KR101686406B1 - 바이오가스 미생물의 군집을 유도하여 바이오가스를 생산하는 방법 및 이에 따라 생성된 바이오가스 - Google Patents

바이오가스 미생물의 군집을 유도하여 바이오가스를 생산하는 방법 및 이에 따라 생성된 바이오가스 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바이오가스 미생물의 군집을 유도하여 바이오가스를 생성하는 방법 및 이에 따라 생성된 바이오가스에 관한 것으로 연속식 혐기성소화 장치 내에 전도성 담체, 접종 슬러지 및 아세트산이 함유된 유입수를 투입하여 상기 전도성 담체에 바이오가스 미생물이 부착 성장되는 단계를 포함함으로써, 바이오가스 미생물의 군집 및 성장을 유도하여 바이오가스의 생성속도를 향상시킨다.

Description

바이오가스 미생물의 군집을 유도하여 바이오가스를 생산하는 방법 및 이에 따라 생성된 바이오가스{Biogas production method and biogas produced therefrom}
본 발명은 전도성담체에 의한 전기활성 바이오가스 미생물의 군집 및 성장을 유도하여 바이오가스의 생성속도를 향상시키는 바이오가스를 생성하는 방법 및 이에 따라 생성된 바이오가스에 관한 것이다.
폐수는 인간 활동과 각종 산업 활동에 의해 끊임없이 생성되는 것으로, 이러한 폐수가 처리되지 않고 유기물질을 함유한 채로 자연생태계에 유입되면 각종 질병을 유발하는 등 인간생활에 많은 악영향을 미치게 된다.
따라서, 폐수에서 유기물질을 제거하여야 할 시스템이 필수적으로 요구되는데, 폐수를 물리화학적으로 처리하는 방식과 생물학적으로 처리하는 방식이 적용되고 있다.
이때, 물리화학적 처리방식은 비용이 많이 들어가고 처리 후의 생성물을 재처리 또는 처분해야 하는 단점을 가지고 있으며 도시생활하수의 1차 처리 및 3차 처리에 주로 사용되어진다.
생물학적 처리방식은 주로 미생물을 이용하여 폐수 내의 오염물질을 분해/해독/분리시키는 것으로서, 주로 도시생활하수의 2차 처리나 유기물질을 함유한 공장폐수 및 이로부터 생성되는 슬러지(sludge)의 처리에 사용되며, 비교적 저렴한 경비와 다양한 공정 등의 장점으로 가장 널리 활용되고 있다.
이러한 생물학적 처리방식은 산소의 이용 유무에 따라 호기성 처리와 혐기성 처리로 나뉘어지는데, 이들의 처리 방법에 있어 미생물들은 폐수 내에 균일하게 또는 플록(floc)을 형성하여 부유생활을 하거나 적당한 표면에서 부착생활을 하는 등
크게 두 가지 유형으로 대별할 수 있다.
여기서, 혐기성 처리는 혐기성 미생물을 이용하여 폐수중의 유기오염물을 산소가 존재하지 않는 혐기조건(anaerobic) 상태하에서 메탄가스(CH4)와 이산화탄소(CO2)로 분해하여 제거하는 폐수처리방식으로서, 미생물 부착성질을 이용하여 혐기성 소화조 내에 담체(擔體)를 설치하는 혐기성 필터(anaerobic filter) 공법과, 미생물의 자기 고정화(self immobilization)에 따른 입상화(granulation)를 이용하는 UASB(Upflow Anaerobic Sludge Blanket) 공법이 통상적으로 적용되고 있다.
하지만, 상기 혐기성 필터 공법은 운반체인 담체가 설치되어 있으므로 소화조의 내부용적이 감소하고 처리효율이 떨어지며 단락현상에 의해 소화조 내의 경로 막힘이 자주 발생됨은 물론 유출수가 혼탁해지는 단점을 지니고 있다.
또한, 상기 혐기성 소화의 분열은 종종 소화조에서 박테리아 및 메탄의 상호 연계로 발생하는 소화조의 불안정성으로 이어진다. 입상 활성탄(GAC)은 혐기성 소화조에서 혼란을 극복하고 안정성을 높이기 위해 적용될 수 있다. 상기 활성탄의 장점은 메탄을 억제하는 흡착 독성 유기 화합물이 없고, 미생물 성장을 위해 높은 표면적을 제공한다.
대한민국 등록특허 제232,398호 대한민국 등록특허 제636,617호 대한민국 등록특허 제198,191호 미국 공개특허 제2009-0317881호
Energy Environ. Sci., 2012, 5, 8982 Biochemical engineering journal 47(2009) 31-37 Biotechnology and bioengineering 2014, 111(2), 285-294
본 발명의 목적은 연속식 혐기성소화 장치 내에 투입된 하수처리장에서 얻은 슬러지 하에서 전도성 담체, 아세테이트 투입과 특정 부하량을 유지하여 전기활성바이오가스 미생물의 군집 및 성장을 유도함으로써 아세테이트로부터 바이오가스 생산속도를 향상시키는 방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 바이오가스를 생성하는 방법에 따라 생성된 바이오가스를 제공하는데 있다.
본 발명의 바이오가스 생성방법은 연속식 혐기성소화 장치 내에 전도성 담체, 접종 슬러지 및 아세트산이 함유된 유입수를 투입하여 상기 전도성 담체에 바이오가스 미생물이 부착되어 성장하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 바이오가스 미생물은 지오박터(Geobacter) 종 미생물 및 타우어(Thauer) 종 미생물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상; 및 메타놀리네아(Methanolinea) 종 미생물, 메타노스피릴룸(Methanospirillum) 종 미생물 및 메타노사르시나(Methanosarcina) 종 미생물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물이 혼합된 것일 수 있다.
상기 바이오가스 미생물은 지오박터(Geobacter) 종 미생물, 메타노스피릴룸(Methanospirillum) 종 및 메타노사르시나(Methanosarcina) 종 미생물로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 미생물이 혼합된 것일 수 있다.
상기 연속식 혐기성소화 장치 내에는 전도성 담체 1 중량부에 대하여 접종 슬러지 10 내지 50 중량부 및 아세트산이 함유된 유입수 40 내지 200 중량부가 투입될 수 있다.
상기 아세트산의 농도는 2 내지 15 g/L일 수 있다.
상기 연속식 혐기성소화 장치 내에는 0.1 내지 0.8 g아세트산/L/day의 부하량이 유지되며, pH는 7.0 내지 7.4일 수 있다.
상기 연속식 혐기성소화 장치 내의 화학적 산소요구량은 0.15 내지 0.25 gCOD/L/day이며, 수리학적 체류시간은 15 내지 25일일 수 있다.
상기 전도성 담체는 활성탄; 전도성 부직포; 또는 금속이 코팅된 활성탄일 수 있다.
상기 바이오가스 생성방법으로 생산된 바이오가스는 25 내지 50 mL/day일 수 있다.
또한, 상기 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 바이오가스는 상기 바이오가스 생성방법으로 생성될 수 있다.
본 발명의 바이오가스를 생성하는 방법은 전도성 담체를 투입하여 시스템 내에 전기를 생산하는 미생물을 우점화시키며, 상기 전기를 생산하는 미생물과 전도성 담체를 매개체로 하여 전자를 직접 전달받는 바이오가스 생산 미생물이 효과적으로 상호작용하도록 함으로써 궁극적으로 바이오가스 생산 속도 및 생산량을 증대시킬 수 있다. 이러한 바이오가스를 생성하는 방법은 기존 하폐수 처리장의 동절기 또는 독성물질의 유입 사고 발생 시나 초기 가동 조건에서 보다 효과적인 바이오가스 생산에 널리 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 전도성 담체가 투입된 연속식 혐기성소화 장치(b) 및 전도성 담체가 투입되지 않은 연속식 혐기성소화 장치(a)의 단면도이다.
도 2a는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 혐기성 반응조에서 생산된 메탄의 생산율을 측정한 그래프이다.
도 2b는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 혐기성 반응조에서 생산된 비메탄생성속도(SMA, specific methane activity)를 나타낸 그래프이다.
도 2c는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 혐기성 반응조로부터 폐수에서 용존성대사산물(SMP, soluble metabolic products)의 농도를 측정한 그래프이다.
도 2d는 본 발명의 실시예에서 활성탄에 부착된 바이오매스의 SEM 이미지이다.
도 2e는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 혐기성 반응조에서 MLVSS 농도를 나타낸 그래프이다.
도 2f는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 혐기성 반응조에서 계산된 바이오매스의 총 양을 나타낸 그래프이다.
도 3a는 본 발명 실시예의 연속식 혐기성 반응조로부터 시간에 따른 박테리아 군집 구성을 나타낸 그래프이다.
도 3b는 본 발명 실시예의 혐기성 반응조로부터 타우어(Thauer) 종 미생물 및 지오박터(Geobacter) 종 미생물의 양을 나타낸 그래프이다.
도 3c는 지오박터(Geobacter) 종 미생물의 계통도이다.
도 4a는 본 발명 실시예의 연속식 혐기성 반응조로부터 시간에 따른 아키아(archara) 군집 구성을 나타낸 그래프이다.
도 4b는 유리고세균(Euryarchaeota) 미생물의 계통도이다.
도 5a는 누적된 메탄가스의 함량을 나타낸 그래프이며, 막대 그래프는 종류가 다른 바이오매스에 따른 메탄가스 형성을 나타낸 그래프이다(○: 실시예에서 수득된 현탁된 바이오매스, ▼: 실시예에서 수득된 미생물이 부착된 바이오매스 및 ●: 총 바이오매스).
도 5b는 비메탄생성속도를 나타낸 그래프이다.
도 5c는 누적된 이산화탄소의 함량을 나타낸 그래프이다.
도 6a 및 도 6b는 전도성 담체에 미생물이 부착된 바이오매스를 함유한 용액에서 양극(a) 및 음극(b) 전류를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 연속식 혐기성소화 장치 내에 투입된 하수처리장에서 얻은 슬러지 하에서 아세테이트 투입과 특정 부하량을 유지하여 전기활성 바이오가스 미생물의 군집 및 성장을 유도함으로써 바이오가스의 생성속도 및 생산량을 향상시키는 바이오가스를 생성하는 방법 및 이에 따라 생성된 바이오가스에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 바이오가스 생성방법은 연속식 혐기성소화 장치 내에 전도성 담체, 접종 슬러지 및 아세트산이 함유된 유입수를 투입하여 상기 전도성 담체에 전기활성 바이오가스 미생물(이하, 바이오가스 미생물)이 부착 성장되는 단계를 포함함으로써, 바이오가스의 생산속도를 향상시킨다.
상기 연속식 혐기성소화 장치는 유입구 및 유출구가 구비되고 혐기성 조건 하에서 유입수를 연속식으로 처리하는 장치이다.
상기 전도성 담체는 바이오가스 미생물이 부착되어 군집을 형성하며, 전도성 담체를 매개체로 하여 전기를 생산하는 미생물과 바이오가스를 생산하는 미생물이 효과적으로 상호작용을 하도록 함으로써 바이오가스의 생산속도 및 생산량을 향상시킨다. 예컨대, 상기 바이오가스 미생물은 전기를 생산하는 미생물과 바이오가스를 생산하는 미생물이 혼합된 미생물을 의미한다.
상기 전도성 담체로는 활성탄; 전도성 부직포; 또는 금속이 코팅된 활성탄을 들 수 있으며, 상기 금속으로는 백금, 은 또는 금을 들 수 있다. 상기 활성탄 및 부직포는 바이오가스 미생물이 부착되어 성장할 수 있다면 밀도, 비표면적, 입경 등은 특별히 한정되지 않는다.
상기 접종 슬러지는 하수처리장의 혐기소화조에서 채취한 소화조 슬러지로서, 아세트산이 함유된 유입수와 혼합되어 배양됨으로써 바이오가스 미생물을 형성할 수 있으며, 종간직접전자전달(DIET)을 발견할 수 있다. 이때 접종 슬러지는 박테리아 및 메탄생성미생물인 고세균들을 함유한다. 상기 박테리아 및 고세균을 각각 100 중량%로 기준으로 하였을 때, 상기 박테리아 성분 중에서 박테로이데티스(Bacteroidetes)는 35 내지 50 중량%, 베타프로테오박테리아(Betaproteobacteria)는 15 내지 40 중량%, 델타프로테오박테리아(Deltaproteobacteria)는 5 내지 20 중량%, 감마프로테오박테리아(Gammaproteobacteria)는 0.1 내지 5 중량%, 기타 박테리아는 5 내지 30 중량%이며; 고세균 성분 중에서 메타노미크로비움(Methanomicrobiales) 미생물은 80 내지 95 중량%, 메타노스피릴룸( Methanospirillaceae) 미생물은 1 내지 10 중량%, 써머플라스머테일스( Thermoplasmatales ) 미생물은 1 내지 10 중량% 및 메타노사르시나(Methanosarcinaceae) 미생물은 1 내지 10 중량%이다. 상기 성분의 함량을 벗어나는 접종 슬러지를 사용하는 경우에는 원하는 전기를 생산하는 미생물과 바이오가스를 생산하는 미생물을 우점화시킬 수 없다.
상기 접종 슬러지의 함량은 전도성 담체 1 중량부에 대하여 10 내지 50 중량부, 바람직하게는 20 내지 30 중량부이다. 접종 슬러지의 함량이 상기 하한치 미만인 경우에는 바이오가스 미생물이 전도성 담체에 부착되지 못하고 성장되지 못할 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 원하는 바이오가스 미생물의 성장에 방해가 될 수 있다.
상기 전도성 담체에 부착되어 군집을 이루며 성장되는 바이오가스 미생물들은 생물막의 형태로 존재하며, 이러한 바이오가스 미생물들은 유입수의 적정한 기질 및 부하량의 유지하에서 빠른 시간내에 군집을 형성하고 성장이 유도된다.
이때, 상기 적정한 기질은 유입수에 아세트산을 함유시키는 것으로서, 아세트산에서 파생된 아세테이트가 상기 바이오가스 미생물에 의해 바이오가스를 생성한다. 상기 아세트산의 농도는 2 내지 15 g/L, 바람직하게는 4 내지 8 g/L로서, 아세트산의 농도가 상기 하한치 미만인 경우에는 바이오가스 미생물의 군집을 형성할 수 없으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 원하는 바이오가스 미생물들을 우점화시킬 수 없다.
또한, 아세트산이 함유된 유입수의 함량은 전도성 담체 1 중량부에 대하여 40 내지 200 중량부, 바람직하게는 50 내지 100 중량부이다. 아세트산이 함유된 유입수의 함량이 상기 하한치 미만인 경우에는 바이오가스 미생물이 성장할 수 없으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 바이오가스 미생물의 성장을 방해할 수 있다.
상기 아세트산이 함유된 유입수의 부하량은 0.1 내지 0.8 g아세트산/L/day, 바람직하게는 0.2 내지 0.4 g아세트산/L/day가 유지되는 것이다. 하루에 혐기성소화 장치 1L에 주입되는 아세트산의 양이 상기 하한치 미만인 경우에는 바이오가스 미생물의 군집을 형성할 수 없으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 원하는 바이오가스 미생물들을 우점화시킬 수 없다.
상기 전도성 담체에 생물막의 형태로 군집되어 성장하는 바이오가스 미생물 중 전기를 생산하는 미생물로는 델타프로테오박테리아(Deltaproteobacteria) 미생물 및 베타프로테오박테리아(Betaproteobacteria) 미생물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 바람직하게는 지오박터(Geobacter) 종 미생물 및 타우어(Thauer) 종 미생물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 더욱 바람직하게는 지오박터 썰페리듀센(Geobacter sulfurreducens), 지오박터 러블리(Geobacter lovely) 및 타우어 후미르듀센스(Thauera humireducens)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 들 수 있다.
또한, 상기 바이오가스 미생물 중 바이오가스를 생산하는 미생물로는 메타노미크로비움(Methanomicrobiales) 미생물, 메타노스피릴룸( Methanospirillaceae) 미생물 및 메타노사르시나(Methanosarcinaceae) 미생물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 바람직하게는 메타놀리네아(Methanolinea) 종 미생물, 메타노스피릴룸(Methanospirillum) 종 미생물 및 메타노사르시나(Methanosarcina) 종 미생물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 더욱 바람직하게는 메타놀리네아 따르다(Methanolinea tarda), 메타노스피릴룸 헝가테이(Methanospirillum hungatei) 및 메타노사르시나 고온균(Methanosarcina thermophila)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 들 수 있다.
이때, 바이오가스의 생산속도를 높이며 다량의 바이오가스를 얻기 위해서는 상기 미생물 중 지오박터(Geobacter) 종 미생물과 메타노스피릴룸(Methanospirilum) 종 미생물 및 메타노사르시나(Methanosarcina) 종 미생물로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 미생물이 혼합된 것을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 원하는 바이오가스 미생물들을 우점화시키기 위해서는 상기 연속식 혐기성소화 장치 내의 pH를 7.0 내지 7.4로 조절하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 연속식 혐기성소화 장치 내의 화학적 산소요구량은 0.15 내지 0.25 gCOD/L/day이며, 수리학적 체류시간은 15 내지 25일인 것이 바이오가스를 빠른 속도로 생산할 수 있다.
상기와 같은 방법으로 생산되는 바이오가스는 미생물의 성장을 유도하지 않고 바이오가스를 생산한 경우에는 비하여 2 내지 3배 높은 25 내지 50 mL/day이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예 1.
연속식 혐기성 유리 반응조(0.5 L, 35 ℃)에 활성탄 5 g를 주입하여 활성탄을 반응조 바닥에 위치시키고, 마그네틱바 교반을 최소화시켜, 활성탄 층이 가급적 부유하지 않도록 운전하였다(도 1b, B-2). 국내 하수처리장 혐기소화조에서 채취한 소화조 슬러지 100 g을 접종슬러지로 사용하여 반응기에 넣고 아세트산(4 g/L)이 함유된 인공 유입수 400 g을 상기 연속식 혐기성 반응조에 주입하고 pH는 1 N HCl 또는 NaOH로 조절하여 7.2에서 7.5로 유지하였다. 상기 혐기성소화 반응조의 상부 공간은 혐기성 조건을 만들기 위해 질소로 20분간 퍼징하였으며, 상기 연속식 시스템의 수리학적체류시간(HRT)은 20일이고, 연속적 기질 주입은 최초 미생물 발생 및 기질 접종 10일 후에 시행하였다. 상기 반응조에서 발생하는 메탄을 비롯한 바이오가스는 장치 상부에 장착된 가스백에서 포집, 분석하였다. 상기 반응기로부터의 유출물은 45일 후 화학적 산소 요구량(COD)의 분석을 위해 채취하였다.
상기 활성탄의 밀도, 비표면적 및 입자직경은 각각 0.43 내지 0.48 g/mL, 950 m2/d, 및 1.18 내지 1.41 mm이며, 유입수 1 L당 성상은 CH3COOH 4 g, NaHCO3 5 g, NH4Cl 0.23g, KH2PO4 0.05 g, MgSO4·7H2O 0.05 g이다.
비교예 1.
상기 실시예 1과 동일하게 실시하되, 연속식 혐기성 유리 반응조에 활성탄을 첨가하지 않고 반응을 수행하였다.
< 시험예 >
시험예 1. 바이오가스 생산속도 측정
0.1 g의 활성탄에 바이오가스 미생물이 부착된 바이오매스(실시예 1), 현탁된 바이오매스 2.5 g VSS mg/L를 포함하는 용액(비교예 1) 및 상기 0.1 g의 활성탄에 미생물이 부착된 바이오매스에 현탁된 바이오매스가 보충된 용액(실시예 1+현탁된 바이오매스)을 100 mL 혈청병에 투입한다.
상기 혈청병의 상부공간을 5분 동안 질소가스로 플로싱(flushing)시켜 혐기성 조건으로 만든 후 고무 캡으로 밀봉하여 35 ℃ 배양기에 넣고 매일 50 mL 주사기를 이용하여 바이오가스의 생산량을 측정하였다. 회분식 실험은 이중으로 실시하였다.
도 2a는 실시예 1 및 비교예 1에 따른 혐기성 반응조에서 생산된 메탄의 생산율을 측정한 그래프이며, 도 2b는 실시예 1 및 비교예 1에 따른 혐기성 반응조에서 생산된 비메탄생성속도(SMA, specific methane activity)를 나타낸 그래프이고, 도 2c는 실시예 1 및 비교예 1에 따른 혐기성 반응조로부터 폐수에서 용존성대사산물(SMP, soluble metabolic products)의 농도를 측정한 그래프이며, 도 2d는 실시예 1에서 활성탄에 부착된 바이오매스의 SEM 이미지이고, 도 2e는 실시예 1 및 비교예 1에 따른 혐기성 반응조에서 MLVSS 농도를 나타낸 그래프이며, 도 2f는 실시예 1 및 비교예 1에 따른 혐기성 반응조에서 계산된 바이오매스의 총 양을 나타낸 그래프이다.
도 2a에 도시된 바와 같이, 실시예 1에 따라 활성탄이 연속식 혐기성 반응조로 투입될 때 메탄 생산율은 높았다. 구체적으로, 실시예 1의 연속식 혐기성 반응조에서는 평균 32.9±11.0 mLCH4/day로 메탄을 생산하였으나, 비교예 1의 연속식 혐기성 반응조에서는 평균 18.7±7.1 mLCH4/day로 메탄을 생산한 것으로 확인되었으며, 이는 실시예 1의 연속식 혐기성 반응조가 비교예 1의 연속식 혐기성 반응조에 비하여 약 2배 이상의 메탄을 더 생산하는 것을 알 수 있다.
또한, 메탄생성속도를 측정하기 위하여 연속 시스템에서 활성탄에 부착된 바이오매스를 신선한 아세테이트 배지 및 혈청 배지를 이용하였다. 측정은 메탄 생산율/바이오매스 중량으로 측정하였다.
도 2b에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 연속식 혐기성 반응조에서는 1.25 mL-CH4/g VSS/day로 바이오매스의 비메탄생성속도를 나타내었으며, 비교예 1의 연속식 혐기성 반응조에서는 0.67 mL-CH4/g VSS/day로 바이오매스의 비메탄생성속도를 나타내었다. 이는 활성탄을 이용한 실시예 1의 연속식 혐기성 반응조가 비교예 1의 연속식 혐기성 반응조에 비하여 비메탄생성속도가 약 2배 이상 높은 것을 알 수 있다.
도 2c에 도시된 바와 같이, 비교예 1의 연속식 혐기성 반응조에서의 COD 농도는 0.17±0.04 g COD/L인 것과 달리, 실시예 1의 연속식 혐기성 반응조에서의 COD 농도는 0.12±0.02 g COD/L로서 상기 비교예 1의 연속식 혐기성 반응조에서 비하여 COD 농도가 더 낮은 것을 확인하였다. 이는 실시예 1의 연속식 혐기성 반응조의 용존성대사산물(soluble microbial product, SMP)의 양이 적기 때문인 것으로 보인다.
상기 활성탄은 혐기성 반응조에서 유출 수질뿐만 아니라 메탄가스 생산량을 높이는 것에 좋다.
도 2d에 도시된 바와 같이, 실시예 1에서는 활성탄에 미생물이 부착되지만 활성탄 표면에는 미생물이 관찰되지 않는 것을 확인하였다.
도 2e에 도시된 바와 같이, 상기 반응조에서 바이오매스의 농도에 관련하여 실시예 1의 반응조 및 비교예 1의 반응조를 이용한 바이오매스 사이의 작은 차이가 있다. 활성탄을 투여하지 않거나 투여한 반응조에서 바이오매스의 평균 농도는 각각 218±40.3 mg VSS/L 및 232±73.9 mg VSS/L이다.
또한, 도 2f에 도시된 바와 같이, 활성탄에 부착된 8.7% 바이오매스는 메탄 성능에 거의 영향이 없는 반응기에서 바이오매스의 양을 지원하는 것을 확인하였다.
시험예 2. 활성탄에 부착된 미생물 군집 분석
상기 실시예 1에서 제작된 활성탄에 고정된(부착된) 바이오가스 미생물을 동정하기 위하여, 상기 활성탄으로부터 총 DNA를 수득하고, 이를 역전사, PCR 증폭 및 서열결정의 일련과정을 걸쳐 염기서열을 결정하고, 이를 데이터베이스에 조회하여 상기 활성탄에 고정된 미생물을 동정할 뿐만 아니라, 이들의 우점율을 비교하였다(도 3, 도 4).
도 3a는 실시예 1의 연속식 혐기성 반응조로부터 시간에 따른 박테리아 군집 구성을 나타낸 그래프이며, 도 3b는 실시예 1의 혐기성 반응조로부터 타우어(Thauer) 종 미생물 및 지오박터(Geobacter) 종 미생물의 양을 나타낸 그래프이고, 도 3c는 지오박터(Geobacter) 종 미생물의 계통도이다.
도 3a에 도시된 바와 같이, 파이로시퀀싱(pyrosequencing)을 통한 연속식 혐기성 반응조 내 박테리아의 군집구조를 시간대별로 분석하여 나타내었다. C(비교예 1의 유기체), GS(실시예 1의 현탁된 유기체), GA(실시예 1의 부착된 유기체)이며, 숫자(1, 2, 3)는 각각 운전초기, 20일, 40일 경과시점이다. 상기 GS는 활성탄이 있는 반응조 내 부유액에서 채취한 것이며, 부착된 바이오매스와는 상관없는 별도의 시료이다.
활성탄이 있는 경우, Beta 및 델타프로테오박테리아(Deltaproteobacteria) 미생물이 많았으며, 델타프로테오박테리아(Deltaproteobacteria) 미생물 중에서 지오박터(Geobacter) 종 미생물(68.8%)이 가장 많았다. 반면, 활성탄이 없는 반응조(비교예 1)의 경우에는 지오박터(Geobacter) 종 미생물이 관찰되지 않았다.
지오박터(Geobacter) 종 미생물은 전자를 미생물연료전지시스템의 탄소계 전극에 직접적으로 전자를 전달하는 미생물로 보고되고 있으며, 본원발명에서는 지오박터(Geobacter) 종 미생물을 우점화시킬 수 있었다.
도 3b에 도시된 바와 같이, 활성탄의 사용 여부에 따른 메탄생성 미생물 반응기에서 각 배양한 총 종 중 지오박터(Geobacter) 종 미생물 및 타우어(Thauer) 종 미생물의 분율을 나타내었다. 비교예 1에서는 검출되지 않은 지오박터(Geobacter) 종 미생물이 실시예 1의 활성탄에 27%가 부착된 것을 확인하였다.
상기 베타프로테오박테리아(Betaproteobacteria) 미생물의 대부분은 활성탄의 표면에 부착된 미생물에서 다른 종 보다 실질적으로 더 높게 타우어(Thauer) 종 분획이 차지한다.
또한, 도 3c에 도시된 바와 같이, 델타프로테오박테리아(Deltaproteobacteria) 미생물 계통의 대부분은 지오박터 썰페리듀센(Geobacter sulfurreducens) 및 지오박터 러블리(Geobacter lovely)와 강하게 연계되어 있으며; 베타프로테오박테리아(Betaproteobacteria) 미생물 대부분은 타우어 후미르듀센스(Thauera humireducens)로 식별된다.
도 4a는 실시예 1의 연속식 혐기성 반응조로부터 배양에서 시간에 따른 아키아(archara) 군집 구성을 나타낸 그래프이며, 도 4b는 유리고세균(Euryarchaeota) 미생물의 계통도이다.
도 4a에 도시된 바와 같이, 파이로시퀀싱(pyrosequencing)을 통한 연속식 혐기성 반응조 내 아키아(archara)의 군집구조를 시간대별로 분석하여 나타내었다. 활성탄이 있는 경우, 활성탄이 주입되지 않은 비교예 1에서 공통적으로 많이 발견된 메타노미크로비움(Methanomicrobiales)을 제외하고, 메타노스피릴룸 (Methanospirillaceae)의 양이 높게 나타났고, 그 중에서 메타노스피릴룸 헝가테이(Methanospirillum hungatei)가 우점하는 것으로 나타났다. 전도성 담체 활용 및 그에 따른 지오박터(Geobacter) 종 미생물의 동반 우점 현상을 고려할 때, 전자를 직접 전달받을 수 있는 가능성이 있을 것으로 보인다.
또한, 그 다음으로 많이 발견된 미생물은 메타노사르시나(Methanosarcina) 속 미생물로서 전자를 직접 전달받을 수 있는 메탄가스생성 미생물이다.
메타놀리네아(Methanolinea) 속 미생물은 수소와 이산화탄소를 이용하여 아세테이트에서 바이오가스(메탄가스)를 형성하였다.
도 4b에 도시된 바와 같이, 메타놀리네아 따르다(Methanolinea tarda)는 메타노스피릴룸(Methanospirillaceae) 속 미생물 메타노사르키나(Methanosarcinaceae)가 각각 메타노스피릴룸 헝가테이(Methanospirillum hungatei) 및 메타노사르시나 고온균(Methanosarcina thermophila)을 입증하는 동안 메타노미크로비움(Methanomicrobiales)과 관련되어 있음을 나타낸다.
상기 메타노사르시나(Methanosarcina) 및 메타노스피릴룸(Methanospirillum)은 수소 또는 포름산/이산화탄소를 이용한 하이드로젠트로픽(hydrogentrophic) 메탄생성 미생물로 알려져 있고, 메타놀리네아(Methanolinea)는 전자 주개로서 수소 또는 아세테이트를 이용한다.
시험예 3. 활성탄에 부착된 바이오가스 미생물의 메탄발생 특성
도 5a는 누적된 메탄가스의 함량을 나타낸 그래프이며, 막대 그래프는 종류가 다른 바이오매스에 따른 메탄가스 형성을 나타낸 그래프이고, 도 5b는 비메탄생성속도를 나타낸 그래프이며, 도 5c는 누적된 이산화탄소의 함량을 나타낸 그래프이다. 상기 도 5a 및 도 5b에서 삽입도는 24시간 동안 메탄가스 생산의 특성을 확대한 확대도이며, 실시예 1에서 수득된 현탁된 바이오매스(SS; ○), 실시예 1에서 수득된 미생물이 부착된 바이오매스(GAC; ▼) 및 총 바이오매스(●)를 이용한 회분식 실험에서 시간에 따른 메탄가스 및 이산화탄소의 양을 나타낸다.
도 5에서 상기 활성탄에 미생물이 부착된 바이오매스, 현탁된 바이오매스 및 총 바이오매스에 의한 누적 메탄 생산은 24시간 동안 각각 0.57 mL, 1.15 mL 및 1.67 mL이며, 현탁된 바이오매스 및 미생물이 부착된 바이오매스에 기인하는 메탄가스 양의 합은 막대(3% 오차)로 보여준 총 메탄가스 생성량과 일치하는 것을 확인하였다(도 5a). 또한, 활성탄에 미생물이 부착된 바이오매스(1.71 mL-CH4/mg VSS)의 메탄 생성속도는 현탁된 바이오매스(0.47 mL-CH4/mg VSS) 보다 3.6배 높은 것을 확인하였다(도 5b).
시험예 4. 생물막의 전기화학적 특성
활성탄을 통한 미생물의 전자 전달 및 수용을 알아보기 위해 별도의 실험을 추가한다. 연속식 혐기성 반응조에 사용되었던 활성탄을 30 mL의 혐기성셀속의 2 mL 작은 튜브 두 개에 각각 동량으로 담는다(0.44 g). 2 mL 작은 튜브안에 그라파이트전극(워킹 및 카운터전극)을 각각 삽입하고, 그 안에 담겨져 있는 활성탄에 잘 접촉하도록 위치시킨다. 30 mL 혐기성셀속에 별도의 참고전극(Ag/AgCl)을 삽입하고 상부공간은 질소로 퍼징하여 혐기성으로 만든다. 반응은 워터배스를 이용하여 30 ℃를 유지하며, 포텐스탯을 이용하여 워킹전극(그라파이트전극)에 양의 전압(0.13 V)을 인가해주면서 양극에서 발생하는 전류를 자동계측한다. 반응 후, 음전극에 음의 전압(-0.15 V)을 인가해주면서 음극에서 발생하는 전류를 자동계측한다. 전류는 60초 간격으로 측정하였다.
도 6a에 나타낸 바와 같이, 양극 전류는 아마도 양극 및 활성탄 생물막 사이에 연결 때문에 52시간 동안 13.5 uA/cm2까지 증가되었다. 지오박터 썰페리듀센(Geobacter sulfurreducens)은 아세테이트를 이용함으로써 전류를 생성하는 것으로 보인다. 활성탄은 상당히 큰 전류 밀도가 생성된 음극 표면에 활성탄 생물막에 대하여 전자 주개의 역할을 하였다.
또한, 도 6b에 도시된 바와 같이, 음극 전류 밀도는 4시간 후 -50 uA/cm2에서 안정적으로 나타났으며, 음극 전류 밀도는 양극 전류보다 4배 더 높은 것을 확인하였다.
이는 전자를 공여하는 중요한 역할을 할 전자 수용성 전기활성 미생물이 활성탄 표면상에 성장될 가능성을 시사한다. 구체적으로, 음극 전류는 카운터 전극을 통해 전자를 받아 이산화탄소를 메탄으로 전환하는 전기활성미생물의 존재로 증명된다.
실시예 1의 반응조에서 향상된 메탄 생산 속도는 활성탄 표면에 지오박터(Geobacter) 종 미생물 및 타우어(Thauer) 종 미생물 등의 미생물이 성장된 것이 이유 중 하나이다. 상기 지오박터(Geobacter) 종 미생물은 상호 메탄 생산에 필수적이라는 것이 활성탄에 부착된 미생물에서 관찰되었다.
바람직하게는 지오박터(Geobacter) 종 미생물, 메타노스피릴룸 (Methanospirillum) 및 메타노사르시나(Methanosarcina) 종 미생물 사이의 상호작용으로 인하여 메탄가스의 생산율 및 속도가 향상된 것이다. 이는 전도성 활성탄이 수소를 생산/소모, 나중에 메탄 생산하는 지오박터(Geobacter) 종 미생물, 메타노스피릴룸(Methanospirillum) 종 미생물 및 메타노사르시나(Methanosarcina) 종 미생물 성장의 가속에 촉매 역할을 한다.
-파이로시퀀싱(pyrosequencing) 측정
박테리아 DNA의 추출방법은 스툴 DNA 추출키트(Bioneer Inc, Korea)를 이용하여 측정된다. 라이브러리는 GS FLX 플러스 라이브러리 준비 가이드에 따라 PCR 제품을 사용하여 준비되고, Picogreen 분석(Victor 3)을 사용하여 정량한다.
정제된 라이브러리의 클론 증폭에 대응하는 에멀젼 기반 PCR은 GS-FLX plus emPCR 키트(454 Life Sciences)를 이용하여 수행하였다. 간략하게, 라이브러리는 DNA 캡쳐 비드상에 고정된다.
얻어진 라이브러리-비드는 증폭 믹스와 싱글 비드를 모두 포함하는 "마이크로 반응기"를 생성하기 위하여 Tissue Lyser II (Qiagen)에 증폭 믹스와 오일을 혼합하여 첨가하고 격렬하게 흔들어서 얻었으며, 에멀젼을 96-웰 플레이트에 분주하고, PCR 증폭 프로그램을 실행하였다. 각 샘플 DNA의 20 ng 분취액을 50 ul PCR 반응에 이용하였다.
16S 유니버셜 프라이머 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'), 518R (5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3') 및 아키아(archara)류 프라이머 571R primer (5-GCYTAAAGSRNCCGTAGC- 3)/1048 arcR-M (5-CGRCGGCCATGCACCWC- 3)은 16s rRNA 유전자의 증폭에 사용하였다.
빠른 시작 고충실도 PCR 시스템(Roche)은 하기의 조건으로 PCR에 사용된다: 94 ℃에서 15초 동안 35 사이클에 이어 94 ℃에서 3분; 45초 동안 55 ℃ 및 1분 동안 72 ℃; 및 72 ℃에서 8분 동안 최종 신장단계.
PCR 반응 후, AMPure 비드(Beckman coulter)를 사용하여 제품을 정제하고, 모든 정제 DNA는 단일 튜브에서 혼합되고 Genome Sequencer 454 FLX Titanium system (Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany)으로 분석하였다.
서열의 프라이머 사이트는 트리밍(trimming)되고 저품질 및 키메라 서열은 제외되었다. 프라이머 사이트 및 저품질 서열(길이는 < 300 nt; 평균 품질 스코어는 < 25, 및 모호성)은 RDP 파이로시퀀싱 기법을 사용하여 제거하였다.
가능한 키메라는 제거하고, 500 서열의 대표 번호는 Mothur 프로그램을 이용하여 선택되었다. RDP 파이로시퀀싱 기법은 파이로시퀀싱 데이터 분석을 위해 사용된다.
운영 분류 단위(OTU)는 3%의 유사성으로 측정하였으며, > 80% 부트 스트랩 값과 파이프라인의 RDP 분류기를 이용하여 속 레벨에서 배정하였다.
- 메탄 함량, COD 분석
바이오가스에서 메탄의 함량은 Porapak Q 및 열전도 검출기로 패킹된 1.8 m X 3.2 mm 스테인리스-스틸 컬럼이 장착된 가스 크로마토그래피(GC, Gow Mac series 580., USA)를 이용하여 분석하였다.
오븐, 인젝터 및 디텍터의 작동 온도는 각각 40 ℃이며, 99.999% 헬륨을 캐리어 가스로 사용하였다.
총 및 용해성 COD 농도는 COD 키트(HACH Co., USA)로 측정되고, 용해성 COD 분석을 위한 액체 샘플은 0.45 um 멤브레인 필터로 여과한 후 준비하였다.
- 활성탄 표면에서 메탄으로 아세테이트 변환의 화학양론
[제1 단계] 아세테이트 부분 산화에 의해 수소와 메탄 형성
Figure 112015019229610-pat00001
[제2 단계] 수소 산화에 의한 메탄 생성
Figure 112015019229610-pat00002
[제3 단계] 상기 제1 단계 및 제2 단계를 조합한 최종 메탄 생성
Figure 112015019229610-pat00003
수소 또는 전기에 의존하는 메탄생성 미생물 및 활성탄에 Geobacter sp의 조합이 두 단계 전자 전달 경로에서 아세트산이 메탄으로 변환된다. 감소된 생산물은 모두 수용성 대사 물질, 수소와 메탄을 포함한다.
제1 단계에서는 감소된 제품 각각에 의해 표시되는 전자 당량의 상대적인 분율을 선택하며, 수소 및 메탄을 향해 아세테이트 전환된 전자 당량의 상대적인 비율을 얻기 위해, 1몰 아세트산이 4몰 수소의 전자 당량을 가질 수 있음을 화학적 양론 반응을 사용하였다(수학식 1 및 5).
아세테이트의 주개로부터 전자가 분할되는 방법을 바탕으로, 수소를 향해 등가전자가 있다는 것을 가정할 수 있으며, 아세테이트로부터 생산된 메탄은 각각 0.2 및 0.8이다. 이는 각 전자 수용체의 반쪽 반응에 대한 승수(multiplier)로 사용된다(수학식 1 내지 4).
여기서, ee1 는 수소의 전자 수용체에 의해 표시되는 n 환원 생성물의 분획이다.
상기 ee2 는 다른 전자 수용체로 메탄을 향한 전자의 분획을 나타낸다.
전자 주개-반쪽 반응(수학식 5)에 적용된 전자 등가 분획과 결합된 전자 수용체 반쪽반응을 계산한 후 전체 에너지 반응(수학식 6)이 공동 제작 수소 및 메탄의 방정식을 사용하여 발견된다.
여기서, 열역학적으로 유리한 경로를 의미하는 포지티브 에너지(+0.004 V)는 아세토클래스틱 메탄 생성 미생물 사이의 상호작용을 할 때 얻어지거나, 이산화탄소 및 하이드로젠트로픽(hydrogentrophic) 메탄 생성 미생물에 직접 전자를 전달할 수 있는 것은 전도성 활성탄의 표면에 발생한다.
활성탄을 통한 수소 및 메탄으로 아세테이트의 부분 변환은 아세테이트가 수소로 변환되는 것에 비해 에너지가 감소된다(-0.14 V). 이어서, 하이드로젠트로픽(hydrogentrophic) 메탄생성 미생물에 의한 메탄 형성의 두 번째 단계는 수소 산화에 따라 작동될 수 있다(수학식 7-9).
아세테이트-수소-메탄 결합된 반쪽 반응을 전체 에너지 반응으로 생성한다(수학식 10).
상기 수학식으로 설명한 바와 같이, 1 몰 메탄이 이산화탄소 발생없이 1몰 아세테이트로부터 형성되며, 수학식 10에서 계산된 표준 전위의 총 양은 +0.04 V이다.
메탄 형성을 위한 이산화탄소를 탄소원으로 사용한다. 제1 단계에서 수소 및 메탄으로 아세테이트 변환의 열역학적 반응은 박테리아가 세포 합성 및 유지를 위하여 ATP를 만들기 위해 에너지를 얻는 경로를 택하여 받아들이는 것이 유리할 수 있다. 상기 인식은 활성탄으로 보충된 농축 배양에서 Geobacter, 전기활성 메탄생성 미생물 및 하이드로젠트로픽(hydrogentrophic) 메탄생성 미생물 사이에 발생할 수 있음을 의미한다.

Claims (11)

  1. 연속식 혐기성소화 장치 내에 전도성 담체 1 중량부에 대하여 접종 슬러지 10 내지 50 중량부 및 아세트산이 함유된 유입수 40 내지 200 중량부를 투입하여 상기 전도성 담체에 바이오가스 미생물이 부착되어 성장하는 단계를 포함하되,
    상기 아세트산의 농도는 2 내지 15 g/L이며,
    상기 연속식 혐기성소화 장치 내에는 0.1 내지 0.8 g아세트산/L/day의 부하량이 유지되고,
    상기 바이오가스 미생물은 지오박터(Geobacter) 종 미생물 및 타우어(Thauer) 종 미생물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상; 및 메타놀리네아(Methanolinea) 종 미생물, 메타노스피릴룸(Methanospirillum) 종 미생물 및 메타노사르시나(Methanosarcina) 종 미생물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물이 혼합된 것을 특징으로 하는 바이오가스 생성방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 바이오가스 미생물은 지오박터(Geobacter) 종 미생물, 메타노스피릴룸(Methanospirillum) 종 미생물 및 메타노사르시나(Methanosarcina) 종 미생물로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 미생물이 혼합된 것을 특징으로 하는 바이오가스 생성방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 연속식 혐기성소화 장치 내의 pH는 7.0 내지 7.4인 것을 특징으로 하는 바이오가스 생성방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 연속식 혐기성소화 장치 내의 화학적 산소요구량은 0.15 내지 0.25 gCOD/L/day이며, 수리학적 체류시간은 15 내지 25일인 것을 특징으로 하는 바이오가스 생성방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 전도성 담체는 활성탄; 전도성 부직포; 또는 금속이 코팅된 활성탄인 것을 특징으로 하는 바이오가스 생성방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 바이오가스 생성방법으로 생산된 바이오가스는 25 내지 50 mL/day인 것을 특징으로 하는 바이오가스 생성방법.
  11. 삭제
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