取试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶中纯化。
实施例2
构建用于表达PAL2的酵母载体
使用带有包含EcoR1和Spe1限制性位点的5’突出的正向和反向引物(表1),通过PCR再扩增如实施例1所述分离的编码PAL2的基因。用EcoR1/Spe1消化所扩增的PAL2PCR产物,并连接进经EcoR1/Spe1消化的pESC-URA载体(Stratagene),得到载体pESC-URA-PAL2。通过对两个不同克隆的测序来验证基因序列。
实施例3
构建用于表达4CL1的酵母载体
如实施例1所述分离编码4CL1的基因。用Xba1/BamH1消化所扩增的4CL1产物,并连接进经Spel/BglII消化的pESC-TRP载体(Stratagene),得到载体pESC-TRP-4CL1。对两个不同的pESC-TRP-4CL1克隆进行测序,以验证所克隆基因的序列。
实施例4
构建用于表达4CL1和RES的酵母载体
如实施例1所述分离编码RES的基因。用BamH1/Xho1消化所扩增的合成RES基因,并连接进经BamH1/Xho1消化的pESC-TRP-4CL1(实施例3)。所得到的质粒pESC-TRP-4CL1-RES含有发散的GAL1/GAL10启动子控制下的编码4CL1和RES的基因。通过对两个不同的pESC-TRP-4CL1-VST1克隆进行测序来验证编码VST1的基因序列。
实施例5
构建用于表达4CL1和VST1的酵母载体
如实施例1所述分离编码VST1的基因。将经纯化和消化的VST1基因连接进经BamH1/Xho1消化的pESC-TRP-4CL1(实施例3)。所得质粒pESC-TRP-4CL1-VST1含有发散的GAL1/GAL10控制下的编码4CL1和VST1的基因。通过对两个不同的pESC-TRP-4CL1-VST1克隆进行测序来验证编码VST1的基因序列。
实施例6
使用PAL2、4CL1和RES在酿酒酵母中表达通向赤松素的途径
分开或组合地用实施例2、3和4所述载体转化含有适当遗传标记的酵母菌株。酵母细胞的转化根据本领域已知方法进行,使用感受态细胞,或者例如通过电穿孔(参阅如Sambrook等,1989)。在缺乏尿嘧啶和/或色氨酸的培养基上选择转化体,并在相同培养基上划线纯化。
用pESC-URA-PAL2(实施例2)和pESC-TRP-4CL1-RES(实施例4)共转化酿酒酵母菌株FS01267(MATa trp1 ura3),转化菌株命名为FSSC-PAL24CL1RES。
实施例7
使用PAL2、4CL1和VST1在酿酒酵母中表达通向赤松素的途径
分开或组合地用实施例2、3和5所述载体转化含有适当遗传标记的酵母菌株。酵母细胞的转化根据本领域已知方法进行,使用感受态细胞,或者例如通过电穿孔(参阅如Sambrook等,1989)。在缺乏尿嘧啶和/或色氨酸的培养基上选择转化体,并在相同培养基上划线纯化。
用pESC-URA-PAL2(实施例2)和pESC-TRP-4CL1-VST1(实施例5)共转化酿酒酵母菌株FS01267(MATa trp1 ura3),转化菌株命名为FSSC-PAL24CL1VST1。
实施例8
在摇瓶中使用重组酵母菌株进行发酵
使用无菌接种环从琼脂平板上接种重组酵母菌株并在100ml成分确定的矿物质培养基中培养(Verduyn等,1992),该培养基中含有维生素、微量元素、5g/l葡萄糖、95g/l半乳糖。将500ml塞紧瓶塞的摇瓶在30℃和160rpm下孵育3天。
实施例9
a)提取赤松素
通过5000g离心5分钟来收获细胞。将50ml上清液等分试样使用20ml乙酸乙酯萃取一次。将乙酸乙酯冻干,将干产物重溶于0.7ml甲醇中,并过滤到HPLC管中。
将来自100ml培养基的细胞沉淀溶于2ml水中,并分到三个快速制备管中,用玻璃珠破碎。将来自这三个管的粗提物合并到50mlSartorius管中的10ml 100%甲醇中,并在4℃下在冷的暗室中在旋转室中提取48小时。48小时后,5000g离心5分钟除去细胞碎片,冻干过夜除去甲醇。将干燥的残留物重溶于0.7ml甲醇中并过滤到HPLC管中。
b)分析赤松素
HPLG
对于肉桂酸、香豆酸和赤松素的定量分析,将样品置于高效液相层析(HPLC)Agilent1100系列系统(Hewlett Packard),之后在λ=306nm处进行uv二极管阵列检测。在40℃下使用Phenomenex(Torrance,CA,USA)Luna 3微米C18(100×2.00mm)柱。使用0.4ml/分钟流速的乙腈和milliq水(均含有50ppm三氟乙酸)梯度作为流动相。梯度模式为20分钟中从15%乙腈到100%乙腈的线性梯度。洗脱时间对于反式赤松素来说约为8.8至8.9分钟。纯赤松素标准品(纯度>95%)购自ArboN ova(Turku,Finland).
LC-MS
在具有与Agilent 1100 HPLC系统(Agilent Technologies Walbron,Germany)偶联的LocksprayTM参比探头的Waters(Micromass,Manchester,UK)LCTTM飞行时间质谱仪上通过负离子电喷雾LC-MS分析样品和标准品。在0.3ml/分钟下使用水-乙腈梯度,在装有4mm×2mm ID SecurityGuardTM预制柱(Phenomenex,USA)的50mm×2mmID Luna C-18(II)柱(Phenomenex,USA)上进行分离。两种洗脱液均含有20mM甲酸。溶剂组成在20分钟中从注入时的15%乙腈变成100%乙腈,然后维持5分钟,再将梯度变回起始条件。在所有情况下,均注入3μl样品并将所述柱保持在40℃。所有化学品均为HPLC级,并溶于Milli-QTM水中。以4nm的解析度,以2个谱/秒在200-700nm处采集UV谱。
将质谱仪调成负离子电喷雾模式的最高灵敏度,对亮氨酸脑啡肽溶液为高于5500FWH的分辨率(0.5μg/ml,在含有0.5%甲酸的50%乙腈中)。所述溶液还在LocksprayTM中以15μl/分钟在负离子ESI中用作质量参比。该仪器在负离子ESI中以50%乙腈中的羧化PEG混合物校准。在两种情况下,该校准在至少25种校准离子中的残差小于2mDa。将运行条件选择成用于最低源内断裂。以0.1秒扫描间隔时间,以0.4秒/谱在100至900Da/e收集质谱。每3秒从LockmassTM探针收集参比谱,将10个参比谱平均后作为内质量校正。
使用预计代谢物的质子化或去质子化质量+/-25mDa抽取窄离子痕迹。
结果
如实施例8所述在100g/l半乳糖中培养菌株FSSC-PAL24CL1RES和FSSC-PAL24CL1VST1,并分析其赤松素含量。此外,还包括了仅含有空载体的对照菌株FSSC-对照。HPLC分析显示,菌株FSSC-PAL24CL1VST1和FSSC-PAL24CL1RES中含有与反式赤松素相同的8.8-9.0分钟驻留时间的组分(图4和5)。所述结果被LC-MS分析证实,显示菌株FSSC-PAL24CL1VST1的上清液中存在驻留时间8.2分钟的组分,其M/Z为211.0579Da/e±25mDA,事实上与阴离子模式中纯赤松素的M/Z一致(图6)。此外,UV吸收谱也与纯反式赤松素(未显示)的吸收谱相似,λmax约为306nm。
因此,结果显示酿酒酵母中存在活跃的苯基丙烷类途径,导致在体内产生反式赤松素。很可能可以通过在分批和连续培养中在良好确定的生长条件下培养菌株和/或优化各个酶的表达/活性来改进赤松素的产生。
实施例10
a)构建用于在大肠杆菌中表达PAL2的细菌载体
以下实施例中使用的质粒含有一种或多种标记基因,使得可以将带有它们的微生物从不带有它们的微生物中选择出来。选择系统是基于显性标记,例如针对氨苄青霉素和卡那霉素的抗性。此外,该质粒中含有允许表达重组基因的启动子及终止子序列。此外,该质粒中含有辅助克隆DNA片段及随后鉴定重组体的合适独特限制性位点。在本实施例中,含有氨苄青霉素抗性基因的质粒命名为pET16b(Novagen)和含有卡那霉素抗性基因的质粒命名为pET26b(Novagen)。
使用带有包含适当限制性位点的5’突出端的正向及反向引物,通过PCR从质粒pESC-URA-PAL2(实施例2)再扩增如实施例1所述分离的编码PAL2的基因。在所述基因5’和3’末端引入所述限制性位点使得可以将经限制性处理的PCR产物连接进含有T7启动子的经消化pET16B载体。所得质粒pET16B-PAL2含有T7启动子控制下的编码PAL2的基因。
b)构建用于在大肠杆菌中表达4CL1和VST1的细菌载体
使用带有包含适当限制性位点的5’突出端的正向及反向引物,通过PCR从质粒pESC-URA-4CL1-VST1(实施例5)再扩增如实施例1所述分离的编码4CL1的基因。在所述基因5’和3’末端引入所述限制性位点使得可以将经限制性处理的PCR产物连接进经消化pET26B载体。所得质粒pET26B-4CL1含有来自乳酸乳杆菌的T7启动子控制下的编码4CL1的基因。
使用带有包含适当限制性位点的5’突出端的正向及反向引物,通过PCR从质粒pESC-URA-4CL1-VST1(实施例5)再扩增如实施例1所述分离的编码VST1的基因。在所述基因5’和3’末端引入所述限制性位点使得可以将经限制性处理的PCR产物连接进经消化pET16B载体。所得质粒pET16B-VST1含有T7启动子控制下的编码VST1的基因。使用带有包含适当限制性位点的5’突出端的正向及反向引物,通过PCR从质粒pET16B-VST1作为一个片段再扩增T7启动子和编码VST1的基因。在所述DNA片段5’和3’末端引入所述限制性位点使得可以将经限制性处理的PCR产物连接进经消化的质粒pET26B-4CL1。所得质粒pET26B-4CL1-VST1含有各自在T7启动子控制下的编码4CL1和VST1的基因。通过对两个不同的pET26B-4CL1-VST1克隆进行测序验证了编码4CL1和VST1的基因的序列。
c)在大肠杆菌中表达通向赤松素的途径
分开或组合地用(a)和(b)所述载体转化大肠杆菌菌株。细菌细胞的转化根据本领域已知的方法进行,通过使用感受态细胞或者例如使用电穿孔(参阅如Sambrook等,1989)。在含有氨苄青霉素和卡那霉素的培养基中选择转化体,并在相同培养基上划线纯化。用载体pET16B-PAL2(a)转化大肠杆菌菌株BL21(DE3),得到菌株FSEC-PAL2;并用pET26B-4CL1-VST1(b)进行转化,得到菌株FSEC-4CL1VST1。此外用pET16B-PAL2(a)和pET26B-4CL1-VST1(n)共转化大肠杆菌BL21(DE3),转化菌株命名为FSEC-PAL24CL1VST1。
d)在发酵罐中使用重组大肠杆菌菌株进行发酵
所述重组酵母菌株可在以分批、补料分批或恒化培养方式运行的发酵罐中培养。在本例中,发酵在摇瓶中进行。
在含有100μg/ml氨苄青霉素和60μg/ml卡那霉素的7ml LB培养基中,以160rpm和37℃培养大肠杆菌BL21(DE3)的预培养物。使用指数生长的预培养物接种500ml振荡摇瓶中,其中含有补充了50g/l葡萄糖、5g/l K2HPO4、80μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的200ml LB培养基,将振荡摇瓶(baffled shake flask)以160rpm在37℃下孵育。5小时后,添加异丙基(β-硫代半乳糖苷)(IPTG)至终浓度1mM,作为三种基因PAL2、4CL1和VST1每一个之前的T7启动子的诱导物。以37℃孵育48小时后,收获细胞并进行提取操作,并分析所产生赤松素的存在情况。
e)提取并分析大肠杆菌中的赤松素
提取和分析使用如实施例9所述的方法进行。图9的上图和下图分别显示使用所述改造菌株和含有空质粒的对照菌株的发酵物中所提取材料进行的HPLC结果。图中标出了赤松素和肉桂酸的产生。
实施例11
a)构建用于在乳酸乳球菌中表达PAL2的细菌载体
以下实施例中使用的质粒pSH71及其衍生物是双功能穿梭载体,具有来自大肠杆菌和乳酸乳杆菌的多个复制起点。这样,宿主范围跨越了大肠杆菌和其他乳酸菌物种。在乳酸乳球菌中通常没有问题,而在其他乳酸菌物种中可能的转化困难可通过使用大肠杆菌作为构建重组质粒的中间宿主来克服。该质粒含有一个或多个标记基因,以使得可以将带有所述标记基因的微生物从不带有它们的微生物中选择出来。用于乳酸乳球菌的选择系统是基于显性标记,例如针对红霉素和氯霉素的抗性,但也已描述了基于涉及碳水化合物代谢、肽酶和食品级标记之基因的系统。此外,该质粒中含有允许表达重组基因的启动子及终止子序列。合适的启动子可取自乳酸乳球菌基因,例如lacA。此外,该质粒含有合适的独特限制性位点,以便于克隆DNA片段和其后鉴定重组体。
在下文的方法中,含有红霉素抗性基因的质粒命名为pSH71-ERYr或含有氯霉素抗性基因的质粒命名为pSH71-CMr。
使用带有包含适当限制性位点的5’突出端的正向及反向引物,通过PCR从质粒pESC-URA-PAL2(实施例2)再扩增如实施例1所述分离的编码PAL2的基因。在所述基因5’和3’末端引入所述限制性位点使得可以将经限制性处理的PCR产物连接进含有乳酸乳球菌lacA启动子的经消化pSH71-ERYr载体。所得质粒pSH71-ERYr-PAL2含有乳酸乳球菌lacA启动子控制下的编码PAL2的基因。通过对两个不同的pSH71-ERYr-PAL2克隆测序来验证编码PAL2的基因的序列。
b)构建用于在乳酸乳球菌中表达4CL1和VST1的细菌载体
使用带有包含适当限制性位点的5’突出端的正向及反向引物,通过PCR从质粒pESC-TRP-4CL1-VST1(实施例5)再扩增如实施例1所述分离的编码4CL1的基因。在所述基因5’和3’末端引入所述限制性位点使得可以将经限制性处理的PCR产物连接进经消化的pSH71-CMr载体。所得质粒pSH71-CMr-4CL1含有乳酸乳球菌lacA启动子控制下的编码4CL1的基因。使用带有包含适当限制性位点的5’突出端的正向及反向引物,通过PCR从质粒pESC-TRP-4CL1-VST1(实施例5)再扩增如实施例1所述分离的编码VST1的基因。在所述基因5’和3’末端引入所述限制性位点使得可以将经限制性处理的PCR产物连接进经消化的pSH71-ERYr载体。所得质粒pSH71-ERYr-VST1含有乳酸乳球菌lacA启动子控制下的编码VST1的基因。使用带有包含适当限制性位点的5’突出端的正向及反向引物,通过PCR从质粒pSH71-ERYr-VST1作为一个片段的lacA启动子和编码VST1的基因。在所述DNA片段的5’和3’末端引入所述限制性位点使得可以将经限制性处理的PCR产物连接进经消化的质粒pSH71-CMr-4CL1。所得质粒pSH71-CMr-4CL1-VST1含有其各自lacA启动子控制下的编码4CL1和VST1的基因。通过对两个不同pSH71-CMr-4CL1-VST1克隆测序来验证编码4CL1和VST1的基因序列。
c)在乳酸乳球菌中表达通向赤松素的途径
分别或组合地用如实施例16和17所述载体转化乳酸乳球菌菌株。细菌细胞的转化根据本领域已知的方法进行,通过使用感受态细胞或者例如使用电穿孔(参阅如Sambrook等,1989)。在含有红霉素和氯霉素的培养基中选择转化体,并在相同培养基上划线纯化。
用载体pSH71-ERYr-PAL2(实施例16)转化乳酸乳球菌菌株MG1363,得到菌株FSLL-PAL2。另外,用pSH71-ERYr-PAL2(实施例16)和pSH71-CMr-4CL1-VST1(实施例17)共转化乳酸乳球菌菌株MG1363,转化菌株命名为FSLL-PAL24CL1VST1。
d)在发酵罐中用重组乳酸乳球菌进行发酵
可以在以分批、补料分批或恒化培养方式运行的发酵罐中培养重组的乳球菌菌株。
分批及补料分批培养
在厌氧、需氧或微需氧条件下,以1.5升工作体积在带挡板的生物反应器中培养微生物。所有的培养物均在30℃以350rpm孵育。通过自动添加10M KOH维持6.6的恒定pH。在补充了以下成分以允许在需氧条件下生长的成分确定的MS10培养基中以乳糖来培养细胞:MnSO4(1.25×10-5g/l)、硫胺素(1mg/l)和DL-6,8-硫辛酸(2.5mg/l)。乳糖浓度为例如50g/l。用来自预培养物的细胞接种生物反应器,所述预培养物在30℃下在以三倍浓度K2HPO4和KH2PO4缓冲的含有上述培养基的摇瓶中培养。通过以下步骤确保厌氧条件:接种前用N2(纯度99.998%)进行灌冲,在培养过程中在生物反应器顶部空间中维持50ml/分钟的N2恒流。用于微需氧和需氧培养的生物反应器装有以空气(DOT,100%)和N2(DOT,0%)校准的极谱氧传感器。通过以1vvm的速率向生物反应器中喷入空气以确保DOT高于80%来获得需氧条件。在微需氧实验中,通过以0.25vvm的速率向生物反应器中喷入由N2和空气组成的气体混合物将DOT保持5%恒定。
恒化培养
在恒化培养中,细胞可在例如30℃和350rpm下在1L工作体积的Applikon实验发酵罐中培养。稀释速率(D)可以设置成不同的值,例如0.050h-1、0.10h-1、0.15h-1或0.20h-1。使用补充有50μl/L消泡剂的上述生长培养基,通过自动添加5M KOH使pH保持恒定,例如保持为6.6。乳糖的浓度可设置成不同值,例如3.0g/l、6.0g/l、12.0g/l、15.0g/l或18.0g/l。接种生物反应器至起始生物量浓度为1mg/l,在指数生长期结束时打开补料泵。
通过向生物反应器的顶部空间引入50ml/分钟的N2(纯度99.998%)来获得厌氧稳态。可以通过喷入250ml/分钟由不同比例的N2(纯度99.998%)及空气所组成的气体来获得不同的缺氧稳态。通过向生物反应器中喷入空气(100%DOT)和N2(0%DOT)来校准氧电极。
对于所有的条件,气体在引入生物反应器之前均除菌过滤。废气通过冷却至-8℃以下的冷凝器排出,并通过声学气体分析仪分析其CO2和O2的体积含量。
在至少5个驻留时间之后并且如果生物量及发酵终产物的浓度在最后两个驻留时间中保持不变(相对偏差小于5%),则认为培养处于稳态。
e)提取和分析乳酸乳球菌中的赤松素
使用如实施例9所述方法进行提取和分析。
实施例12
a)构建用于在曲霉属物种中表达PAL2的真菌载体
本实施例中使用的质粒来自pARp1,其含有来自构巢曲霉的AMA1复制起始序列,它还在黑曲霉和米曲霉中保持自主质粒复制(Gems等,1991)。此外,该质粒为穿梭载体,其含有大肠杆菌复制序列,因此可以使用大肠杆菌作为中间宿主来构建重组质粒,从而克服在黑曲霉和米曲霉中固有的转化困难。该质粒含有一个或多个标记基因,其允许将带有所述选择标记的微生物从不带有它们的微生物中选择出来。选择系统可基于显性标记(如针对潮霉素B、腐草霉素和博来霉素的抗性)或异源标记(如氨基酸和pyrG基因)。此外,该质粒含有允许表达重组基因的启动子及终止子序列。合适的启动子可取自构巢曲霉基因,例如alcA、glaA、amy、niaD和gpdA。此外,该质粒含有合适的独特限制性位点,以便于克隆DNA片段和其后鉴定重组体。
该质粒含有强组成型gpdA启动子和营养缺陷型标记,均来源于构巢曲霉;含有参与甲硫氨酸生物合成的基因methG的质粒命名为pAMA1-MET;含有参与组氨酸生物合成的基因hisA的质粒命名为pAMA1-HIS。
使用带有包含适当限制性位点的5’突出端的正向及反向引物,通过PCR从质粒pESC-URA-PAL2(实施例2)再扩增如实施例1所述分离的编码PAL2的基因。在所述基因5’和3’末端引入所述限制性位点使得可以将经限制性处理的PCR产物连接进经消化的pAMA1-MET载体。所得质粒pAMA1-MET-PAL2含有构巢曲霉gpdA启动子控制下的编码PAL2的基因。通过对两个不同的pAMA1-MET-PAL2克隆测序来验证编码PAL2的基因的序列。
b)构建用于在属于曲霉属的物种中表达4CL1和VST1的真菌载体
使用带有包含适当限制性位点的5’突出端的正向及反向引物,通过PCR从质粒pESC-TRP-4CL1-VST1(实施例5)再扩增如实施例1所述分离的编码4CL1的基因。在所述基因5’和3’末端引入所述限制性位点使得可以将经限制性处理的PCR产物连接进经消化的pAMA1-HIS载体,该载体含有来自构巢曲霉的gpdA启动子。所得质粒pAMA1-HIS-4CL1含有构巢曲霉gpdA启动子控制下的编码4CL1的基因。使用带有包含适当限制性位点的5’突出端的正向及反向引物,通过PCR从质粒pESC-TRP-4CL1-VST1(实施例5)再扩增如实施例1所述分离的编码VST1的基因。在所述基因5’和3’末端引入所述限制性位点使得可以将经限制性处理的PCR产物连接进经消化的pAMA1-MET载体,得到pAMA1-MET-VST1。使用带有包含适当限制性位点的5’突出端的正向及反向引物,通过PCR从质粒pAMA1-MET-VST1作为一个片段的gpdA启动子和编码VST1的基因。在所述DNA片段的5’和3’末端引入所述限制性位点使得可以将经限制性处理的PCR产物连接进经消化的质粒pAMA1-HIS-4CL1。所得质粒pAMA1-HIS-4CL1-VST1含有其各自构巢曲霉pgdA启动子控制下的编码4CL1和VST1的基因。通过对两个不同pAMA1-HIS-4CL1-VST1克隆测序来验证编码4CL1和VST1的基因序列。
c)在黑曲霉中表达通向赤松素的途径
分开或组合地用(a)和(b)所述载体转化黑曲霉菌株。真菌细胞的转化根据本领域已知的方法进行,例如通过电穿孔或者接合(参阅如Sambrook等,1989)。在缺乏甲硫氨酸和/或组氨酸的基本培养基中选择转化体。
分别用(a)pAMA1-MET-PAL2载体转化组氨酸及甲硫氨酸营养缺陷型黑曲霉,例如菌株FGSC A919(参阅http://www.fgsc.net),得到菌株FSAN-PAL2,和(b)用pAMA1-HIS-4CL1-VST1转化,得到菌株FSAN-4CL1VST1。此外,用pAMA1-MET-PAL2(a)和pAMA1-HIS-4CL1-VST1(b)共转化黑曲霉菌株FGSC A919,得到的转化菌株命名为FSAN-PAL24CL1VST1。
实施例13
在米曲霉中表达通向赤松素的途径
用载体pAMA1-MET-VST1(实施例29)转化含有编码PAL2和4CL1的一组天然基因并且是甲硫氨酸营养缺陷型的米曲霉菌株(Seshime等,2005),得到菌株FSAO-VST1。真菌细胞的转化根据本领域已知的方法进行,例如通过电穿孔或通过接合(参阅如Sambrook等,1989)。在缺少甲硫氨酸的基本培养基上选择转化体。
实施例14
在发酵罐中用重组黑曲霉和米曲霉菌株进行发酵
可以在以分批、补料分批或恒化培养方式运行的发酵罐中培养重组曲霉菌株。
分批及补料分批培养
在需氧条件下,在1.5升工作体积的带挡板生物反应器中培养微生物。所有的培养物均在30℃以500rpm孵育。通过自动添加10M KOH维持6.0的恒定pH,通过以1vvm的速率向生物反应器中喷入空气以确保DOT高于80%来获得需氧条件。在补充了以下成分以允许在分批培养下生长的成分确定的培养基中以葡萄糖来培养细胞:7.3g/l(NH4)2SO4、1.5g/l KH2PO4、1.0g/l MgSO4·7H2O、1.0g/l NaCl、0.1g/lCaCl2·2H2O、0.1ml/l Sigma消泡剂、7.2mg/l ZnSO4·7H2O、1.3mg/lCuSO4·5H2O、0.3mg/l NiCl2·6H2O、3.5mg/l MnCl2·4H2O和6.9mg/lFeSO4·7H2O。葡萄糖浓度为例如10、20、30、40或50g/l。为在补料分批培养中进行生长,在分批期中培养基由以下成分组成:7.3g/l(NH4)2SO4、4.0g/l KH2PO4、1.9g/l MgSO4·7H2O、1.3g/l NaCl、0.10g/l CaCl2·2H2O、0.1ml/l Sigma消泡剂、7.2mg/l ZnSO4·7H2O、1.3mg/lCuSO4·5H2O、0.3mg/l NiCl2·6H2O、3.5mg/l MnCl2·4H2O和6.9mg/lFeSO4·H2O。然后,向反应器中补充例如285g/kg葡萄糖和42g/kg(NH4)2SO4。
使用来自分批培养的游离菌丝体接种分批培养和补料分批培养物。使用2×109个孢子/l的孢子浓度接种pH2.5的预分批培养物(pre-batch culture)。通过在加入以下组分的29g稻米上繁殖冻干的孢子来获得孢子:6ml 15g/l蔗糖、2.3g/l(NH4)2SO4、1.0g/l KH2PO4、0.5g/l MgSO4·7H2O、0.50g/l NaCl、14.3mg/l ZnSO4·7H2O、2.5mg/CuSO4·5H2O、0.50mg/l NiCl2·6H2O和13.8mg/l FeSO4.7H2O。将孢子在30℃下繁殖7-14天,以在稻谷上获得黑色孢子层,并通过加入100ml无菌水中的0.1% Tween20进行收获。对于所有的条件,气体在导入生物反应器之前进行除菌过滤。废气通过冷却至-8℃以下的冷凝器排出,并通过声学气体分析仪分析CO2和O2的体积含量。
恒化培养
在恒化培养中,细胞可在例如30℃和500rpm下在1.5L工作体积的Biostat B实验发酵罐中培养。通过自动添加10M KOH维持6.0的恒定pH,通过以1vvm的速率向生物反应器中喷入空气以确保DOT高于80%来获得需氧条件。稀释速率(D)可以设置成不同的值,例如0.050h-1、0.10h-1、0.15h-1或0.20h-1。使用含有以下组分的基本生长培养基,通过自动添加10M KOH使pH保持恒定,例如保持为6.6:2.5g/l(NH4)2SO4、0.75g/l KH2PO4、1.0g/l MgSO4·7H2O、1.0g/l NaCl、0.1g/l CaCl2·2H2O、0.1ml/l Sigma消泡剂、7.2mg/l ZnSO4·7H2O、1.3mg/l CuSO4·5H2O、0.3mg/l NiCl2·6H2O、3.5mg/l MnCl2·4H2O和6.9mg/l FeSO4·7H2O。葡萄糖浓度可设置成不同值,例如3.0g/l、6.0g/l、12.0g/l、15.0g/l或18.0g/l。如上述用来自预分批培养物的游离菌丝体接种生物反应器,在指数生长期结束时打开补料泵。
对于所有的条件,气体在导入生物反应器之前除菌过滤。废气通过冷却至-8℃以下的冷凝器排出,并通过声学气体分析仪分析CO2和O2的体积含量。
在至少5个驻留时间之后并且如果生物量及发酵终产物的浓度在最后两个驻留时间中保持不变(相对偏差小于5%),则认为培养处于稳态。
实施例15
提取和分析黑曲霉及米曲霉中的赤松素
如实施例9所述进行提取和分析。
实施例16
在构巢曲霉AR1中产生赤松素
构巢曲霉AR1已缺失了以下基因:argB2、pyrG89、veA基因。
a)构建带有argB(鸟氨酸氨甲酰转移酶)标记的丝状真菌表达载体
使用带有分别含有EcoRI和XmaI限制性位点的5’突出端的正向引物5-CG GAATTC ATA CGC GGT TTT TTG GGG TAG TCA-3(SEQID NO:17)和反向引物5-CG CCCGGG TAT GCC ACC TAC AGC CATTGC GAA-3(SEQ ID NO:18),从构巢曲霉AR1基因组DNA中扩增包含同源启动子及终止子序列的编码argB的基因。
在PCR产物中加入的限制性位点允许插入经EcoRI和XmaI消化的pUC19(New England biolabs,Ipswich,MA.)中,得到pUC19-argB。
使用带有分别含有BamHI限制性位点和27碱基对适配体的5’突出端的正向引物5-GC GGATCC ATA GGG CGC TTA CAC AGT ACACGA-3(SEQ ID NO:19)和反向引物5-CGGAGAGGGCGCGCCCGTGGCGGCCGC GGA TCC ACT TAACGT TAC TGA-3(SEQ ID NO:20),从构巢曲霉基因组DNA中扩增trpC(吲哚-3-甘油磷酸合酶)。
使用带有分别含有27碱基对适配体和HindIII限制性位点的5’突出端的正向引物5-GCGGCCGCCACGGGCGCGCCCTCTCCGGCG GTA GTG ATG TCT GCT CAA-3(SEQ ID NO:21)和反向引物5-CG AAGCTT TAT AAT TCC CTT GTA TCT CTA CAC-3(SEQ IDNO:22),从构巢曲霉AR1基因组DNA中扩增gpdA(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)启动子。
加入了限制性位点的trpC及gpdA片段的融合PCR产物使得可以插入经BamHI和HindIII消化的pUC19-argB中,得到pAT3。b)构建用于在构巢曲霉AR1中表达C4H(肉桂酸-4-羟化酶)的带有pyrG(乳清苷-5′-单磷酸脱羧酶)标记的丝状真菌表达载体
使用带有分别含有限制性位点BssHII和NotI的5’突出端的正向引物5-CG G CGCG C ATA ATG GAC CTC CTC TTG CTG GAG-3(SEQ ID NO:23)和反向引物5-GG GC GGCC GC TTA TTA ACA GTTCCT TGG TTT CAT AAC G-3(SEQ ID NO:24),从酵母质粒pESC-URA-PAL2-C4H(WO2006089898,实施例3)中再扩增编码C4H的基因。在所述PCR产物中引入的限制性位点使得可以插入经BssHII和NotI消化的pAT3载体,得到pAT3-C4H。通过限制性酶切和测序来验证该构建体。使用以下两种限制性酶除去argB标记:BsiWI和PciI。
使用带有5’突出端的正向引物5-CGT GTAC AATA TTA AT TAACGAGA GCG AT CGC AAT AAC CGT ATT ACC GCC TTT GAG-3(SEQ ID NO:25)和反向引物5-CGA CATG TAT TCC CGG GAA GATCTC ATG GTC A-3(SEQ ID NO:26),从烟曲霉基因组DNA中再扩增编码pyrG的基因,包括同源启动子及终止子序列,所述5’突出端中包含以下限制性位点:正向引物中为BsrGI、PacI、AsiSI,反向引物中为PciI。在所述PCR产物中引入的限制性位点使得可以插入经BsiWI和PciI消化的pAT3载体,得到pAT3-C4H-pryG。通过限制性酶切和测序来验证该构建体。
c)构建用于在构巢曲霉AR1中表达4CL1(4-香豆酸辅酶A连接酶)的带有argB标记的丝状真菌表达载体
使用正向引物5-GCGGAGAGGGCGCG ATG GCG CCA CAAGAA CAA GCA-3(SEQ ID NO:27)和反向引物5-TGGATCCGCGGCCGC TCA CAA TCC ATT TGC TAG TTT TGC-3(SEQ ID NO:28),从酵母质粒pESC-TRP-4CL1-VST1中再扩增编码4CL1的基因。使用InfusionTM PCR克隆技术(Clontech,Mountain View,Calif.),将4CL1基因插入经BssHII和NotI消化的pAT3载体,得到pAT3-4CL1。通过限制性酶切和测序来验证该构建体。
d)构建用于在构巢曲霉AR1中表达VST1(白藜芦醇合酶)的带有argB标记的丝状真菌表达载体
使用带有分别含有限制性位点BssHII和NotI的5’突出端的正向引物5-CG G CGCG C ATA ATG GCA TCC GTA GAG GAG TTC-3(SEQ ID NO:29)和反向引物5-GG GC GGCC GC TTA TCA TTA GTTAGT GAC AGT TGG AA-3(SEQ ID NO:30),从酵母质粒pESC-TRP-4CL1-VST1(实施例5)中再扩增编码VST1的基因。在所述PCR产物中引入的限制性位点使得可以插入将经BssHII和NotI消化的pAT3载体,得到pAT3-VSTl。通过限制性酶切和测序来验证该构建体。e)使用C4H、4CL1和VST1在构巢曲霉AR1(该菌株具有argB2、pyrG89、veA1的缺失)中表达通向赤松素的途径
使用细胞壁裂解酶(glucanex,novozymes),根据本领域已知方法通过原生质体化(protoplastation)进行构巢曲霉AR1真菌的转化,(Tilburn等,1983)。C4H、4CL1和VST1的随机整合在两个步骤中进行。使用限制性酶BmrI将质粒pAT3-4CL1和pAT3-VST1线性化,并利用营养缺陷标记argB根据Guerra等,2006所述的共转化整合进基因组。分离含有4CL1和VST1表达盒的转化体,其后用以BmrI线性化的pAT3-C4H-pyrG进行转化,得到含有C4H、4CL1和VST1的重组构巢曲霉菌株。
f)在摇瓶中用重组构巢曲霉菌株进行发酵
在37℃下,在含有以下成分的琼脂平板中将构巢曲霉预培养物培养5天:1g/L葡萄糖、0.85g/L NaNO3、0.1g/L KC1、0.1g/LMgSO4·7H2O以及0.3g/L KH2PO4、0.00008g/L CuSO4·5H2O、0.000008g/L Na2B4O7·10H2O、0.00016g/L FeSO4·7H2O、0.00016g/LMnSO4·2H2O、0.00016g/L Na2MoO4·2H2O和0.0016g/L ZnSO4·7H2O。使用该预培养物接种含有100ml Czapek培养基(CZ)的500ml振荡摇瓶(baffled shake flask)。将摇瓶以150rpm和30℃孵育,培养基的起始pH为6.2。孵育24小时后,取样品并进行提取操作(见下文),并分析所产生赤松素的存在情况。
g)从构巢曲霉摇瓶培养物中提取赤松素
从摇瓶中抽出由100ml培养物(细胞和培养液)组成的样品。代谢物的提取如下进行:将样品转移至两个50ml Sartorius管中,并以4500rpm离心10分钟。将上清液转移进烧杯,生物质分成八个等分试样,其被转移到含有约300μl玻璃珠(0.25-0.50mm)的2ml Sarstedt带盖小管中。将管插入Fastprep 120(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA.),以6.5级进行四个循环,每次30秒,循环之间保持在冰上。破碎的细胞被分装到2个15毫升Sartorius管中。向管中装入10ml上清液并加入3ml乙酸乙酯。用涡旋混合器将管剧烈混合2分钟,并置于冰上5分钟。接着通过4500rpm离心10分钟将乙酸乙酯相与水相分离,并收集乙酸乙酯相到四个1.5ml Eppendorf管中。接着将乙酸乙酯冻干45分钟,将干燥的样品重溶于0.3ml 50%甲醇中用于进一步的HPLC分析,如实施例9b所述
h)重组构巢曲霉的摇瓶结果
图7显示了来自典型摇瓶实验的HPLC层析图。上图显示来自产生赤松素的改造菌株的结果,下图显示来自亲本野生型对照菌株的结果。改造菌株的赤松素产生水平为1.0至2.0mg/l不等。对照菌株未显示任何赤松素形成。
通过与纯标准品的UV层析图进行比较,通过二极管阵列UV谱进一步证实赤松素峰的身份(图8)
实施例17
测定PALCPR连续培养物中茋类化合物的细胞内及细胞外水平
在1升工作体积的限碳连续培养物中培养过表达CPR的酵母菌株FSSC-PAL2C4H4CL2VST1-pADH1CPR1。对该培养物补充含有以下成分的Verduyn等(1992)所述成分限定的培养基:5.0g/L(NH4)2SO4;3.0g/L KH2PO4;0.5g/L MgSO4·7H2O;微量金属及维生素以及作为生长限制营养素的5g/l葡萄糖和35g/l半乳糖。加入消泡剂(300μl/L,SigmaA-8436)以避免形成泡沫。将碳源与矿物质培养基分别高压灭菌,其后加入发酵罐中。此外,在培养基高压灭菌并冷却之后通过除菌过滤将维生素和微量金属加入发酵罐中。发酵罐系统来自Sartorius BBI系统,由1升工作体积的带有Biostat B Plus控制器的带挡板的3升反应器组成,其装有两个以1000rpm旋转的Rushton涡轮,温度保持在30±1℃,通过自动添加2M KOH将pH保持在5.5±0.2。通过质量流控制器来控制气流,并设置成1.5vvm(1.5l/分钟)。废气通过冷却的冷凝器导出,并分析O2及CO2(Model 1308,Innova,Denmark)。通过用10ml指数生长的摇瓶培养物(含有5g/l葡萄糖和35g/l半乳糖)接种培养物来起始含有35g/l半乳糖的最初分批培养物。通过向反应器中连续补充相同培养基而将分批培养转换成连续模式。基于恒定水平来控制稀释速率,目标为D=0.050h-1。当稀释速率和废气信号在至少五个驻留时间中保持不变,并且以一个驻留时间为间隔的两个连续样品中代谢物浓度的偏差低于3%,则认为连续培养处于稳态。连续监测的溶解氧浓度保持在高于60%空气饱和度。在所述条件下,菌株消耗了所有的半乳糖,主要产生生物量和CO2以及仅少量的乙醇。此外,RQ近似均一,表明代谢主要为呼吸模式。
对于茋类化合物(stilbenoids)的测定,在约300小时发酵(对应于15个驻留时间)时取样。通过5000g离心5分钟来收获细胞。对于茋类化合物细胞外水平的测定,将上清液的25ml等分试样用10ml乙酸乙酯提取一次。将乙酸乙酯冻干,并将干燥产物重溶于0.6ml甲醇中。将样品在水中50倍稀释,转移到HPLC管中,并通过HPLC进行分析。此外,为了评估所产生的茋类化合物水平是否超出了培养基的溶解度,或者是否与细胞膜结合,将细胞培养物(因此包括细胞和培养基)的1ml等分试样与1ml 100%乙醇混合,剧烈混合,然后离心。接着将上清液转移至HPLC管,直接分析茋类化合物含量。对于茋类化合物细胞内水平的测定,取50ml培养物等分试样,通过离心分离细胞和培养基。用50ml水洗涤沉淀,以除去与细胞结合或包在沉淀中的任何茋类化合物,沉淀再次离心后溶于1ml水中。将所得的细胞悬液分配到提取管中,并使用fast-prep机器用玻璃珠破碎。将粗提物合并到10ml100%甲醇中,在4℃下在冷的暗室中在旋转腔中提取24小时。其后,5000g离心5分钟除去细胞碎片,冻干过夜除去残余的甲醇。将干燥残余物重溶于0.4ml甲醇和0.1ml水中。将样品在水中50倍稀释,接着转移进HPLC管中,并通过HPLC进行分析。
下表总结了连续培养300小时后的结果:
| 细胞内赤松素(a) | 细胞外赤松素(b) | 乙醇中的细胞外赤松素(c) | 总计赤松素(a+c) |
mg/l | 16.45 | 12.55 | 113.57 | 130.02 |
总量% | 12.65 | 9.65 | 87.35 | 100.00 |
mg/g干重 | 1.83 | | | |
根据以下章节中解释的计算,茋类化合物的胞内水平表达为mg/g生物量(干重)。提取物中赤松素的浓度测定为1646mg/l,该提取物的体积为0.5ml,因此所提取赤松素的绝对量分别为0.5×1646/1000=0.8230mg。所述茋类化合物提取自50ml培养物等分试样,因此以每升培养物表示的赤松素胞内浓度为0.8230×(1000/50)=16.46mg/l。所述培养物的生物量浓度为9g/l。因此,以每克干重表示的胞内赤松素水平为16.46/9=1.83mg/g干重。
实施例18
克隆产油酵母(oleaginous yeast)解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)中的反式赤松素途径
a)分离基因
将PAL(苯丙氨酸氨裂合酶)、CL(肉桂酰辅酶A连接酶)和VST1基因(其中基因定义为编码蛋白质的序列)作为合成基因(GenScriptCorporation,Piscataway,NJ)产生,其经密码子优化用于在解脂亚罗酵母中表达。解脂亚罗酵母中密码子使用的确定先前已有描述(WO2006125000)。还可通过PCR从拟南芥cDNA(Stratagene)中分离PAL和4CL基因。肉桂酰辅酶A连接酶CL可以是任何接受肉桂酸为底物的羟基肉桂酰辅酶A连接酶。例如来自拟南芥的由4CL1和4CL2基因编码的4-香豆酰辅酶A连接酶接受肉桂酸,尽管优选底物为4-羟基肉桂酸(香豆酸)(Hamberger和Hahlbrock,2004;Costa等,2005)。更特别地,所述CL是经密码子优化的对肉桂酸为底物具有特异性的连接酶,例如来自天蓝色链霉菌的肉桂酸辅酶A连接酶(Kaneko等,2003)。类似地,VST1基因可以是接受肉桂酰辅酶A为底物的任何经密码子优化或未经密码子优化的茋合酶,尽管茋合酶的优选底物通常为4-香豆酰辅酶A,产生白藜芦醇,故称为白藜芦醇合酶。这类双底物接受性是来自葡萄的VST1基因(SEQ ID NO:9)的本性。更特别地,使用对肉桂酰辅酶A作为底物具有特异性的来自松科的茋合酶(Schanz等,1992;Koda等,2002)。
b)启动子和终止子的分离
可用于在解脂亚罗酵母中表达异源基因的启动子例如但不仅限于以下启动子:长链酰基辅酶A氧化酶POX2、hp4d、异柠檬酸裂合酶ICL1、细胞外碱性蛋白酶XPR2、翻译延伸因子TEF、核糖体蛋白S7RPS7、甘油醛-3-磷酸脱氢酶GPD、YAT1、GPAT、FBA1和FBAIN的启动子(Müller等,1998:WO2006055322;WO2006125000)。
可用于在解脂亚罗酵母中表达异源基因的终止子例如但不仅限于以下终止子:XPR2、LIP2、PEX20和SQS终止子(Merkulov等,2000;WO2006055322;WO2006125000)。
通过PCR从解脂亚罗酵母基因组DNA中分离终止子和启动子DNA片段,所述基因组DNA分离自解脂亚罗酵母的完整细胞,例如来自美国典型培养物保藏中心的细胞,例如ATCC16618、ATCC18943和ATCC18944、ATCC90811、ATCC90812和ATCC90903。
c)产生表达盒
产生表达盒是指装配由以下组成的线性双链DNA片段:与异源基因的蛋白质编码序列融合的启动子(组成型或诱导型)以及终止子,即5′-启动子::基因::终止子-3′DNA片段。
表达盒可通过不同基因片段、启动子、基因编码序列和终止片段的融合PCR的组合来产生。例如,可使用PCR技术将PAL基因与XPR2启动子融合,可将所得的XPR2::PAL片段通过第二个PCR反应与终止子融合,产生表达盒XPR2::PAL::终止子。
产生表达盒的另一种方法是将异源基因(如PAL)的蛋白质编码序列克隆进已有的表达载体中,例如但不仅限于ATCC载体69355TM。该ATCC载体已经具有了启动子(XPR2)和终止子区以及启动子及终止子之间具有独特限制性位点的多克隆位点(MCS),用于通过标准分子生物学工具引入异源基因。如果靶载体在启动子与终止子区之间的限制性位点数有限,则可以使用Infusion克隆试剂盒技术(Clontech,CA,USA),因为它仅需要载体中的一个限制性位点来进行基因插入。通过将基因插入载体中启动子与终止子之间,表达盒启动子::基因::终止子在环状载体内部产生,而不是作为单个双链DNA片段产生。如果需要线性DNA表达盒片段,则可使用PCR从表达载体中扩增表达盒。本领域技术人员会认识到,可以向同一质粒或载体中引入多个表达盒,产生表达盒簇,优选用来自完整代谢途径的基因来进行,例如赤松素产生途径(PAL、CL和VST1基因)。赤松素产生所需的这三种基因(PAL、CL和VST1基因)的表达盒簇定义为赤松素途径表达簇。
d)在解脂亚罗酵母中插入异源基因PAL、CL和VST1以用于产生赤松素
将赤松素途径基因(PAL、CL、VST1)装配成带有启动子和终止子的表达盒启动子::基因::终止子。对于不同基因PAL、CL和VST1而言,所述启动子和终止子可以是相同的,或是不同启动子与终止子的组合。本领域技术人员会认识到可用于在解脂亚罗酵母中引入和表达赤松素途径表达簇(包括含有基因PAL、CL和VST1的表达盒)所需的克隆技术、克隆载体或克隆工具,因为这些工具已经描述于若干出版物(LeDAll等,1994;Pignede等,2000;Juretzek等,2001;Madzak等,2004)和专利申请(WO2006055322;WO2006125000)中。
总之,一旦获得了适于在解脂亚罗酵母中表达赤松素途径(PAL、CL和VST1)的表达盒,就可将其(i)置于能在宿主细胞中自主复制的质粒载体中,或者(ii)直接整合进宿主细胞基因组,或者其组合,以在解脂亚罗酵母宿主中建立赤松素途径表达簇。可将表达盒设计成随机整合进宿主基因组,或者可以靶向至特定位置。在两种情况下,都将表达盒进一步构建成在该表达盒两侧都含有与宿主基因组同源的周围区。同源性区域可以为足以与宿主基因座靶向重组的20至1000个碱基对。可将单个拷贝靶向至基因组中不会导致缺失必要基因的任何部分。当期望高水平基因表达时,在解脂亚罗酵母基因组中多个位置进行插入可能特别有用,用于插入表达盒的多个拷贝的靶标例如但不仅限于核糖体DNA序列(rDNA)或反转录转座子样元件(TY1元件)(Pignede等,2000)。当向解脂亚罗酵母基因组的随机位置插入表达盒的多个拷贝时,实际上表达盒启动子-基因-终止子可以更短,仅包括启动子-基因,因为整合将使得解脂亚罗酵母基因组中已有的终止子作为该表达盒的终止子。
还可以将包含表达盒的质粒DNA整合进其他位点,以达到期望的表达盒拷贝数,例如但不仅限于URA3基因座(登记号AJ306421)和LEU2基因座(登记号AF260230)。LEU2整合载体例如但不仅限于ATCC载体69355TM。这种含有表达盒的表达载体可直接用于转化亮氨酸营养缺陷型解脂亚罗酵母,以选择含有解脂亚罗酵母LEU2标记基因的表达载体。还可以通过PCR技术从表达载体中扩增表达盒,以进一步用于构建含有适当的抗生素选择标记或生物合成氨基酸标记的其他表达载体。
URA3整合位点可以与5-氟乳清酸(5-fluoro orotic acid,5-FOA)选择一起重复使用。具体而言,在解脂亚罗酵母宿主中缺失天然URA3基因,以产生具有URA-营养缺陷型表型的菌株,其中基于5-FOA抗性进行选择。当URA3存在时,5-FOA被URA3基因所编码的乳清酸-5′-磷酸脱羧酶降解成有毒化合物5-氟尿嘧啶,仅有缺乏URA3基因的细胞将具有抗性。因此,可以在多个轮次中将多个表达盒和新URA3基因的簇插入解脂亚罗酵母基因组的多个基因座,从而产生具有URA+原养型表型的新菌株。当所引入的URA3基因自主缺失(称为环出(loop-out)或跳出(pop-out))时,再使用5-FOA选择进行的后续整合产生新的URA3-营养缺陷型菌株。因此,URA3基因与5-FOA选择的组合可在多轮遗传修饰及表达盒整合中用作选择标记。
e)转化解脂亚罗酵母
可以使用标准转化技术(Chen等,1997;WO2006125000)将包含表达盒的外源DNA、自主复制载体或DNA片段引入解脂亚罗酵母宿主,例如诸如ATCC90811、ATCC90812和ATCC90903的细胞。用于在解脂亚罗酵母中维持所引入外源DNA的选择方法可基于氨基酸标记(Fickers等,2003)或抗生素标记(Cordero等,1996)。
实施例19
(a)用重组大肠杆菌菌株进行分批培养
在需氧条件下,将重组大肠杆菌FSEC-PAL24CL1VST1和BL21(DE3)(对照菌株)培养在1.5升工作体积的带挡板生物反应器中。以30℃、800rpm孵育培养物。通过自动添加2N KOH保持恒定的pH7。通过以1vvm的速率向生物反应器中喷入空气以确保溶解氧密度(dissolved oxygen density,DOT)高于60%来获得需氧条件。在引入生物反应器之前将空气进行除菌过滤。将废气通过冷却至6℃以下的冷凝器排出,并通过声学气体分析仪分析其CO2和O2体积含量。该生物反应器装有以空气(DOT,100%)和N2(DOT,0%)校准的极谱氧传感器。
在分批培养中,在含有用以允许生长的以下组分的半确定培养基中用甘油培养细胞:6.0g/l酵母提取物、27.2g/l Na2HPO4(无水)、12.0g/l KH2PO4、2.0g/l NaCl和4.0g/l NH4Cl。甘油浓度为20g/l。在培养基中补充50mg/l氨苄青霉素和50mg/l卡那霉素。加入消泡剂至终浓度为50μl/l。
用重组菌株的1ml甘油储存培养物接种生物反应器,使600nm的最终吸光度约为0.03。通过在30℃和150rpm下在摇瓶中以半确定培养基培养细胞来获得甘油储存培养物。培养基的组成与上述培养基相同,但重新调整成四分之一,即5g/l甘油、1.5g/l酵母提取物、6.8g/lNa2HPO4(无水)、3.0g/l KH2PO4、0.5g/l NaCl和1.0g/l NH4Cl。在培养基中补充50mg/l氨苄青霉素和50mg/l卡那霉素。在指数生长后期收获细胞,通过离心进行收集并重悬于适当体积的15%(重量/体积)无菌甘油溶液中,例如600nm处的最终吸光度为30。将1ml悬浮细胞的等分试样保存于-80℃。
当细胞开始在生物反应器中生长之后(接种后5.5小时),添加异丙基(β-硫代半乳糖苷)(IPTG)至终浓度为1mM,作为三种基因PAL2、4CL1和VST1中每一个之前的T7启动子的诱导物。
在分批培养过程中收集细胞培养液样品并分析其赤松素存在情况。此外,分析样品的生物量(以吸光度OD600进行分析)、碳源(甘油)和主要副产物(乙醇、乙酸、丙酮酸、琥珀酸)。
(b)提取大肠杆菌中的赤松素
用乙酸乙酯提取细胞内的赤松素。为此,将4mL乙酸乙酯加入8mL细胞培养液中。通过混合(30秒)和通过离心(4500rpm5分钟,4℃)进行相分离来加强提取。将乙酸乙酯相冻干(约2小时),将干燥产物重溶于0.5ml甲醇中,并通过HPLC进行分析。然后将这些样品在水中稀释(1:5)并通过HPLC进行分析。
(c)分析赤松素
使用如实施例9b所述方法对来自分批培养的样品进行赤松素分析。之前,样品进行以下平行进行的样品分离操作:(i)离心细胞培养液(5分钟)并分析上清液;(ii)添加乙醇(99.9%)至终浓度50%(体积/体积)、振荡(30秒)、离心(5分钟)并分析上清液;(iii)根据上述(b)用乙酸乙酯提取,并分析重溶于甲醇的干燥样品。
结果
如上文(a)所述,在分批模式的生物反应器中以20g/L甘油培养如实施例10c所述的重组大肠杆菌菌株FSEC-PAL24CL1VST1和BL21(DE3)(对照菌株)。在培养过程中,根据上文(a)分析重组菌株的赤松素含量。
HPLC分析显示,菌株FSEC-PAL24CL1VST1含有驻留时间与反式赤松素标准品相同的组分(图4和5)。此外,UV吸收谱也与纯反式赤松素(未显示)的相似,λmax约为306nm。
下表中显示了所检测赤松素的最高浓度:
| 胞内赤松素 | 胞外赤松素 | 乙醇中的胞外赤松素 | 总赤松素 |
| (a) | (b) | 乙醇中(c) | (a)+(c) |
mg/l | 0.016 | (*) | (*) | 0.016 |
总量% | 100 | 0 | 0 | 100 |
mg/g干重 | (**) | (**) | (**) | (**) |
(*)检出水平以下。(**)未检测
来自对照菌株分批培养的样品中未检测到赤松素。
因此,该结果证明,在分批模式生物反应器中培养的大肠杆菌中存在活跃的苯基丙烷类途径,导致在体内产生反式赤松素。
实施例20
(a)用重组构巢曲霉菌株进行分批培养
在需氧条件下,将含有C4H、4CL1和VST1的重组构巢曲霉菌株培养在1.5升工作体积的带挡板生物反应器中。以30℃、700rpm孵育培养物。通过自动添加2N KOH保持恒定的pH6。通过以1vvm的速率向生物反应器中喷入空气以确保溶解氧密度(dissolved oxygendensity,DOT)高于60%来获得需氧条件。在引入生物反应器之前将空气进行除菌过滤。将废气通过冷却至6℃以下的冷凝器排出,并通过声学气体分析仪分析其CO2和O2体积含量。该生物反应器装有以空气(DOT,100%)和N2(DOT,0%)校准的极谱氧传感器。在由以下组分组成的成分确定的培养基中以蔗糖培养细胞:3.0g/l NaNO3、1.0g/lKH2PO4、0.5g/l KC1、0.5g/l MgSO4·7H2O、0.5/lg FeSO4·7H2O。蔗糖浓度为30g/l。加入消泡剂至终浓度为50μl/l。
以含有C4H、4CL1和VST1的构巢曲霉菌株的孢子接种生物反应器,所述孢子之前在具有以下组成的固体基本培养基上繁殖:1g/L葡萄糖、0.85g/L NaNO3、0.1g/L KCl、0.1g/L MgSO4·7H2O以及0.3g/LKH2PO4、0.00008g/L CuSO4·5H2O、0.000008g/L Na2B4O7·10H2O、0.00016g/L FeSO4·7H2O、0.00016g/L MnSO4·2H2O、0.00016g/LNa2MoO4·2H2O和0.0016g/L ZnSO4·7H2O。将孢子以37℃培养5天,然后加入Tween 80%溶液(0.25%(总量/体积))进行收获。
(b)提取构巢曲霉中的赤松素
通过匀浆(在Polytron组织匀浆机中)破碎细胞,用10ml乙酸乙酯提取细胞内赤松素。通过在旋转混合仪中混合(约15分钟)和通过离心进行相分离(4500rpm,4℃,5分钟)来加强萃取。将乙酸酯相冻干(约2小时),将干燥产物重溶于0.5ml甲醇中并通过HPLC进行分析。
(c)分析赤松素
使用如实施例9b所述的方法对来自分批培养的样品进行赤松素分析
结果
根据实施例HD4,在分批模式的生物反应器中以30g/L蔗糖培养如实施例16e所述的含有C4H、4CL1和VST1的重组构巢曲霉菌株。培养约48小时之后,从生物反应器中收获细胞,通过匀浆进行破坏并根据上文(b)和(c)分析其赤松素细胞内含量。
HPLC分析显示,含有C4H、4CL1和VST1的构巢曲霉菌株在胞内显示驻留时间与反式赤松素标准品相同的组分(图4和5)。此外,UV吸收谱也与纯反式赤松素(未显示)的吸收谱相似,λmax约为306nm。
因此,所述结果证明,在分批模式生物反应器中培养的构巢曲霉中存在活跃的苯基丙烷类途径,导致在体内产生反式赤松素。
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以下为本文中出现的核苷酸及氨基酸序列总结:
SEQ ID NO:1为来自拟南芥的编码苯丙氨酸氨裂合酶(PAL2)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:2为SEQ ID NO:1所编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3为来自拟南芥的编码4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL1)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:4为SEQ ID NO:3所编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5为来自圆叶大黄的编码白藜芦醇合酶(RES)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:6为SEQ ID NO:5所编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7为来自圆叶大黄的白藜芦醇合酶(RES)核苷酸序列,其针对在酿酒酵母中表达而进行了密码子优化。
SEQ ID NO:8为SEQ ID NO:7所编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9为来自葡萄的编码白藜芦醇合酶(VST1)的核苷酸序列,其针对在酿酒酵母中表达而进行了密码子优化。
SEQ ID NO:10为SEQ ID NO:9所编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11-16为实施例1中表1中的引物序列。
SEQ ID NO:17-22为实施例16a中使用的引物序列。
SEQ ID NO:23-26为实施例16b中使用的引物序列。
SEQ ID NO:27-30为实施例16c中使用的引物序列。