JP2009543572A - ピノシルビンを生産するための代謝改変細胞 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図3
Description
後者のルートにおいて、トランス−ケイヒ酸は、ピノシルビンシンターゼ(PST)は、続いて、マロニルCoAを有するシンナモイル−CoAのフェニルプロパン単位の凝縮を触媒する4CLの反応によって、直接的にシンナモイル−CoAへ活性化させることができる。
PDSTS3の独特な特徴は、フレームシフトによる突然変異によってもたらされたスチルベンシンターゼに通常共通するC−ターミナル伸長の欠如とみなすことができる。さらに、別の研究では、遺伝子のDNAライブラリーは、プローブとしてピノシルビンシンターゼcDNA pSP−54と選別された(Muller et al.1999)。サブ・クローニング後、4つの異なるメンバーは、配列によって特徴づけられた。遺伝子PST−1、PST−2、PST−3、及びPST−5に由来すると推定されるアミノ酸配列は、概して95%を超えて一致した。
そのデータは、マツにおいて、PST−1の遺伝子生産物は、苗木中のストレス反応と、心材中のピノシルビン形成体の両方に関与することを指し示す。
先の誤解は、基質選択における細菌因子の影響によって、及び大腸菌で発現された植物特有のタンパク質の活性によってもたらされた。発現システムの改良後、次の速度論分析は、フェニルプロピオニル−CoAよりもむしろシンナモイル−CoAの方が、クローン化されたスチルベンシンターゼの好ましい基質であることを明らかにした。さらに、P.sylvestris由来の抽出物は、基質選択に選択的に影響を与えた。例えば、活性はフェニルプロピオニル−CoAで低下したが、シンナモイルCoAでは低下しなかった。このことは、植物抽出物と、大腸菌で発現したクローン化された酵素との明らかな違い、自然界に起因する警告を説明し、新しいホストは、クローン化された配列の機能的同定を複雑にさせるだろう。
より高いCPR活性は、高いレベルで過剰発現した場合、C4H酵素のmoleあたりのより多くのC4Hに導き、最終的に純粋なクマル酸に導くだろう。ミズタニの論文(Mizutani et al.1998)で5倍だけ過剰発現したCPRは、125molesクマル酸/moleC4H/分をもたらし、唯一の67molesケイヒ酸は、1分あたりPALからもたらされるだろう。それゆえ、CPRは、純粋なクマル酸に対して約8倍(望ましくない)少なくとも過剰発現するに違いない。
しかしながら、我々は、ここで、選好する基質を有する酵素を、シンナメート−CoAリガーゼ’酵素(あるいは、シンナモイル−CoAリガーゼ)とよぶ。そのような酵素の1つは、例えばAneko et al.2003に記述されている。
微生物は、アスペルギルス属(Aspergillus)に属する糸状菌、例えばA.flavus、A.nidulans、A.oryzae、A.fumigatus、アカパンカビ属(Neurospora)に属する糸状菌、例えばN.crassa、ヤロウイア属(Yarrowia)に属する真菌、例えばY.lipolytica、Mycosphaerella属に属する真菌、例えばM.graminicola、マイコバクテリウム属(Mycobacterium)に属する細菌、例えばM.bovis、M.leprae、M.tuberculosis、ナイセリア属(Neisseria)に属する細菌、例えばN.meningitidis、ストレプトマイセス属(Streptomyces)に属する細菌、例えばS.coelicolor、ロドバクター属(Rhodobacter)に属する細菌、例えばR.capsulatus、アンシロストーマ属(Ancylostoma)に属する線虫、例えばA.ceylanicum、カエノルハブディティス属(Caenorhabditis)に属する線虫、例えばC.elegans、ヘモンクス属(Haemonchus)に属する線虫、例えばH.contorus、Lumbricus属に属する線虫、例えばL.rubellus、Meilodogyne属に属する線虫、例えばM.hapla、Strongyloidus属に属する線虫、例えばS.rattii、S.stercoralis、Pristionchus属に属する線虫、例えばP.pacificusであってもよい。
本発明の上記説明の容易な理解を助けるために、添付の図面を参照されたい。
(実施例1)
PAL、4CL、RES、及びVST1をコードする遺伝子の単離
フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL2)(コクレンら(Cochrane et al.)、2004年;配列番号1、配列番号2)、4−クマレート:コエンザイムAリガーゼ(4CL1)(ハンバーガー及びハルブロック((Hamberger and Hahlbrock)、2004年;エルチングら(Ehlting et al.)、1999年;配列番号3、配列番号4)を、PCRにより、表1のプライマーを用いて、シロイヌナズナ(A.thaliana)のcDNA(バイオキャット社(BioCat)、ハイデルベルグ、ドイツ)から単離した。
ケイヒ酸とシンナモイル−CoAのそれぞれに対する好ましい速度パラメーターのために、幾つかのシロイヌナズナ相同体(A.thaliana homologues)のうち、PAL2と4CL1を選択した(コクレンら(Cochrane et al.)、2004年;ハンバーガー及びハルブロック((Hamberger and Hahlbrock)、2004年;エルチングら(Ehlting et al.),1999年)。
合成遺伝子組立てのためのオリゴ(Oligos)は、MWGバイオテック社(MWG Biotech)で構築され、合成遺伝子は、以下に述べるマーチンら(Martin et al.)(2003年)の若干改良された方法プロトコールを用いて、PCRにより組み立てられた。
PCRプログラムは以下の通りである。
最初に98℃で30秒間、次に、1000塩基対あたり、98℃で10秒間、40℃で1分間及び72℃で1分間の30サイクル、及び最後に72℃で5分間とした。得られたPCR反応物から、20μlを1%アガロースゲルで精製した。その結果はPCRスメアであり、欲する大きさの周囲の領域をアガロースゲルから切り取り、QiaQuick Gel Extraction Kit(キアゲン社(Qiagen))を用いて精製した。
表1の外側のプライマーによる最終的なPCRは、要求されたRES遺伝子を与えた。Quickchange部位特異的変異誘発IIキット(ストラタジン社(Stratagene)、ラホーヤ、カリフォルニア州)を用いて点突然変異を補正した。
リスベラトロールシンターゼ(Hain et al.,1993)を,GenScript Corporation(Piscataway,NJ)により合成した。アミノ酸配列(配列番号10)を、S.セレヴィシエ(S.cerevisiae)(配列番号9)での発現のために最適化された合成遺伝子コドンを産出するために鋳型として用いた。合成VST1遺伝子を、BamH1とXho1の制限部位によって側面に位置する大腸菌pUC57を供給し、挿入した。合成遺伝子を、BamH1/Xho1制限によるpUC57ベクターで精製し、且つ、QiaQuick Gel Extraction Kit(キアゲン社(Qiagen))を用いてアガロースゲルで精製した。
PAL2発現用の酵母ベクターの構築
実施例1に記載のように単離されたPAL2をコードする遺伝子を、EcoR1とSpe1の制限部位(表1)を含む5'突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いるPCRにより再増幅した。増幅されたPAL2 PCR産物をEcoR1/Spe1により消化し、消化されたpESC−URAベクター(ストラタジン社(Stratagene))をEcoR1/Spe1に連結して、ベクターpESC−URA−PAL2を得た。
遺伝子の配列は、2つの異なるクローンの配列決定により検証した。
4CL1発現用酵母ベクターの構築
4CL1をコードする遺伝子を実施例1に記載のように単離した。増幅された4CL1 PCR産物をXba1/BamH1により消化し、Spe1/BglIIで消化されたpESC−TRPベクター(ストラタジン社(Stratagene))に連結して、ベクターpESC−TRP−4CL1を得た。pESC−TRP−4CL1の2つの異なるクローンの配列を決定して、クローニングされた遺伝子の配列を検証した。
4CL1及びRES発現用の酵母ベクターの構築
RESをコードする遺伝子を実施例1に記載のように単離した。増幅された合成RES遺伝子をBamH1/Xho1により消化し、BamH1/Xho1で消化されたpESC−TRP−4CL1(実施例3)に連結した。
得られたプラスミドpESC−TRP−4CL1−RESは、分岐GAL1/GAL10プロモーターの制御下に4CL1とRESをコードする遺伝子を含んでいた。VST1をコードする遺伝子の配列はpESC−TRP−4CL1−VST1の2つの異なるクローンの配列決定により検証した。
4CL1及びVST1発現用の酵母ベクターの構築
VST1をコードする遺伝子を実施例1に記載のように単離した。精製され且つ消化されたVST1遺伝子を、BamH1/Xho1で消化されたpESC−TRP−4CL(実施例4)に連結した。得られたプラスミドpESC−TRP−4CL1−VST1は、分岐GAL1/GAL10プロモーターの制御下に4CL1とVST1をコードする遺伝子を含んでいた。VST1をコードする遺伝子の配列はpESC−TRP−4CL1−VST1の2つの異なるクローンの配列決定により検証した。
酵母S.セレヴィシエにおいてPAL2、4CL1、及びRESを用いてリスベラトロールを導く経路の発現
適当な遺伝子マーカーを含む酵母菌株を実施例2、実施例3、及び実施例4で記載したベクターにより別々に、又は組合せて形質転換した。酵母細胞の形質転換は、当分野で公知の方法にしたがって、コンピテント細胞、又はその代わりになるものとして例えば電気穿孔法を用いて実施した(例えば、サムブルックら(Sambrook et al.)、1989年を参照)。形質転換体は、ウラシル及び/又はトリプトファンを欠如する培地上で選択し、画線を同培地上で精製した。
S.セレヴィシエ菌株FS01267(MATa trp1 ura3)を、pESC−URA−PAL2(実施例2)、及びpESC−TRP−4CL1−RES(実施例4)により同時形質転換し、形質転換された菌株をFSSC−PAL24CL1RESと命名した。
酵母S.セレヴィシエにおいてPAL2、4CL1、及びVST1を用いてピノシルビンを導く経路の発現
適当な遺伝子マーカーを含む酵母菌株を実施例2、実施例3、及び実施例5で記載したベクターにより別々に、又は組合せて形質転換した。酵母細胞の形質転換は、当分野で公知の方法にしたがって、例えば、コンピテント細胞又は電気穿孔法を用いて実施した(例えば、サムブルックら(Sambrook et al.)、1989年を参照)。形質転換体は、ウラシル及び/又はトリプトファンを欠如する培地上で選択し、画線を同培地上で精製した。
S.セレヴィシエ菌株FS01267(MATa trp1 ura3)を、pESC−URA−PAL2(実施例2)、及びpESC−TRP−4CL1−VST1(実施例5)により同時形質転換し、形質転換された菌株をFSSC−PAL24CL1VST1と命名した。
振盪フラスコによる組換え酵母菌株による発酵
前記組換え酵母菌株を、滅菌した接種用ループにより寒天プレートに接種し、ビタミン類、微量元素、5g/lのグルコース及び95g/lを含有する100mlの合成無機培地(ベルダインら(Verduyn et al.)、1992年)で増殖させた。500mlのコック付き振盪フラスコを3日間、30℃、160rpmでインキュベートした。
a)ピノシルビンの抽出
5分間の遠心により5000gの細胞を回収した。50mlの上清アリコートを20mlの酢酸エチルで一回抽出した。この酢酸エチルを凍結乾燥し、乾燥生成物を0.7mlのメタノールで再溶解し、ろ過してHPLCバイアルに入れた。
100ml培地から得られた細胞ペレットを2mlの水に溶解し、3本の迅速調製チューブに分割し、ガラス玉で砕いた。これらの3チューブからの粗製抽出物を、50mlの縫工チューブ中の10mlの100%メタノール中にプールし、4℃の冷暗部屋でロータリーチャンバーにより48時間抽出した。48時間後、細胞デブリスを遠心により5分間、5000gで除去し、該メタノールを一晩の凍結乾燥により除去した。乾燥残留物を0.7mlのメタノールに再溶解し、ろ過してHPLCバイアルに入れた。
(HPLC)
ケイヒ酸、クマル酸及びリスベラトロールの定量的分析のために、試料を、λ=306nmのUVダイオードアレイ検出前に高速液体クロマトグラフィー(HPLC)アジレント(Agilent)シリーズ1100システム(ヒューレットパッカード社(Hewlett Packard)製)による分離に供した。
フェノメネックス社(Phenomenex)(トランス、カリフォルニア州、アメリカ合衆国)製Luna3マイクロメートルC18(100×2.00mm)カラムを40℃で用いた。移動相として、アセトニトリルとミリQ水(両方とも50ppmのトリフルオロ酢酸を含む)のグラジエントを0.4ml/分の流速で用いた。グラジエントのプロフィールは20分間にわたる15%アセトニトリルから100%アセトニトリルの間、リニアであった。溶出時間はトランス−ピノシルビンで約8.8〜8.9分であった。純粋ピノシルビンスタンダード(>95%純粋)は、アルボノバ社(ArboNova)(トゥルク、フィンランド)から購入した。
サンプルと標準を、Agilent 1100 HPLCシステム(アジレントテクノロジーズ社(Agilent Technologies)、ワルブロン、ドイツ)に連結したLockspray(商品名)基準プルーブを具備したWaters(マイクロマス社(Micromass)、マンチェスター、イギリス)LCT(商品名)飛行時間質量分析計で、ネガティブ電気スプレイによって分析した。分離は、0.3ml/分で水−アセトニトリドのグラジエントを用いて、4mm×2mm ID SecurityGuard(商品名)プレ−カラム(フェノメネックス社(Phenomenex)、アメリカ)に取り付けられた50mm×2mm ID Luna C−18(II)カラム(フェノメネックス社(Phenomenex、アメリカ)で行った。2つの溶離液は共に、20mMのギ酸を含有していた。溶媒の組成を、20分間で、注入時15%のアセトニトリルから100%のアセトニトリルへ変化させ、それをグラジエントを始動条件に戻す前に5分間維持した。3μlサンプルを、すべてのケースに注入し、カラムを40℃に維持した。すべての化学物質は、HPLC勾配で、MiLLi−Q(商品名)水に溶解した。UVスペクトルは、4nmの分解能を有する2スペクトル/秒で200〜700nmから収集した。質量分析計を、ロイシン enkphaline(0.5%ギ酸を使って50%アセトニトリル中で0.5μg/ml)の溶液に5500FWHよりも良好な分解能になるようにネガティブ電気スプレイモードで最大感度にして調節した。前記溶液を、15μl/分のネガティブESIのLockspray(商品名)で質量基準として使用した。機器を、50%アセトニトリルのカルボキシル化したPEG混合液においてネガティブESIで較正した。両方の場合の較正において、少なくとも25キャリブレーションイオンで2mDaよりも少ない残余誤差であった。運転条件は、最小インソースフラグメンテーションのために選んだ。質量スペクトルを、0.1秒のインタースキャン時間のスペクトルあたりの0.4秒の比で100〜900Da/eから収集した。基準スペクトルを、3秒毎に、Lockspray(商品名)プローブから収集し、10の基準スペクトルを、内部質量補正のために平均化した。狭いイオンの微量を、期待された代謝のプロトン化、又は非プロトン化した質量あたりで+/−25mDaを用いて抽出した。
FSSC−PAL24CL1RES菌株とFSSC−PAL24CL1VST1菌株を実施例8に記載のように100g/lのガラクトースで培養し、ピノシルビンの含量を分析した。さらに、空のベクターのみを含むコントロール菌株のFSSCコントロールを含めた。HPLC分析は、FSSC−PAL24CL1VST1菌株とFSSC−PAL24CL1RES菌株がトランス−ピノシルビンと同じ8.8〜9.0分の保持時間を有する成分を含むことを示した(図4及び図5)。この結果は、8.2分の保持時間を有するFSSC−PAL24CL1VST1菌株の浮遊物中の成分の存在を明らかにするLC−MSによっても確認され、この浮遊物中の成分は、211.0579Da/e±25のM/Zを有し、ネガティブイオンモードで純粋ピノシルビンのM/Zに実際に一致した。
さらに、UV吸収スペクトルは、約306nmのλmaxを有する純粋なトランス−ピノシルビン(図示せず)の吸収スペクトルに類似した。
a)大腸菌におけるPAL2の発現用細菌ベクターの構築
以下の実施例で用いられたプラスミドは1つ以上のマーカー遺伝子を持っており、それらを持つ微生物を、それらを持たない微生物から選択することができる。選択システムは、優性マーカー、例えば、アンピシリンとカナマイシンに対する耐性に基づく。さらに、プラスミドは、組換え遺伝子の発現を可能とするプロモーター配列とターミネーター配列を含む。さらに、プラスミドはDNA断片のクローニングとそれに引き続く組換え体の同定を容易にする好適な独自の制限部位を含む。本実施例において、プラスミドは、pET16b(ノヴァゲン社(Novagen))と呼ばれるアンピシリン耐性遺伝子又はpET26b(ノヴァゲン社(Novagen))と呼ばれるカナマイシン耐性遺伝子のいずれかを含む。
実施例1に記載のように単離された4CL1をコードする遺伝子を、好適な制限部位を含む5'突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてプラスミドpESC−URA−4CL1−VST1(実施例5)からPCRにより再増幅する。遺伝子の5'末端と3'末端における該制限酵素部位の導入により、制限PCR産物を消化pET26Bベクターに連結することができる。得られたプラスミドpET26B−4CL1は、乳酸桿菌(Lactobacillus lactis)由来のT7プロモーターの制御下に4CL1をコードする遺伝子を含有する。
大腸菌の菌株を、(a)と(b)に記載されたベクターで別々に、又は組合せて形質転換した。細菌細胞の形質転換は、当分野で公知の方法にしたがって、コンピテント細胞、又はその代わりになるものとして例えば電気穿孔法を用いて実施した(例えば、サムブルックら(Sambrook et al.)、1989年を参照)。形質転換体は、抗生物質アンピシリン(antibiotics ampicilin)及びカナマイシンを含む培地上で選択し、画線を同培地上で精製した。
組換え酵母菌株は、バッチ培養、流加バッチ培養又はケモスタット培養として操作される発酵槽で増殖させることができる。この場合、発酵を、振盪フラスコで行った。
抽出と分析は実施例9に記載された方法を用いて実施した。
記述した改変菌株(上段)と対照菌株(下段)を使用する発酵に由来する抽出物について行ったHPCLの結果を、図9に示す。ピノシルビンとケイヒ酸の生成物は、図にマークされている。
a)乳酸連鎖球菌におけるPAL2の発現用細菌ベクターの構築
下記実施例に使用されるプラスミドpSH71とその誘導体は、大腸菌と乳酸連鎖球菌に由来する複数の複製開始点を有する二機能性シャトルベクターである。それによって、宿主域特異性は大腸菌及び他の種の乳酸菌にわたる。したがって、乳酸連鎖球菌の形質転換は通常は問題なく進むが、他の種の乳酸菌の推定上の困難な形質転換は組換えプラスミドの構築のための中間ホストとして大腸菌を用いることにより克服することができる。プラスミドは1つ以上のマーカー遺伝子を持っており、それらを持つ微生物を、それらを持たない微生物から選択することができる。乳酸連鎖球菌に用いられる選択システムは、優性マーカー、例えば、エリスロマイシンとクロラムフェニコールに対する耐性に基づくが、糖質代謝に関与する遺伝子、ペプチダーゼ及び食品用マーカーに基づくシステムも記載されてきた。さらに、プラスミドは、組換え遺伝子の発現を可能とするプロモーター配列とターミネーター配列を含む。好適なプロモーターは、乳酸連鎖球菌の遺伝子、例えば、lacAから取られる。さらに、プラスミドはDNA断片のクローニングとそれに引き続く組換え体の同定を容易にする好適な独自の制限部位を含む。
実施例1に記載のように単離された4CL1をコードする遺伝子を、好適な制限部位を含む5'突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドpESC−TRP−4CL1−VST1(実施例5)からPCRにより再増幅した。遺伝子の5'末端と3'末端における該制限酵素部位の導入により、制限PCR産物を消化pSH71−CMrベクターに連結することができる。得られたプラスミドpSH71−CMr−4CL1は、乳酸桿菌(Lactobacillus lactis)由来のlacAプロモーターの制御下に4CL1をコードする遺伝子を含有する。
実施例1に記載のように単離されたVST1をコードする遺伝子を、好適な制限部位を含む5'突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドpESC−TRP−4CL1−VST1(実施例5)からPCRにより再増幅した。遺伝子の5'末端と3'末端における該制限酵素部位の導入により、制限PCR産物を消化pSH71−ERYrベクターに連結することができる。得られたプラスミドpSH71−ERYr−VST1は、乳酸連鎖球菌に由来するlacAプロモーターの制御下にVST1をコードする遺伝子を含む。lacAプロモーターと、VST1をコードする遺伝子とを、好適な制限部位を含む5'突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドpSH71−ERYr−VST1からPCRにより1つの断片として再増幅する。DNA断片の5'末端と3'末端における該制限酵素部位の導入により、制限PCR産物を消化プラスミドpSH71−CMr−4CL1に連結することができる。得られたプラスミドpSH71−CMr−4CL1−VST1は、個々のlacAプロモーターの制御下に4CL1及びVST1をそれぞれコードする遺伝子を含む。4CL1とVST1をコードする遺伝子の配列を、pSH71−CMr−4CL1−VST1の2つの異なるクローンの配列決定により検証する。
乳酸連鎖球菌株を、実施例16及び実施例17に記載されたベクターで別々に、又は組合せて形質転換する。細菌細胞の形質転換は当分野で公知の方法にしたがって、例えば、コンピテント細胞又は電気穿孔法を用いて実施した(例えば、サムブルックら(Sambrook et al.)(1989年)を参照)。形質転換体は、抗生物質のエリスロマイシンとクロラムフェニコールとを含有する培地上で選択し、画線を同培地上で精製した。
組換え乳酸連鎖球菌株は、バッチ培養、流加バッチ培養又はケモスタット培養として操作される発酵槽で増殖させることができる。
微生物を、1.5リットルの有効容積のバッフル付きバイオリアクターで、嫌気的、好気的又は微好気的条件で増殖させる。すべての培養物を30℃で、350rpmにてインキュベートする。pH6.6で一定になるように10MのKOHの自動添加により維持する。細胞を、以下の成分を補充した合成MS10培地中でラクトースにより増殖させて好気的条件下の増殖を可能とする:MnSO4(1.25×10−5g/l)、チアミン(1mg/l)及びDL−6,8−チオクト酸(2.5mg/l)。ラクトース濃度は、例えば、50g/lである。3倍高い濃度のK2HPO4とKH2PO4で緩衝化した上記培地により、振盪フラスコ内、30℃で増殖させた前培養物の細胞をバイオリアクターに接種する。接種前にN2(純度99.998%)を培地に流すことにより、かつ培養中にバイオリアクターの上部空間にN250ml/分の定速を維持することにより好気的条件を確保する。微好気的条件及び好気的培養のために用いられるバイオリアクターは、空気(DOT、100%)及びN2(DOT、0%)で較正されたポーラログラフィー酸素センサーを備える。好気的条件はバイオリアクターに空気を1vvmの速度で拡散させてDOTが80%を超えることを確保することで得られる。微好気的実験中、N2と大気の空気の混合物からなる気体を0.25vvmの速度でリアクターに拡散することによりDOTが5%の一定に保たれる。
ケモスタット培養物において、細胞は例えば1Lの有効容積のアプリコン(Applikon)実験室用発酵槽で、30℃、350rpmで増殖させることができる。希釈率(D)は、異なった値、例えば、0.050h−1、0.10h−1、0.15h−1又は0.20h−1に設定することができる。消泡剤(50μl/l)を追加した上記成長培地を用いて、5MのKOHの自動追加によりpHを一定、例えば6.6に保つ。ラクトースの濃度を異なる値、例えば、3.0g/l、6.0g/l、12.0g/l、15.0g/l又は18.0g/lに設定することができる。バイオリアクターに1mg/lの初期バイオマス濃度で接種し、指数増殖期の終わりにフィードポンプを作動させる。
抽出と分析は実施例9に記載された方法を用いて実施する。
a)アスペルギルス属に属する種におけるPAL2の発現用真菌ベクターの構築
本実施例で使用されるプラスミドは、黒色アスペルギルスと麹菌で自己プラスミド複製も維持する、アスペルギルス nidulans由来のAMA1開始複製配列を含有するpARp1から得られる(ゲムスら(Gems et al.)、1991年)。さらに、プラスミドは大腸菌の複製配列を含むシャトルベクターであるので、黒色アスペルギルス及び麹菌での固有の困難な形質転換が、組換えプラスミドの構築のために中間ホストとして大腸菌を用いることにより克服することができる。プラスミドは1つ以上のマーカー遺伝子を持っており、それらを持つ微生物を、それらを持たない微生物から選択することを可能とする。選択システムは、優性マーカー、例えば、ハイグロマイシンB、フレオマイシン及びブレオマイシンに対する耐性、又は異種マーカー、例えば、アミノ酸及びpyrG遺伝子に基づくことができる。さらに、プラスミドは組換え遺伝子の発現を可能とするプロモーター配列とターミネーター配列を含む。好適なプロモーターは、アスペルギルス nidulansの遺伝子、例えば、alcA、glaA、amy、niaD及びgpdAから得られる。さらに、プラスミドはDNA断片のクローニング及びその後の組換え体の同定を容易にする好適な独自の制限部位を含む。
実施例1に記載のように単離された4CL1をコードする遺伝子を、好適な制限部位を含む5'突出を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを用いて、プラスミドpESC−TRP−4CL1−VST1(実施例5)からPCRにより再増幅する。遺伝子の5'末端と3'末端における該制限酵素部位の導入により、制限PCR産物を、アスペルギルス nidulans由来のgpdAプロモーターを含む消化pAMA1−HISベクターに連結することができる。得られたプラスミドpAMA1−HIS−4CL1は、アスペルギルス nidulansに由来するgpdAプロモーターの制御下に4CL1をコードする遺伝子を含む。
黒色アスペルギルス菌株を、(a)及び(b)に記載されたベクターで、別々に、又は組合せて形質転換する。細菌細胞の形質転換は当分野で公知の方法にしたがって、例えば、電気穿孔法又は接合を用いて実施する(例えば、サムブルックら(Sambrook et al.)(1989年)を参照)。形質転換体は、メチオニン及び/又はヒスチジンを欠く最小培地により選択する。
麹菌においてピノシルビンを導く経路の発現
PAL2、及び4CL1をコードする天然の遺伝子組を含有する麹菌の菌株(セシムら(Seshime et al.)、2005年)であって、メチオニンに対して栄養要求性のある菌株をベクターpAMA1−MET−VST1(実施例29)により形質転換して、菌株FSAO−VST1を得る。真菌細胞の形質転換は当分野で公知の方法にしたがって、例えば、電気穿孔法又は接合を用いて実施する(例えば、サムブルックら(Sambrook et al.)(1989年)を参照)。形質転換体はメチオニンを欠く培地により選択する。
培養槽における黒色アスペルギルス及び麹菌の組換え菌株による発酵
組換えアスペルギルス菌株は、バッチ培養、流加バッチ培養又はケモスタット培養として操作される発酵槽で増殖させることができる。
微生物は、好気的条件下で、1.5リットルの有効容積のバッフル付きバイオリアクターで増殖させる。すべての培養物を30℃で、500rpmにてインキュベートする。pH6.0で一定となるように10MのKOHの自動添加により維持し、好気的条件は空気を1vvmの速度でバイオリアクターに拡散させてDOTが80%を超えることを確保することで得られる。以下の成分からなる合成培地中で細胞をグルコースで増殖させてバッチ培養で増殖させる。7.3g/lの(NH4)2SO4、1.5g/lのKH2PO4、1.0g/lのMgSO4・7H2O、1.0g/lのNaCl、0.1g/lのCaCl2・2H2O、0.1ml/lのシグマ社製の消泡剤、7.2mg/lのZnSO4・7H2O、1.3mg/lのCuSO4・5H2O、0.3mg/lのNiCl2・6H2O、3.5mg/lのMnCl2・4H2O及び6.9mg/lのFeSO4・7H2O。グルコース濃度は、例えば、10g/l、20g/l、30g/l、40g/l又は50g/lである。流加バッチ培養で細胞を増殖させるために、培地は、バッチ相中の7.3g/lの(NH4)2SO4、4.0g/lのKH2PO4、1.9g/lのMgSO4・7H2O、1.3g/lのNaCl、0.10g/lのCaCl2・2H2O、0.1ml/lのシグマ社製の消泡剤、7.2mg/lのZnSO4・7H2O、1.3mg/lのCuSO4・5H2O、0.3mg/lのNiCl2・6H2O、3.5mg/lのMnCl2・4H2O及び6.9mg/lのFeSO4・H2Oからなる。次に、リアクターに、例えば、285g/kgのグルコースと42g/kg(NH4)2SO4を供給する。
ケモスタット培養では、例えば1.5リットルの有効容積のバッフル付きバイオスタットB実験室用発酵槽で、30℃、500rpmで細胞を増殖させることができる。pH6.6で一定になるように10MのKOHの自動添加により維持し、好気的条件は、空気を1vvmの速度でバイオリアクターに拡散して、確実にDOTが80%を超えさせることにより得られる。希釈率(D)は、異なる値、例えば、0.050h−1、0.10h−1、0.15h−1又は0.20h−1に設定できる。以下の成分を有する最小成長培地を用いて、10Mの自動追加によりpHを一定、例えば、6.6に保持する。2.5g/lの(NH4)2SO4、0.75g/lのKH2PO4、1.0g/lのMgSO4・7H2O、1.0g/lのNaCl、0.1g/lのCaCl2・2H2O、0.1ml/lのシグマ社製消泡剤、7.2mg/lのZnSO4・7H2O、1.3mg/lのCuSO4・5H2O、0.3mg/lのNiCl2・6H2O、3.5mg/lのMnCl2・4H2O及び6.9mg/lのFeSO4・7H2O。グルコースの濃度は異なる値、例えば、3.0g/l、6.0g/l、12.0g/l、15.0g/l又は18.0g/lに設定することができる。バイオリアクターには上記のように前バッチ培養物からの遊離菌糸体が接種され、指数増殖期の終わりにフィードポンプを作動させる。
黒色アスペルギルス及び麹菌におけるリスベラトロールの抽出と分析
抽出と分析は実施例9に記載された方法を用いて実施する。
黒色アスペルギルスAR1におけるピノシルビンの生産
黒色アスペルギルスAR1は、次の遺伝子argB2、pyrG89、veAを削除した。
PCR生成物において、組み込まれた制限酵素認識部位は、pUC19(New England biolabs,Ipswich,MA.)への挿入が許可され、pUC19−argBを与えるEcoRIとXmaIとで消化した。
PCR生成物において、組み込まれた制限酵素認識部位をもつ断片trpC及びgpdAの融合PCR生産物は、pAT3を産出するBamHI及びHindIIIで消化されたpUC19−argBへの挿入を許可する。
PCR生成物において、組み込まれた制限酵素認識部位は、BssHII及びpAT3−C4Hを与えるNotIで消化されたpAT3への挿入を許可した。該構築は、制限酵素切断及び配列によって検証された。argBマーカーを、2つの制限酵素BsiWI及びPciIを使うことによって取り除いた。
4CL1遺伝子は、注入PCR(In−fusionTMPCR)クローン技術(Clontech, Mountain View,Calif)を使って、pAT3−4CL1を産出するために、BssHII及びNotIで消化されたpAT3ベクターへ挿入された。該構築は、制限酵素切断及び配列によって検証された。
4CL1及びVST1発現カセットを含む形質転換を、単離し、BmrIで線形化されたpAT3−C4H−pyrGで連続的形質転換は、C4H、4CL1、VST1を含む組み換えA.nidulans菌株を与えた。
A.nidulansの前培養を、1g/L グルコース、0.85g/L NaNo3、0.1g/L KCl、0.1g/L MgSO4・7H2O; 及び0.3g/L KH2PO4、0.00008g/L CuSO4・5H2O、0.000008g/L Na2B4O7・10H2O、0.00016g/L FeSO4・7H2O、0.00016g/L MnSO4・2H2O、0.00016g/L Na2MoO4/2H2O、0.0016g/L ZnSO4・7H2Oを含む37℃の寒天プレートにて5日間成長させた。
前培養には、100mlのCzapek medium(CZ)を含む500mlのbaffled振盪フラスコを植菌のため使用した。該振盪フラスコは、150rpm、30℃で培養され、その培地の初期pHは6.2であった。24時間培養した後、そのサンプルを取り出し、抽出法に従い(下記参照)、生成したピノシルビンの存在を分析した。
100mlの培養物(細胞と培養液の両方)からなるサンプルは、振盪フラスコから回収された。代謝物の抽出は、次のように行った。サンプルは2つのSartorius tubesに移し、4500rpmで10分間遠心分離を行った。浮遊物は、ビーカーに移し、約300μlのガラスビーズ(0.25〜0.50mm)を含むカップで2mlSartoriusマイクロ管に移されて、バイオマスは8つのアリコートに分割した。該管は、Fastprep120(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA.)に挿入し、1回につき30秒間レベル6.5で4サイクル行ない、サイクルの間に冷たい状態を維持した。破砕細胞は2つの15ml Sartorius tubesに分割した。該管は、10mlの浮遊物で満たし、3mlのエチルアセテートを添加した。該管は、渦巻きミキサーで活発に2分間混合させ、5分間氷を当てた。エチルアセテート相は、4500rpmで10分間遠心分離し、4つの1.5mlエッペンドルフ管に集めた。エチルアセテートは、45分間凍結乾燥させて、乾燥させたサンプルは、実施例9bに記述したように、HPLC分析のために、0.3ml、50%メタノールで再溶解させた。
図7は、典型的な振盪フラスコ実験由来のHPLC−クロマトグラムを表す。上段は、ピノシルビンを生産する人工的に作り出された菌株由来の結果で、下段は、親野生型対照菌株由来の結果を示す。人工的に作り出された菌株によって生産されたピノシルビン濃度は、1.0〜2.0mg/lの範囲で変化させた。対照菌株は、あらゆるピノシルビンの形成体を示すものではない。
ピノシルビンピークの識別は、純粋な標準UV−クロマトグラムと比較することによって、ダイオードアレイUV−スペクトルで、さらに確認された(図8)。
PALCPRの連続的培養物においてスチルベノイドの細胞内及び細胞外の濃度の定量
過剰発現したCPRを有する酵母菌株FSSC−PAL2C4H4CL2VST1−pADH1CPR1を、1リッターの可動範囲で炭素制限された連続的培養物中で成長させた。ヴェルダインら(Verduyn et al.)(1992)に従って、5.0g/Lの(NH4)2SO4、3.0g/LのKH2PO4、0.5gLのMgSO4・7H2O、微量金属、ビタミン、及び、成長を制限する栄養物として5/lのグルコース及び35g/lのガラクトースを含有する特定の培地で培養物を成長させた。泡立ちを避けるために、消泡剤(300μl/L、シグマ社(Sigma)、A−8436)を、加えた。炭素源を、無機培地とは別にオートクレーブし、その後、発酵装置に加えた。さらに、培地をオートクレーブ及び冷却した後、ビタミンと、微量金属の溶解液を、除菌により発酵装置に加えた。発酵システムは、Sartorius BBIシステムであり、Biostat B Plusコントローラーを具備した1リッターの可動範囲を有するでバッフル3リッター反応器からなる。反応器は、2つのRushton turbineを具備し、該Rushton turbinesは、1000rpmもしないで回転した。温度を30±1℃に維持し、2M KOHの自動添加によってpHを5.5±0.2に維持した。ガス流を、質量流量コントローラーによって制御し、1.5vvm(1.5 l/分)に設定した。排気ガスを、冷却されたコンデンサーに導き、O2とCO2について分析した(Model 1308、イノヴァ社(Innova)、デンマーク)。35g/lのガラクトースを有する初期バッチ培養を、5g/lグルコース及び35g/lガラクトースを含む、10mlの対数的に成長する振盪フラスコ培養を有する培養の植菌によって開始した。バッチ培養を、反応物に継続的に同じ培地を供給することによって継続モードに交換した。D=0.050h−1になるように一定の基準レベルで希釈率を制御した。希釈率と排ガスシグナルの両方が、少なくとも5度の滞留時間において変化しなかった時、及び、1つの滞留時間の間隔でとった2つの連続的なサンプルにおける代謝濃度が、3%未満を逸脱しなかった時、連続的培養は定常状態であるとみなした。連続的に観察された溶解酸素濃度を、60%を超える空気の飽和状態に維持した。前記条件下で、菌株は、全てのガラクトースを消費し、主にバイオマス、CO2、及び、ごく少量のエタノールを生産した。さらに、RQは、一致に近く、代謝の大部分が呼吸モードであることを示した。
次の表は、300時間の連続的な培養後の結果をまとめたものである。
脂肪性の酵母菌、Yarrowia lipolyticaにおけるトランスピノシルビンの経路のクローニング
遺伝子がタンパク質のコード配列として定義される、PAL(フェニルアラニン アンモニアリアーゼ)、CL(シンナモイル:CoAリガーゼ)、及びVST1遺伝子を、Yarrowia lipolyticaにおける発現に対するコドン最適化で、合成遺伝子(ジェンスクリプト コーポレーション(GenScript Corporation)、ピスカタウェィ、ニュージャージー州、アメリカ合衆国)として生成する。Y.lipolyticaにおけるコドン使用量の定量は、前述した(WO2006125000)。PALと4CL遺伝子は、A.thaliana cDNA(Stratagene)からPCRによって単離することができる。シンナモイル:CoAリガーゼCLは、基質としてケイヒ酸を受容するあらゆるヒドロキシシンナモイル:CoAリガーゼになりえる。例えば、4CL1及び4CL2遺伝子によってコードされたA.thaliana由来の4−クマロイル:CoAリガーゼは、好ましい基質は4−ヒドロキシケイヒ酸(クマル酸)であるが、ケイヒ酸を受容する(Hamberger and Hahlbrock,2004;コスタら(Costa et al),2005)。最も好ましくは、CLが、ストレプトミセスcoelicolor由来のシンナメイト:CoAなど、基質としてケイヒ酸に対して特有のコドンで最適化されたリガーゼである(カネコら(Kaneko et al),2003)。同様に、リスベラトロール、いわゆるリスベラトロールシンターゼを生成するスチルベンシンターゼにおいて、通常好ましい基質は4−クマロイル:CoAであるが、VST1遺伝子は、あらゆる基質としてシンナモイル:CoAを受容するコドンで最適化された、又は、最適化されていないスチルベンシンターゼであってもより。2重の基質の許容性のタイプは、Vitis viniferaに由来するVST1遺伝子(配列番号9)の性質を持っている。もっとも好ましくは、基質としてシンナモイル:CoAに特有のPinusのファミリー由来のスチルベンシンターゼを用いる(シャンズら(Schanz et al),1992、コダンら(Kodan et al),2002)。
Yarrowia lipolyticaにおいて非相同遺伝子の発現に使用することができるプロモーターは、次のプロモーターに制限されてはいないが、例えば、長鎖アシル:CoAオキシダーゼPOX2、hp4d、イソシトレート・リアーゼICL1、細胞外のアルカリプロテアーゼXPR2、翻訳延長ファアクターTEF、リボソームタンパク質S7 RPS7、グリセルアルデヒド−3−フォスフェイトデヒドロゲナーゼGPD、YAT1、GPAT、FBA1、及びFBAINプロモーターが挙げられる(ミューラーら(Muller et al),1998、WO2006055322、WO2006125000)。
発現カセットの産出は、例えば5’−プロモーター::遺伝子::ターミネーター−3’DNA断片など、非相同遺伝子のタンパク質をコードする配列とターミネーター配列と共に融合されたプロモーター(構造性の又は誘導性の)を含む線状二本鎖DNA断片の集合を意味する。
ピノシルビン経路遺伝子(PAL、CL、VST1)は、プロモーター、及びターミネータープロモーター::遺伝子:ターミネーターと発現カセットとして組み立てられる。プロモーター及びターミネーターは、異なる遺伝子、PAL、CL、及びVST1に対する異なるプロモーターとターミネーターの同一物或いは組み合わせになりうる。当業者は、Y.lipolyticaにおいてピノシルビン経路発現クラスター(遺伝子PAL、CL、及びVST1を有する発現カセットを含む)の導入と発現に必要とされる利用できるクローニング技術、クローニングベクター、クローニングツールを、これらのツールがさまざまな文献(レダルら(Le DAll et al),1994、ピグネデら(Pignede et al),2000、ジュレツゼクら(Juretzek et al),2001、マザクら(Madzak et al),2004)、及び公報(WO2006055322、WO2006125000)に記述されてきたので認めるだろう。
標準的な形質転換技術(チェンら(Chen et al),1997、WO2006125000)を、Y.lipolyticaホストへ発現カセットを含む異質DNA、自己複製ベクター、又はDNA断片を導入するために使用することができる。これに限定されないが、例えば、ATCC90811、ATCC90812、及びARCC90903等のホスト細胞が挙げられる。Y.lipolyticaに導入された異質DNAを維持するために使用される選択方法は、アミノ酸マーカー(フィッカーら(Fickers et al),2003)、又は抗生物質マーカー(コルデロら(Cordero et al),1996)に基づいていてもよい。
(a)組み換え型大腸菌の菌株を使ったバッチ培養
大腸菌PAL24CL1VST1及びBL21(DE3)(対照菌株)の組換え型菌株を、好気的条件下で、1.5リッターの可動範囲のバッフルされた生物反応器で成長させた。培養を、30℃、800rpmでインキュベートした。一定pH7を、2NのKOHの自動添加によって維持した。好気的条件は、溶解酸素濃度(DOT)が60%を超えることを確かめるために、1vvmの割合で生物反応器に、空気を散布することによって得られた。空気を、生物反応器に導入する前に細菌ろ過した。排気ガスを、コンデンサーを通じて導き、6℃未満に冷却し、音響ガス分析機(acoustic gas analyser)によってCO2及びO2の容積測定の含有量について分析した。生物反応器には、空気(DOT、100%)とN2(DOT、0%)で較正されたポーラログラフの酸素センサーが備え付けられた。
細胞の培養液のサンプルは、バッチ培養の過程で採取され、ピノシルビンの存在について分析された。加えて、サンプルを、バイオマス(光学的濃度OD600に関して)、炭素源(グリセロール)、及び主要な副生成物(エタノール、アセテート、ピルビン酸塩、コハク酸エステル)について分析した。
細胞内のピノシルビンをエチルアセテートを使って抽出した。その目的のために、4mlのエチルアセテートを8mlの細胞培養液に加えた。その抽出物を、混合し(30秒)、遠心分離器(4℃で、5分間、4500rpm)によって相分離した。アセテート相を、凍結乾燥し(約2時間)、乾燥生成物を0.5mlのメタノールに再溶解し、HPLCによって分析した。これらのサンプルを、さらに水で希釈し(1:5)、HPLCによって分析した。
バッチ培養由来のサンプルにおけるピノシルビンの分析を、実施例9bで記述されたような方法を使って行った。サンプルを、あらかじめ次のサンプル前処理手順で、同時に処理した。(i)細胞培養液の遠心分離(5分)と浮遊物の分析、(ii)エタノール(99.9%)添加して50%(v/v)の最終濃度にし、渦(30秒)、遠心分離(5分)を行い、浮遊物を分析、(iii)上記(b)に従ってエチルアセテートで抽出し、メタノール中に再溶解させた乾燥したサンプルを分析。
実施例10cに示されるように、大腸菌FSEC−PAL24CL1VST1、及びBL21(DE3)(対照菌株)の組み換え型菌株を、上述の(a)のように、バッチモードにおいて生物反応器で20g/Lのグリセロールで培養した。培養過程で、組み換え型菌株を、上述の(c)に従ってピノシルビンの含有量について分析した。
検出されたピノシルビンの最大濃度を、次の表に示す。
その結果は、したがって、バッチモードの生物反応器内で成長した大腸菌において、トランス−ピノシルビンの生体内の生成につながる活性化されたフェニル−プロパノイド経路の存在を明らかにした。
(a)組み換え型の黒色アスペルギルス菌株を用いたバッチ培養
C4H、4CL1、及びVST1を含む黒色アスペルギルスの組み換え型菌株を、好気的条件下で1.5リッターの可動範囲のバッフルされた生物反応器内で成長させた。培養を、30℃、700rpmでインキュベートした。一定pH6を、2NのKOHの自動添加によって維持した。好気的条件は、溶解させた酸素圧(DOT)が60%を超えることを確認するために、1vvmの割合で生物反応器に空気を散布することによって得られた。空気を、生物反応器に導入する前に細菌濾過した。排気ガスを、コンデンサー通じて導き、6℃未満に冷却し、音響ガス分析機(acoustic gas analyser)によってCO2及びO2の容積測定の含有量について分析した。生物反応器には、空気(DOT、100%)とN2(DOT、0%)で較正されたポーラログラフの酸素センサーが備え付けられた。細胞を、次の成分を含む定義された培地のスクロース上で成長させた。3.0g/lのNaNO3、1.0g/lのKH2PO4、0.5g/lのKCl、0.5g/lのMgSO4・7H2O、0.5g/lのFeSO4・7H2O。スクロースの濃度は30g/lであった。消泡剤を最終濃度が50μ/lとなるまで添加した。
細胞を、均質化によって分裂させ(ポリトロン細胞組織ホモジナイザー)、細胞内のピノシルビンを、10mlのエチルアセテートを用いて抽出した。その抽出物を、回転混合機によって混合し(約15分)、遠心分離器(4℃で、5分間、4500rpm)によって、相分離した。アセテート相を、凍結乾燥(約2時間)し、乾燥生成物を0.5mlのメタノールで再溶解し、HPLCによって分析した。
バッチ培養由来のサンプルにおけるピノシルビンの分析を、実施例9bに記述されたような方法で行った。
実施例16eに記述されているようにC4H、4CL1、及びVST1を含む黒色アスペルギルスの組み換え型菌株を、実施例HD4に従って、バッチモードにおいて生物反応器で30g/Lのスクロースで培養した。約48時間の培養後、細胞を生物反応器から集菌し、均質化によって分裂させ、上述した(b)及び(c)に従ってピノシルビンの細胞内の含有量について分析した。
その結果は、したがって、バッチモードの生物反応器内で成長した黒色アスペルギルスにおいて、トランス−ピノシルビンの生体内の生成につながる活性化されたフェニル−プロパノイド経路の存在を明らかにした。
下記の刊行物はすべて、参照され本明細書の一部とされる。
南アフリカ特許番号第ZA200408194号
欧州特許番号第EP0309862号
欧州特許番号第EP0464461号
米国特許番号第US5391724号
米国特許番号第US5973230号
Method for the production of resveratrol in a recombinant oleaginous microorganism
Huamg Lixuan Lisa, Du Pont (US)
High arachidonic acid producing strains of Yarrowia lipolytica
Damude Howard, Du Pont (US)
Phytochemistry. 6, 2447−2453.
Anticancer Res. 24, 2783−840. Review.
Plant Physiol. 116, 743−754.
FEMS Yeast Res. 4, 79−85.
One−step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica.
Appl Microbiol Biotechnol. 1997:48:232−5.
Efficient selection of hygromycin−B−resistant Yarrowia lipolytica transformants.
Appl Microbiol Biotechnol. 1996:46:143−8.
Phytochemistry, 2005:66:2072−2091
Vectors for gene expression and amplification in the yeast Yarrowia lipolytica.
Yeast.2001:18:97−113.
Multipile−copy integration in the yeast
Yarrowia lipolytica
Curr Genet.1994:26:38−44.
Heterologous protein expression and secretion in the non−conventional yeast Yarrowia lipolytica: a review. J Biotechnol.2004:109:63−81.
Cloning and characterization of the Yarrowia lipolytica squalene synthase(SQS1)gene and functional complementation of the Saccharomyces cerevisiae erg9 mutation.
Yeast.2000:16:197−206.
Two Isoforms of NADPH:Cytochrome P450 Reductase in Arabidopsis thaliana. Gene Structure, Heterologous Expression in Insect Cells, and Differential Regulation Plant Physiol.116, 357−367.
Autocloning and amplification of LIP2 in Yarrowia lipolytica. Appl Environ Microbiol.2000:66:3283−9.
配列番号1は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL2)をコードするシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)由来のヌクレオチド配列である。
配列番号2は、配列番号1によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号3は、4−クマレート:補酵素Aリガーゼ(4CL1)をコードするシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)由来のヌクレオチド配列である。
配列番号4は、配列番号3によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号6は、配列番号5によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号7は、S.セレヴィシエ(S.cerevisiae)での発現のためにコドン最適化されたリスベラトロールシンターゼ(RES)をコードするRheum tataricum由来のヌクレオチド配列である。
配列番号8は、配列番号7によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号10は、配列番号9によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号17〜22は、実施例16aで使用されるプライマー配列である。
配列番号23〜26は、実施例16bで使用されるプライマー配列である。
配列番号27〜30は、実施例16cで使用されるプライマー配列である。
Claims (89)
- 少なくとも1種類の酵素活性を含む操作的な代謝経路を有する微生物において、当該経路がケイヒ酸からピノシルビンを生産することを特徴とするピノシルビン生産微生物の使用。
- 前記微生物が、ケイヒ酸を生産し、且つ、そこからピノシルビンを生産することを特徴とする請求項1に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- 前記ピノシルビンが、内在性のマロニル−CoAが基質である酵素により触媒される反応で生産されることを特徴とする請求項2に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- 前記ピノシルビンが、シンナモイル−CoAから生産されることを特徴とする請求項1〜3のいずれかの請求項に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- 前記ピノシルビンが、シンナモイル−CoAからスチルベンシンターゼにより生産されることを特徴とする請求項4に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- 前記スチルベンシンターゼが、前記微生物中において、前記微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸から発現されることを特徴とする請求項5に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- 前記スチルベンシンターゼが、ラッカセイ属に属する植物、ダイオウ属に属する植物、ヴィートス属に属する植物、或いは、マツ属、トウヒ属、ユリ属、ユーカリノキ属、ツタ属、シッサス属、カロコルタス属、タデ属、グネツム属、パンノキ属、ナンキョクブナ属、ナツメヤシ属、ウシノケグサ属、スゲ属、シュロソウ属、ハカマカズラ属、又はPterolobium属のいずれか1種類に属する植物に由来するリスベラトロールシンターゼ(EC 2.3.1.95)であることを特徴とする請求項6に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- 前記スチルベンシンターゼが、P.sylvestris、P.strobes、P.densiflora、P.taedaを含むマツ属に属する植物、トウヒ属に属する植物、又はユーカリノキ属のいずれか1種類に属する植物に由来するピノシルビンシンターゼ(EC 2.3.1.146)であることを特徴とする請求項6に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- 前記ケイヒ酸が、アンモニアが生成される酵素触媒反応でL−フェニルアラニンから前記経路で生産されることを特徴とする請求項1〜8のいずれかの請求項に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- 前記ケイヒ酸が、L−フェニルアラニンからL−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)により形成されることを特徴とする請求項9に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- 前記フェニルアラニンアンモニアリアーゼが、前記微生物中において、前記微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸から発現されることを特徴とする請求項10に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- 前記ケイヒ酸が、シロイヌナズナ属に属する植物、アブラナ属に属する植物、ミカン属に属する植物、インゲンマメ属に属する植物、マツ属に属する植物、ハコヤナギ属に属する植物、ナス属に属する植物、サクラ属に属する植物、ヴィートス属に属する植物、トウモロコシ属に属する植物、或いは、アガスタケ属、アナナス属、アスパラガス属、ブロムヘディア属、ホウライチク属、フダンソウ属、カバノキ属、キュウリ属、ツバキ属、トウガラシ属、カッシア属、カタランサス属、マメ属、スイカ属、コーヒーノキ属、カボチャ属、ギョウギシバ属、ニンジン属、デンドロビウム属、ナデシコ属、ジギタリス属、ヤマノイモ属、ユーカリ属、ガルス属、イチョウ属、ダイズ属、オオムギ属、ヒマワリ属、サツマイモ属、アキノノゲシ属、リソスペルマム属、ハス属、トマト属、ウマゴヤシ属、リンゴ属、マニホット属、ウマゴヤシ属、メセンブリアンテマム属、タバコ属、オリーブ属、オリザ属、ピスム属、ペルセア属、ペトロセリヌム属、ファレノプシス属、マダケ属、センタイ属、ピケア属、ピルス属、ケルクス属、ラファヌス属、ジオウ属、キイチゴ属、モロコシ属、スフェノスチリス属、ハコベ属、スタイロ属、コムギ属、シャジクソウ属、コムギ属、スノキ属、ササゲ属、又はジニア属のいずれか1種類に属する植物、又は、アスペルギルス属に属する糸状菌に由来するL−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(EC 4.3.1.5)によりL−フェニルアラニンから形成されることを特徴とする請求項11に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- 前記PALが、基質としてチロシンを受容し、且つ、そこからケイヒ酸を形成する場合、前記PALに対するKm(フェニルアラニン)/Km(チロシン)の比は、1:1未満となるように、前記PALが、基質としてフェニルアラニンを受容し、且つ、そこからケイヒ酸を生産することを特徴とする請求項10〜12のいずれかの請求項に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- 前記微生物が、シンナメート−4−ヒドロキシラーゼ酵素(C4H)を生産する場合、Kcat(PAL)/Kcat(C4H)の比は、少なくとも2:1であることを特徴とする請求項13に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- 前記シンナモイル−CoAが、ATP及びCoAが基質で、且つ、ADPが生産物である酵素により触媒される反応で、前記経路により形成されることを特徴とする請求項1〜14のいずれかの請求項に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- 前記シンナモイル−CoAが、4−クマレート−CoAリガーゼ、又はシンナモイル−CoAリガーゼにより触媒される反応で形成されることを特徴とする請求項1〜15のいずれかの請求項に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- 前記4−クマレート−CoAリガーゼ、又はシンナメート−CoAリガーゼが、モミ属に属する植物、シロイヌナズナ属に属する植物、アブラナ属に属する植物、ミカン属に属する植物、カラマツ属に属する植物、インゲンマメ属に属する植物、マツ属に属する植物、ハコヤナギ属に属する植物、ナス属に属する植物、ヴィートス属、トウモロコシ属に属する植物、或いは、アガスタケ属、アンフォラ属、カタヤ属、ヒマラヤスギ属、クロッカス属、ウシノケグサ属、ダイズ属、クルミ属、シマモミ属、リソスペルマム属、ロリウム属、ハス属、トマト属、リンゴ属、ウマゴヤシ属、メセンブリアンテマム属、タバコ属、ノトツガ属、オリザ属、テンジクアオイ属、ペトロセリヌム属、センタイ属、トウヒ属、サクラ属、モミ属、トガサワラ属、ローザ属、キイチゴ属、Ryza属、サトウキビ属、マツナ属、テルンギエラ属、コムギ属、又はツガ属のいずれか1種類に属する植物に由来する、又は、アスペルギルス属に属する糸状菌、アカパンカビ属に属する糸状菌、ヤロウイア属に属する真菌、Mycosphaerella属に属する真菌に由来する、又は、マイコバクテリウム属に属する細菌、ナイセリア属に属する細菌、ストレプトマイセス属に属する細菌、ロドバクター属に属する細菌に由来する、又は、アンシロストーマ属に属する線虫、カエノルハブディティス属に属する線虫、ヘモンクス属に属する線虫、Lumbricus属に属する線虫、Meilodogyne属に属する線虫、Strongyloidus属に属する線虫、又はPristionchus属に属する線虫類に由来する4−クマレート−CoAリガーゼ/シンナメート−CoAリガーゼ(EC 6.2.1.12)であることを特徴とする請求項16に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- 前記代謝経路の各酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列の少なくとも1つのコピーが、前記微生物に組換えで導入されていることを特徴とする請求項1〜17のいずれかの請求項に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- フェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする遺伝子配列の少なくとも1つのコピーが、前記微生物中の前記遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結していることを特徴とする請求項1〜18のいずれかの請求項に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- 4−クマレート−CoAリガーゼ、又はシンナメート−CoAリガーゼをコードする遺伝子配列の少なくとも1つのコピーが、前記微生物中の前記遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結していることを特徴とする請求項1〜19のいずれかの請求項に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- リスベラトロールシンターゼをコードする遺伝子配列の少なくとも1つのコピーが、前記微生物中の前記遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結していることを特徴とする請求項1〜20のいずれかの請求項に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- ピノシルビンシンターゼをコードする遺伝子配列の少なくとも1つのコピーが、前記微生物中の前記遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結していることを特徴とする請求項1〜21のいずれかの請求項に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- 前記微生物が、発現シグナルに作動可能に連結されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする異種DNA配列の1つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結された4−クマレート−CoAリガーゼ、又はシンナメート−CoAリガーゼをコードする異種DNA配列の1つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結されたリスベラトロールシンターゼをコードする異種DNA配列の1つ以上のコピーを含有する微生物であることを特徴とする請求項1に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- 前記微生物が、発現シグナルに作動可能に連結されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする異種DNA配列の1つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結された4−クマレート−CoAリガーゼ、又はシンナメート−CoAリガーゼをコードする異種DNA配列の1つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結されたピノシルビンシンターゼをコードする異種DNA配列の1つ以上のコピーを含有する微生物であることを特徴とする請求項1に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- 前記微生物が、真菌であることを特徴とする請求項1〜24のいずれかの請求項に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- 前記微生物が、糸状菌であることを特徴とする請求項25に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- 前記微生物が、アスペルギルス属に属することを特徴とする請求項26に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- 前記微生物が、黒色アスペルギルス、又は麹菌の菌株であることを特徴とする請求項27に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- 前記微生物が、酵母菌であることを特徴とする請求項25に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- 前記微生物が、サッカロミセス属、クリベロミセス属、カンジダ属、ピチア属、デバロミセス属、ハンゼヌラ属、ヤロウイア属、ザイゴサッカロミセス属、又はシゾサッカロミセス属に属することを特徴とする請求項29に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- 前記微生物が、Saccharomyces cerevisiae、S.kluyveri、S.bayanus、S.exiguus、S.sevazzi、S.uvarum、Klyuveromyces lactis K.marxianus var.marxianus、K.thermotolerans、Candida utilis C.tropicalis、Pichia stipidis、P.pastoris、P.sorbitophila、Debaromyces hansenii、Hansenula polymorpha、Yarrowia lipolytica、Zygosaccharomyces rouxii、又はSchizosaccharomyces pombeの菌株であることを特徴とする請求項30に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- 前記微生物が、細菌であることを特徴とする請求項1〜24のいずれかの請求項に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- 前記微生物が、エシェリキア属、又はラクトコッカス属に属することを特徴とする請求項32に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- 前記微生物が、大腸菌、又は乳酸連鎖球菌の菌株であることを特徴とする請求項33に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
- フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、4−クマレート−CoAリガーゼ、又はシンナメート−CoAリガーゼ、及びリスベラトロールシンターゼをコードするヌクレオチド配列の異種発現のピノシルビンを生産するための使用。
- フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、4−クマレート−CoAリガーゼ、又はシンナメート−CoAリガーゼ、及びピノシルビンシンターゼをコードするヌクレオチド配列の異種発現のピノシルビンを生産するための使用。
- ピノシルビンの生産条件下で、代謝経路を作り出すピノシルビンを有する微生物細胞を培養する工程を含むピノシルビンを生産する方法であって、
前記経路が、基質としてフェニルアラニンを受容し、且つ、そこからケイヒ酸を生産するフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)を含み、
前記PALが、基質としてチロシンを受容し、且つ、そこからクマル酸を形成する場合、前記PALに対するKm(フェニルアラニン)/Km(チロシン)の比は、1:1未満であり、且つ、
前記微生物が、シンナメート−4−ヒドロキシラーゼ酵素(C4H)を生産する場合、Kcat(PAL)/Kcat(C4H)の比は、少なくとも2:1であることを特徴とするピノシルビンを生産する方法。 - 生産された単離ピノシルビンをさらに含むことを特徴とする請求項37に記載のピノシルビンを生産する方法。
- 前記培養工程が、ケイヒ酸又はその誘導体の外部源の実質的な非存在下で行われることを特徴とする請求項37又は請求項38に記載のピノシルビンを生産する方法。
- 前記微生物細胞が、糸状菌及び細菌からなる群より選択されることを特徴とする請求項37〜39のいずれかの請求項に記載のピノシルビンを生産する方法。
- 前記微生物細胞が、酵母菌からなる群より選択される真菌であることを特徴とする請求項40に記載のピノシルビンを生産する方法。
- 前記酵母菌が、Saccharomyes属より選択されることを特徴とする請求項41に記載のピノシルビンを生産する方法。
- 前記微生物細胞には、C4Hの外因性の生産がないことを特徴とする請求項37〜42のいずれかの請求項に記載のピノシルビンを生産する方法。
- 前記微生物細胞には、C4Hの内因性の生産がないことを特徴とする請求項43に記載のピノシルビンを生産する方法。
- 前記微生物細胞が、請求項1〜36のいずれかに従って用いられることを特徴とする請求項37〜44のいずれかの請求項に記載のピノシルビンを生産する方法。
- 前記培養工程が、単糖類、オリゴ糖類、多糖類からなる発酵性の炭素基質からなる群より選択される炭素基質の存在下で行われることを特徴とする請求項37〜45のいずれかに記載のピノシルビンを生産する方法。
- 前記発酵性の炭素基質が、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、マンノース、スクロース、ラクトース、エリトロース、スレオース、リボースであることを特徴とする請求項46に記載のピノシルビンを生産する方法。
- 前記培養工程が、非発酵性の炭素基質からなる群より選択される炭素基質の存在下で行われることを特徴とする請求項37〜47のいずれかの請求項に記載のピノシルビンを生産する方法。
- 前記非発酵性の炭素基質が、エタノール、アセテート、グリセロール、乳酸塩であることを特徴とする請求項48に記載のピノシルビンを生産する方法。
- 前記非発酵性の炭素基質が、アミノ酸からなる群より選択されることを特徴とする請求項48に記載のピノシルビンを生産する方法。
- 前記非発酵性の炭素基質が、フェニルアラニンからなる群より選択されることを特徴とする請求項50に記載のピノシルビンを生産する方法。
- 食物又は餌の製品に、栄養補助食品として前記生産されたピノシルビンの組み込みをさらに含むことを特徴とする請求項37〜51のいずれかの請求項に記載のピノシルビンの生産方法。
- 前記ピノシルビンが、乳製品又は飲料の栄養補助食品として使用されることを特徴とする請求項52のピノシルビンを生産する方法。
- 前記ピノシルビンが、ビールの栄養補助食品として使用されることを特徴とする請求項52のピノシルビンを生産する方法。
- 基質とする4−シンナモイル−CoAとの転写回転率よりも、基質とするシンナモイル−CoAとより高い転写回転率を有するスチルベンゼンシンターゼの作用によって、シンナモイル−CoAを生産し、且つ、そこからピノシルビンを生産する操作的な代謝経路を有する微生物。
- 前記スチルベンシンターゼが、前記微生物中において、前記微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸から発現されることを特徴とする請求項55に記載の微生物。
- 前記スチルベンシンターゼが、木の種に属するピノシルビンシンターゼであることを特徴とする請求項56に記載の微生物。
- 前記スチルベンシンターゼが、マツ属、ユーカリノキ属、トウヒ属、マクルラ属に固有のピノシルビンシンターゼであることを特徴とする請求項57に記載の微生物。
- 前記スチルベンシンターゼが、P.sylvestris、P.strobes、P.densiflora、P.taedaを含むマツ属に属する植物に由来するピノシルビンシンターゼ(EC 2.3.1.146)であることを特徴とする請求項58に記載の微生物。
前記ケイヒ酸が、L−フェニルアラニンからL−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)により形成されることを特徴とする請求項55に記載の微生物。 - 前記スチルベンシンターゼが、前記微生物中において、前記微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸から発現されることを特徴とする請求項59に記載の微生物。
- 前記ケイヒ酸が、シロイヌナズナ属に属する植物、アブラナ属に属する植物、ミカン属に属する植物、インゲンマメ属に属する植物、マツ属に属する植物、ハコヤナギ属に属する植物、ナス属に属する植物、サクラ属に属する植物、ヴィートス属に属する植物、トウモロコシ属に属する植物、或いは、アガスタケ属、アナナス属、アスパラガス属、ブロムヘディア属、ホウライチク属、フダンソウ属、カバノキ属、キュウリ属、ツバキ属、トウガラシ属、カッシア属、カタランサス属、マメ属、スイカ属、コーヒーノキ属、カボチャ属、ギョウギシバ属、ニンジン属、デンドロビウム属、ナデシコ属、ジギタリス属、ヤマノイモ属、ユーカリ属、ガルス属、イチョウ属、ダイズ属、オオムギ属、ヒマワリ属、サツマイモ属、アキノノゲシ属、リソスペルマム属、ハス属、トマト属、ウマゴヤシ属、リンゴ属、マニホット属、ウマゴヤシ属、メセンブリアンテマム属、タバコ属、オリーブ属、オリザ属、ピスム属、ペルセア属、ペトロセリヌム属、ファレノプシス属、マダケ属、センタイ属、ピケア属、ピルス属、ケルクス属、ラファヌス属、ジオウ属、キイチゴ属、モロコシ属、スフェノスチリス属、ハコベ属、スタイロ属、コムギ属、シャジクソウ属、コムギ属、スノキ属、ササゲ属、又はジニア属のいずれか1種類に属する植物、又は、アスペルギルス属に属する糸状菌に由来するL−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(EC 4.3.1.5)によりL−フェニルアラニンから形成されることを特徴とする請求項60に記載の微生物。
- 前記PALが、基質としてチロシンを受容し、且つ、そこからケイヒ酸を形成する場合、前記PALに対するKm(フェニルアラニン)/Km(チロシン)の比は、1:1未満となるように、前記PALが、基質としてフェニルアラニンを1つ受容し、且つ、そこからケイヒ酸を生産することを特徴とする請求項59〜61のいずれかの請求項に記載の微生物。
- 前記微生物が、シンナメート−4−ヒドロキシラーゼ酵素(C4H)を生産する場合、Kcat(PAL)/Kcat(C4H)の比は、少なくとも2:1であることを特徴とする請求項62に記載の微生物。
- スチルベンシンターゼの作用により、シンナモイル−CoAを生産し、且つ、そこからピノシルビンを生産する操作的な代謝経路を有する微生物であって、
前記L−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)が、基質としてチロシンを受容し、且つ、そこからクマル酸を形成する場合、前記PALに対するKm(フェニルアラニン)/Km(チロシン)の比は、1:1未満となるように、前記ケイヒ酸が、基質としてフェニルアラニンを受容し、且つ、そこからケイヒ酸を生産する前記PALにより、L−フェニルアラニンから形成されることを特徴とするピノシルビンを生産する方法。 - 前記微生物が、シンナメート−4−ヒドロキシラーゼ酵素(C4H)を生産する場合、Kcat(PAL)/Kcat(C4H)の比は、少なくとも2:1であることを特徴とする請求項64に記載の微生物。
- シンナモイル−CoAが、ATP及びCoAが基質で、且つ、ADPが生成物である酵素により触媒される反応で形成されることを特徴とする請求項55〜65のいずれかの請求項に記載の微生物。
- シンナモイル−CoAが、4−クマロイル−CoAリガーゼ、又はシンナメート−CoAリガーゼにより触媒される反応で形成されることを特徴とする請求項66に記載の微生物。
- 前記4−クマロイル−CoAリガーゼ、又はシンナメート−CoAリガーゼが、前記微生物中において、前記微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸から発現されることを特徴とする請求項67に記載の微生物。
- 前記4−クマレート−CoAリガーゼ、又はシンナメート−CoAリガーゼが、モミ属に属する植物、シロイヌナズナ属に属する植物、アブラナ属に属する植物、ミカン属に属する植物、カラマツ属に属する植物、インゲンマメ属に属する植物、マツ属に属する植物、ハコヤナギ属に属する植物、ナス属に属する植物、ヴィートス属、トウモロコシ属に属する植物、或いは、アガスタケ属、アンフォラ属、カタヤ属、ヒマラヤスギ属、クロッカス属、ウシノケグサ属、ダイズ属、クルミ属、シマモミ属、リソスペルマム属、ロリウム属、ハス属、トマト属、リンゴ属、ウマゴヤシ属、メセンブリアンテマム属、タバコ属、ノトツガ属、オリザ属、テンジクアオイ属、ペトロセリヌム属、センタイ属、トウヒ属、サクラ属、モミ属、トガサワラ属、ローザ属、キイチゴ属、Ryza属、サトウキビ属、マツナ属、テルンギエラ属、コムギ属、又はツガ属のいずれか1種類に属する植物に由来する、又は、アスペルギルス属に属する糸状菌、アカパンカビ属に属する糸状菌、ヤロウイア属に属する真菌、Mycosphaerella属に属する真菌に由来する、又は、マイコバクテリウム属に属する細菌、ナイセリア属に属する細菌、ストレプトマイセス属に属する細菌、ロドバクター属に属する細菌に由来する、又は、アンシロストーマ属に属する線虫、カエノルハブディティス属に属する線虫、ヘモンクス属に属する線虫、Lumbricus属に属する線虫、Meilodogyne属に属する線虫、Strongyloidus属に属する線虫、又はPristionchus属に属する線虫類に由来する4−クマレート−CoAリガーゼ/シンナメート−CoAリガーゼ(EC 6.2.1.12)であることを特徴とする請求項68に記載の微生物。
- 前記代謝経路の各酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子配列の少なくとも1つのコピーが、前記微生物に組換えで導入されていることを特徴とする請求項55〜69のいずれかの請求項に記載の微生物。
- フェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする遺伝子配列の少なくとも1つのコピーが、前記微生物中の前記遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結していることを特徴とする請求項55〜70のいずれかの請求項に記載の微生物。
- 4−クマレート−CoAリガーゼ、又はシンナメート−CoAリガーゼをコードする遺伝子配列の少なくとも1つのコピーが、前記微生物中の前記遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結していることを特徴とする請求項55〜71のいずれかの請求項に記載の微生物。
- 前記シンナメート−CoAリガーゼが、基質とするトランス−クマル酸よりも、基質するクマル酸とより大きい活性を有することを特徴とする請求項72に記載の微生物。
- ピノシルビンシンターゼをコードする遺伝子配列の少なくとも1つのコピーが、前記微生物中の前記遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに作動可能に連結していることを特徴とする請求項55〜73のいずれかの請求項に記載の微生物。
- 前記微生物が、発現シグナルに作動可能に連結されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする異種DNA配列の1つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結された4−クマレート−CoAリガーゼ、又はシンナメート−CoAリガーゼをコードする異種DNA配列の1つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結されたリスベラトロールシンターゼをコードする異種DNA配列の1つ以上のコピーを含有することを特徴とする請求項55、請求項64、又は請求項65に記載の微生物。
- 前記微生物が、発現シグナルに作動可能に連結されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする異種DNA配列の1つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結された4−クマレート−CoAリガーゼ、又はシンナメート−CoAリガーゼをコードする異種DNA配列の1つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに作動可能に連結されたピノシルビンシンターゼをコードする異種DNA配列の1つ以上のコピーを含有することを特徴とする請求項55、請求項64、請求項65に記載の微生物。
- 前記微生物が、真菌であることを特徴とする請求項55〜76のいずれかの請求項に記載の微生物。
- 前記微生物が、糸状菌であることを特徴とする請求項77に記載の微生物。
- 前記微生物が、アスペルギルス属に属する微生物であることを特徴とする請求項78に記載の微生物。
- 前記微生物が、黒色アスペルギルス、又は麹菌の菌株であることを特徴とする請求項79に記載の微生物。
- 前記微生物が、酵母菌であることを特徴とする請求項77に記載の微生物。
- 前記微生物が、サッカロミセス属、クリベロミセス属、カンジダ属、ピチア属、デバロミセス属、ハンゼヌラ属、ヤロウイア属、ザイゴサッカロミセス属、又はシゾサッカロミセス属に属することを特徴とする請求項81に記載の微生物。
- 前記微生物が、Saccharomyces cerevisiae、S.kluyveri、S.bayanus、S.exiguus、S.sevazzi、S.uvarum、Klyuveromyces lactis K.marxianus var.marxianus、K.thermotolerans、Candida utilis C.tropicalis、Pichia stipidis、P.pastoris、P.sorbitophila、Debaromyces hansenii、Hansenula polymorpha、Yarrowia lipolytica、Zygosaccharomyces rouxii、又はSchizosaccharomyces pombeの菌株であることを特徴とする請求項82に記載の微生物。
- 前記微生物が、細菌であることを特徴とする請求項55に記載の微生物。
- 前記微生物が、エシェリキア属、又はラクトコッカス属に属することを特徴とする請求項84に記載の微生物。
- 前記微生物が、大腸菌、又は乳酸連鎖球菌の菌株であることを特徴とする請求項85に記載の微生物。
- ピノシルビンの生産条件下で、請求項55〜86のいずれかの請求項に記載の微生物を培養する工程を含むピノシルビンを生産する方法。
- 微生物で生産されたピノシルビンを含む食物の製品。
- 微生物細胞、及び少なくとも乾燥重量基準で1.5mg/gのピノシルビンを含む微生物組成物。
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