CN101535488B

CN101535488B - 用于生产赤松素的代谢改造细胞

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Publication number: CN101535488B
Application number: CN2007800336364A
Authority: CN
Inventors: 迈克尔·卡茨; 约亨·福斯特; 黑尔佳·大卫; 汉斯·彼得·施密特; 马林·森德柳斯; 萨拉·彼得森·比约恩; 托马斯·托马森·杜尔许斯
Original assignee: Fluxome Sciences AS
Current assignee: Evolva Holding SA
Priority date: 2006-07-20
Filing date: 2007-07-19
Publication date: 2012-10-24
Anticipated expiration: 2027-07-19
Also published as: EP2046966B1; ZA200900958B; CA2658294A1; JP2009543572A; US9725743B2; US20090317881A1; AU2007275126A8; AU2007275126A1; EP2046966A1; AU2007275126B2; US8343739B2; GB0614442D0; WO2008009728A1; CN101535488A; CA2658294C; ES2585477T3; US20140024862A1; JP5528108B2; NZ574895A

Abstract

使用经遗传改造的微生物进行赤松素生产，所述微生物具有产生肉桂酰辅酶A和通过茋合酶的作用由其产生赤松素的有效代谢途径。所述肉桂酸可通过L-苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)由L-苯丙氨酸形成，PAL是一种接受苯丙氨酸为底物并由其产生肉桂酸的酶，优选使得如果该PAL还接受酪氨酸作为底物并由其形成香豆酸，则所述PAL的Km(苯丙氨酸)/Km(酪氨酸)比值小于1∶1，并且如果所述微生物产生肉桂酸-4-羟化酶(C4H)，则K_cat(PAL)/K_cat(C4H)的比值为至少2∶1。

Description

用于生产赤松素的代谢改造细胞

技术领域

本发明总体而言涉及赤松素这种多酚的生产。此外，本发明涉及产生赤松素的天然或重组微生物用于生产食品、饲料和饮料的用途。

背景技术

利用微生物生产化学品是生物技术的一种重要应用。开发这样的生物生产方法的步骤一般可包括1)选择合适的微生物宿主，2)消除产生副产物的代谢途径，3)使期望的途径在酶活性水平和转录水平都失去调节，和4)过表达期望途径中的适当酶。在一些优选的方面中，本发明利用以上步骤的组合，通过植物苯基丙烷类(phenylpropanoid)途径的酶使来自苯丙氨酸的碳流重新定向，所述苯基丙烷类途径为期望的赤松素生物合成提供必要的前体。

赤松素(或称为银松素或3，5-二羟基反式茋)是一种属于茋类植物抗毒素的植物酚，茋类植物抗毒素是构成植物中应答于感染或其他胁迫相关事件的主动防御机制的低分子量次级代谢物。茋类植物抗毒素包含茋骨架(反式茋)作为其共同的基本结构：还可通过添加其他基团进行补充(Hart和Shrimpton，1979，Hart，1981)。茋类可见于某些树木中(被子植物、裸子植物)，但也可见于一些草本植物中(在桃金娘科(Myrtaceae)、葡萄科(Vitaceae)和豆科(Leguminosae)物种中)。所述化合物对有害生物(特别是对真菌、细菌和昆虫)具有毒性。仅有少数植物能够合成茋类或者以足以抵抗昆虫的量提供茋类。

基本茋骨架的合成通过茋合酶进行，在多数所检查物种中该酶包括一个小基因家族(Kodan等2002)。茋合酶似乎是由查耳酮合酶演化而来，属于具有超过65％氨基酸同源性的聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)超家族。与细菌PKS不同，茋合酶和查耳酮合酶都作为具有单个活性位点的单模块PKS发挥作用，形成相对小的同型二聚体(Tropf等，1995)。茋合酶和查耳酮合酶使用共同的底物：三种丙二酸单酰辅酶A和一种肉桂酰辅酶A/对香豆酰辅酶A，通过类似的反应机制形成其产物(Kindl，1985)。茋合酶可归类到4-香豆酰辅酶A特异性类型(使用4-香豆酰辅酶A作为底物时具有最高活性，例如白藜芦醇合酶(EC2.3.1.95))中，或者归类到肉桂酰辅酶A特异性类型(使用肉桂酰辅酶A作为底物时具有最高活性，例如赤松素合酶(EC 2.3.1.146))中。编码白藜芦醇合酶的基因之前已就花生(Arachis hypogaea)(Schoppner和Kindl，1984；Schroder等，1988)和葡萄(Vitis vinifera)(Melchior和Kindl，1991；Wiese等，1994)进行了描述，而编码赤松素合酶的基因主要针对松树(Pinus sylvestris和Pinus strobus)进行了描述(Schanz等，1992；Raiber等，1995；Kodan等，2002；Hemingway等，1977)。

赤松素存在于桉树、云杉树和松树例如欧洲赤松(Pinus sylvestris)、赤松(Pinus densiflora)、火炬松(Pinus taeda)和北美乔松(Pinus strobus)的木浆中。在松树中，赤松素组分仅存在于心材中(Kindl，1985)。然而，该化合物作为对损伤、真菌攻击或环境胁迫(如UV照射和臭氧接触)的应答而在边材、韧皮部和针叶中被诱导出来(Hart，1981；Kindl，1985；Richter和Wild，1992；Lieutier等，1996；Rosemann等，1991)。该化合物具有针对广泛的真菌种类的高效抗真菌活性(Lindberg等，2004；，Pacher等，2002)。

赤松素(图1，反式)由两个紧密连接的酚环组成，因此属于多酚。与多数其他羟基茋不同，赤松素缺乏环B中的羟基(图1)，由未取代的肉桂酰辅酶A和三个丙二酸单酰辅酶A分子缩合而成。也就是说，赤松素在结构上类似于红酒中发现的三羟基茋——白藜芦醇(Aggarwal等，2004)。已经有许多数据证实了白藜芦醇在健康方面的益处。例如，白藜芦醇在许多癌细胞系中的高效抗癌活性已经非常明确(Aggarwal等，2004)。由于在结构上与白藜芦醇的相似性，预计赤松素也具有高效的健康益处。事实上，已经研究了赤松素对多种癌症的作用，包括结肠直肠癌和肝癌，并已显示其化学预防和抗白血病的活性(Skinnider和Stoessl，1986；.Mellanen等，1996；Roupe等，2005以及2006)。此外，赤松素还具有抗氧化剂的能力，尽管程度低于例如白藜芦醇(Stojanovic等，2001)。

目前，赤松素大多在多种黄酮类的混合物中获得，该混合物提取自松树皮。所述提取是产率很低的劳动密集型方法。在一些优选的方面中，本发明提供新的更为高效且高产率的生产方法。

在植物中，苯基丙烷类途径负责合成多种次级代谢化合物，包括木质素、水杨酸、香豆素、羟基肉桂酰胺、色素、类黄酮和植物抗毒素。事实上，茋类在植物中的形成通过苯基丙烷类途径进行。通过L-苯丙氨酸氨裂合酶(L-phenylalanine ammonia lyase，PAL)，经由非氧化脱氨基作用将氨基酸L-苯丙氨酸转化成反式肉桂酸(图2)。从反式肉桂酸开始，该途径可分支成形成白藜芦醇的途径或形成赤松素的途径。在第一个途径中，通过肉桂酸-4-羟化酶(cinnamate-4-hydroxylase，C4H)(一种细胞色素P450单加氧酶)与NADPH：细胞色素P450还原酶(cytochrome P450 reductase，CPR)的结合，将反式肉桂酸在对位羟化成4-香豆酸(4-羟基肉桂酸)。其后，接着通过4-香豆酸-辅酶A连接酶(4-coumarate-CoA ligase，4CL)的作用将4-香豆酸活化成4-香豆酰辅酶A。接着，一种白藜芦醇合酶(VST1)可催化4-香豆酰辅酶A的苯基丙烷单元与丙二酸单酰辅酶A缩合，从而形成白藜芦醇。在后一途径中，通过4CL的作用将反式肉桂酸直接活化成肉桂酰辅酶A，其中赤松素合酶(pinosylvin synthase，PST)随后催化肉桂酰辅酶A中苯基丙烷单元与丙二酸单酰辅酶A的缩合，从而形成赤松素。

茋合酶是一些底物相当广泛的酶，能接受多种生理及非生理底物。例如，体外加成多种苯基丙烷辅酶A起始酯类导致形成若干产物(Ikuro等，2004；Morita等，2001)。类似地，已经显示，来自大黄(Rheumtartaricum)的白藜芦醇合酶在以肉桂酰辅酶A代替香豆酰辅酶A作为底物时事实上合成了少量赤松素(Samappito等，2003)。

类似地，香豆酰辅酶A连接酶可接受香豆酸和肉桂酸作为底物，尽管对肉桂酸的催化效率(K_m/K_cat)比香豆酸低100倍(Allina等，1998；Ehlting等，1999)。我们由此推断，有可能在由4CL和茋合酶(甚至是指定为经典白藜芦醇合酶的茋合酶)所组成的途径中产生赤松素。

近来，公开了一种能从葡萄汁中少量存在的香豆酸产生白藜芦醇的酵母(Becker等2003，ZA200408194)。通过共表达异源辅酶A连接酶基因(来自杂交白杨)与葡萄白藜芦醇合酶基因(VST1)实现了在酿酒酵母(S.cerevisiae)实验室菌株中由外源4-香豆酸产生4-香豆酰辅酶A和伴随产生的白藜芦醇。白藜芦醇合酶的另一种底物丙二酸单酰辅酶A已在酵母中内源产生，并参与脂肪酸从头生物合成。该研究显示，酿酒酵母细胞在补充有4-香豆酸的合成培养基中培养时可产生游离形式或与葡糖苷结合形式的少量白藜芦醇。

由于白藜芦醇合酶的底物广泛性，所述酵母有可能在添加显著量的肉桂酸进行培养时也能产生赤松素。然而，这种酵母的商业应用将受困于很可能出现的低白藜芦醇产率以及因在工业培养基中不充足而需要添加肉桂酸。因此，为了加快并拓宽赤松素作为药物或营养物的应用，非常期望提供能直接由葡萄糖生产赤松素而无需添加肉桂酸或任何下游肉桂酸衍生物(例如肉桂酰辅酶A)的酵母或其他微生物。

最近的一项研究(Ro和Douglas，2004)描述了通过引入来自白杨的PAL、C4H和CPR在酿酒酵母中重建苯基丙烷类途径的进入点。其目的是评估含有PAL和C4H的多酶复合体(multienzyme complex，MEC)对于进入苯基丙烷类代谢的这一进入点是否具有功能重要性。通过向重组酵母提供[3H]-苯丙氨酸，发现大部分代谢掉的[3H]-苯丙氨酸掺入到4-[3H]-香豆酸中，并且通过抑制C4H活性高度降低了苯丙氨酸代谢。此外，仅表达PAL的宿主仅将极少量苯丙氨酸代谢成肉桂酸。当向该三重表达宿主同时提供[3H]-苯丙氨酸和[14C]-反式肉桂酸时，没有发现内源合成的[3H]-反式肉桂酸流向4-香豆酸的证据。因此，在酵母中，通过PAL和C4H所催化反应从苯丙氨酸向4-香豆酸的有效碳流量似乎不需要通过MEC，PAL与C4H的完全生物化学偶联看来足以驱动碳流量进入苯基丙烷类途径。在另一项研究(Hwang等，2003)中，通过表达人工基因簇实现了通过大肠杆菌产生植物特异性黄酮，所述人工基因簇包含多种异源来源的三个苯基丙烷类途径基因：来自酵母菌深红酵母(Rhodotorula rubra)的PAL、来自放线菌天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)的4CL以及来自甘草植物刺甘草(Glycyrrhiza echinata)的查耳酮合酶(chalcone synthase，CHS)。这些途径绕开了C4H，因为细菌4CL酶将反式肉桂酸和4-香豆酸均与辅酶A连接。此外，来自深红酵母的PAL使用苯丙氨酸和酪氨酸均作为底物。因此，含有该基因簇并在葡萄糖上培养的大肠杆菌细胞产生少量的两种黄酮：来自苯丙氨酸的生松素(0.29g/l)和来自酪氨酸的柚皮素(0.17g/l)。此外，还累积了大量它们的前体：4-香豆酸和反式肉桂酸(分别为0.47和1.23mg/l)。另外，可通过添加苯丙氨酸和酪氨酸来提高这些化合物的产率。

还描述了这样的研究：其中通过首先将基因克隆进大肠杆菌来研究赤松素合酶的酶特性。例如，Raiber等，1995报告了来自北美乔松(东方白松)(Pinus strobus)的茋类，其中在大肠杆菌中异源表达后对其进行研究。为此，使用来自欧洲赤松(Pinus sylvestris)的茋合酶(stilbenesynthase，STS)探针筛选北美乔松cDNA文库，在所分离的cDNA中发现了两种密切相关的STS基因：STS1和STS2，其蛋白质中存在五个氨基酸差异。将所述基因克隆到质粒上并在大肠杆菌中表达，对细胞提取物进行酶测定。看上去两种蛋白质都接受肉桂酰辅酶A作为底物，因此被认为是赤松素合酶，但它们显示了巨大的差异。STS1仅具有STS2活性的3-5％，其最适pH向更低值(pH6)迁移，并且其使用肉桂酰辅酶A合成另一种未知产物。定点诱变显示，STS1中Arg向His的单个改变造成了所有这些差异。在另一项研究中，分离了来自赤松(Pinusdensifiora)的三种STS cDNA(PDSTS1、PDSTS2和PDSTS3)，并在大肠杆菌中异源表达所述cDNA，以表征其酶特性(Kodan等，2002)。PDSTS3看来是一种不常见的STS同工酶，其在所测试的STS中显示最高的赤松素形成活性。此外，PDSTS3对产物抑制不敏感，这与PDSTS1和PDSTS2不同。PDSTS3的不寻常特征可能是由于缺少了茋合酶通常具有的C端延伸部分，这是由移码突变导致的。在另一项研究中，用赤松素合酶cDNA pSP-54作为探针筛选基因组DNA文库(Müller等，1999)。亚克隆之后，通过测序来表征四种不同的成员。从PST-1、PST-2、PST-3和PST-5推出的氨基酸序列具有高于95％的总体同一性。

接着通过在烟草原生质体中进行瞬时表达来分析启动子强度的差异。所使用的构建体包含在松树基因PST-1、PST-2和PST-3的启动子控制之下的细菌葡萄糖醛酸糖苷酶。用UV光或真菌激发剂处理后，PST-1的启动子显示最高的应答，并在维管束中产生组织特异性表达。该数据提示，在松树中，PST-1的基因产物负责幼苗中的胁迫应答以及心材中的赤松素形成。

另一项研究显示，克隆自苏格兰松(欧洲赤松)的一种茋合酶先前被错误地归类为二氢赤松素合酶，但它显示是赤松素合酶。之前的误解是由于细菌因子影响了在大肠杆菌中表达的植物特异性蛋白的底物偏好性和活性。改进表达系统后，后续的动力学分析显示，所克隆的茋合酶的偏好底物是肉桂酰辅酶A，而不是苯基丙酰基辅酶A。此外，来自欧洲赤松的提取物中含有选择性影响底物偏好性的因子，即：使用苯基丙酰基辅酶A时活性降低，而使用肉桂酰辅酶A则不然。这解释了植物提取物与大肠杆菌中表达的克隆酶之间的表观差异，并且提醒人们，自然界及新宿主中的因子可以使克隆序列的功能鉴定复杂化。

此外，描述了带有茋合酶(可以指白藜芦醇合酶和赤松素合酶)基因的载体，所述载体用于转化生物体和植物体以赋予增强的昆虫及创伤抗性(EP0309862和EP0464461)。

此外，还描述了含有与欧洲赤松中赤松素合酶杂交的DNA序列的另一些载体(US5391724)，所述载体用于在植物中进行表达(US5973230)。然而，没有公开将PAL和4CL与茋合酶一起掺入以用于在生物中产生赤松素。也没有公开任何产生赤松素的微生物。

近来，已有证据显示丝状真菌米曲霉(A.oryzae)中含有通常在植物中参与类黄酮(如柚皮素)生物合成的查耳酮合酶(CHS)(Juvvadi等，2005；Seshime等，2005)。事实上，还显示米曲霉中含有负责苯基丙烷类-类黄酮代谢的一组重要基因，即PAL、C4H和4CL。然而，没有迹象表面米曲霉中含有茋合酶。

我们的共同未决申请WO2006/089898描述了产生白藜芦醇的微生物，特别是酵母。

发明概述

本发明现提供了具有有效代谢途径的微生物，所述代谢途径中包含至少一种由肉桂酸产生赤松素的酶活性。在一些优选的微生物中，所述途径产生肉桂酸并由其产生赤松素。特别地，本发明提供了这些微生物用于生产赤松素的用途。这样的微生物可以是天然存在的，并可通过适当的筛选方法(例如简并性PCR、Southern印迹和计算机同源性检索)分离，但更优选是经遗传改造的。

本发明包括从这些微生物中生产赤松素的方法，并任选地包括分离或纯化由此产生的赤松素。优选地，培养在基本不存在外源肉桂酸的情况下进行。这也暗指基本不存在于苯基丙烷类途径中由其形成的肉桂酸衍生物(例如肉桂酰辅酶A)的外源来源。

优选实施方案详述

优选地，所述赤松素或衍生物在内源丙二酸单酰辅酶A是其底物的酶催化反应中产生，优选地，由肉桂酰辅酶A产生所述赤松素。

所述赤松素或衍生物优选由肉桂酰辅酶A产生，优选通过茋合酶产生，所述茋合酶优选由编码所述酶的核酸在所述微生物中表达，其中所述核酸不是该微生物中天然存在的。

一般来说，在本文中，除非上下文表明为其他含义，否则提及赤松素时包括其寡聚衍生物或糖苷结合衍生物。

因此，在某些优选的实施方案中，所述茋合酶为白藜芦醇合酶(EC2.3.1.95)，所述白藜芦醇合酶来自属于落花生属(Arachis)的植物，例如A.glabatra、落花生(A.hypogaea)；属于大黄属(Rheum)的植物，例如圆叶大黄(R.tataricum)；属于葡萄属(Vitus)的植物，例如美国葡萄(V.labrusca)、河岸葡萄(V.riparaia)、欧洲葡萄(V.vinifera)；或者以下任何属的植物：松属(Pinus)、云杉属(Piceea)、百合属(Lilium)、桉属(Eucalyptus)、爬山虎属(Parthenocissus)、白粉藤属(Cissus)、蝶花百合属(Calochortus)、蓼属(Polygonum)、买麻藤属(Gnetum)、木菠萝属(Artocarpus)、假山毛榉属(Nothofagus)、刺葵属(Phoenix)、羊茅属(Festuca)、薹草属(Carex)、藜芦属(Veratrum)、羊蹄甲属(Bauhinia)或老虎刺属(Pterolobium)。

所述茋合酶可以是在以肉桂酰辅酶A作为底物时转换率高于(例如至少1.5或至少2的因数)在以4-香豆酰辅酶A作为底物时转换率的酶。因此，在另一些优选的实施方案中，所述茋合酶是赤松素合酶，其合适地来自树木，例如松属、桉属、云杉属或橙桑属(Maclura)物种。特别地，所述茋合酶可以是来自以下植物的赤松素合酶(EC 2.3.1.146)：属于松属的植物，例如欧洲赤松、北美乔松、赤松、火炬松(P.taeda)；属于云杉属的植物，或者桉属的任一植物。

优选地，所述肉桂酸可在酶催化的产生氨的反应中从L-苯丙氨酸产生，适当时所述肉桂酸通过苯丙氨酸氨裂合酶从L-苯丙氨酸产生。

在一些优选的实施方案中，所述L-苯丙氨酸氨裂合酶是来自植物或微生物的L-苯丙氨酸氨裂合酶(EC 4.3.1.5)。所述植物可属于拟南芥属(Arabidopsis)，例如拟南芥(A.thaliana)；属于芸苔属(Brassica)的植物，例如欧洲油菜(B.napus)、芜青(B.rapa)；属于柑橘属(Citrus)的植物，例如柑橘(C.reticulata)、克莱蒙柑橘(C.clementinus)、柠檬(C.limon)；属于菜豆属(Phaseolus)的植物，例如荷包豆(P.coccineus)、菜豆(P.vulgaris)；属于松属(Pinus)的植物，例如北美短针松(P.banksiana)、加州山松(P.monticola)、海岸松(P.pinaster)、欧洲赤松(P.sylvestris)、火炬松(P.taeda)；属于杨属(Populus)的植物，例如小叶杨(P.balsamifera)、P.deltoides、加杨(P.Canadensis)、P.kitakamiensis、欧洲山杨(P.tremuloides)；属于茄属(Solanum)的植物，例如马铃薯(S.tuberosum)；属于李属(Prunus)的植物，例如欧洲甜樱桃(P.avium)、桃(P.persica)；属于葡萄属(Vitus)的植物，例如葡萄(Vitus vinifera)；属于玉蜀黍属(Zea)的植物，例如玉蜀黍(Z.mays)；或者其他植物属，例如藿香属(Agastache)、凤梨属(Ananas)、天门冬属(Asparagus)、布氏兰属(Bromheadia)、簕竹属(Bambusa)、甜菜属(Beta)、桦木属(Betula)、黄瓜属(Cucumis)、山茶属(Camellia)、辣椒属(Capsicum)、决明属(Cassia)、长春花属(Catharanthus)、鹰嘴豆属(Cicer)、西瓜属(Citrullus)、咖啡属(Coffea)、南瓜属(Cucurbita)、狗牙根属(Cynodon)、胡萝卜属(Daucus)、石斛属(Dendrobium)、石竹属(Dianthus)、洋地黄属(Digitalis)、薯蓣属(Dioscorea)、桉属(Eucalyptus)、Gallus、银杏属(Ginkgo)、大豆属(Glycine)、大麦属(Hordeum)、向日葵属(Helianthus)、番薯属(IPomoea)、莴苣属(Lactuca)、紫草属(Lithospermum)、百脉根属(Lotus)、番茄属(Lycopersicon)、苜蓿属(Medicago)、苹果属(Malus)、木薯属(Manihot)、苜蓿属(Medicago)、日中花属(Mesembryanthemum)、烟草属(Nicotiana)、木犀榄属(Olea)、稻属(Oryza)、豌豆属(Pisum)、鳄梨属(Persea)、欧芹属(Petroselinum)、蝴蝶兰属(Phalaenopsis)、刚竹属(Phyllostachys)、小立碗藓属(Physcomitrella)、云杉属(Picea)、梨属(Pyrus)、栎属(Quercus)、萝卜属(Raphanus)、地黄属(Rehmannia)、悬钩子属(Rubus)、高粱属(Sorghum)、Sphenostylis、繁缕属(Stellaria)、铅笔花属(Stylosanthes)、小麦属(Triticum)、车轴草属(Trifolium)、小麦属(Triticum)、越桔属(Vaccinium)、豇豆属(Vigna)、百日草属(Zinnia)。所述微生物可以是属于蘑菇属(Agaricus)的真菌，例如双孢蘑菇(A.bisporus)；属于曲霉属(Aspergillus)的真菌，例如米曲霉(A.oryzae)、构巢曲霉(A.nidulans)、烟曲霉(A.fumigatus)；属于黑粉菌属(Ustilago)的真菌，例如U.maydis；属于红细菌属(Rhodobacter)的细菌，例如荚膜红细菌(R.capsulatus)；属于链霉菌属(Streptomyces)的细菌，例如S.maritimus；属于光杆状菌属(Photorhabdus)的细菌，例如发光光杆状菌(P.luminescens)；属于红酵母(Rhodotorula)的酵母，例如深红酵母(R.rubra)。

由于如上文所述，为了产生赤松素，我们需要通过PAL酶产生肉桂酸并将其转化成赤松素，而不是通过底物广泛的PAL从酪氨酸产生香豆酸或是通过C4H酶转化肉桂酸来生产香豆酸，因此由于本发明的微生物优选具有偏好以苯丙氨酸(因此产生肉桂酸)而不是酪氨酸(将产生香豆酸)作为底物的PAL。因此，该PAL的K_m(苯丙氨酸)/K_m(酪氨酸)比值优选小于1∶1，优选小于1∶5，例如小于1∶10。一般地，K_m是产生最高产物形成速率(V_max)一半的底物(分别为苯丙氨酸或酪氨酸)摩尔浓度。

C4H的存在对于赤松素产生没有帮助，但也无需禁止，只要肉桂酸不将肉桂酸从赤松素产生过多地转向形成白藜芦醇的方向即可。因此，优选地，不存在C4H产生，或者使得K_cat(PAL)/K_cat(C4H)大于2，优选大于4。一般地，在每种情况下，K_cat是V_max/[酶]，其中[酶]是相关酶的浓度。

例如，拟南芥苯丙氨酸氨裂合酶PAL2及其同源物PAL1的典型Km值在使用苯丙氨酸作为底物时约为60μM(Cochrane等，2004)，在使用酪氨酸为底物时则高于1000μM(Watts等，2006)。拟南芥PAL2的催化转换率K_cat在将苯丙氨酸转化成肉桂酸时为192mol/mol酶PAL2(Cochrane等，2004)，而将酪氨酸转化成香豆酸时K_cat很小。具有以上动力学特性的PAL特异性地以苯丙氨酸作为底物，并仅仅从苯丙氨酸形成肉桂酸，从酪氨酸形成香豆酸的水平检测不到。

C4H所催化的羟化酶反应的典型转换率在天然酵母CPR活性支持该反应时为25摩尔香豆酸产物/摩尔酶/分钟(Urban等，1994)。C4H的活性可受限于NADPH的可用性，如果过表达细胞色素P450羟化酶(CPR)则这种活性可提高。如果CPR如文献所示例的那样过表达5至20倍(Mizutani等1998，Urban等，1994)，则C4H反应将肉桂酸转化成香豆酸的催化转换率分别提高到125摩尔香豆酸产物/摩尔酶/分钟和530摩尔香豆酸产物/摩尔酶/分钟。

组合反应PAL-C4H-CPR的结果将取决于催化数和每种酶的存在量，特别是支持为C4H供给电子(NADPH)的CPR的量。使用天然CPR活性时，高效的PAL将给出约192摩尔肉桂酸/摩尔PAL/分钟，其后C4H酶将约25摩尔这种肉桂酸/摩尔C4H/分钟转化成香豆酸。因此，使用天然CPR活性，该组合反应PAL-C4H-CPR的主要产物将是肉桂酸(167摩尔肉桂酸/摩尔PAL酶/分钟和25摩尔香豆酸/摩尔C4H酶/分钟)。如果以高水平过表达，则越高的CPR活性将导致越高的C4H活性/摩尔C4H酶，最终导致纯的香豆酸。在Mizutani的论文(Mizutani等，1998)中，过表达仅5倍的CPR会导致125摩尔香豆酸/摩尔C4H/分钟，而从所述PAL每分钟仅产生67摩尔肉桂酸。因此，为了(不期望的)纯香豆酸产生，CPR必须至少过表达约8倍。

对于带有若干PAL/TAL和C4H的重组或天然微生物的情况，可以制备细胞提取物，并测量表观催化转换率和Km值作为表观酶PAL、TAL或C4H的总和(或总和酶)。从这些估计的整体特性中将有可能确定该生物主要产生香豆酸还是肉桂酸，并因此确定当在该生物中表达4CL和VST时结果将是哪种产物：白藜芦醇还是赤松素。在此，转换率将表示为摩尔产物/(摩尔总蛋白/时间)，而不是使用纯酶时的摩尔产物/(摩尔纯酶/时间)。因此，对于PAL而言小于1∶1的优选比值K_m(苯丙氨酸)/K_m(酪氨酸)可适用于存在多于一种PAL时的总和PAL活性，大于2的优选比值K_cat(PAL)/K_cat(C4H)可适用于存在多于一种PAL和/或C4H活性时的PAL和/或C4H总和活性(通过CPR调节)。

优选地，所述微生物不含有外源C4H，即未经遗传修饰以提供C4H酶的表达。所存在的任何C4H产生都将是该生物天然的。任选地，所述无外源C4H的微生物还可缺乏内源C4H。内源C4H的缺乏可以是由于通过遗传工程或基因沉默方法缺失了天然C4H能力，或者仅仅是因为该生物由于该酶不是其代谢的一部分而天然地缺乏C4H基因。

同时，从上文可以看出，CPR的存在对于赤松素的产生没有帮助，其过表达一般不是期望的，尽管并不禁止。因此，所述微生物优选地不具有内源性CPR、不具有外源性CPR或没有天然CPR过表达，或者降低了天然CPR的表达。

适当时，所述L-苯丙氨酸氨裂合酶通过编码所述酶的对该微生物来说非天然的核酸在所述微生物中表达。

优选地，肉桂酰辅酶A在以ATP和辅酶A为底物、ADP为产物的酶催化反应中形成，适当时，肉桂酰辅酶A在4-香豆酸辅酶A连接酶(也称为4-香豆酰辅酶A连接酶)所催化的反应中形成。已知的4-香豆酸辅酶A连接酶接受4-香豆酸或肉桂酸作为底物，并产生相应的辅酶A衍生物。通常，无论是以4-香豆酸作为底物还是以肉桂酸作为底物显示更高的活性，这些酶都称为“4-香豆酸辅酶A连接酶”。然而，我们在本文中将具有这种底物偏好性的酶称为“肉桂酸辅酶A连接酶”(或肉桂酰辅酶A连接酶)。一种这样的酶描述于例如Aneko等，2003。

所述4-香豆酸辅酶A连接酶或肉桂酸辅酶A连接酶可以是来自植物、微生物或线虫的4-香豆酸辅酶A连接酶/肉桂酸辅酶A连接酶(EC6.2.1.12)。所述植物可以是以下植物：属于冷杉属(Abies)的植物，例如百山祖冷杉(A.beshanzuensis)、日本冷杉(B.firma)、杉松(B.holophylla)；属于拟南芥属(Arabidopsis)的植物，例如拟南芥(A.thaliana)；属于芸苔属(Brassica)的植物，例如欧洲油菜(B.napus)、芜青(B.rapa)、甘蓝(B.oleracea)；属于柑橘属(Citrus)的植物，例如甜橙(C.sinensis)；属于落叶松属(Larix)的植物，例如欧洲落叶松(L.decidua)、落叶松(L.gmelinii)、西藏红杉(L.griffithiana)、喜玛拉雅红杉(L.himalaica)、日本落叶松(L.kaempferi)、北美落叶松(L.laricina)、四川红杉(L.mastersiana)、美国西部落叶松(L.occidentalis)、红杉(L.potaninii)、信件落叶松(L.sibirica)、怒江红杉(L.speciosa)；属于菜豆属(Phaseolus)的植物，例如P.acutifolius、荷包豆(P.coccineus)；属于松属(Pinus)的植物，例如华山松(P.armandii)、北美短叶松(P.banksiana)、海岸松(P.pinaster)；属于杨属(Populus)的植物，例如小叶杨(P.balsamifera)、毛白杨(P.tomentosa)、欧洲山杨(P.tremuloides)；属于茄属(Solanum)的植物，例如马铃薯(S.tuberosum)；属于葡萄属(Vitus)的植物，例如葡萄(Vitusvinifera)；属于玉蜀黍属(Zea)的植物，例如玉蜀黍(Z.mays)；或者其他植物属，例如藿香属(Agastache)、紫穗槐属(Amorpha)、银杉属(Cathaya)、雪松属(Cedrus)、番红花属(Crocus)、羊茅属(Festuca)、大豆属(Glycine)、胡桃属(Juglans)、油杉属(Keteleeria)、紫草属(Lithospermum)、黑麦草属(Lolium)、百脉根属(Lotus)、番茄属(Lycopersicon)、苹果属(Malus)、苜蓿属(Medicago)、日中花属(Mesembryanthemum)、烟草属(Nicotiana)、长苞铁杉属(Nothotsuga)、稻属(Oryza)、天竺葵属(Pelargonium)、欧芹属(Petroselinum)、小立碗藓属(Physcomitrella)、云杉属(Picea)、李属(Prunus)、金钱松属(Pseudolarix)、黄杉属(Pseudotsuga)、玫瑰属(Rosa)、悬钩子属(Rubus)、Ryza、甘蔗属(Saccharum)、碱蓬属(Suaeda)、盐芥属(Thellungiella)、小麦属(Triticum)、铁杉属(Tsuga)。所述微生物可以是：属于曲霉属(Aspergillus)的丝状真菌，例如黄曲霉(A.flavus)、构巢曲霉(A.nidulans)、米曲霉(A.oryzae)、烟曲霉(A.fumigatus)；属于脉孢霉属(Neurospora)的丝状真菌，例如粗糙脉孢霉(N.crassa)；属于亚罗酵母属(Yarrowia)的真菌，例如解脂亚罗酵母(Y.lipolytics)；属于球腔菌属(Mycosphaerella)的真菌，例如M.graminicola；属于分枝杆菌属(Mycobacterium)的细菌，例如牛分枝杆菌(M.bovis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)；属于奈瑟氏菌属(Neisseria)的细菌，例如脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)；属于链霉菌属(Streptomyces)的细菌，例如天蓝色链霉菌(S.coelicolor)；属于红细菌属(Rhodobacter)的细菌，例如荚膜红细菌(R.capsulatus)；属于钩口线虫属(Ancylostoma)的线虫，例如锡兰钩口线虫(A.ceylanicum)；属于隐杆线虫属(Caenorhabditis)的线虫，例如秀丽隐杆线虫(C.elegans)；属于血矛线虫属(Haemonchus)的线虫，例如捻转血矛线虫(H.contortus)；属于蚯蚓属(Lumbricus)的线虫，例如L.rubellus；属于根结线虫属(Meilodogyne)的线虫，例如北方根结线虫(M.hapla)；属于类圆线虫属(Strongyloidus)的线虫，例如鼠类圆线虫(S.rattii)、粪类圆线虫(S.stercoralis)；属于Pristionchus属的线虫，例如P.pacificus。

尽管所述微生物可以是天然存在的，但优选向所述微生物中重组引入编码所述代谢途径中相应酶的至少一种基因序列的至少一个拷贝。

作为引入编码所述酶的编码序列的补充或替代，可以提供不在所述生物中与所述编码序列天然关联的一种或多种表达信号，例如启动子序列。因此，任选地将编码L-苯丙氨酸氨裂合酶的基因序列的至少一个拷贝与不在所述生物中与所述基因序列天然关联的表达信号有效连接。

表达信号包括位于编码序列上游(5′非编码序列)、其中或下游(3′非编码序列)的核苷酸序列，其影响相关联编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译。这样的序列可包括启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。

任选地，将编码4-香豆酸辅酶A连接酶或肉桂酸辅酶A连接酶(天然与否均可)的基因序列的至少一个拷贝与不在所述生物中与所述基因序列天然关联的表达信号有效连接。

任选地，将编码茋合酶(可以是白藜芦醇合酶)(天然与否均可)的基因序列的至少一个拷贝与不在所述生物中与所述基因序列天然关联的表达信号有效连接。

任选地，将编码赤松素合酶(天然与否均可)的基因序列的至少一个拷贝与不在所述生物中与所述基因序列天然关联的表达信号有效连接。

在一些方面中，本发明提供所述类型的经代谢改造的微生物，其具有有效的代谢途径，其中第一代谢物在第一酶所催化的反应中转化成第二代谢物，所述反应步骤产生氨；其中第二代谢物在第二酶所催化的ATP和辅酶A为底物、ADP为产物的反应中转化成第三代谢物；其中所述第三代谢物在第三酶所催化的以内源性丙二酸单酰辅酶A为底物的反应中转化成第四代谢物。

上述微生物包括这样的微生物：包含与表达信号有效连接的编码苯丙氨酸氨裂合酶的异源DNA序列的一个或多个拷贝；包含与表达信号有效连接的编码4-香豆酸辅酶A连接酶或肉桂酸辅酶A连接酶的异源DNA序列的一个或多个拷贝；以及包含与表达信号有效连接的编码茋合酶(可以是白藜芦醇合酶)的异源DNA序列的一个或多个拷贝。

或者，上述微生物包括这样的微生物：包含与表达信号有效连接的编码苯丙氨酸氨裂合酶的异源DNA序列的一个或多个拷贝；包含与表达信号有效连接的编码4-香豆酸辅酶A连接酶或肉桂酸辅酶A连接酶的异源DNA序列的一个或多个拷贝；以及包含与表达信号有效连接的编码赤松素合酶的异源DNA序列的一个或多个拷贝。

在本文中，术语“微生物”指微观生物，包括细菌；微观真菌，包括酵母。

更具体地，所述微生物可以是真菌，更具体地为属于曲霉属(Aspergillus)的丝状真菌，例如黑曲霉(A.niger)、泡盛曲霉(A.awamori)、米曲霉(A.oryzae)、构巢曲霉(A.nidulans)；属于酵母属(Saccharomyces)的酵母，例如酿酒酵母(S.cerevisiae)、S.kluyveri、S.bayanus、少孢酵母(S.exiguus)、S.sevazzi、葡萄汁酵母(S.uvarum)；属于克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的酵母，例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、K.marxianus var.marxianus、K.thermotolerans；属于假丝酵母属(Candida)的酵母，例如产朊假丝酵母(C.utilis)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、白色假丝酵母(C.albicans)、解脂假丝酵母(C.lipolytics)、C.versatilis；属于毕赤酵母属(Pichia)的酵母，例如树干毕赤酵母(P.stipidis)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、P.sorbitophila；或者其他酵母属，例如隐球菌属(Cryptococcus)、德巴利酵母属(Debaromyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia)、亚罗酵母属(Yarrowia)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)。就其他微生物而言，合适的丝状真菌的非穷举性列表如下：属于青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)、镰孢霉属(Fusarium)、梭孢霉属(Fusidium)、赤霉属(Gibberella)、毛霉属(Mucor)、被孢霉属(Mortierella)、木霉属(Trichoderma)的物种。

就细菌而言，合适细菌的非穷举性列表如下：属于芽孢杆菌属(Bacillus)的物种、属于埃希氏菌属(Escherichia)的物种、属于乳杆菌属(Lactobacillus)的物种、属于乳球菌属(Lactococcus)的物种、属于棒杆菌属(Corynebacterium)的物种、属于醋菌属(Acetobacter)的物种、属于不动杆菌属(Acinetobacter)的物种、属于假单胞菌属(Pseudomonas)的物种等。

本发明的优选微生物可以为酿酒酵母、黑曲霉、米曲霉、大肠杆菌、乳酸乳杆菌(L.lactis)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。

所构建和改造的微生物可使用公知方法进行培养，包括恒化器(chemostat)、分批培养、补料分批培养等。

因此，本发明包括用于产生赤松素的方法，包括使微生物细胞在基本不存在肉桂酸外部来源的情况下接触碳底物，所述细胞能在该条件下产生赤松素，其中所述微生物可选自真菌和细菌，尤其是酵母。

这样产生的赤松素可任选地分离或纯化，合适的方法包括使用正己烷进行溶剂提取，其后用100％乙醚、丙酮、甲醇和水依次提取，以及在使用正己烷/乙酸乙酯(2/1)体系的硅胶柱上进行层析纯化(Suga等1993)。

所述碳底物任选地选自由以下构成的可发酵碳底物：单糖、寡糖和多糖(例如葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、蔗糖、乳糖、赤藓糖、苏糖和/或核糖)。作为补充或替代，所述碳底物可选自非发酵碳底物，包括乙醇、乙酸、甘油和/或乳酸。作为补充或替代，所述非发酵碳底物可选自氨基酸，并可以是苯丙氨酸。

在另一个方面中，本发明包括用于通过异源表达编码苯丙氨酸氨裂合酶、4-香豆酸辅酶A连接酶和白藜芦醇合酶的核苷酸序列来产生赤松素的方法，以及通过异源表达编码苯丙氨酸氨裂合酶、4-香豆酸辅酶A连接酶和赤松素合酶的核苷酸序列来产生赤松素的方法。

赤松素(包括这样产生的赤松素)可在食品(例如乳制品或饮料如啤酒或葡萄酒)中作为营养物。因此，本发明包括含有通过微生物产生的赤松素的食品。

本发明还包括包含微生物细胞和至少1.5mg/g赤松素(基于干重)的微生物组合物。例如，可以提供含有赤松素(或这样产生的赤松素)的酵母或含有酵母或来源于酵母的制剂，以供人或动物消费，例如为干燥形式，适当时为单位经口剂型，例如含有酵母的片剂或胶囊剂，其中可含有如至少0.5g所述酵母，例如1-3g。

本文提及的任何野生型酶均可被其突变体形式替换，所述突变体形式适当时与所提及的野生型酶具有至少50％、更优选至少60％、更优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％或至少95％的氨基酸同源性，而同时当然仍保留野生型的所需酶活性。这可包括保留野生型的任何底物偏好性，例如对苯丙氨酸相对于酪氨酸的偏好性，或者对肉桂酸相对于香豆酸的偏好性，或者对肉桂酰辅酶A相对于香豆酰辅酶A的偏好性。编码本文提及酶的任何野生型编码序列均可被编码相同的酶但密码子使用(codon usage)经过调整的序列替换。这对上文讨论的野生型酶及突变体形式均适用。编码野生型酶的突变体形式的核苷酸序列优选与编码相应野生型酶的野生型核苷酸序列具有至少50％、更优选至少60％、更优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％或至少95％的同源性程度。

酶的突变体形式可以具有与野生型酶相比没有大改变的酶活性水平，或者可以选择成具有更高的活性水平。可以根据已知的实践进行野生型酶的保守性氨基酸替换。具有提高活性的酶可通过本领域已知的定向演化技术来开发，酶中的随机改变可通过诸如以下的方法来产生：在适当的测试生物如大肠杆菌或酿酒酵母中在编码该酶的序列中引入随机基因改变，随后表达，并通过筛选期望的特性来选择提高的突变体，或者通过施加在该条件下表达提高活性的生物将具有存活优势的自选择条件来选择。

本文中提及的不存在或基本不存在或缺乏物质(如肉桂酸)供应包括基本不存在可代谢成该物质或是该物质进一步代谢之直接产物的其衍生物，例如肉桂酸酯(包括硫酯)，例如肉桂酰辅酶A。特别的，缺乏肉桂酸暗示缺乏肉桂酰辅酶A。

根据本发明产生的赤松素可以是顺式或反式赤松素，预期它们分别由顺式肉桂酸和反式肉桂酸形成。或者，可以通过包括异构化的方法由反式肉桂酸形成顺式赤松素。但预期反式形式通常是主要的。

附图说明

为了便于理解本发明的以上描述，参考以下附图，其中：

图1显示赤松素的化学结构；

图2显示利用作用于香豆酰辅酶A的白藜芦醇合酶产生白藜芦醇的苯基丙烷类途径；和

图3显示利用作用于肉桂酰辅酶A的赤松素合酶或白藜芦醇合酶产生赤松素的苯基丙烷类途径。

图4显示在100g/l半乳糖上培养的酿酒酵母菌株FSSC-PAL4CLVST1的上清液及细胞提取物的HPLC层析图。包括60ng纯赤松素的层析图。

图5显示在100g/l半乳糖上培养的酿酒酵母菌株FSSC-PAL4CLRES的细胞提取物的HPLC层析图。包括60ng纯赤松素的层析图。

图6显示纯赤松素以及由在100g/l半乳糖上培养的酿酒酵母菌株FSSC-PAL4CLVST1所产生的赤松素的LC-MS数据。显示了基峰层析图和M/Z 211.0759Da/e处的负离子痕迹。

图7显示了得自实施例16的HPLC层析图。

图8显示了产生赤松素的大肠杆菌菌株(上图)和对照菌株(下图)的发酵物的提取产物的HPLC分析。

本发明将通过以下非限制性实施例进行进一步描述和举例说明。

实施例

实施例1

分离编码PAL、4CL、RES和VST1的基因

使用表1所述引物，通过PCR从拟南芥cDNA(BioCat，Heidelberg，Germany)中分离苯丙氨酸氨裂合酶(PAL2)(Cochrane等，2004；SEQID NO：1、2)、4-香豆酸：辅酶A连接酶(4CL1)(Hamberger和Hahlbrock2004；Ehlting等，1999；SEQ ID NO：3、4)。在若干拟南芥同源物中选择PAL2和4CL1，因为它们分别具有有利于通向肉桂酸和肉桂酰辅酶A的动力学参数(Cochrane等，2004；Hamberger和Hahlbrock 2004；Ehlting等，1999)。

使用www.entelechon.com的在线服务反翻译工具，对来自圆叶大黄(Rheum tataricum)的白藜芦醇合酶(RES)编码序列(Samappito等2003；SEQ ID NO：5、6)进行用于酿酒酵母表达的密码子优化，得到序列SEQ ID NO：7、8。用于装配合成基因的寡核苷酸在MWG Biotech构建，使用下述来自Martin等(2003)的稍加修改的方法操作，通过PCR装配合成基因。

^＊SEQ ID No 11-16

将来自MWG的用于装配合成基因的引物溶于milliQ水至浓度为100pmole/μl。将每种引物5μl的等分试样与总混合物(totalmix)组合，接着用milliQ水稀释10倍。每50μl使用5μl稀释的总混合物作为模板并与融合DNA聚合酶(Finnzymes)合并，通过PCR装配所述基因。PCR程序如下：首先98℃30秒，接着为98℃10秒、40℃1分钟和72℃1分钟/1000碱基对的30个循环，最后72℃5分钟。对于得到的PCR反应，将20μl在1％琼脂糖凝胶上纯化。结果为PCR弥散带，从琼脂糖凝胶上切下期望大小附近的区域，使用QiaQuick凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化。最后使用表1中外部引物的PCR获得了所需的RES基因。使用Quickchange定点诱变II试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)校正点突变。

由GenScript Corporation(Piscataway，NJ)合成编码葡萄(Vitisvinifera)白藜芦醇合酶的VST1基因(Hain等1993)。使用该氨基酸序列(SEQ ID NO：10)作为模板来产生用于酿酒酵母表达的经密码子优化的合成基因(SEQ ID NO：9)。将合成VST1基因递送并插入大肠杆菌pUC57载体，侧翼为BamH1和Xho1限制性位点。通过BamH1/Xho1限制性处理从pUC57载体中纯化该合成基因，并使用QiaQuick凝胶提取试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶中纯化。

实施例2

构建用于表达PAL2的酵母载体

使用带有包含EcoR1和Spe1限制性位点的5’突出的正向和反向引物(表1)，通过PCR再扩增如实施例1所述分离的编码PAL2的基因。用EcoR1/Spe1消化所扩增的PAL2PCR产物，并连接进经EcoR1/Spe1消化的pESC-URA载体(Stratagene)，得到载体pESC-URA-PAL2。通过对两个不同克隆的测序来验证基因序列。

实施例3

构建用于表达4CL1的酵母载体

如实施例1所述分离编码4CL1的基因。用Xba1/BamH1消化所扩增的4CL1产物，并连接进经Spel/BglII消化的pESC-TRP载体(Stratagene)，得到载体pESC-TRP-4CL1。对两个不同的pESC-TRP-4CL1克隆进行测序，以验证所克隆基因的序列。

实施例4

构建用于表达4CL1和RES的酵母载体

如实施例1所述分离编码RES的基因。用BamH1/Xho1消化所扩增的合成RES基因，并连接进经BamH1/Xho1消化的pESC-TRP-4CL1(实施例3)。所得到的质粒pESC-TRP-4CL1-RES含有发散的GAL1/GAL10启动子控制下的编码4CL1和RES的基因。通过对两个不同的pESC-TRP-4CL1-VST1克隆进行测序来验证编码VST1的基因序列。

实施例5

构建用于表达4CL1和VST1的酵母载体

如实施例1所述分离编码VST1的基因。将经纯化和消化的VST1基因连接进经BamH1/Xho1消化的pESC-TRP-4CL1(实施例3)。所得质粒pESC-TRP-4CL1-VST1含有发散的GAL1/GAL10控制下的编码4CL1和VST1的基因。通过对两个不同的pESC-TRP-4CL1-VST1克隆进行测序来验证编码VST1的基因序列。

实施例6

使用PAL2、4CL1和RES在酿酒酵母中表达通向赤松素的途径

分开或组合地用实施例2、3和4所述载体转化含有适当遗传标记的酵母菌株。酵母细胞的转化根据本领域已知方法进行，使用感受态细胞，或者例如通过电穿孔(参阅如Sambrook等，1989)。在缺乏尿嘧啶和/或色氨酸的培养基上选择转化体，并在相同培养基上划线纯化。

用pESC-URA-PAL2(实施例2)和pESC-TRP-4CL1-RES(实施例4)共转化酿酒酵母菌株FS01267(MATa trp1 ura3)，转化菌株命名为FSSC-PAL24CL1RES。

实施例7

使用PAL2、4CL1和VST1在酿酒酵母中表达通向赤松素的途径

分开或组合地用实施例2、3和5所述载体转化含有适当遗传标记的酵母菌株。酵母细胞的转化根据本领域已知方法进行，使用感受态细胞，或者例如通过电穿孔(参阅如Sambrook等，1989)。在缺乏尿嘧啶和/或色氨酸的培养基上选择转化体，并在相同培养基上划线纯化。

用pESC-URA-PAL2(实施例2)和pESC-TRP-4CL1-VST1(实施例5)共转化酿酒酵母菌株FS01267(MATa trp1 ura3)，转化菌株命名为FSSC-PAL24CL1VST1。

实施例8

在摇瓶中使用重组酵母菌株进行发酵

使用无菌接种环从琼脂平板上接种重组酵母菌株并在100ml成分确定的矿物质培养基中培养(Verduyn等，1992)，该培养基中含有维生素、微量元素、5g/l葡萄糖、95g/l半乳糖。将500ml塞紧瓶塞的摇瓶在30℃和160rpm下孵育3天。

实施例9

a)提取赤松素

通过5000g离心5分钟来收获细胞。将50ml上清液等分试样使用20ml乙酸乙酯萃取一次。将乙酸乙酯冻干，将干产物重溶于0.7ml甲醇中，并过滤到HPLC管中。

将来自100ml培养基的细胞沉淀溶于2ml水中，并分到三个快速制备管中，用玻璃珠破碎。将来自这三个管的粗提物合并到50mlSartorius管中的10ml 100％甲醇中，并在4℃下在冷的暗室中在旋转室中提取48小时。48小时后，5000g离心5分钟除去细胞碎片，冻干过夜除去甲醇。将干燥的残留物重溶于0.7ml甲醇中并过滤到HPLC管中。

b)分析赤松素

HPLC

对于肉桂酸、香豆酸和赤松素的定量分析，将样品置于高效液相层析(HPLC)Agilent 1100系列系统(Hewlett Packard)，之后在λ＝306nm处进行uv二极管阵列检测。在40℃下使用Phenomenex(Torrance，CA，USA)Luna 3微米C18(100×2.00mm)柱。使用0.4ml/分钟流速的乙腈和milliq水(均含有50ppm三氟乙酸)梯度作为流动相。梯度模式为20分钟中从15％乙腈到100％乙腈的线性梯度。洗脱时间对于反式赤松素来说约为8.8至8.9分钟。纯赤松素标准品(纯度＞95％)购自ArboNova(Turku，Finland).

LC-MS

在具有与Agilent 1100 HPLC系统(Agilent Technologies Walbron，Germany)偶联的Lockspray^TM参比探头的Waters(Micromass，Manchester，UK)LCT^TM飞行时间质谱仪上通过负离子电喷雾LC-MS分析样品和标准品。在0.3ml/分钟下使用水-乙腈梯度，在装有4mm×2mm ID SecurityGuard^TM预制柱(Phenomenex，USA)的50mm×2mmID Luna C-18(II)柱(Phenomenex，USA)上进行分离。两种洗脱液均含有20mM甲酸。溶剂组成在20分钟中从注入时的15％乙腈变成100％乙腈，然后维持5分钟，再将梯度变回起始条件。在所有情况下，均注入3μl样品并将所述柱保持在40℃。所有化学品均为HPLC级，并溶于Milli-Q^TM水中。以4nm的解析度，以2个谱/秒在200-700nm处采集UV谱。

将质谱仪调成负离子电喷雾模式的最高灵敏度，对亮氨酸脑啡肽溶液为高于5500FWH的分辨率(0.5μg/ml，在含有0.5％甲酸的50％乙腈中)。所述溶液还在Lockspray^TM中以15μl/分钟在负离子ESI中用作质量参比。该仪器在负离子ESI中以50％乙腈中的羧化PEG混合物校准。在两种情况下，该校准在至少25种校准离子中的残差小于2mDa。将运行条件选择成用于最低源内断裂。以0.1秒扫描间隔时间，以0.4秒/谱在100至900Da/e收集质谱。每3秒从Lockmass^TM探针收集参比谱，将10个参比谱平均后作为内质量校正。

使用预计代谢物的质子化或去质子化质量+/-25mDa抽取窄离子痕迹。

结果

如实施例8所述在100g/l半乳糖中培养菌株FSSC-PAL24CL1RES和FSSC-PAL24CL1VST1，并分析其赤松素含量。此外，还包括了仅含有空载体的对照菌株FSSC-对照。HPLC分析显示，菌株FSSC-PAL24CL1VST1和FSSC-PAL24CL1RES中含有与反式赤松素相同的8.8-9.0分钟驻留时间的组分(图4和5)。所述结果被LC-MS分析证实，显示菌株FSSC-PAL24CL1VST1的上清液中存在驻留时间8.2分钟的组分，其M/Z为211.0579Da/e±25mDA，事实上与阴离子模式中纯赤松素的M/Z一致(图6)。此外，UV吸收谱也与纯反式赤松素(未显示)的吸收谱相似，λ_max约为306nm。

因此，结果显示酿酒酵母中存在活跃的苯基丙烷类途径，导致在体内产生反式赤松素。很可能可以通过在分批和连续培养中在良好确定的生长条件下培养菌株和/或优化各个酶的表达/活性来改进赤松素的产生。

实施例10

a)构建用于在大肠杆菌中表达PAL2的细菌载体

以下实施例中使用的质粒含有一种或多种标记基因，使得可以将带有它们的微生物从不带有它们的微生物中选择出来。选择系统是基于显性标记，例如针对氨苄青霉素和卡那霉素的抗性。此外，该质粒中含有允许表达重组基因的启动子及终止子序列。此外，该质粒中含有辅助克隆DNA片段及随后鉴定重组体的合适独特限制性位点。在本实施例中，含有氨苄青霉素抗性基因的质粒命名为pET16b(Novagen)和含有卡那霉素抗性基因的质粒命名为pET26b(Novagen)。

使用带有包含适当限制性位点的5’突出端的正向及反向引物，通过PCR从质粒pESC-URA-PAL2(实施例2)再扩增如实施例1所述分离的编码PAL2的基因。在所述基因5’和3’末端引入所述限制性位点使得可以将经限制性处理的PCR产物连接进含有T7启动子的经消化pET16B载体。所得质粒pET16B-PAL2含有T7启动子控制下的编码PAL2的基因。

b)构建用于在大肠杆菌中表达4CL1和VST1的细菌载体

使用带有包含适当限制性位点的5’突出端的正向及反向引物，通过PCR从质粒pESC-URA-4CL1-VST1(实施例5)再扩增如实施例1所述分离的编码4CL1的基因。在所述基因5’和3’末端引入所述限制性位点使得可以将经限制性处理的PCR产物连接进经消化pET26B载体。所得质粒pET26B-4CL1含有来自乳酸乳杆菌的T7启动子控制下的编码4CL1的基因。

使用带有包含适当限制性位点的5’突出端的正向及反向引物，通过PCR从质粒pESC-URA-4CL1-VST1(实施例5)再扩增如实施例1所述分离的编码VST1的基因。在所述基因5’和3’末端引入所述限制性位点使得可以将经限制性处理的PCR产物连接进经消化pET16B载体。所得质粒pET16B-VST1含有T7启动子控制下的编码VST1的基因。使用带有包含适当限制性位点的5’突出端的正向及反向引物，通过PCR从质粒pET16B-VST1作为一个片段再扩增T7启动子和编码VST1的基因。在所述DNA片段5’和3’末端引入所述限制性位点使得可以将经限制性处理的PCR产物连接进经消化的质粒pET26B-4CL1。所得质粒pET26B-4CL1-VST1含有各自在T7启动子控制下的编码4CL1和VST1的基因。通过对两个不同的pET26B-4CL1-VST1克隆进行测序验证了编码4CL1和VST1的基因的序列。

c)在大肠杆菌中表达通向赤松素的途径

分开或组合地用(a)和(b)所述载体转化大肠杆菌菌株。细菌细胞的转化根据本领域已知的方法进行，通过使用感受态细胞或者例如使用电穿孔(参阅如Sambrook等，1989)。在含有氨苄青霉素和卡那霉素的培养基中选择转化体，并在相同培养基上划线纯化。用载体pET16B-PAL2(a)转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，得到菌株FSEC-PAL2；并用pET26B-4CL1-VST1(b)进行转化，得到菌株FSEC-4CL1VST1。此外用pET16B-PAL2(a)和pET26B-4CL1-VST1(n)共转化大肠杆菌BL21(DE3)，转化菌株命名为FSEC-PAL24CL1VST1。

d)在发酵罐中使用重组大肠杆菌菌株进行发酵

所述重组酵母菌株可在以分批、补料分批或恒化培养方式运行的发酵罐中培养。在本例中，发酵在摇瓶中进行。

在含有100μg/ml氨苄青霉素和60μg/ml卡那霉素的7ml LB培养基中，以160rpm和37℃培养大肠杆菌BL21(DE3)的预培养物。使用指数生长的预培养物接种500ml振荡摇瓶中，其中含有补充了50g/l葡萄糖、5g/l K₂HPO₄、80μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的200ml LB培养基，将振荡摇瓶(baffled shake flask)以160rpm在37℃下孵育。5小时后，添加异丙基(β-硫代半乳糖苷)(IPTG)至终浓度1mM，作为三种基因PAL2、4CL1和VST1每一个之前的T7启动子的诱导物。以37℃孵育48小时后，收获细胞并进行提取操作，并分析所产生赤松素的存在情况。

e)提取并分析大肠杆菌中的赤松素

提取和分析使用如实施例9所述的方法进行。图9的上图和下图分别显示使用所述改造菌株和含有空质粒的对照菌株的发酵物中所提取材料进行的HPLC结果。图中标出了赤松素和肉桂酸的产生。

实施例11

a)构建用于在乳酸乳球菌中表达PAL2的细菌载体

以下实施例中使用的质粒pSH71及其衍生物是双功能穿梭载体，具有来自大肠杆菌和乳酸乳杆菌的多个复制起点。这样，宿主范围跨越了大肠杆菌和其他乳酸菌物种。在乳酸乳球菌中通常没有问题，而在其他乳酸菌物种中可能的转化困难可通过使用大肠杆菌作为构建重组质粒的中间宿主来克服。该质粒含有一个或多个标记基因，以使得可以将带有所述标记基因的微生物从不带有它们的微生物中选择出来。用于乳酸乳球菌的选择系统是基于显性标记，例如针对红霉素和氯霉素的抗性，但也已描述了基于涉及碳水化合物代谢、肽酶和食品级标记之基因的系统。此外，该质粒中含有允许表达重组基因的启动子及终止子序列。合适的启动子可取自乳酸乳球菌基因，例如lacA。此外，该质粒含有合适的独特限制性位点，以便于克隆DNA片段和其后鉴定重组体。

在下文的方法中，含有红霉素抗性基因的质粒命名为pSH71-ERY^r或含有氯霉素抗性基因的质粒命名为pSH71-CM^r。

使用带有包含适当限制性位点的5’突出端的正向及反向引物，通过PCR从质粒pESC-URA-PAL2(实施例2)再扩增如实施例1所述分离的编码PAL2的基因。在所述基因5’和3’末端引入所述限制性位点使得可以将经限制性处理的PCR产物连接进含有乳酸乳球菌lacA启动子的经消化pSH71-ERY^r载体。所得质粒pSH71-ERY^r-PAL2含有乳酸乳球菌lacA启动子控制下的编码PAL2的基因。通过对两个不同的pSH71-ERY^r-PAL2克隆测序来验证编码PAL2的基因的序列。

b)构建用于在乳酸乳球菌中表达4CL1和VST1的细菌载体

使用带有包含适当限制性位点的5’突出端的正向及反向引物，通过PCR从质粒pESC-TRP-4CL1-VST1(实施例5)再扩增如实施例1所述分离的编码4CL1的基因。在所述基因5’和3’末端引入所述限制性位点使得可以将经限制性处理的PCR产物连接进经消化的pSH71-CM^r载体。所得质粒pSH71-CM^r-4CL1含有乳酸乳球菌lacA启动子控制下的编码4CL1的基因。使用带有包含适当限制性位点的5’突出端的正向及反向引物，通过PCR从质粒pESC-TRP-4CL1-VST1(实施例5)再扩增如实施例1所述分离的编码VST1的基因。在所述基因5’和3’末端引入所述限制性位点使得可以将经限制性处理的PCR产物连接进经消化的pSH71-ERY^r载体。所得质粒pSH71-ERY^r-VST1含有乳酸乳球菌lacA启动子控制下的编码VST1的基因。使用带有包含适当限制性位点的5’突出端的正向及反向引物，通过PCR从质粒pSH71-ERY^r-VST1作为一个片段的lacA启动子和编码VST1的基因。在所述DNA片段的5’和3’末端引入所述限制性位点使得可以将经限制性处理的PCR产物连接进经消化的质粒pSH71-CM^r-4CL1。所得质粒pSH71-CM^r-4CL1-VST1含有其各自lacA启动子控制下的编码4CL1和VST1的基因。通过对两个不同pSH71-CM^r-4CL1-VST1克隆测序来验证编码4CL1和VST1的基因序列。

c)在乳酸乳球菌中表达通向赤松素的途径

分别或组合地用如实施例16和17所述载体转化乳酸乳球菌菌株。细菌细胞的转化根据本领域已知的方法进行，通过使用感受态细胞或者例如使用电穿孔(参阅如Sambrook等，1989)。在含有红霉素和氯霉素的培养基中选择转化体，并在相同培养基上划线纯化。

用载体pSH71-ERY^r-PAL2(实施例16)转化乳酸乳球菌菌株MG1363，得到菌株FSLL-PAL2。另外，用pSH71-ERY^r-PAL2(实施例16)和pSH71-CM^r-4CL1-VST1(实施例17)共转化乳酸乳球菌菌株MG1363，转化菌株命名为FSLL-PAL24CL1VST1。

d)在发酵罐中用重组乳酸乳球菌进行发酵

可以在以分批、补料分批或恒化培养方式运行的发酵罐中培养重组的乳球菌菌株。

分批及补料分批培养

在厌氧、需氧或微需氧条件下，以1.5升工作体积在带挡板的生物反应器中培养微生物。所有的培养物均在30℃以350rpm孵育。通过自动添加10M KOH维持6.6的恒定pH。在补充了以下成分以允许在需氧条件下生长的成分确定的MS10培养基中以乳糖来培养细胞：MnSO₄(1.25×10^-5g/l)、硫胺素(1mg/l)和DL-6，8-硫辛酸(2.5mg/l)。乳糖浓度为例如50g/l。用来自预培养物的细胞接种生物反应器，所述预培养物在30℃下在以三倍浓度K₂HPO₄和KH₂PO₄缓冲的含有上述培养基的摇瓶中培养。通过以下步骤确保厌氧条件：接种前用N₂(纯度99.998％)进行灌冲，在培养过程中在生物反应器顶部空间中维持50ml/分钟的N₂恒流。用于微需氧和需氧培养的生物反应器装有以空气(DOT，100％)和N₂(DOT，0％)校准的极谱氧传感器。通过以1vvm的速率向生物反应器中喷入空气以确保DOT高于80％来获得需氧条件。在微需氧实验中，通过以0.25vvm的速率向生物反应器中喷入由N₂和空气组成的气体混合物将DOT保持5％恒定。

恒化培养

在恒化培养中，细胞可在例如30℃和350rpm下在1L工作体积的Applikon实验发酵罐中培养。稀释速率(D)可以设置成不同的值，例如0.050h^-1、0.10h^-1、0.15h^-1或0.20h^-1。使用补充有50μl/L消泡剂的上述生长培养基，通过自动添加5M KOH使pH保持恒定，例如保持为6.6。乳糖的浓度可设置成不同值，例如3.0g/l、6.0g/l、12.0g/l、15.0g/l或18.0g/l。接种生物反应器至起始生物量浓度为1mg/l，在指数生长期结束时打开补料泵。

通过向生物反应器的顶部空间引入50ml/分钟的N₂(纯度99.998％)来获得厌氧稳态。可以通过喷入250ml/分钟由不同比例的N₂(纯度99.998％)及空气所组成的气体来获得不同的缺氧稳态。通过向生物反应器中喷入空气(100％DOT)和N₂(0％DOT)来校准氧电极。

对于所有的条件，气体在引入生物反应器之前均除菌过滤。废气通过冷却至-8℃以下的冷凝器排出，并通过声学气体分析仪分析其CO₂和O₂的体积含量。

在至少5个驻留时间之后并且如果生物量及发酵终产物的浓度在最后两个驻留时间中保持不变(相对偏差小于5％)，则认为培养处于稳态。

e)提取和分析乳酸乳球菌中的赤松素

使用如实施例9所述方法进行提取和分析。

实施例12

a)构建用于在曲霉属物种中表达PAL2的真菌载体

本实施例中使用的质粒来自pARp1，其含有来自构巢曲霉的AMA1复制起始序列，它还在黑曲霉和米曲霉中保持自主质粒复制(Gems等，1991)。此外，该质粒为穿梭载体，其含有大肠杆菌复制序列，因此可以使用大肠杆菌作为中间宿主来构建重组质粒，从而克服在黑曲霉和米曲霉中固有的转化困难。该质粒含有一个或多个标记基因，其允许将带有所述选择标记的微生物从不带有它们的微生物中选择出来。选择系统可基于显性标记(如针对潮霉素B、腐草霉素和博来霉素的抗性)或异源标记(如氨基酸和pyrG基因)。此外，该质粒含有允许表达重组基因的启动子及终止子序列。合适的启动子可取自构巢曲霉基因，例如alcA、glaA、amy、niaD和gpdA。此外，该质粒含有合适的独特限制性位点，以便于克隆DNA片段和其后鉴定重组体。

该质粒含有强组成型gpdA启动子和营养缺陷型标记，均来源于构巢曲霉；含有参与甲硫氨酸生物合成的基因methG的质粒命名为pAMA1-MET；含有参与组氨酸生物合成的基因hisA的质粒命名为pAMA1-HIS。

使用带有包含适当限制性位点的5’突出端的正向及反向引物，通过PCR从质粒pESC-URA-PAL2(实施例2)再扩增如实施例1所述分离的编码PAL2的基因。在所述基因5’和3’末端引入所述限制性位点使得可以将经限制性处理的PCR产物连接进经消化的pAMA1-MET载体。所得质粒pAMA1-MET-PAL2含有构巢曲霉gpdA启动子控制下的编码PAL2的基因。通过对两个不同的pAMA1-MET-PAL2克隆测序来验证编码PAL2的基因的序列。

b)构建用于在属于曲霉属的物种中表达4CL1和VST1的真菌载体

使用带有包含适当限制性位点的5’突出端的正向及反向引物，通过PCR从质粒pESC-TRP-4CL1-VST1(实施例5)再扩增如实施例1所述分离的编码4CL1的基因。在所述基因5’和3’末端引入所述限制性位点使得可以将经限制性处理的PCR产物连接进经消化的pAMA1-HIS载体，该载体含有来自构巢曲霉的gpdA启动子。所得质粒pAMA1-HIS-4CL1含有构巢曲霉gpdA启动子控制下的编码4CL1的基因。使用带有包含适当限制性位点的5’突出端的正向及反向引物，通过PCR从质粒pESC-TRP-4CL1-VST1(实施例5)再扩增如实施例1所述分离的编码VST1的基因。在所述基因5’和3’末端引入所述限制性位点使得可以将经限制性处理的PCR产物连接进经消化的pAMA1-MET载体，得到pAMA1-MET-VST1。使用带有包含适当限制性位点的5’突出端的正向及反向引物，通过PCR从质粒pAMA1-MET-VST1作为一个片段的gpdA启动子和编码VST1的基因。在所述DNA片段的5’和3’末端引入所述限制性位点使得可以将经限制性处理的PCR产物连接进经消化的质粒pAMA1-HIS-4CL1。所得质粒pAMA1-HIS-4CL1-VST1含有其各自构巢曲霉pgdA启动子控制下的编码4CL1和VST1的基因。通过对两个不同pAMA1-HIS-4CL1-VST1克隆测序来验证编码4CL1和VST1的基因序列。

c)在黑曲霉中表达通向赤松素的途径

分开或组合地用(a)和(b)所述载体转化黑曲霉菌株。真菌细胞的转化根据本领域已知的方法进行，例如通过电穿孔或者接合(参阅如Sambrook等，1989)。在缺乏甲硫氨酸和/或组氨酸的基本培养基中选择转化体。

分别用(a)pAMA1-MET-PAL2载体转化组氨酸及甲硫氨酸营养缺陷型黑曲霉，例如菌株FGSC A919(参阅http://www.fgsc.net)，得到菌株FSAN-PAL2，和(b)用pAMA1-HIS-4CL1-VST1转化，得到菌株FSAN-4CL1VST1。此外，用pAMA1-MET-PAL2(a)和pAMA1-HIS-4CL1-VST1(b)共转化黑曲霉菌株FGSC A919，得到的转化菌株命名为FSAN-PAL24CL1VST1。

实施例13

在米曲霉中表达通向赤松素的途径

用载体pAMA1-MET-VST1(实施例29)转化含有编码PAL2和4CL1的一组天然基因并且是甲硫氨酸营养缺陷型的米曲霉菌株(Seshime等，2005)，得到菌株FSAO-VST1。真菌细胞的转化根据本领域已知的方法进行，例如通过电穿孔或通过接合(参阅如Sambrook等，1989)。在缺少甲硫氨酸的基本培养基上选择转化体。

实施例14

在发酵罐中用重组黑曲霉和米曲霉菌株进行发酵

可以在以分批、补料分批或恒化培养方式运行的发酵罐中培养重组曲霉菌株。

分批及补料分批培养

在需氧条件下，在1.5升工作体积的带挡板生物反应器中培养微生物。所有的培养物均在30℃以500rpm孵育。通过自动添加10M KOH维持6.0的恒定pH，通过以1vvm的速率向生物反应器中喷入空气以确保DOT高于80％来获得需氧条件。在补充了以下成分以允许在分批培养下生长的成分确定的培养基中以葡萄糖来培养细胞：7.3g/l(NH₄)₂SO₄、1.5g/l KH₂PO₄、1.0g/l MgSO₄·7H₂O、1.0g/l NaCl、0.1g/lCaCl₂·2H₂O、0.1ml/l Sigma消泡剂、7.2mg/l ZnSO₄·7H₂O、1.3mg/lCuSO₄·5H₂O、0.3mg/l NiCl₂·6H₂O、3.5mg/l MnCl₂·4H₂O和6.9mg/lFeSO₄·7H₂O。葡萄糖浓度为例如10、20、30、40或50g/l。为在补料分批培养中进行生长，在分批期中培养基由以下成分组成：7.3g/l(NH₄)₂SO₄、4.0g/l KH₂PO₄、1.9g/l MgSO₄·7H₂O、1.3g/l NaCl、0.10g/l CaCl₂·2H₂O、0.1ml/l Sigma消泡剂、7.2mg/l ZnSO₄·7H₂O、1.3mg/lCuSO₄·5H₂O、0.3mg/l NiCl₂·6H₂O、3.5mg/lMnCl₂·4H₂O和6.9mg/lFeSO₄·H₂O。然后，向反应器中补充例如285g/kg葡萄糖和42g/kg(NH₄)₂SO₄。

使用来自分批培养的游离菌丝体接种分批培养和补料分批培养物。使用2×10⁹个孢子/l的孢子浓度接种pH2.5的预分批培养物(pre-batch culture)。通过在加入以下组分的29g稻米上繁殖冻干的孢子来获得孢子：6ml 15g/l蔗糖、2.3g/l(NH₄)₂SO₄、1.0g/l KH₂PO₄、0.5g/l MgSO₄·7H₂O、0.50g/l NaCl、14.3mg/l ZnSO₄·7H₂O、2.5mg/CuSO₄·5H₂O、0.50mg/l NiCl₂·6H₂O和13.8mg/l FeSO₄.7H₂O。将孢子在30℃下繁殖7-14天，以在稻谷上获得黑色孢子层，并通过加入100ml无菌水中的0.1％Tween 20进行收获。对于所有的条件，气体在导入生物反应器之前进行除菌过滤。废气通过冷却至-8℃以下的冷凝器排出，并通过声学气体分析仪分析CO₂和O₂的体积含量。

恒化培养

在恒化培养中，细胞可在例如30℃和500rpm下在1.5L工作体积的Biostat B实验发酵罐中培养。通过自动添加10M KOH维持6.0的恒定pH，通过以1vvm的速率向生物反应器中喷入空气以确保DOT高于80％来获得需氧条件。稀释速率(D)可以设置成不同的值，例如0.050h^-1、0.10h^-1、0.15h^-1或0.20h^-1。使用含有以下组分的基本生长培养基，通过自动添加10M KOH使pH保持恒定，例如保持为6.6∶2.5g/l(NH₄)₂SO₄、0.75g/l KH₂PO₄、1.0g/l MgSO₄·7H₂O、1.0g/l NaCl、0.1g/l CaCl₂·2H₂O、0.1ml/l Sigma消泡剂、7.2mg/l ZnSO₄·7H₂O、1.3mg/l CuSO₄·5H₂O、0.3mg/l NiCl₂·6H₂O、3.5mg/l MnCl₂·4H₂O和6.9mg/l FeSO₄·7H₂O。葡萄糖浓度可设置成不同值，例如3.0g/l、6.0g/l、12.0g/l、15.0g/l或18.0g/l。如上述用来自预分批培养物的游离菌丝体接种生物反应器，在指数生长期结束时打开补料泵。

对于所有的条件，气体在导入生物反应器之前除菌过滤。废气通过冷却至-8℃以下的冷凝器排出，并通过声学气体分析仪分析CO₂和O₂的体积含量。

实施例15

提取和分析黑曲霉及米曲霉中的赤松素

如实施例9所述进行提取和分析。

实施例16

在构巢曲霉AR1中产生赤松素

构巢曲霉AR1已缺失了以下基因：argB2、pyrG89、veA基因。

a)构建带有argB(鸟氨酸氨甲酰转移酶)标记的丝状真菌表达载体

使用带有分别含有EcoRI和XmaI限制性位点的5’突出端的正向引物5-CG GAATTC ATA CGC GGT TTT TTG GGG TAG TCA-3(SEQID NO：17)和反向引物5-CG CCCGGG TAT GCC ACC TAC AGC CATTGC GAA-3(SEQ ID NO：18)，从构巢曲霉AR1基因组DNA中扩增包含同源启动子及终止子序列的编码argB的基因。

在PCR产物中加入的限制性位点允许插入经EcoRI和XmaI消化的pUC19(New England biolabs，Ipswich，MA.)中，得到pUC19-argB。

使用带有分别含有BamHI限制性位点和27碱基对适配体的5’突出端的正向引物5-GC GGATCC ATA GGG CGC TTA CAC AGT ACACGA-3(SEQ ID NO：19)和反向引物5-CGGAGAGGGCGCGCCCGTGGCGGCCGC GGA TCC ACT TAACGT TAC TGA-3(SEQ ID NO：20)，从构巢曲霉基因组DNA中扩增trpC(吲哚-3-甘油磷酸合酶)。

使用带有分别含有27碱基对适配体和HindIII限制性位点的5’突出端的正向引物5-GCGGCCGCCACGGGCGCGCCCTCTCCGGCG GTA GTG ATG TCT GCT CAA-3(SEQ ID NO：21)和反向引物5-CG AAGCTT TAT AAT TCC CTT GTA TCT CTA CAC-3(SEQ IDNO：22)，从构巢曲霉AR1基因组DNA中扩增gpdA(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)启动子。

加入了限制性位点的trpC及gpdA片段的融合PCR产物使得可以插入经BamHI和HindIII消化的pUC19-argB中，得到pAT3。

b)构建用于在构巢曲霉AR1中表达C4H(肉桂酸-4-羟化酶)的带有pyrG(乳清苷-5′-单磷酸脱羧酶)标记的丝状真菌表达载体

使用带有分别含有限制性位点BssHII和NotI的5’突出端的正向引物5-CG G CGCG C ATA ATG GAC CTC CTC TTG CTG GAG-3(SEQ ID NO：23)和反向引物5-GG GC GGCC GC TTA TTA ACA GTTCCT TGG TTT CAT AAC G-3(SEQ ID NO：24)，从酵母质粒pESC-URA-PAL2-C4H(WO2006089898，实施例3)中再扩增编码C4H的基因。在所述PCR产物中引入的限制性位点使得可以插入经BssHII和NotI消化的pAT3载体，得到pAT3-C4H。通过限制性酶切和测序来验证该构建体。使用以下两种限制性酶除去argB标记：BsiWI和PciI。

使用带有5’突出端的正向引物5-CGT GTAC AATA TTA AT TAACGAGA GCG AT CGC AAT AAC CGT ATT ACC GCC TTT GAG-3(SEQ ID NO：25)和反向引物5-CGA CATG TAT TCC CGG GAA GATCTC ATG GTC A-3(SEQ ID NO：26)，从烟曲霉基因组DNA中再扩增编码pyrG的基因，包括同源启动子及终止子序列，所述5’突出端中包含以下限制性位点：正向引物中为BsrGI、PacI、AsiSI，反向引物中为PciI。在所述PCR产物中引入的限制性位点使得可以插入经BsiWI和PciI消化的pAT3载体，得到pAT3-C4H-pryG。通过限制性酶切和测序来验证该构建体。

c)构建用于在构巢曲霉AR1中表达4CL1(4-香豆酸辅酶A连接酶)的带有argB标记的丝状真菌表达载体

使用正向引物5-GCGGAGAGGGCGCG ATG GCG CCA CAAGAA CAA GCA-3(SEQ ID NO：27)和反向引物5-TGGATCCGCGGCCGC TCA CAA TCC ATT TGC TAG TTT TGC-3(SEQ ID NO：28)，从酵母质粒pESC-TRP-4CL1-VST1中再扩增编码4CL1的基因。使用Infusion^TM PCR克隆技术(Clontech，Mountain View，Calif.)，将4CL1基因插入经BssHII和NotI消化的pAT3载体，得到pAT3-4CL1。通过限制性酶切和测序来验证该构建体。

d)构建用于在构巢曲霉AR1中表达VST1(白藜芦醇合酶)的带有argB标记的丝状真菌表达载体

使用带有分别含有限制性位点BssHII和NotI的5’突出端的正向引物5-CG G CGCG C ATA ATG GCA TCC GTA GAG GAG TTC-3(SEQ ID NO：29)和反向引物5-GG GC GGCC GC TTA TCA TTA GTTAGT GAC AGT TGG AA-3(SEQ ID NO：30)，从酵母质粒pESC-TRP-4CL1-VST1(实施例5)中再扩增编码VST1的基因。在所述PCR产物中引入的限制性位点使得可以插入将经BssHII和NotI消化的pAT3载体，得到pAT3-VST1。通过限制性酶切和测序来验证该构建体。

e)使用C4H、4CL1和VST1在构巢曲霉AR1(该菌株具有argB2、pyrG89、veA1的缺失)中表达通向赤松素的途径

使用细胞壁裂解酶(glucanex，novozymes)，根据本领域已知方法通过原生质体化(protoplastation)进行构巢曲霉AR1真菌的转化，(Tilburn等，1983)。C4H、4CL1和VST1的随机整合在两个步骤中进行。使用限制性酶BmrI将质粒pAT3-4CL1和pAT3-VST1线性化，并利用营养缺陷标记argB根据Guerra等，2006所述的共转化整合进基因组。分离含有4CL1和VST1表达盒的转化体，其后用以BmrI线性化的pAT3-C4H-pyrG进行转化，得到含有C4H、4CL1和VST1的重组构巢曲霉菌株。

f)在摇瓶中用重组构巢曲霉菌株进行发酵

在37℃下，在含有以下成分的琼脂平板中将构巢曲霉预培养物培养5天：1g/L葡萄糖、0.85g/L NaNO3、0.1g/L KC1、0.1g/LMgSO₄·7H₂O以及0.3g/L KH₂PO₄、0.00008g/L CuSO₄·5H₂O、0.000008g/L Na₂B₄O₇·10H₂O、0.00016g/L FeSO₄·7H₂O、0.00016g/LMnSO₄·2H₂O、0.00016g/L Na₂MoO₄·2H₂O和0.0016g/L ZnSO₄·7H₂O。使用该预培养物接种含有100ml Czapek培养基(CZ)的500ml振荡摇瓶(baffled shake flask)。将摇瓶以150rpm和30℃孵育，培养基的起始pH为6.2。孵育24小时后，取样品并进行提取操作(见下文)，并分析所产生赤松素的存在情况。

g)从构巢曲霉摇瓶培养物中提取赤松素

从摇瓶中抽出由100ml培养物(细胞和培养液)组成的样品。代谢物的提取如下进行：将样品转移至两个50ml Sartorius管中，并以4500rpm离心10分钟。将上清液转移进烧杯，生物质分成八个等分试样，其被转移到含有约300μl玻璃珠(0.25-0.50mm)的2ml Sarstedt带盖小管中。将管插入Fastprep 120(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA.)，以6.5级进行四个循环，每次30秒，循环之间保持在冰上。破碎的细胞被分装到2个15毫升Sartorius管中。向管中装入10ml上清液并加入3ml乙酸乙酯。用涡旋混合器将管剧烈混合2分钟，并置于冰上5分钟。接着通过4500rpm离心10分钟将乙酸乙酯相与水相分离，并收集乙酸乙酯相到四个1.5ml Eppendorf管中。接着将乙酸乙酯冻干45分钟，将干燥的样品重溶于0.3ml 50％甲醇中用于进一步的HPLC分析，如实施例9b所述

h)重组构巢曲霉的摇瓶结果

图7显示了来自典型摇瓶实验的HPLC层析图。上图显示来自产生赤松素的改造菌株的结果，下图显示来自亲本野生型对照菌株的结果。改造菌株的赤松素产生水平为1.0至2.0mg/l不等。对照菌株未显示任何赤松素形成。

通过与纯标准品的UV层析图进行比较，通过二极管阵列UV谱进一步证实赤松素峰的身份(图8)

实施例17

测定PALCPR连续培养物中茋类化合物的细胞内及细胞外水平

在1升工作体积的限碳连续培养物中培养过表达CPR的酵母菌株FSSC-PAL2C4H4CL2VST1-pADH1CPR1。对该培养物补充含有以下成分的Verduyn等(1992)所述成分限定的培养基：5.0g/L(NH₄)₂SO₄；3.0g/L KH₂PO₄；0.5g/L MgSO₄·7H₂O；微量金属及维生素以及作为生长限制营养素的5g/l葡萄糖和35g/l半乳糖。加入消泡剂(300μl/L，SigmaA-8436)以避免形成泡沫。将碳源与矿物质培养基分别高压灭菌，其后加入发酵罐中。此外，在培养基高压灭菌并冷却之后通过除菌过滤将维生素和微量金属加入发酵罐中。发酵罐系统来自Sartorius BBI系统，由1升工作体积的带有Biostat B Plus控制器的带挡板的3升反应器组成，其装有两个以1000rpm旋转的Rushton涡轮，温度保持在30±1℃，通过自动添加2M KOH将pH保持在5.5±0.2。通过质量流控制器来控制气流，并设置成1.5vvm(1.5l/分钟)。废气通过冷却的冷凝器导出，并分析O₂及CO₂(Model 1308，Innova，Denmark)。通过用10ml指数生长的摇瓶培养物(含有5g/l葡萄糖和35g/l半乳糖)接种培养物来起始含有35g/l半乳糖的最初分批培养物。通过向反应器中连续补充相同培养基而将分批培养转换成连续模式。基于恒定水平来控制稀释速率，目标为D＝0.050h^-1。当稀释速率和废气信号在至少五个驻留时间中保持不变，并且以一个驻留时间为间隔的两个连续样品中代谢物浓度的偏差低于3％，则认为连续培养处于稳态。连续监测的溶解氧浓度保持在高于60％空气饱和度。在所述条件下，菌株消耗了所有的半乳糖，主要产生生物量和CO₂以及仅少量的乙醇。此外，RQ近似均一，表明代谢主要为呼吸模式。

对于茋类化合物(stilbenoids)的测定，在约300小时发酵(对应于15个驻留时间)时取样。通过5000g离心5分钟来收获细胞。对于茋类化合物细胞外水平的测定，将上清液的25ml等分试样用10ml乙酸乙酯提取一次。将乙酸乙酯冻干，并将干燥产物重溶于0.6ml甲醇中。将样品在水中50倍稀释，转移到HPLC管中，并通过HPLC进行分析。此外，为了评估所产生的茋类化合物水平是否超出了培养基的溶解度，或者是否与细胞膜结合，将细胞培养物(因此包括细胞和培养基)的1ml等分试样与1ml 100％乙醇混合，剧烈混合，然后离心。接着将上清液转移至HPLC管，直接分析茋类化合物含量。对于茋类化合物细胞内水平的测定，取50ml培养物等分试样，通过离心分离细胞和培养基。用50ml水洗涤沉淀，以除去与细胞结合或包在沉淀中的任何茋类化合物，沉淀再次离心后溶于1ml水中。将所得的细胞悬液分配到提取管中，并使用fast-prep机器用玻璃珠破碎。将粗提物合并到10ml 100％甲醇中，在4℃下在冷的暗室中在旋转腔中提取24小时。其后，5000g离心5分钟除去细胞碎片，冻干过夜除去残余的甲醇。将干燥残余物重溶于0.4ml甲醇和0.1ml水中。将样品在水中50倍稀释，接着转移进HPLC管中，并通过HPLC进行分析。

下表总结了连续培养300小时后的结果：

	细胞内赤松素(a)	细胞外赤松素(b)	乙醇中的细胞外赤松素(c)	总计赤松素(a+c)
					mg/l	16.45	12.55	113.57	130.02
总量％	12.65	9.65	87.35	100.00
					mg/g干重	1.83

根据以下章节中解释的计算，茋类化合物的胞内水平表达为mg/g生物量(干重)。提取物中赤松素的浓度测定为1646mg/l，该提取物的体积为0.5ml，因此所提取赤松素的绝对量分别为0.5×1646/1000＝0.8230mg。所述茋类化合物提取自50ml培养物等分试样，因此以每升培养物表示的赤松素胞内浓度为0.8230×(1000/50)＝16.46mg/l。所述培养物的生物量浓度为9g/l。因此，以每克干重表示的胞内赤松素水平为16.46/9＝1.83mg/g干重。

实施例18

克隆产油酵母(oleaginous yeast)解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)中的反式赤松素途径

a)分离基因

将PAL(苯丙氨酸氨裂合酶)、CL(肉桂酰辅酶A连接酶)和VST1基因(其中基因定义为编码蛋白质的序列)作为合成基因(GenScriptCorporation，Piscataway，NJ)产生，其经密码子优化用于在解脂亚罗酵母中表达。解脂亚罗酵母中密码子使用的确定先前已有描述(WO2006125000)。还可通过PCR从拟南芥cDNA(Stratagene)中分离PAL和4CL基因。肉桂酰辅酶A连接酶CL可以是任何接受肉桂酸为底物的羟基肉桂酰辅酶A连接酶。例如来自拟南芥的由4CL1和4CL2基因编码的4-香豆酰辅酶A连接酶接受肉桂酸，尽管优选底物为4-羟基肉桂酸(香豆酸)(Hamberger和Hahlbrock，2004；Costa等，2005)。更特别地，所述CL是经密码子优化的对肉桂酸为底物具有特异性的连接酶，例如来自天蓝色链霉菌的肉桂酸辅酶A连接酶(Kaneko等，2003)。类似地，VST1基因可以是接受肉桂酰辅酶A为底物的任何经密码子优化或未经密码子优化的茋合酶，尽管茋合酶的优选底物通常为4-香豆酰辅酶A，产生白藜芦醇，故称为白藜芦醇合酶。这类双底物接受性是来自葡萄的VST1基因(SEQ ID NO：9)的本性。更特别地，使用对肉桂酰辅酶A作为底物具有特异性的来自松科的茋合酶(Schanz等，1992；Koda等，2002)。

b)启动子和终止子的分离

可用于在解脂亚罗酵母中表达异源基因的启动子例如但不仅限于以下启动子：长链酰基辅酶A氧化酶POX2、hp4d、异柠檬酸裂合酶ICL1、细胞外碱性蛋白酶XPR2、翻译延伸因子TEF、核糖体蛋白S7RPS7、甘油醛-3-磷酸脱氢酶GPD、YAT1、GPAT、FBA1和FBAIN的启动子(Miiller等，1998：WO2006055322；WO2006125000)。

可用于在解脂亚罗酵母中表达异源基因的终止子例如但不仅限于以下终止子：XPR2、LIP2、PEX20和SQS终止子(Merkulov等，2000；WO2006055322；WO2006125000)。

通过PCR从解脂亚罗酵母基因组DNA中分离终止子和启动子DNA片段，所述基因组DNA分离自解脂亚罗酵母的完整细胞，例如来自美国典型培养物保藏中心的细胞，例如ATCC16618、ATCC18943和ATCC18944、ATCC90811、ATCC90812和ATCC90903。

c)产生表达盒

产生表达盒是指装配由以下组成的线性双链DNA片段：与异源基因的蛋白质编码序列融合的启动子(组成型或诱导型)以及终止子，即5′-启动子::基因::终止子-3′DNA片段。

表达盒可通过不同基因片段、启动子、基因编码序列和终止片段的融合PCR的组合来产生。例如，可使用PCR技术将PAL基因与XPR2启动子融合，可将所得的XPR2::PAL片段通过第二个PCR反应与终止子融合，产生表达盒XPR2::PAL::终止子。

产生表达盒的另一种方法是将异源基因(如PAL)的蛋白质编码序列克隆进已有的表达载体中，例如但不仅限于ATCC载体69355^TM。该ATCC载体已经具有了启动子(XPR2)和终止子区以及启动子及终止子之间具有独特限制性位点的多克隆位点(MCS)，用于通过标准分子生物学工具引入异源基因。如果靶载体在启动子与终止子区之间的限制性位点数有限，则可以使用Infusion克隆试剂盒技术(Clontech，CA，USA)，因为它仅需要载体中的一个限制性位点来进行基因插入。通过将基因插入载体中启动子与终止子之间，表达盒启动子::基因::终止子在环状载体内部产生，而不是作为单个双链DNA片段产生。如果需要线性DNA表达盒片段，则可使用PCR从表达载体中扩增表达盒。本领域技术人员会认识到，可以向同一质粒或载体中引入多个表达盒，产生表达盒簇，优选用来自完整代谢途径的基因来进行，例如赤松素产生途径(PAL、CL和VST1基因)。赤松素产生所需的这三种基因(PAL、CL和VST1基因)的表达盒簇定义为赤松素途径表达簇。

d)在解脂亚罗酵母中插入异源基因PAL、CL和VST1以用于产生赤松素

将赤松素途径基因(PAL、CL、VST1)装配成带有启动子和终止子的表达盒启动子::基因::终止子。对于不同基因PAL、CL和VST1而言，所述启动子和终止子可以是相同的，或是不同启动子与终止子的组合。本领域技术人员会认识到可用于在解脂亚罗酵母中引入和表达赤松素途径表达簇(包括含有基因PAL、CL和VST1的表达盒)所需的克隆技术、克隆载体或克隆工具，因为这些工具已经描述于若干出版物(LeDAll等，1994；Pignede等，2000；Juretzek等，2001；Madzak等，2004)和专利申请(WO2006055322；WO2006125000)中。

总之，一旦获得了适于在解脂亚罗酵母中表达赤松素途径(PAL、CL和VST1)的表达盒，就可将其(i)置于能在宿主细胞中自主复制的质粒载体中，或者(ii)直接整合进宿主细胞基因组，或者其组合，以在解脂亚罗酵母宿主中建立赤松素途径表达簇。可将表达盒设计成随机整合进宿主基因组，或者可以靶向至特定位置。在两种情况下，都将表达盒进一步构建成在该表达盒两侧都含有与宿主基因组同源的周围区。同源性区域可以为足以与宿主基因座靶向重组的20至1000个碱基对。可将单个拷贝靶向至基因组中不会导致缺失必要基因的任何部分。当期望高水平基因表达时，在解脂亚罗酵母基因组中多个位置进行插入可能特别有用，用于插入表达盒的多个拷贝的靶标例如但不仅限于核糖体DNA序列(rDNA)或反转录转座子样元件(TY1元件)(Pignede等，2000)。当向解脂亚罗酵母基因组的随机位置插入表达盒的多个拷贝时，实际上表达盒启动子-基因-终止子可以更短，仅包括启动子-基因，因为整合将使得解脂亚罗酵母基因组中已有的终止子作为该表达盒的终止子。

还可以将包含表达盒的质粒DNA整合进其他位点，以达到期望的表达盒拷贝数，例如但不仅限于URA3基因座(登记号AJ306421)和LEU2基因座(登记号AF260230)。LEU2整合载体例如但不仅限于ATCC载体69355^TM。这种含有表达盒的表达载体可直接用于转化亮氨酸营养缺陷型解脂亚罗酵母，以选择含有解脂亚罗酵母LEU2标记基因的表达载体。还可以通过PCR技术从表达载体中扩增表达盒，以进一步用于构建含有适当的抗生素选择标记或生物合成氨基酸标记的其他表达载体。

URA3整合位点可以与5-氟乳清酸(5-fluoro orotic acid，5-FOA)选择一起重复使用。具体而言，在解脂亚罗酵母宿主中缺失天然URA3基因，以产生具有URA-营养缺陷型表型的菌株，其中基于5-FOA抗性进行选择。当URA3存在时，5-FOA被URA3基因所编码的乳清酸-5′-磷酸脱羧酶降解成有毒化合物5-氟尿嘧啶，仅有缺乏URA3基因的细胞将具有抗性。因此，可以在多个轮次中将多个表达盒和新URA3基因的簇插入解脂亚罗酵母基因组的多个基因座，从而产生具有URA+原养型表型的新菌株。当所引入的URA3基因自主缺失(称为环出(loop-out)或跳出(pop-out))时，再使用5-FOA选择进行的后续整合产生新的URA3-营养缺陷型菌株。因此，URA3基因与5-FOA选择的组合可在多轮遗传修饰及表达盒整合中用作选择标记。

e)转化解脂亚罗酵母

可以使用标准转化技术(Chen等，1997；WO2006125000)将包含表达盒的外源DNA、自主复制载体或DNA片段引入解脂亚罗酵母宿主，例如诸如ATCC90811、ATCC90812和ATCC90903的细胞。用于在解脂亚罗酵母中维持所引入外源DNA的选择方法可基于氨基酸标记(Fickers等，2003)或抗生素标记(Cordero等，1996)。

实施例19

(a)用重组大肠杆菌菌株进行分批培养

在需氧条件下，将重组大肠杆菌FSEC-PAL24CL1VST1和BL21(DE3)(对照菌株)培养在1.5升工作体积的带挡板生物反应器中。以30℃、800rpm孵育培养物。通过自动添加2N KOH保持恒定的pH7。通过以1vvm的速率向生物反应器中喷入空气以确保溶解氧密度(dissolved oxygen density，DOT)高于60％来获得需氧条件。在引入生物反应器之前将空气进行除菌过滤。将废气通过冷却至6℃以下的冷凝器排出，并通过声学气体分析仪分析其CO₂和O₂体积含量。该生物反应器装有以空气(DOT，100％)和N₂(DOT，0％)校准的极谱氧传感器。

在分批培养中，在含有用以允许生长的以下组分的半确定培养基中用甘油培养细胞：6.0g/l酵母提取物、27.2g/l Na₂HPO₄(无水)、12.0g/l KH₂PO₄、2.0g/l NaCl和4.0g/l NH₄Cl。甘油浓度为20g/l。在培养基中补充50mg/l氨苄青霉素和50mg/l卡那霉素。加入消泡剂至终浓度为50μl/l。

用重组菌株的1ml甘油储存培养物接种生物反应器，使600nm的最终吸光度约为0.03。通过在30℃和150rpm下在摇瓶中以半确定培养基培养细胞来获得甘油储存培养物。培养基的组成与上述培养基相同，但重新调整成四分之一，即5g/l甘油、1.5g/l酵母提取物、6.8g/lNa₂HPO₄(无水)、3.0g/l KH₂PO₄、0.5g/l NaCl和1.0g/l NH₄Cl。在培养基中补充50mg/l氨苄青霉素和50mg/l卡那霉素。在指数生长后期收获细胞，通过离心进行收集并重悬于适当体积的15％(重量/体积)无菌甘油溶液中，例如600nm处的最终吸光度为30。将1ml悬浮细胞的等分试样保存于-80℃。

当细胞开始在生物反应器中生长之后(接种后5.5小时)，添加异丙基(β-硫代半乳糖苷)(IPTG)至终浓度为1mM，作为三种基因PAL2、4CL1和VST1中每一个之前的T7启动子的诱导物。

在分批培养过程中收集细胞培养液样品并分析其赤松素存在情况。此外，分析样品的生物量(以吸光度OD600进行分析)、碳源(甘油)和主要副产物(乙醇、乙酸、丙酮酸、琥珀酸)。

(b)提取大肠杆菌中的赤松素

用乙酸乙酯提取细胞内的赤松素。为此，将4mL乙酸乙酯加入8mL细胞培养液中。通过混合(30秒)和通过离心(4500rpm 5分钟，4℃)进行相分离来加强提取。将乙酸乙酯相冻干(约2小时)，将干燥产物重溶于0.5ml甲醇中，并通过HPLC进行分析。然后将这些样品在水中稀释(1∶5)并通过HPLC进行分析。

(c)分析赤松素

使用如实施例9b所述方法对来自分批培养的样品进行赤松素分析。之前，样品进行以下平行进行的样品分离操作：(i)离心细胞培养液(5分钟)并分析上清液；(ii)添加乙醇(99.9％)至终浓度50％(体积/体积)、振荡(30秒)、离心(5分钟)并分析上清液；(iii)根据上述(b)用乙酸乙酯提取，并分析重溶于甲醇的干燥样品。

结果

如上文(a)所述，在分批模式的生物反应器中以20g/L甘油培养如实施例10c所述的重组大肠杆菌菌株FSEC-PAL24CL1VST1和BL21(DE3)(对照菌株)。在培养过程中，根据上文(a)分析重组菌株的赤松素含量。

HPLC分析显示，菌株FSEC-PAL24CL1VST1含有驻留时间与反式赤松素标准品相同的组分(图4和5)。此外，UV吸收谱也与纯反式赤松素(未显示)的相似，λ_max约为306nm。

下表中显示了所检测赤松素的最高浓度：

	胞内赤松素	胞外赤松素	乙醇中的胞外赤松素	总赤松素
						(a)	(b)	乙醇中(c)	(a)+(c)
mg/l	0.016	(^＊)	(^＊)	0.016
					总量％	100	0	0	100
mg/g干重	(^＊＊)	(^＊＊)	(^＊＊)	(^＊＊)

(^＊)检出水平以下。(^＊＊)未检测

来自对照菌株分批培养的样品中未检测到赤松素。

因此，该结果证明，在分批模式生物反应器中培养的大肠杆菌中存在活跃的苯基丙烷类途径，导致在体内产生反式赤松素。

实施例20

(a)用重组构巢曲霉菌株进行分批培养

在需氧条件下，将含有C4H、4CL1和VST1的重组构巢曲霉菌株培养在1.5升工作体积的带挡板生物反应器中。以30℃、700rpm孵育培养物。通过自动添加2N KOH保持恒定的pH6。通过以1vvm的速率向生物反应器中喷入空气以确保溶解氧密度(dissolved oxygendensity，DOT)高于60％来获得需氧条件。在引入生物反应器之前将空气进行除菌过滤。将废气通过冷却至6℃以下的冷凝器排出，并通过声学气体分析仪分析其CO₂和O₂体积含量。该生物反应器装有以空气(DOT，100％)和N₂(DOT，0％)校准的极谱氧传感器。在由以下组分组成的成分确定的培养基中以蔗糖培养细胞：3.0g/l NaNO₃、1.0g/lKH₂PO₄、0.5g/l KC1、0.5g/l MgSO₄·7H₂O、0.5/lg FeSO₄·7H₂O。蔗糖浓度为30g/l。加入消泡剂至终浓度为50μl/l。

以含有C4H、4CL1和VST1的构巢曲霉菌株的孢子接种生物反应器，所述孢子之前在具有以下组成的固体基本培养基上繁殖：1g/L葡萄糖、0.85g/L NaNO₃、0.1g/L KCl、0.1g/L MgSO₄·7H₂O以及0.3g/LKH₂PO₄、0.00008g/L CuSO₄·5H₂O、0.000008g/L Na₂B₄O₇·10H₂O、0.00016g/L FeSO₄·7H₂O、0.00016g/L MnSO₄·2H₂O、0.00016g/LNa₂MoO₄·2H₂O和0.0016g/L ZnS0₄·7H₂O。将孢子以37℃培养5天，然后加入Tween 80％溶液(0.25％(总量/体积))进行收获。

(b)提取构巢曲霉中的赤松素

通过匀浆(在Polytron组织匀浆机中)破碎细胞，用10ml乙酸乙酯提取细胞内赤松素。通过在旋转混合仪中混合(约15分钟)和通过离心进行相分离(4500rpm，4℃，5分钟)来加强萃取。将乙酸酯相冻干(约2小时)，将干燥产物重溶于0.5ml甲醇中并通过HPLC进行分析。

(c)分析赤松素

使用如实施例9b所述的方法对来自分批培养的样品进行赤松素分析

结果

根据实施例HD4，在分批模式的生物反应器中以30g/L蔗糖培养如实施例16e所述的含有C4H、4CL1和VST1的重组构巢曲霉菌株。培养约48小时之后，从生物反应器中收获细胞，通过匀浆进行破坏并根据上文(b)和(c)分析其赤松素细胞内含量。

HPLC分析显示，含有C4H、4CL1和VST1的构巢曲霉菌株在胞内显示驻留时间与反式赤松素标准品相同的组分(图4和5)。此外，UV吸收谱也与纯反式赤松素(未显示)的吸收谱相似，λ_max约为306nm。

因此，所述结果证明，在分批模式生物反应器中培养的构巢曲霉中存在活跃的苯基丙烷类途径，导致在体内产生反式赤松素。

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以下为本文中出现的核苷酸及氨基酸序列总结：

SEQ ID NO：1为来自拟南芥的编码苯丙氨酸氨裂合酶(PAL2)的核苷酸序列。

SEQ ID NO：2为SEQ ID NO：1所编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3为来自拟南芥的编码4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL1)的核苷酸序列。

SEQ ID NO：4为SEQ ID NO：3所编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5为来自圆叶大黄的编码白藜芦醇合酶(RES)的核苷酸序列。

SEQ ID NO：6为SEQ ID NO：5所编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7为来自圆叶大黄的白藜芦醇合酶(RES)核苷酸序列，其针对在酿酒酵母中表达而进行了密码子优化。

SEQ ID NO：8为SEQ ID NO：7所编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO：9为来自葡萄的编码白藜芦醇合酶(VST1)的核苷酸序列，其针对在酿酒酵母中表达而进行了密码子优化。

SEQ ID NO：10为SEQ ID NO：9所编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO：11-16为实施例1中表1中的引物序列。

SEQ ID NO：17-22为实施例16a中使用的引物序列。

SEQ ID NO：23-26为实施例16b中使用的引物序列。

SEQ ID NO：27-30为实施例16c中使用的引物序列。

序列表

<110>弗卢克索姆科学公司

<120>用于生产赤松素的代谢改造细胞

<130>PJS/P15302wo

<150>GB 0614442.2

<151>2006-07-06

<160>30

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>2154

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>1

atggatcaaa tcgaagcaat gttgtgcggc ggaggagaga agacaaaagt ggcggttact 60

acgaagactt tggcagatcc attgaattgg ggtttagcag cggatcaaat gaaaggaagt 120

catttagatg aagtgaagaa gatggtcgaa gagtatcgta gaccagtcgt gaatcttggc 180

ggagaaacac tgacgatcgg acaagttgct gccatctcca ccgtaggagg cagcgttaag 240

gttgagttag cggagacttc aagagccggt gtgaaagcta gcagtgattg ggttatggag 300

agcatgaaca aaggtactga cagttacgga gtcaccaccg gctttggtgc tacttctcac 360

cggagaacca aaaacggcac cgcattacaa acagaactca ttagattttt gaacgccgga 420

atattcggaa acacgaagga gacatgtcac acactgccgc aatccgccac aagagccgcc 480

atgctcgtca gagtcaacac tcttctccaa ggatactccg ggatccgatt cgagatcctc 540

gaagcgatta caagtctcct caaccacaac atctctccgt cactacctct ccgtggaacc 600

attaccgcct ccggcgatct cgttcctctc tcttacatcg ccggacttct caccggccgt 660

cctaattcca aagccaccgg tcccgacggt gaatcgctaa ccgcgaaaga agcttttgag 720

aaagccggaa tcagtactgg attcttcgat ttacaaccta aggaaggttt agctctcgtt 780

aatggcacgg cggttggatc tggaatggcg tcgatggttc tattcgaagc gaatgtccaa 840

gcggtgttag cggaggtttt atcagcgatc ttcgcggagg ttatgagcgg gaaacctgag 900

tttaccgatc atctgactca tcgtttaaaa catcatcccg gacaaatcga agcggcggcg 960

ataatggagc acatactcga cggaagctca tacatgaaat tagctcaaaa ggttcacgag 1020

atggatccat tgcagaaacc aaaacaagat cgttacgctc ttcgtacatc tcctcaatgg 1080

ctaggtcctc aaattgaagt aatccgtcaa gctacgaaat cgatagagcg tgaaatcaac 1140

tccgttaacg ataatccgtt gatcgatgtt tcgaggaaca aggcgattca cggtggtaac 1200

ttccaaggaa caccaatcgg agtttctatg gataacacga gattggcgat tgctgcgatt 1260

gggaagctaa tgtttgctca attctctgag cttgttaatg atttctacaa caatggactt 1320

ccttcgaatc taactgcttc gagtaatcca agtttggatt atggattcaa aggagcagag 1380

attgctatgg cttcttattg ttctgagctt caatacttgg ctaatccagt cacaagccat 1440

gttcaatcag ctgagcaaca taatcaagat gtgaactctc ttggtttgat ctcgtctcgt 1500

aaaacatctg aagctgtgga tattcttaag ctaatgtcaa caacgttcct tgtggggata 1560

tgtcaagctg ttgatttgag acatttggag gagaatctga gacaaactgt gaagaacaca 1620

gtttctcaag ttgctaagaa agtgttaacc actggaatca acggtgagtt acatccgtca 1680

aggttttgcg agaaggactt gcttaaggtt gttgatcgtg agcaagtgtt cacgtatgtg 1740

gatgatcctt gtagcgctac gtacccgttg atgcagagac taagacaagt tattgttgat 1800

cacgctttgt ccaacggtga gactgagaag aatgcagtga cttcgatctt tcaaaagatt 1860

ggagcttttg aagaggagct taaggctgtg cttccaaagg aagttgaagc ggctagagcg 1920

gcttatggga atggaactgc gccgattcct aaccggatta aggaatgtag gtcgtatccg 1980

ttgtataggt tcgtgaggga agagcttgga acgaagttgt tgactggaga aaaggttgtg 2040

tctccgggag aggagtttga taaggtcttc actgctatgt gtgaaggtaa acttattgat 2100

ccgttgatgg attgtctcaa ggaatggaac ggagctccga ttccgatttg ctaa 2154

<210>2

<211>717

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>2

Met Asp Gln Ile Glu Ala Met Leu Cys Gly Gly Gly Glu Lys Thr Lys

1 5 10 15

Val Ala Val Thr Thr Lys Thr Lau Ala Asp Pro Leu Asn Trp Gly Leu

20 25 30

Ala Ala Asp Gln Met Lys Gly Ser His Leu Asp Glu Val Lys Lys Met

35 40 45

Val Glu Glu Tyr Arg Arg Pro Val Val Asn Leu Gly Gly Glu Thr Leu

50 55 60

Thr Ile Gly Gln Val Ala Ala Ile Ser Thr Val Gly Gly Ser Val Lys

65 70 75 80

Val Glu Leu Ala Glu Thr Ser Arg Ala Gly Val Lys Ala Ser Ser Asp

85 90 95

Trp Val Met Glu Ser Met Asn Lys Gly Thr Asp Ser Tyr Gly Val Thr

100 105 110

Thr Gly Phe Gly Ala Thr Ser His Arg Arg Thr Lys Asn Gly Thr Ala

115 120 125

Leu Gln Thr Glu Leu Ile Arg Phe Leu Asn Ala Gly Ile Phe Gly Asn

130 135 140

Thr Lys Glu Thr Cys His Thr Leu Pro Gln Ser Ala Thr Arg Ala Ala

145 150 155 160

Met Leu Val Arg Val Asn Thr Leu Leu Gln Gly Tyr Ser Gly Ile Arg

165 170 175

Phe Glu Ile Leu Glu Ala Ile Thr Ser Leu Leu Asn His Asn Ile Ser

180 185 190

Pro Ser Leu Pro Leu Arg Gly Thr Ile Thr Ala Ser Gly Asp Leu Val

195 200 205

Pro Leu Ser Tyr Ile Ala Gly Leu Leu Thr Gly Arg Pro Asn Ser Lys

210 215 220

Ala Thr Gly Pro Asp Gly Glu Ser Leu Thr Ala Lys Glu Ala Phe Glu

225 230 235 240

Lys Ala Gly Ile Ser Thr Gly Phe Phe Asp Leu Gln Pro Lys Glu Gly

245 250 255

Leu Ala Leu Val Asn Gly Thr Ala Val Gly Ser Gly Met Ala Ser Met

260 265 270

Val Leu Phe Glu Ala Asn Val Gln Ala Val Leu Ala Glu Val Leu Ser

275 280 285

Ala Ile Phe Ala Glu Val Met Ser Gly Lys Pro Glu Phe Thr Asp His

290 295 300

Leu Thr His Arg Leu Lys His His Pro Gly Gln Ile Glu Ala Ala Ala

305 310 315 320

Ile Met Glu His Ile Leu Asp Gly Ser Ser Tyr Met Lys Leu Ala Gln

325 330 335

Lys Val His Glu Met Asp Pro Leu Gln Lys Pro Lys Gln Asp Arg Tyr

340 345 350

Ala Leu Arg Thr Ser Pro Gln Trp Leu Gly Pro Gln Ile Glu Val Ile

355 360 365

Arg Gln Ala Thr Lys Ser Ile Glu Arg Glu Ile Asn Ser Val Asn Asp

370 375 380

Asn Pro Leu Ile Asp Val Ser Arg Asn Lys Ala Ile His Gly Gly Asn

385 390 395 400

Phe Gln Gly Thr Pro Ile Gly Val Ser Met Asp Asn Thr Arg Leu Ala

405 410 415

Ile Ala Ala Ile Gly Lys Leu Met Phe Ala Gln Phe Ser Glu Leu Val

420 425 430

Asn Asp Phe Tyr Asn Asn Gly Leu Pro Ser Asn Leu Thr Ala Ser Ser

435 440 445

Asn Pro Ser Leu Asp Tyr Gly Phe Lys Gly Ala Glu Ile Ala Met Ala

450 455 460

Ser Tyr Cys Ser Glu Leu Gln Tyr Leu Ala Asn Pro Val Thr Ser His

465 470 475 480

Val Gln Ser Ala Glu Gln His Asn Gln Asp Val Asn Ser Leu Gly Leu

485 490 495

Ile Ser Ser Arg Lys Thr Ser Glu Ala Val Asp Ile Leu Lys Leu Met

500 505 510

Ser Thr Thr Phe Leu Val Gly Ile Cys Gln Ala Val Asp Leu Arg His

515 520 525

Leu Glu Glu Asn Leu Arg Gln Thr Val Lys Asn Thr Val Ser Gln Val

530 535 540

Ala Lys Lys Val Leu Thr Thr Gly Ile Asn Gly Glu Leu His Pro Ser

545 550 555 560

Arg Phe Cys Glu Lys Asp Leu Leu Lys Val Val Asp Arg Glu Gln Val

565 570 575

Phe Thr Tyr Val Asp Asp Pro Cys Ser Ala Thr Tyr Pro Leu Met Gln

580 585 590

Arg Leu Arg Gln Val Ile Val Asp His Ala Leu Ser Asn Gly Glu Thr

595 600 605

Glu Lys Asn Ala Val Thr Ser Ile Phe Gln Lys Ile Gly Ala Phe Glu

610 615 620

Glu Glu Leu Lys Ala Val Leu Pro Lys Glu Val Glu Ala Ala Arg Ala

625 630 635 640

Ala Tyr Gly Asn Gly Thr Ala Pro Ile Pro Asn Arg Ile Lys Glu Cys

645 650 655

Arg Ser Tyr Pro Leu Tyr Arg Phe Val Arg Glu Glu Leu Gly Thr Lys

660 665 670

Leu Leu Thr Gly Glu Lys Val Val Ser Pro Gly Glu Glu Phe Asp Lys

675 680 685

Val Phe Thr Ala Met Cys Glu Gly Lys Leu Ile Asp Pro Leu Met Asp

690 695 700

Cys Leu Lys Glu Trp Asn Gly Ala Pro Ile Pro Ile Cys

705 710 715

<210>3

<211>1686

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>3

atggcgccac aagaacaagc agtttctcag gtgatggaga aacagagcaa caacaacaac 60

agtgacgtca ttttccgatc aaagttaccg gatatttaca tcccgaacca cctatctctc 120

cacgactaca tcttccaaaa catctccgaa ttcgccacta agccttgcct aatcaacgga 180

ccaaccggcc acgtgtacac ttactccgac gtccacgtca tctcccgcca aatcgccgcc 240

aattttcaca aactcggcgt taaccaaaac gacgtcgtca tgctcctcct cccaaactgt 300

cccgaattcg tcctctcttt cctcgccgcc tccttccgcg gcgcaaccgc caccgccgca 360

aaccctttct tcactccggc ggagatagct aaacaagcca aagcctccaa caccaaactc 420

ataatcaccg aagctcgtta cgtcgacaaa atcaaaccac ttcaaaacga cgacggagta 480

gtcatcgtct gcatcgacga caacgaatcc gtgccaatcc ctgaaggctg cctccgcttc 540

accgagttga ctcagtcgac aaccgaggca tcagaagtca tcgactcggt ggagatttca 600

ccggacgacg tggtggcact accttactcc tctggcacga cgggattacc aaaaggagtg 660

atgctgactc acaagggact agtcacgagc gttgctcagc aagtcgacgg cgagaacccg 720

aatctttatt tccacagcga tgacgtcata ctctgtgttt tgcccatgtt tcatatctac 780

gctttgaact cgatcatgtt gtgtggtctt agagttggtg cggcgattct gataatgccg 840

aagtttgaga tcaatctgct attggagctg atccagaggt gtaaagtgac ggtggctccg 900

atggttccgc cgattgtgtt ggccattgcg aagtcttcgg agacggagaa gtatgatttg 960

agctcgataa gagtggtgaa atctggtgct gctcctcttg gtaaagaact tgaagatgcc 1020

gttaatgcca agtttcctaa tgccaaactc ggtcagggat acggaatgac ggaagcaggt 1080

ccagtgctag caatgtcgtt aggttttgca aaggaacctt ttccggttaa gtcaggagct 1140

tgtggtactg ttgtaagaaa tgctgagatg aaaatagttg atccagacac cggagattct 1200

ctttcgagga atcaacccgg tgagatttgt attcgtggtc accagatcat gaaaggttac 1260

ctcaacaatc cggcagctac agcagagacc attgataaag acggttggct tcatactgga 1320

gatattggat tgatcgatga cgatgacgag cttttcatcg ttgatcgatt gaaagaactt 1380

atcaagtata aaggttttca ggtagctccg gctgagctag aggctttgct catcggtcat 1440

cctgacatta ctgatgttgc tgttgtcgca atgaaagaag aagcagctgg tgaagttcct 1500

gttgcatttg tggtgaaatc gaaggattcg gagttatcag aagatgatgt gaagcaattc 1560

gtgtcgaaac aggttgtgtt ttacaagaga atcaacaaag tgttcttcac tgaatGcatt 1620

cctaaagctc catcagggaa gatattgagg aaagatctga gggcaaaact agcaaatgga 1680

ttgtga 1686

<210>4

<211>561

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>4

Met Ala Pro Gln Glu Gln Ala Val Ser Gln Val Met Glu Lys Gln Ser

1 5 10 15

Asn Asn Asn Asn Ser Asp Val Ile Phe Arg Ser Lys Leu Pro Asp Ile

20 25 30

Tyr Ile Pro Asn His Leu Ser Leu His Asp Tyr Ile Phe Gln Asn Ile

35 40 45

Ser Glu Phe Ala Thr Lys Pro Cys Leu Ile Asn Gly Pro Thr Gly His

50 55 60

Val Tyr Thr Tyr Ser Asp Val His Val Ile Ser Arg Gln Ile Ala Ala

65 70 75 80

Asn Phe His Lys Leu Gly Val Asn Gln Asn Asp Val Val Met Leu Leu

85 90 95

Leu Pro Asn Cys Pro Glu Phe Val Leu Ser Phe Leu Ala Ala Ser Phe

100 105 110

Arg Gly Ala Thr Ala Thr Ala Ala Asn Pro Phe Phe Thr Pro Ala Glu

115 120 125

Ile Ala Lys Gln Ala Lys Ala Ser Asn Thr Lys Leu Ile Ile Thr Glu

130 135 140

Ala Arg Tyr Val Asp Lys Ile Lys Pro Leu Gln Asn Asp Asp Gly Val

145 150 155 160

Val Ile Val Cys Ile Asp Asp Asn Glu Ser Val Pro Ile Pro Glu Gly

165 170 175

Cys Leu Arg Phe Thr Glu Leu Thr Gln Ser Thr Thr Glu Ala Ser Glu

180 185 190

Val Ile Asp Ser Val Glu Ile Ser Pro Asp Asp Val Val Ala Leu Pro

195 200 205

Tyr Ser Ser Gly Thr Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val Met Leu Thr His

210 215 220

Lys Gly Leu Val Thr Ser Val Ala Gln Gln Val Asp Gly Glu Asn Pro

225 230 235 240

Asn Leu Tyr Phe His Ser Asp Asp Val Ile Leu Cys Val Leu Pro Met

245 250 255

Phe His Ile Tyr Ala Leu Asn Ser Ile Met Leu Cys Gly Leu Arg Val

260 265 270

Gly Ala Ala Ile Leu Ile Met Pro Lys Phe Glu Ile Asn Leu Leu Leu

275 280 285

Glu Leu Ile Gln Arg Cys Lys Val Thr Val Ala Pro Met Val Pro Pro

290 295 300

Ile Val Leu Ala Ile Ala Lys Ser Ser Glu Thr Glu Lys Tyr Asp Leu

305 310 315 320

Ser Ser Ile Arg Val Val Lys Ser Gly Ala Ala Pro Leu Gly Lys Glu

325 330 335

Leu Glu Asp Ala Val Asn Ala Lys Phe Pro Asn Ala Lys Leu Gly Gln

340 345 350

Gly Tyr Gly Met Thr Glu Ala Gly Pro Val Leu Ala Met Ser Leu Gly

355 360 365

Phe Ala Lys Glu Pro Phe Pro Val Lys Ser Gly Ala Cys Gly Thr Val

370 375 380

Val Arg Asn Ala Glu Met Lys Ile Val Asp Pro Asp Thr Gly Asp Ser

385 390 395 400

Leu Ser Arg Asn Gln Pro Gly Glu Ile Cys Ile Arg Gly His Gln Ile

405 410 415

Met Lys Gly Tyr Leu Asn Asn Pro Ala Ala Thr Ala Glu Thr Ile Asp

420 425 430

Lys Asp Gly Trp Leu His Thr Gly Asp Ile Gly Leu Ile Asp Asp Asp

435 440 445

Asp Glu Leu Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Glu Leu Ile Lys Tyr Lys

450 455 460

Gly Phe Gln Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ala Leu Leu Ile Gly His

465 470 475 480

Pro Asp Ile Thr Asp Val Ala Val Val Ala Met Lys Glu Glu Ala Ala

485 490 495

Gly Glu Val Pro Val Ala Phe Val Val Lys Ser Lys Asp Ser Glu Leu

500 505 510

Ser Glu Asp Asp Val Lys Gln Phe Val Ser Lys Gln Val Val Phe Tyr

515 520 525

Lys Arg Ile Asn Lys Val Phe Phe Thr Glu Ser Ile Pro Lys Ala Pro

530 535 540

Ser Gly Lys Ile Leu Arg Lys Asp Leu Arg Ala Lys Leu Ala Asn Gly

545 550 555 560

Leu

<210>5

<211>1176

<212>DNA

<213>圆叶大黄

<400>5

atggcaccgg aggagtccag gcatgctgaa actgcagtta acagagccgc caccgtcctg 60

gccatcggca ctgccaaccc gccaaactgc tactatcaag cggactttcc tgacttctac 120

ttccgtgcca ccaacagcga ccacctcacg cacctcaagc aaaaatttaa gcgcatttgt 180

gagaaatcga tgattgaaaa acgttatctc catttgacgg aagaaattct caaggagaat 240

ccaaatattg cttccttcga ggcgccatca ttggatgtaa gacataacat tcaagtgaaa 300

gaagtggtgc tgctcggaaa agaggcagct ttgaaggcca tcaatgagtg gggccaaccc 360

aagtcaaaga tcacgcgcct cattgtgtgt tgtattgccg gcgttgacat gcccggcgca 420

gactatcaac tcactaaact ccttggctta caactttctg ttaagcgatt tatgttttac 480

cacctaggat gctatgccgg tggcaccgtc cttcgccttg cgaaggacat agcagaaaac 540

aacaaggaag ctcgtgttct catcgttcgc tctgagatga cgccaatctg tttccgtggg 600

ccatccgaaa cccacataga ctccatggta gggcaagcaa tatttggtga cggtgctgcg 660

gctgttatag ttggtgcaaa tcccgaccta tccatcgaaa ggccgatttt cgagttgatt 720

tctacatccc aaactatcat acctgaatcc gatggtgcga ttgagggaca tttgcttgaa 780

gttggactca gtttccaact ctaccagact gttccctcat taatctctaa ttgtatcgaa 840

acttgtcttt caaaggcttt cacacctctt aacattagtg attggaactc actattctgg 900

attgcacacc ctggtggccg tgctatcctt gacgatatcg aggctactgt tggtctcaag 960

aaggagaaac ttaaggcaac aagacaagtt ttgaacgact atgggaacat gtcaagtgct 1020

tgcgtatttt tcatcatgga tgagatgagg aagaagtcgc tcgcaaacgg tcaagtaacc 1080

actggagaag gactcaagtg gggtgttctt tttgggttcg ggccaggtgt tactgtggaa 1140

actgtggttc taagcagtgt gccgctaatt acctga 1176

<210>6

<211>391

<212>PRT

<213>圆叶大黄

<400>6

Met Ala Pro Glu Glu Ser Arg His Ala Glu Thr Ala Val Asn Arg Ala

1 5 10 15

Ala Thr Val Leu Ala Ile Gly Thr Ala Asn Pro Pro Asn Cys Tyr Tyr

20 25 30

Gln Ala Asp Phe Pro Asp Phe Tyr Phe Arg Ala Thr Asn Ser Asp His

35 40 45

Leu Thr His Leu Lys Gln Lys Phe Lys Arg Ile Cys Glu Lys Ser Met

50 55 60

Ile Glu Lys Arg Tyr Leu His Leu Thr Glu Glu Ile Leu Lys Glu Asn

65 70 75 80

Pro Asn Ile Ala Ser Phe Glu Ala Pro Ser Leu Asp Val Arg His Asn

85 90 95

Ile Gln Val Lys Glu Val Val Leu Leu Gly Lys Glu Ala Ala Leu Lys

100 105 110

Ala Ile Asn Glu Trp Gly Gln Pro Lys Ser Lys Ile Thr Arg Leu Ile

115 120 125

Val Cys Cys Ile Ala Gly Val Asp Met Pro Gly Ala Asp Tyr Gln Leu

130 135 140

Thr Lys Leu Leu Gly Leu Gln Leu Ser Val Lys Arg Phe Met Phe Tyr

145 150 155 160

His Leu Gly Cys Tyr Ala Gly Gly Thr Val Leu Arg Leu Ala Lys Asp

165 170 175

Ile Ala Glu Asn Asn Lys Glu Ala Arg Val Leu Ile Val Arg Ser Glu

180 185 190

Met Thr Pro Ile Cys Phe Arg Gly Pro Ser Glu Thr His Ile Asp Ser

195 200 205

Met Val Gly Gln Ala Ile Phe Gly Asp Gly Ala Ala Ala Val Ile Val

210 215 220

Gly Ala Asn Pro Asp Leu Ser Ile Glu Arg Pro Ile Phe Glu Leu Ile

225 230 235 240

Ser Thr Ser Gln Thr Ile Ile Pro Glu Ser Asp Gly Ala Ile Glu Gly

245 250 255

His Leu Leu Glu Val Gly Leu Ser Phe Gln Leu Tyr Gln Thr Val Pro

260 265 270

Ser Leu Ile Ser Asn Cys Ile Glu Thr Cys Leu Ser Lys Ala Phe Thr

275 280 285

Pro Leu Asn Ile Ser Asp Trp Asn Ser Leu Phe Trp Ile Ala His Pro

290 295 300

Gly Gly Arg Ala Ile Leu Asp Asp Ile Glu Ala Thr Val Gly Leu Lys

305 310 315 320

Lys Glu Lys Leu Lys Ala Thr Arg Gln Val Leu Asn Asp Tyr Gly Asn

325 330 335

Met Ser Ser Ala Cys Val Phe Phe Ile Met Asp Glu Met Arg Lys Lys

340 345 350

Ser Leu Ala Asn Gly Gln Val Thr Thr Gly Glu Gly Leu Lys Trp Gly

355 360 365

Val Leu Phe Gly Phe Gly Pro Gly Val Thr Val Glu Thr Val Val Leu

370 375 380

Ser Ser Val Pro Leu Ile Thr

385 390

<210>7

<211>1176

<212>DNA

<213>圆叶大黄

<400>7

atggccccag aagagagcag gcacgcagaa acggccgtta acagagctgc aactgttttg 60

gctattggta cggccaatcc acccaattgt tactatcaag ctgactttcc tgatttttat 120

ttcagagcca caaatagcga tcatttgact catcttaagc aaaaatttaa aaggatatgc 180

gagaagtcca tgattgaaaa gagatacttg caccttaccg aagagatctt aaaagaaaac 240

ccaaatatag cttcttttga agctccctcc ttagatgtac gtcacaacat tcaagtcaag 300

gaggtggttt tacttggtaa ggaagccgca ttgaaagcta taaacgaatg gggacagcct 360

aaaagtaaga taaccagatt gatcgtatgt tgcatagctg gcgttgacat gcctggtgca 420

gattatcaac taacaaaatt gctgggtcta caattatccg taaaaaggtt tatgttctac 480

catttaggct gttacgctgg tggcacagtt ttaagactgg ctaaggatat agcagaaaat 540

aacaaggagg ctagagtctt aatagtgcgt agtgaaatga ctcctatttg ctttagaggt 600

ccatcagaaa cacatatcga cagcatggta ggtcaggcaa ttttcggtga tggtgctgca 660

gccgtaattg tgggagctaa tcctgattta agtatcgaaa gacctatttt tgaacttatt 720

tctacttcgc aaaccattat ccccgaatca gatggtgcaa ttgaaggcca tttattggag 780

gttggtttgt cctttcaatt gtatcagaca gtgccatctt taatttcaaa ctgtatagaa 840

acctgtctaa gtaaagcatt tacaccatta aacatttctg actggaattc tttgttctgg 900

attgctcatc caggtggaag agccatctta gatgacatcg aagctactgt gggactgaaa 960

aaggaaaaac taaaagctac tagacaagtt ttaaatgact acggtaatat gtcatctgct 1020

tgtgtatttt tcattatgga tgagatgaga aaaaagtcac ttgcaaatgg ccaggtcacg 1080

acaggtgagg gtctaaaatg gggagtccta ttcggattcg gcccaggtgt cactgttgaa 1140

accgttgtcc tgtcttcggt tccattgatc acttaa 1176

<210>8

<211>391

<212>PRT

<213>圆叶大黄

<400>8

Met Ala Pro Glu Glu Ser Arg His Ala Glu Thr Ala Val Asn Arg Ala

1 5 10 15

Ala Thr Val Leu Ala Ile Gly Thr Ala Asn Pro Pro Asn Cys Tyr Tyr

20 25 30

Gln Ala Asp Phe Pro Asp Phe Tyr Phe Arg Ala Thr Asn Ser Asp His

35 40 45

Leu Thr His Leu Lys Gln Lys Phe Lys Arg Ile Cys Glu Lys Ser Met

50 55 60

Ile Glu Lys Arg Tyr Leu His Leu Thr Glu Glu Ile Leu Lys Glu Asn

65 70 75 80

Pro Asn Ile Ala Ser Phe Glu Ala Pro Ser Leu Asp Val Arg His Asn

85 90 95

Ile Gln Val Lys Glu Val Val Leu Leu Gly Lys Glu Ala Ala Leu Lys

100 105 110

Ala Ile Asn Glu Trp Gly Gln Pro Lys Ser Lys Ile Thr Arg Leu Ile

115 120 125

Val Cys Cys Ile Ala Gly Val Asp Met Pro Gly Ala Asp Tyr Gln Leu

130 135 140

Thr Lys Leu Leu Gly Leu Gln Leu Ser Val Lys Arg Phe Met Phe Tyr

145 150 155 160

His Leu Gly Cys Tyr Ala Gly Gly Thr Val Leu Arg Leu Ala Lys Asp

165 170 175

Ile Ala Glu Asn Asn Lys Glu Ala Arg Val Leu Ile Val Arg Ser Glu

180 185 190

Met Thr Pro Ile Cys Phe Arg Gly Pro Ser Glu Thr His Ile Asp Ser

195 200 205

Met Val Gly Gln Ala Ile Phe Gly Asp Gly Ala Ala Ala Val Ile Val

210 215 220

Gly Ala Asn Pro Asp Leu Ser Ile Glu Arg Pro Ile Phe Glu Leu Ile

225 230 235 240

Ser Thr Ser Gln Thr Ile Ile Pro Glu Ser Asp Gly Ala Ile Glu Gly

245 250 255

His Leu Leu Glu Val Gly Leu Ser Phe Gln Leu Tyr Gln Thr Val Pro

260 265 270

Ser Leu Ile Ser Asn Cys Ile Glu Thr Cys Leu Ser Lys Ala Phe Thr

275 280 285

Pro Leu Asn Ile Ser Asp Trp Asn Ser Leu Phe Trp Ile Ala His Pro

290 295 300

Gly Gly Arg Ala Ile Leu Asp Asp Ile Glu Ala Thr Val Gly Leu Lys

305 310 315 320

Lys Glu Lys Leu Lys Ala Thr Arg Gln Val Leu Asn Asp Tyr Gly Asn

325 330 335

Met Ser Ser Ala Cys Val Phe Phe Ile Met Asp Glu Met Arg Lys Lys

340 345 350

Ser Leu Ala Asn Gly Gln Val Thr Thr Gly Glu Gly Leu Lys Trp Gly

355 360 365

Val Leu Phe Gly Phe Gly Pro Gly Val Thr Val Glu Thr Val Val Leu

370 375 380

Ser Ser Val Pro Leu Ile Thr

385 390

<210>9

<211>1182

<212>DNA

<213>葡萄

<400>9

atggcatccg tagaggagtt cagaaatgca cagagggcaa aaggtccagc aaccatattg 60

gctattggaa cagccacccc tgatcactgt gtttatcaat ctgattacgc tgattactat 120

ttcagagtaa ctaaaagtga acatatgaca gaacttaaga aaaagtttaa tagaatttgt 180

gataaatcta tgataaagaa aagatacata catctaactg aagaaatgtt agaggaacat 240

ccaaatatag gtgcatatat ggcaccatct ttgaatatta gacaagaaat cataacagcc 300

gaggtaccta gactaggtag agacgcagcc ttgaaagctt taaaggaatg gggacaacca 360

aaatctaaga ttacacattt ggttttctgt acaacttccg gtgtcgaaat gccaggtgct 420

gattataaac tagcaaacct attgggatta gagacctctg ttagaagagt tatgttgtat 480

catcaaggtt gttacgccgg aggtacagtg cttagaactg ctaaggattt ggcagaaaat 540

aacgccggtg ctagggtttt agtcgtctgc agtgaaatca ctgtcgtaac tttcagaggt 600

ccatcagaag atgctctaga cagtttggtc ggacaagcat tgtttggcga tggatcttcc 660

gccgtaattg taggcagcga tcctgatgtg tccattgaaa gaccactatt tcaattagtt 720

tctgctgctc aaacttttat tccaaattcc gccggtgcca tagcaggaaa cttgagagaa 780

gttggtttga cttttcattt gtggcctaat gtcccaacct taatttcaga aaacatcgaa 840

aaatgcttaa ctcaagcctt tgacccattg ggcataagcg actggaactc attgttttgg 900

attgctcatc caggtggtcc agcaatttta gacgcagtgg aggcaaaact aaacttagag 960

aagaaaaagt tggaagctac aagacacgtt ctatcagagt atggcaacat gagctctgcc 1020

tgcgttttat tcattctaga tgagatgagg aagaagtctt taaagggtga aaaagccaca 1080

accggagaag gtttagattg gggtgttcta tttggtttcg gtcctggctt aacaattgag 1140

acagtggtgt tacactctgt tccaactgtc actaactaat ga 1182

<210>10

<211>392

<212>PRT

<213>葡萄

<400>10

Met Ala Ser Val Glu Glu Phe Arg Asn Ala Gln Arg Ala Lys Gly Pro

1 5 10 15

Ala Thr Ile Leu Ala Ile Gly Thr Ala Thr Pro Asp His Cys Val Tyr

20 25 30

Gln Ser Asp Tyr Ala Asp Tyr Tyr Phe Arg Val Thr Lys Ser Glu His

35 40 45

Met Thr Glu Leu Lys Lys Lys Phe Asn Arg Ile Cys Asp Lys Ser Met

50 55 60

Ile Lys Lys Arg Tyr Ile His Leu Thr Glu Glu Met Leu Glu Glu His

65 70 75 80

Pro Asn Ile Gly Ala Tyr Met Ala Pro Ser Leu Asn Ile Arg Gln Glu

85 90 95

Ile Ile Thr Ala Glu Val Pro Arg Leu Gly Arg Asp Ala Ala Leu Lys

100 105 110

Ala Leu Lys Glu Trp Gly Gln Pro Lys Ser Lys Ile Thr His Leu Val

115 120 125

Phe Cys Thr Thr Ser Gly Val Glu Met Pro Gly Ala Asp Tyr Lys Leu

130 135 140

Ala Asn Leu Leu Gly Leu Glu Thr Ser Val Arg Arg Val Met Leu Tyr

145 150 155 160

His Gln Gly Cys Tyr Ala Gly Gly Thr Val Leu Arg Thr Ala Lys Asp

165 170 175

Leu Ala Glu Asn Asn Ala Gly Ala Arg Val Leu Val Val Cys Ser Glu

180 185 190

Ile Thr Val Val Thr Phe Arg Gly Pro Ser Glu Asp Ala Leu Asp Ser

195 200 205

Leu Val Gly Gln Ala Leu Phe Gly Asp Gly Ser Ser Ala Val Ile Val

210 215 220

Gly Ser Asp Pro Asp Val Ser Ile Glu Arg Pro Leu Phe Gln Leu Val

225 230 235 240

Ser Ala Ala Gln Thr Phe Ile Pro Asn Ser Ala Gly Ala Ile Ala Gly

245 250 255

Asn Leu Arg Glu Val Gly Leu Thr Phe His Leu Trp Pro Asn Val Pro

260 265 270

Thr Leu Ile Ser Glu Asn Ile Glu Lys Cys Leu Thr Gln Ala Phe Asp

275 280 285

Pro Leu Gly Ile Ser Asp Trp Asn Ser Leu Phe Trp Ile Ala His Pro

290 295 300

Gly Gly Pro Ala Ile Leu Asp Ala Val Glu Ala Lys Leu Asn Leu Glu

305 310 315 320

Lys Lys Lys Leu Glu Ala Thr Arg His Val Leu Ser Glu Tyr Gly Asn

325 330 335

Met Ser Ser Ala Cys Val Leu Phe Ile Leu Asp Glu Met Arg Lys Lys

340 345 350

Ser Leu Lys Gly Glu Lys Ala Thr Thr Gly Glu Gly Leu Asp Trp Gly

355 360 365

Val Leu Phe Gly Phe Gly Pro Gly Leu Thr Ile Glu Thr Val Val Leu

370 375 380

His Ser Val Pro Thr Val Thr Asn

385 390

<210>11

<211>33

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>11

cggaattctc atggatcaaa tcgaagcaat gtt 33

<210>12

<211>29

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>12

cgactagttt agcaaatcgg aatcggagc 29

<210>13

<211>36

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>13

gctctagacc tatggcgcca caagaacaag cagttt 36

<210>14

<211>36

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>14

gcggatcccc ttcacaatcc atttgctagt tttgcc 36

<210>15

<211>31

<212>DNA

<213>圆叶大黄

<400>15

ccggatccaa atggccccag aagagagcag g 31

<210>16

<211>35

<212>DNA

<213>圆叶大黄

<400>16

cgctcgagtt aagtgatcaa tggaaccgaa gacag 35

<210>17

<211>32

<212>DNA

<213>构巢曲霉

<400>17

cggaattcat acgcggtttt ttggggtagt ca 32

<210>18

<211>32

<212>DNA

<213>构巢曲霉

<400>18

cgcccgggta tgccacctac agccattgcg aa 32

<210>19

<211>32

<212>DNA

<213>构巢曲霉

<400>19

gcggatccat agggcgctta cacagtacac ga 32

<210>20

<211>48

<212>DNA

<213>构巢曲霉

<400>20

cggagagggc gcgcccgtgg cggccgcgga tccacttaac gttactga 48

<210>21

<211>48

<212>DNA

<213>构巢曲霉

<400>21

gcggccgcca cgggcgcgcc ctctccggcg gtagtgatgt ctgctcaa 48

<210>22

<211>32

<212>DNA

<213>构巢曲霉

<400>22

cgaagcttta taattccctt gtatctctac ac 32

<210>23

<211>32

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于基因C4H的基于质粒的PCR引物

<400>23

cggcgcgcat aatggacctc ctcttgctgg ag 32

<210>24

<211>38

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于基因C4H的基于质粒的PCR引物

<400>24

gggcggccgc ttattaacag ttccttggtt tcataacg 38

<210>25

<211>56

<212>DNA

<213>烟曲霉

<400>25

cgtgtacaat attaattaac gagagcgatc gcaataaccg tattaccgcc tttgag 56

<210>26

<211>32

<212>DNA

<213>烟曲霉

<400>26

cgacatgtat tcccgggaag atctcatggt ca 32

<210>27

<211>35

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于基因VST1的基于质粒的PCR引物

<400>27

gcggagaggg cgcgatggcg ccacaagaac aagca 35

<210>28

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于基因VST1的基于质粒的引物

<400>28

tggatccgcg gccgctcaca atccatttgc tagttttgc 39

<210>29

<211>32

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于基因VST1的基于质粒的PCR引物序列

<400>29

cggcgcgcat aatggcatcc gtagaggagt tc 32

<210>30

<211>36

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于基因VST1的基于质粒的PCR引物序列

<400>30

gggcggccgc ttatcattag ttagtgacag ttggaa 36

Claims

1.微生物用于产生赤松素的用途，其中所述微生物具有有效代谢途径，所述途径从肉桂酸产生赤松素，其中在所述途径中在所述微生物中表达的显示4-香豆酸或者肉桂酸底物偏好性的4-香豆酸辅酶A连接酶催化的反应中由肉桂酸形成肉桂酰辅酶A，以及通过所述微生物中表达的茋合酶从肉桂酰辅酶A产生所述赤松素。

2.权利要求1的用途，其中所述微生物产生肉桂酸，并从其产生赤松素。

3.权利要求2的用途，其中所述赤松素在由以内源性丙二酸单酰辅酶A为底物的酶所催化的反应中产生。

4.权利要求1的用途，其中所述茋合酶在所述微生物中由编码所述酶的核酸表达，所述核酸对于该微生物来说不是天然的。

5.权利要求4的用途，其中所述茋合酶为来自以下来源的白藜芦醇合酶(EC 2.3.1.95)：属于落花生属(Arachis)的植物；属于大黄属(Rheum)的植物；属于葡萄属(Vitus)或者以下任何属的植物：松属(Pinus)、云杉属(Picea)、百合属(Lilium)、桉属(Eucalyptus)、爬山虎属(Parthenocissus)、白粉藤属(Cissus)、蝶花百合属(Calochortus)、蓼属(Polygonum)、买麻藤属(Gnetum)、木菠萝属(Artocarpus)、假山毛榉属(Nothofagus)、刺葵属(Phoenix)、羊茅属(Festuca)、薹草属(Carex)、藜芦属(Veratrum)、羊蹄甲属(Bauhinia)或老虎刺属(Pterolobium)。

6.权利要求4的用途，其中所述茋合酶为来自以下来源的赤松素合酶(EC 2.3.1.146)：属于松属(Pinus)的植物。

7.权利要求1的用途，其中在所述途径中，在产生氨的酶催化反应中从L-苯丙氨酸产生所述肉桂酸。

8.权利要求7的用途，其中通过L-苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)从L-苯丙氨酸形成所述肉桂酸。

9.权利要求8的用途，其中所述L-苯丙氨酸氨裂合酶在所述微生物中由编码所述酶的核酸表达，所述核酸对于该微生物来说不是天然的。

10.权利要求9的用途，其中通过来自以下来源的L-苯丙氨酸氨裂合酶(EC 4.3.1.5)从L-苯丙氨酸形成所述肉桂酸：属于拟南芥属(Arabidopsis)的植物；属于芸苔属(Brassica)的植物；属于柑橘属(Citrus)的植物；属于菜豆属(Phaseolus)的植物；属于松属(Pinus)的植物；属于杨属(Populus)的植物；属于茄属(Solanum)的植物；属于李属(Prunus)的植物；属于葡萄属(Vitus)的植物；属于玉蜀黍属(Zea)的植物；或者属于以下任一属的植物：藿香属(Agastache)、凤梨属(Ananas)、天门冬属(Asparagus)、布氏兰属(Bromheadia)、簕竹属(Bambusa)、甜菜属(Beta)、桦木属(Betula)、黄瓜属(Cucumis)、山茶属(Camellia)、辣椒属(Capsicum)、决明属(Cassia)、长春花属(Catharanthus)、鹰嘴豆属(Cicer)、西瓜属(Citrullus)、咖啡属(Coffea)、南瓜属(Cucurbita)、狗牙根属(Cynodon)、胡萝卜属(Daucus)、石斛属(Dendrobium)、石竹属(Dianthus)、洋地黄属(Digitalis)、薯蓣属(Dioscorea)、桉属(Eucalyptus)、Gallus、银杏属(Ginkgo)、大豆属(Glycine)、大麦属(Hordeum)、向日葵属(Helianthus)、番薯属(Ipomoea)、莴苣属(Lactuca)、紫草属(Lithospermum)、百脉根属(Lotus)、番茄属(Lycopersicon)、苜蓿属(Medicago)、苹果属(Malus)、木薯属(Manihot)、苜蓿属(Medicago)、日中花属(Mesembryanthemum)、烟草属(Nicotiana)、木犀榄属(Olea)、稻属(Oryza)、豌豆属(Pisum)、鳄梨属(Persea)、欧芹属(Petroselinum)、蝴蝶兰属(Phalaenopsis)、刚竹属(Phyllostachys)、小立碗藓属(Physcomitrella)、云杉属(Picea)、梨属(Pyrus)、栎属(Quercus)、萝卜属(Raphanus)、地黄属(Rehmannia)、悬钩子属(Rubus)、高粱属(Sorghum)、Sphenostylis、繁缕属(Stellaria)、铅笔花属(Stylosanthes)、小麦属(Triticum)、车轴草属(Trifolium)、小麦属(Triticum)、越桔属(Vaccinium)、豇豆属(Vigna)或百日草属(Zinnia)；或者来自曲霉属(Aspergillus)的丝状真菌。

11.权利要求8的用途，其中所述PAL接受苯丙氨酸为底物并由其产生肉桂酸，以使得如果该PAL也接受酪氨酸为底物并由其形成香豆酸，则所述PAL的K_m(苯丙氨酸)/K_m(酪氨酸)比值小于1∶1。

12.权利要求11的用途，其中如果所述微生物产生肉桂酸-4-羟化酶(C4H)，则K_cat(PAL)/K_cat(C4H)比值为至少2∶1。

13.权利要求1的用途，其中显示4-香豆酸或者肉桂酸底物偏好性的所述4-香豆酸辅酶A连接酶是来自以下来源的显示4-香豆酸或者肉桂酸底物偏好性的4-香豆酸辅酶A连接酶(EC 6.2.1.12)：属于冷杉属(Abies)的植物，属于拟南芥属(Arabidopsis)的植物，属于芸苔属(Brassica)的植物，属于柑橘属(Citrus)的植物，属于落叶松属(Larix)的植物，属于菜豆属(Phaseolus)的植物，属于松属(Pinus)的植物，属于杨属(Populus)的植物，属于茄属(Solanum)的植物，属于葡萄属(Vitus)的植物，属于玉蜀黍属(Zea)的植物，或者属于以下任一属的植物：藿香属(Agastache)、紫穗槐属(Amorpha)、银杉属(Cathaya)、雪松属(Cedrus)、番红花属(Crocus)、羊茅属(Festuca)、大豆属(Glycine)、胡桃属(Juglans)、油杉属(Keteleeria)、紫草属(Lithospermum)、黑麦草属(Lolium)、百脉根属(Lotus)、番茄属(Lycopersicon)、苹果属(Malus)、苜蓿属(Medicago)、日中花属(Mesembryanthemum)、烟草属(Nicotiana)、长苞铁杉属(Nothotsuga)、稻属(Oryza)、天竺葵属(Pelargonium)、欧芹属(Petroselinum)、小立碗藓属(Physcomitrella)、云杉属(Picea)、李属(Prunus)、金钱松属(Pseudolarix)、黄杉属(Pseudotsuga)、蔷薇属(Rosa)、悬钩子属(Rubus)、Ryza、甘蔗属(Saccharum)、碱蓬属(Suaeda)、盐芥属(Thellungiella)、小麦属(Triticum)或铁杉属(Tsuga)；来自属于曲霉属(Aspergillus)的丝状真菌，属于脉孢霉属(Neurospora)的丝状真菌，属于亚罗酵母属(Yarrowia)的真菌，属于球腔菌属(Mycosphaerella)属的真菌，属于分枝杆菌属(Mycobacterium)的细菌，属于奈瑟氏菌属(Neisseria)的细菌，属于链霉菌属(Streptomyces)的细菌，属于红细菌属(Rhodobacter)的细菌，或来自属于钩口线虫属(Ancylostoma)的线虫，属于隐杆线虫属(Caenorhabditis)的线虫，属于血矛线虫属(Haemonchus)的线虫，属于蚯蚓属(Lumbricus)的线虫，属于根结线虫属(Meilodogyne)的线虫，属于类圆线虫属(Strongyloidus)的线虫，或属于Pristionchus属的线虫。

14.权利要求1的用途，其中向所述微生物中重组引入了编码所述代谢途径中相应酶的至少一种遗传序列的至少一个拷贝。

15.权利要求1的用途，其中编码L-苯丙氨酸氨裂合酶的遗传序列的至少一个拷贝与在所述生物中不与所述遗传序列天然关联的表达信号有效连接。

16.权利要求1的用途，其中编码显示4-香豆酸或者肉桂酸底物偏好性的4-香豆酸辅酶A连接酶的遗传序列的至少一个拷贝与在所述生物中不与所述遗传序列天然关联的表达信号有效连接。

17.权利要求1的用途，其中编码白藜芦醇合酶的遗传序列的至少一个拷贝与在所述生物中不与所述遗传序列天然关联的表达信号有效连接。

18.权利要求1的用途，其中编码赤松素合酶的遗传序列的至少一个拷贝与在所述生物中不与所述遗传序列天然关联的表达信号有效连接。

19.权利要求1的用途，其中所述微生物含有与表达信号有效连接的编码L-苯丙氨酸氨裂合酶的异源DNA序列的一个或多个拷贝，以及含有与表达信号有效连接的编码显示4-香豆酸或者肉桂酸底物偏好性的4-香豆酸辅酶A连接酶的异源DNA序列的一个或多个拷贝，以及含有与表达信号有效连接的编码白藜芦醇合酶的异源DNA序列的一个或多个拷贝。

20.权利要求1的用途，其中所述微生物含有与表达信号有效连接的编码L-苯丙氨酸氨裂合酶的异源DNA序列的一个或多个拷贝，以及含有与表达信号有效连接的编码显示4-香豆酸或者肉桂酸底物偏好性的4-香豆酸辅酶A连接酶的异源DNA序列的一个或多个拷贝；以及含有与表达信号有效连接的编码赤松素合酶的异源DNA序列的一个或多个拷贝。

21.权利要求1的用途，其中所述微生物是真菌。

22.权利要求21的用途，其中所述微生物是丝状真菌。

23.权利要求22的用途，其中所述微生物属于曲霉属。

24.权利要求23的用途，其中所述微生物是黑曲霉(Aspergillusniger)或米曲霉(A.oryzae)的菌株。

25.权利要求21的用途，其中所述微生物是酵母。

26.权利要求25的用途，其中所述微生物属于以下属：酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、德巴利酵母属(Debaromyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、亚罗酵母属(Yarrowia)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)。

27.权利要求26的用途，其中所述微生物是来自以下的菌株：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、S.kluyveri、S.bayanus、少孢酵母(S.exiguus)、S.sevazzi、葡萄汁酵母(S.uvarum)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、K.marxianus var.marxianus、K.thermotolerans、产朊假丝酵母(Candida utilis)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、树干毕赤酵母(Pichia stipidis)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、P.sorbitophila、汉逊德巴利酵母(Debaromyces hansenii)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)。

28.权利要求1的用途，其中所述微生物是细菌。

29.权利要求28的用途，其中所述微生物属于埃希氏菌属(Escherichia)或乳球菌属(Lactococcus)。

30.权利要求29的用途，其中所述微生物是大肠杆菌(Escherichiacoli)或乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)菌株。

31.编码L-苯丙氨酸氨裂合酶、显示4-香豆酸或者肉桂酸底物偏好性的4-香豆酸辅酶A连接酶以及白藜芦醇合酶的核苷酸序列的异源表达用以产生赤松素的用途。

32.编码L-苯丙氨酸氨裂合酶、显示4-香豆酸或者肉桂酸底物偏好性的4-香豆酸辅酶A连接酶以及赤松素合酶的核苷酸序列的异源表达用以产生赤松素的用途。

33.一种生产赤松素的方法，其包括在产生赤松素的条件下培养具有产生赤松素之代谢途径的微生物细胞，其中在所述途径中在所述微生物中表达的显示4-香豆酸或者肉桂酸底物偏好性的4-香豆酸辅酶A连接酶催化的反应中由肉桂酸形成肉桂酰辅酶A，以及通过所述微生物中表达的茋合酶从肉桂酰辅酶A产生所述赤松素，以及其中所述途径包含接受苯丙氨酸为底物并由其产生肉桂酸的L-苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)，所述PAL使得如果该PAL也接受酪氨酸为底物并由其形成香豆酸，则所述PAL的K_m(苯丙氨酸)/K_m(酪氨酸)比小于1∶1；并且其中如果所述微生物产生肉桂酸-4-羟化酶(C4H)，则K_cat(PAL)/K_cat(C4H)为至少2∶1。

34.权利要求33的方法，还包括分离由此产生的赤松素。

35.权利要求33的方法，其中所述培养在基本不存在肉桂酸或其衍生物的外部来源的情况下进行。

36.权利要求33的方法，其中所述微生物细胞选自真菌和细菌。

37.权利要求36的方法，其中所述微生物细胞是选自酵母的真菌。

38.权利要求37的方法，其中所述酵母选自酵母属。

39.权利要求33的方法，其中所述微生物细胞缺少C4H的外源产生。

40.权利要求39的方法，其中所述微生物细胞缺少C4H的内源产生。

41.权利要求33的方法，其中所述微生物如权利要求1至36中任一项进行使用。

42.权利要求33的方法，其中所述培养在选自以下可发酵碳底物的碳底物存在下进行：单糖、寡糖和多糖。

43.权利要求42的方法，其中所述可发酵碳底物为葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、蔗糖、乳糖、赤藓糖、苏糖、核糖。

44.权利要求33的方法，其中所述培养在选自非可发酵碳底物的碳底物存在下进行。

45.权利要求44的方法，其中所述非可发酵碳底物为乙醇、乙酸、甘油、乳酸。

46.权利要求44的方法，其中所述非可发酵碳底物选自氨基酸。

47.权利要求46的方法，其中所述非可发酵碳底物选自苯丙氨酸。

48.权利要求33的方法，还包括将所述产生的赤松素作为营养物掺入食品或饲料产品中。

49.权利要求48的方法，其中所述赤松素在乳制品或饮料中用作营养物。

50.权利要求48的方法，其中所述赤松素在啤酒中用作营养物。

51.具有产生肉桂酰辅酶A并通过茋合酶的作用由其产生赤松素的有效代谢途径的微生物，其中在所述途径中在所述微生物中表达的显示4-香豆酸或者肉桂酸底物偏好性的4-香豆酸辅酶A连接酶催化的反应中由肉桂酸形成肉桂酰辅酶A，以及通过所述微生物中表达的茋合酶从肉桂酰辅酶A产生所述赤松素，以及所述茋合酶使用肉桂酰辅酶A为底物时比使用4-香豆酰辅酶A为底物时具有更高的转换率。

52.权利要求51的微生物，其中所述茋合酶在所述微生物中由编码所述酶的核酸表达，所述核酸对于该微生物来说不是天然的。

53.权利要求51的微生物，其中在ATP及辅酶A为底物、ADP为产物的酶催化反应中形成所述肉桂酰辅酶A。

54.权利要求53的微生物，其中在显示4-香豆酸或者肉桂酸底物偏好性的4-香豆酸辅酶A连接酶所催化的反应中形成所述肉桂酰辅酶A。

55.权利要求54的微生物，其中所述显示4-香豆酸或者肉桂酸底物偏好性的4-香豆酸辅酶A连接酶在所述微生物中由编码所述酶的核酸表达，所述核酸对于该微生物来说不是天然的。

56.权利要求55的微生物，其中所述显示4-香豆酸或者肉桂酸底物偏好性的4-香豆酸辅酶A连接酶是来自以下来源的显示4-香豆酸或者肉桂酸底物偏好性的4-香豆酸辅酶A连接酶(EC 6.2.1.12)：属于冷杉属(Abies)的植物，属于拟南芥属(Arabidopsis)的植物，属于芸苔属(Brassica)的植物，属于柑橘属(Citrus)的植物，属于落叶松属(Larix)的植物，属于菜豆属(Phaseolus)的植物，属于松属(Pinus)的植物，属于杨属(Populus)的植物，属于茄属(Solanum)的植物，属于葡萄属(Vitus)的植物，属于玉蜀黍属(Zea)的植物，或者属于以下任一属的植物：藿香属(Agastache)、紫穗槐属(Amorpha)、银杉属(Cathaya)、雪松属(Cedrus)、番红花属(Crocus)、羊茅属(Festuca)、大豆属(Glycine)、胡桃属(Juglans)、油杉属(Keteleeria)、紫草属(Lithospermum)、黑麦草属(Lolium)、百脉根属(Lotus)、番茄属(Lycopersicon)、苹果属(Malus)、苜蓿属(Medicago)、日中花属(Mesembryanthemum)、烟草属(Nicotiana)、长苞铁杉属(Nothotsuga)、稻属(Oryza)、天竺葵属(Pelargonium)、欧芹属(Petroselinum)、小立碗藓属(Physcomitrella)、云杉属(Picea)、李属(Prunus)、金钱松属(Pseudolarix)、黄杉属(Pseudotsuga)、蔷薇属(Rosa)、悬钩子属(Rubus)、Ryza、甘蔗属(Saccharum)、碱蓬属(Suaeda)、盐芥属(Thellungiella)、小麦属(Triticum)或铁杉属(Tsuga)；来自属于曲霉属(Aspergillus)的丝状真菌，属于脉孢霉属(Neurospora)的丝状真菌，属于亚罗酵母属(Yarrowia)的真菌，属于球腔菌属(Mycosphaerella)属的真菌；来自属于分枝杆菌属(Mycobacterium)的细菌，属于奈瑟氏菌属(Neisseria)的细菌，属于链霉菌属(Streptomyces)的细菌，属于红细菌属(Rhodobacter)的细菌；或来自属于钩口线虫属(Ancylostoma)的线虫，属于隐杆线虫属(Caenorhabditis)的线虫，属于血矛线虫属(Haemonchus)的线虫，属于蚯蚓属(Lumbricus)的线虫，属于根结线虫属(Meilodogyne)的线虫，属于类圆线虫属(Strongyloidus)的线虫，或属于Pristionchus属的线虫。

57.权利要求51的微生物，其中向所述微生物中重组引入了编码所述代谢途径中相应酶的至少一种遗传序列的至少一个拷贝。

58.权利要求51的微生物，其中编码L-苯丙氨酸氨裂合酶的遗传序列的至少一个拷贝与在所述生物中不与所述遗传序列天然关联的表达信号有效连接。

59.权利要求51的微生物，其中编码显示4-香豆酸或者肉桂酸底物偏好性的4-香豆酸辅酶A连接酶的遗传序列的至少一个拷贝与在所述生物中不与所述遗传序列天然关联的表达信号有效连接。

60.权利要求59的微生物，其中所述显示肉桂酸底物偏好性的4-香豆酸辅酶A连接酶在以内桂酸为底物时比以反式香豆酸为底物时显示更高的活性。

61.权利要求51的微生物，其中编码赤松素合酶的遗传序列的至少一个拷贝与在所述生物中不与所述遗传序列天然关联的表达信号有效连接。

62.权利要求51的微生物，所述微生物是真菌。

63.权利要求62的微生物，所述微生物是丝状真菌。

64.权利要求63的微生物，所述微生物属于曲霉属。

65.权利要求64的微生物，所述微生物是黑曲霉或米曲霉菌株。

66.权利要求62的微生物，所述微生物是酵母。

67.权利要求66的微生物，所述微生物是属于以下属的微生物：酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、德巴利酵母属(Debaromyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、亚罗酵母属(Yarrowia)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)。

68.权利要求67的微生物，所述微生物是来自以下的菌株：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、S.kluyveri、S.bayanus、少孢酵母(S.exiguus)、S.sevazzi、葡萄汁酵母(S.uvarum)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、K.marxianus var.marxianus、K.thermotolerans、产朊假丝酵母(C.utilis)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、树干毕赤酵母(P.stipidis)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、P.sorbitophila、汉逊德巴利酵母(Debaromyces hansenii)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。

69.权利要求51的微生物，所述微生物是细菌。

70.权利要求69的微生物，所述微生物属于埃希氏菌属或乳球菌属。

71.权利要求70的微生物，所述微生物是大肠杆菌或乳酸乳球菌菌株。

72.权利要求51的微生物，其中通过L-苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)从L-苯丙氨酸形成所述肉桂酸。

73.权利要求52的微生物，其中所述茋合酶是属于树木物种的赤松素合酶。

74.权利要求73的微生物，其中所述茋合酶是对于松属、桉属、云杉属或橙桑属物种来说天然的赤松素合酶。

75.权利要求74的微生物，其中所述茋合酶是来自松属物种的赤松素合酶(EC 2.3.1.146)。

76.权利要求75的微生物，其中所述L-苯丙氨酸氨裂合酶在所述微生物中由编码所述酶的核酸表达，所述核酸对该微生物而言不是天然的。

77.权利要求76的微生物，其中通过来自以下来源的L-苯丙氨酸氨裂合酶(EC 4.3.1.5)从L-苯丙氨酸产生所述肉桂酸：属于拟南芥属(Arabidopsis)的植物，属于芸苔属(Brassica)的植物，属于柑橘属(Citrus)的植物，属于菜豆属(Phaseolus)的植物，属于松属(Pinus)的植物，属于杨属(Populus)的植物，属于茄属(Solanum)的植物，属于李属(Prunus)的植物，属于葡萄属(Vitus)的植物，属于玉蜀黍属(Zea)的植物，或者属于以下任一属的植物：藿香属(Agastache)、凤梨属(Ananas)、天门冬属(Asparagus)、布氏兰属(Bromheadia)、簕竹属(Bambusa)、甜菜属(Beta)、桦木属(Betula)、黄瓜属(Cucumis)、山茶属(Camellia)、辣椒属(Capsicum)、决明属(Cassia)、长春花属(Catharanthus)、鹰嘴豆属(Cicer)、西瓜属(Citrullus)、咖啡属(Coffea)、南瓜属(Cucurbita)、狗牙根属(Cynodon)、胡萝卜属(Daucus)、石斛属(Dendrobium)、石竹属(Dianthus)、洋地黄属(Digitalis)、薯蓣属(Dioscorea)、桉属(Eucalyptus)、Gallus、银杏属(Ginkgo)、大豆属(Glycine)、大麦属(Hordeum)、向日葵属(Helianthus)、番薯属(Ipomoea)、莴苣属(Lactuca)、紫草属(Lithospermum)、百脉根属(Lotus)、番茄属(Lycopersicon)、苜蓿属(Medicago)、苹果属(Malus)、木薯属(Manihot)、苜蓿属(Medicago)、日中花属(Mesembryanthemum)、烟草属(Nicotiana)、木犀榄属(Olea)、稻属(Oryza)、豌豆属(Pisum)、鳄梨属(Persea)、欧芹属(Petroselinum)、蝴蝶兰属(Phalaenopsis)、刚竹属(Phyllostachys)、小立碗藓属(Physcomitrella)、云杉属(Picea)、梨属(Pyrus)、栎属(Quercus)、萝卜属(Raphanus)、地黄属(Rehmannia)、悬钩子属(Rubus)、高粱属(Sorghum)、Sphenostylis、繁缕属(Stellaria)、铅笔花属(Stylosanthes)、小麦属(Triticum)、车轴草属(Trifolium)、小麦属(Triticum)、越桔属(Vaccinium)、豇豆属(Vigna)或百日草属(Zinnia)；或者来自曲霉属(Aspergillus)的丝状真菌。

78.权利要求75的微生物，其中所述PAL接受苯丙氨酸为底物并由其产生肉桂酸，使得如果该PAL也接受酪氨酸为底物并由其形成香豆酸，则所述PAL的K_m(苯丙氨酸)/K_m(酪氨酸)比小于1∶1。

79.权利要求78的微生物，其中如果所述微生物产生肉桂酸-4-羟化酶(C4H)，则K_cat(PAL)/K_cat(C4H)比率为至少2∶1。

80.具有产生肉桂酰辅酶A并通过茋合酶的作用由其产生赤松素的有效代谢途径的微生物，其中在所述途径中在所述微生物中表达的显示4-香豆酸或者肉桂酸底物偏好性的4-香豆酸辅酶A连接酶催化的反应中由肉桂酸形成肉桂酰辅酶A，以及通过所述微生物中表达的茋合酶从肉桂酰辅酶A产生所述赤松素，以及其中通过L-苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)从L-苯丙氨酸产生所述肉桂酸，所述PAL接受苯丙氨酸为底物并由其产生肉桂酸，使得如果该PAL也接受酪氨酸为底物并由其形成香豆酸，则所述PAL的K_m(苯丙氨酸)/K_m(酪氨酸)比小于1∶1。

81.权利要求80的微生物，其中如果所述微生物产生肉桂酸-4-羟化酶(C4H)，则K_cat(PAL)/K_cat(C4H)比率为至少2∶1。

82.权利要求51、80或81的微生物，所述微生物含有与表达信号有效连接的编码L-苯丙氨酸氨裂合酶的异源DNA序列的一个或多个拷贝；以及含有与表达信号有效连接的编码显示4-香豆酸或者肉桂酸底物偏好性的4-香豆酸辅酶A连接酶的异源DNA序列的一个或多个拷贝；以及含有与表达信号有效连接的编码白藜芦醇合酶的异源DNA序列的一个或多个拷贝。

83.权利要求51、80或81的微生物，所述微生物含有与表达信号有效连接的编码L-苯丙氨酸氨裂合酶的异源DNA序列的一个或多个拷贝；以及含有与表达信号有效连接的编码显示4-香豆酸或者肉桂酸底物偏好性的4-香豆酸辅酶A连接酶的异源DNA序列的一个或多个拷贝；以及含有与表达信号有效连接的编码赤松素合酶的异源DNA序列的一个或多个拷贝。

84.用于生产赤松素的方法，包括在产生赤松素的条件下培养权利要求51的微生物。