KR20120079735A - 절대혐기성 고세균 및 극한 환경미생물 배양을 위한 혐기배지 제조장치 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 메탄생성 고세균과 같이 극한환경에서 증식하는 난배양성 절대혐기고세균 특히, 산소에 민감하고 2기압 이상의 수소압을 요구하는 메탄생성 고세균인 Methanobrevibacter속의 고세균 또는 절대혐기 초호열균을 배양하기 위한 절대혐기 배지 제조용 산소제거 및 가스혼합/분배장치에 관한 것이다.
본 발명에 따른 혐기성 배양 배지 제조용 산소제거 및 가스혼합 분배장치를 사용하면 기존의 혐기성 배양배지 제조장치의 산소제거컬럼의 막힘현상을 개선하고, 가스압을 일정하게 유지할 수 있으며, 나동선의 색깔변화로 쉽게 컬럼의 재활성화 여부를 파악할 수 있다. 또한 혐기챔버와 산소제거컬럼을 연결하여 저가, 저순도의 가스를 산소가 완벽하게 제거된 고순도의 가스로 전환하여 혐기챔버에 공급함으로써, 절대 혐기성 미생물의 고체배지 배양을 가능하게 하고 knock-out mutant의 제조를 가능하게 한다.
본 발명에 따른 혐기성 배양 배지 제조용 산소제거 및 가스혼합 분배장치를 사용하면 기존의 혐기성 배양배지 제조장치의 산소제거컬럼의 막힘현상을 개선하고, 가스압을 일정하게 유지할 수 있으며, 나동선의 색깔변화로 쉽게 컬럼의 재활성화 여부를 파악할 수 있다. 또한 혐기챔버와 산소제거컬럼을 연결하여 저가, 저순도의 가스를 산소가 완벽하게 제거된 고순도의 가스로 전환하여 혐기챔버에 공급함으로써, 절대 혐기성 미생물의 고체배지 배양을 가능하게 하고 knock-out mutant의 제조를 가능하게 한다.
Description
본 발명은 메탄생성 고세균과 같이 극한환경에서 증식하는 난배양성 절대혐기 고세균 및 세균 특히, 산소에 민감하고 2기압 이상의 수소압을 요구하는 메탄생성 고세균인 Methanobrevibacter속의 고세균 또는 절대혐기 초호열균을 배양하기 위한 절대혐기 배지 제조용 산소제거 및 가스혼합/분배장치에 관한 것이다.
많은 수의 고세균은 그들의 에너지 대사의 절대 필요한 부분으로 메탄을 생성한다. 이와 같은 생물들을 메탄생성세균(methanogens)이라고 부르고 메탄 형성과정을 메탄생성(metanogenesis)이라고 부른다. 생리학적으로 메탄생성세균은 절대 혐기성균으로 그들을 배양하기 위해 절대 혐기성 기술이 필요하다. 종들에 따라서는 메탄생성세균의 배양은 H₂와 CO₂의 공기로 된 최소배지에서 가능하다. 비록 극한생물(extremophile)종들은 매우 높거나 낮은 온도 또는 염의 농도가 매우 높은 곳에서 최적으로 생장하지만 대부분의 알려진 메탄생성세균들은 중온성과 비호염성이다.
메탄생성 세균은 Methanobacterium , Methanococcus , Methanosarcian , Methanospirillium의 4속으로 분류되고 있다. 이들의 세균에 의하여 최종 생성물인 메탄이 발생되는데 그때의 메탄 생성율은 pH에 의존한다.
CH3COO + H2O → CH4 + HCO3- + 에너지
4H2 + HCO3- + H+ → CH4 + 3H2O + 에너지
메탄생성의 대부분은 이 둘째 경로를 통하여 이루어지는데, 이 둘째 경로는 혐기성 반응 전체를 좌우할 만큼 중요하다. 왜냐하면, 이 반응은 시스템 내의 수소를 제거하고, 그 분압을 낮게 유지함으로써 아세트산 생성을 가능케 하는 역할을 하기 때문이다.
메탄 생성 세균은 약하고, 증식속도가 낮으므로 온도, pH 등의 조건을 적합하게 안정시키는 것이 중요하다. 수소분압은 시스템 내의 전반적인 발효반응속도에 대하여 중요한 영향을 주지만, 그 허용한도가 너무 낮으므로 감시하기가 어렵다. 대신에 수소분압이 너무 높아질 경우, 시스템 내에는 프로피온산 등 비아세트산이 축적됨으로써 pH가 저하되는 현상을 볼 수 있다.
메탄 생성 세균은 절대혐기성 세균이므로 자유산소 O2는 이들 세균에게 독성으로 작용하며, NO3 - 등의 결합산소 조차도 그 증식을 저해한다.
메탄생성세균과 같은 절대 혐기성 미생물을 배양하기 위한 배양장치에 대한 선행기술로는, 배양용기와 혐기적 가스생성 및 인디케이터 장치를 함유하는 배양장치에 관한 것으로, 혐기적 가싱(gassing) 및 인디케이팅 장치는 가스 생성장치와 레독스 칼러 인디케이터(redox color indicator)를 가지고 있으며, 하이드로젠 아세틸렌과 같은 환원가스 또는 이산화탄소와의 혼합가스를 컨테이너에 공급하며, 레독스 칼러 인디케이터는 resazurin 용액등의 인디케이팅 용액을 포함하여 산소유무를 측정하며, 산소제거에는 다공성 펠렛형태의 팔라듐-on-알루미나 촉매가 충진된 칼럼을 사용하고, 혐기적 가스 생성 및 전달 장치 및 산소유무를 인디케이팅하는 장치를 포함하고 있는 혐기성 세균 배양장치(US4546086), 스텐레스 스틸 매쉬에 담긴 팔라듐 코팅 알루미나 펠렛을 사용하여 산소를 환원시키고 있으며, 구리튜브를 사용하여 가스를 이송시키는 편성 혐기성균 메탄생성 고세균(methanogenic Archaea)과 같이 엄격한 무산소 상태를 요구하는 미생물의 배양방법 및 배양장치(Kevin R Sower and Joy EM Watts, Methods in microbiology, 35, 757~782, 2006) 및 350℃로 가열된 구리 가루가 충전된 칼럼을 사용하여 산소를 제거하고 있고, 산소가 제거된 가스는 구리튜브를 지나서 폴리에틸렌 튜브를 지나 배양용기에 가스가 충전하는 메탄생성 박테리아를 배양하기 위한 장치( Balch, WE et al ., Applied and enviromenal microbiology, 32:6, 718-791, 1976) 등이 있다.
그러나, 상기 방법들은 산소제거에 팔라듐 코팅 알루미나 펠렛이나 구리 가루가 충전된 칼럼을 사용하고 있어, 산소제거컬럼 내의 가스압을 일정하게 유지하기가 어려웠으며, 가스튜브가 막히는 현상이 잦은 단점이 있었다.
이에, 본 발명자들은 산소제거컬럼 내의 가스압을 일정하게 유지하고, 가스튜브의 막힘 현상을 개선하기 위하여 예의 노력한 결과, 산소제거 및 가스혼합/분배장치에서 산소제거컬럼을 나동선으로 대체하는 경우, 산소제거컬럼 내의 가스압이 일정하게 유지되고, 가스튜브가 막히는 현상이 없으며, 육안으로 쉽게 활성형의 산소제거컬럼을 확인할 수 있고, 영구히 재활성화시켜 산소를 완벽하게 제거하는 것이 가능하며, 산소제거컬럼을 혐기챔버(Anaerobic Chamber)에 연결하여 혐기챔버에 주입되는 가스 내의 산소를 완벽히 제거함으로써 저순도, 저가의 가스를 사용하여 완벽하게 통제된 혐기챔버의 운영 및 절대혐기 미생물의 knock-out mutant 제조 가 가능하다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 산소제거 및 가스혼합/분배장치에서 산소제거컬럼의 막힘현상을 개선하고, 가스압을 일정하게 유지할 수 있으며, 컬럼의 활성화 정도를 육안으로 확인 가능하고, 혐기챔버에 연결하여 완벽한 절대혐기 균주의 유전자 조작을 가능하게 하는 산소제거 컬럼 및 이를 포함하는 혐기배양배지 제조장치를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 나동선으로 구성된 산소제거 칼럼을 가지는 것과 유리컬럼 및 방어 철조망을 설치하여 컬럼 내의 나동선을 육안으로 확인하여 컬럼의 산소제거활성 여부를 손쉽게 확인할 수 있는 혐기성 세균 배양용 산소제거 및 가스혼합 분배장치를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 산소제거 및 가스혼합 분배장치가 장착된 혐기배지 제조장치를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 산소제거 및 가스혼합 분배장치를 이용하는 것을 특징으로 하는 혐기배지의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 산소제거 장치를 혐기챔버와 연결하여 혐기챔버 내의 산소를 완벽히 제거하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 혐기성 배양 배지 제조용 산소제거 및 가스혼합 분배장치를 사용하면 기존의 혐기성 배양배지 제조장치의 산소제거컬럼의 막힘현상을 개선하고, 가스압을 일정하게 유지할 수 있으며, 나동선의 색깔변화로 손쉽게 컬럼의 재활성화 여부를 파악할 수 있다. 또한 혐기챔버와 산소제거컬럼을 연결하여 저가의 저순도 가스를 이용하더라도 완벽하게 산소가 제거된 고순도의 가스를 혐기챔버에 공급할 수 있게 된다.
도 1은 본 발명에 따른 절대혐기 고세균 및 극한환경미생물 배양용 배지 제조 장치를 나타낸 것이다.
도 2는 산소가 오염되어 산소제거컬럼이 어두운 색깔의 산화구리를 형성하고 있는 모습과 수소가스를 이용한 산소제거로 밝은 구리 색깔의 활성화된 산소제거컬럼의 모습을 나타낸 것이다.
도 3은 절대혐기배지제조 장치를 이용한 배지를 제조하는 모습을 나타낸 것이다.
도 4는 국내에서 배양이 되지 못했던 Methanobrevibacter 속의 메탄생성 고세균 배양을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 산소제거컬럼이 혐기챔버에 연결되어 저순도, 저가의 가스를 이용하여 산소가 완전히 제거된 고순도의 가스를 혐기챔버 내에 공급하고 이를 통해 완벽하게 혐기상태를 유지하는 혐기챔버를 나타낸 것이다.
도 2는 산소가 오염되어 산소제거컬럼이 어두운 색깔의 산화구리를 형성하고 있는 모습과 수소가스를 이용한 산소제거로 밝은 구리 색깔의 활성화된 산소제거컬럼의 모습을 나타낸 것이다.
도 3은 절대혐기배지제조 장치를 이용한 배지를 제조하는 모습을 나타낸 것이다.
도 4는 국내에서 배양이 되지 못했던 Methanobrevibacter 속의 메탄생성 고세균 배양을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 산소제거컬럼이 혐기챔버에 연결되어 저순도, 저가의 가스를 이용하여 산소가 완전히 제거된 고순도의 가스를 혐기챔버 내에 공급하고 이를 통해 완벽하게 혐기상태를 유지하는 혐기챔버를 나타낸 것이다.
일 관점에서, 본 발명은 나동선으로 구성된 산소제거 칼럼과 육안으로 나동선의 색변화를 확인할 수 있는 것을 특징으로 하는 혐기성 세균 배양용 산소제거 및 가스혼합 분배장치에 관한 것이다.
본 발명의 혐기성 세균 배양용 산소제거 및 가스 혼합 분배장치는 특히, 메탄생성 고세균과 같이 산소에 극도로 민감하고, 산소에 의해 사멸되는 난배양성 절대혐기 고세균 특히, 2기압이상의 수소압을 요구하는 매탄생성 고세균인 Methanobrevibacter속의 고세균의 배양이 가능한 특징이 있다. 또한 절대혐기 미생물(Geobacter sp.)의 knock out mutant 제조가 가능하다는 특징이 있다.
본 발명에 따른, 혐기배지 제조장치를 도 1에 나타내었다.
기존에 사용된 산소제거장치에서는 컬럼의 활성화 여부를 확인할 수 없었으나, 대상기술의 산소제거 칼럼은 열선과 방어철조망을 통하여 컬럼 내의 동선을 육안으로 확인할 수 있는 구조로 되어 있어, 나동선의 색깔변화로 쉽게 컬럼의 재생여부를 파악할 수 있다 (도 2).
본 발명의 혐기성 세균 배양용 산소제거 및 가스혼합 분배장치에서, 산소제거컬럼은 산소가 있을 경우 고온(200-300℃)에서 구리와 결합하여 구리산화물이 됨으로써 산소를 제거하는 기능을 한다.
본 발명의 혐기성 세균 배양용 산소제거 및 가스혼합 분배장치에서 가스혼합/분배장치는 flowmeter와 압력계기판, 압력튜브 등을 이용해 Metahnobrevibacter 배양을 위한 3~4기압 수소-이산화탄소 혼합가스를 배분하는 기능을 한다.
본 발명의 혐기성 세균 배양용 산소제거 및 가스혼합 분배장치에서 수소가스자동차단기는 실험실 내 수소가스가 위험수준에 도달할 경우 자동 가스 차단하는 기능을 한다.
또한, 가스배분장치를 일반유리가 아닌 구리튜브와 stainless steel 등을 사용하여 가압이 가능하도록 하였고, Flowmeter를 장착하여 원하는 비율로 가스를 혼합할 수 있고, 압력에 견디는 공압튜브와 배지튜브 내의 가스주입장치를 특수제작하여 3-4기압의 원하는 가스압으로 배양튜브 또는 배양 bottle내에 주입하는 것이 가능하며, 혼합된 가스가 최종적으로 산소제거컬럼을 통과하도록 제작하여 완벽하게 산소가 제거된 절대혐기성의 미생물 배지제조가 가능하다.
다른 관점에서, 본 발명은 산소제거 및 가스혼합 분배장치가 장착된 혐기배지 제조장치에 관한 것이다.
또다른 관점에서, 본 발명은 또한, 상기 산소제거 및 가스혼합 분배장치를 이용하는 것을 특징으로 하는 혐기배지의 제조방법에 관한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
:
Methanobrevibater
속 세균 배양용 배지 제조 및 배양
대상기술의 혐기배지제조장치를 사용하여, 메탄생성 고세균인 Methanobrevibater 속 세균 배양용 배지를 제조하였으며(도 3), 상기 제조된 배지를 사용하여, 국내에서 현재까지 배양이 불가능했던 Methanobrevibater속의 절대혐기성 고세균의 배양에 성공하였다(도 4).
또한, 현재까지 Methanobrevibacter ruminatium , M. smithii, Clostridium thermocellum 등의 10여균주를 이용하여, 배양실험을 해본결과, 접종된 모든 절대혐기성의 극한 환경미생물의 배양이 가능하였다.
실험에 사용한 극한 환경 미생물은 메탄생산고세균인 Methanobrevibacter ruminantium DSM 1093T과 Methanobrevibacter smithii DSM 861T을 사용하였으며, 모두 독일의 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)에서 귑하여 사용하였다. 배지 조성은 표 1 및 표 2에 나타내었으며, 독일 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)의 배지번호 191을 약간 변형하였으며, 여기에 절대혐기상태의 coenzyme M (최종 농도, 0.00001% w/v)을 추가적으로 주사기를 이용하여 주입하여 Methanobrevibacter의 생육을 촉진하도록 하였다.
배지제조 방법은 아래의 표의 배지성분을 준비한 후 pH를 7.0으로 조정하고, 5분간 끓인 다음, 배지를 식히는 과정 중에 수소 80%, 이산화탄소 20%의 가스조성으로 배지 내 가스를 치환한 후 혐기병 내에 분배하여 살균하였다. 균을 접종한 직후 수소 80%, 이산화탄소 20%의 살균된 혼합가스를 혐기병 내에 3기압으로 가압하고 37℃에서 배양하였다.
| 배지성분 | 양 |
| KH2PO4 | 0.500 g |
| MgSO4 x 7 H2O | 0.450 g |
| NaCl | 0.450 g |
| NH4Cl | 0.450 g |
| CaCl2 x 2 H2O | 0.045 g |
| FeSO4 x 7 H2O | 0.003 g |
| Trace element solution SL -10 1) | 1.000 ml |
| Yeast extract | 1.000 g |
| Na - acetate | 1.000 g |
| Na - formate | 2.000 g |
| Sludge fluid 2 ) | 30.000 ml |
| NaHCO3 | 4.000 g |
| Fatty acid mixture 3 ) | 20.000 ml |
| Resazurin | 0.001 g |
| Cysteine - HCl x H2O | 0.500 g |
| Na2S x 9 H2O | 0.500 g |
| Distilled water | 970.000 ml |
| Trace element solution SL-10 | HCl (25%; 7.7 M) 10.00 ml, FeCl2 x 4 H2O 1.50 g, ZnCl2 70.00 mg, MnCl2 x 4 H2O 100.00 mg, H3BO3 6.00 mg, CoCl2 x 6 H2O 190.00 mg, CuCl2 x 2 H2O 2.00 mg, NiCl2 x 6 H2O 24.00 mg, Na2MoO4 x 2 H2O 36.00 mg, Distilled water 990.00 ml |
| Sludge fluid (슬러지 용액) |
0.5% yeast extract를 폐수처리 혐기조에서 구한 슬러지에 첨가하고 질소가스를 10분간 주입하여 37℃에서 24시간 배양한다. 슬러지를 13,000g에서 원심분리하여 상등액만을 취한뒤 살균한뒤 혐기상태의 병에 질소가스를 충진하여 보존. 슬러지용액은 상온에서 어두운 장소에 보관함. |
| Fatty acid mixture (지방산 혼합용액) |
Valeric acid 0.500 g, Isovaleric acid 0.500 g, 2-Methylbutyric acid 0.500 g, Isobutyric acid 0.500 g, Distilled water 20.000 ml |
Claims (5)
- 나동선으로 구성된 산소제거 칼럼과 육안으로 나동선의 색변화를 통해 칼럼의 재생여부 확인이 가능하고 칼럼을 재생하여 사용할 수 있는 것을 특징으로 하는 혐기성 세균 배양용 산소제거 및 가스혼합 분배장치.
- 제1항에 있어서, 혐기성 세균은 난배양성 절대혐기 고세균인 것을 특징으로하는 산소제거 및 가스혼합 분배장치.
- 제2항에 있어서, 난배양성 절대혐기 고세균은 매탄생성 고세균인 Methanobrevibacter 속 Methanobacterium 속, Geobacter 속 및 Clostridium 속으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 산소제거 및 가스혼합 분배장치.
- 제1항의 혐기성 세균 배양용 산소제거 및 가스혼합 분배장치가 연결되어 구동되는 것을 특징으로 하는 혐기챔버.
- 제1항의 산소제거 및 가스혼합 분배장치를 이용하는 것을 특징으로 하는 혐기배지의 제조방법.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110001092A KR20120079735A (ko) | 2011-01-05 | 2011-01-05 | 절대혐기성 고세균 및 극한 환경미생물 배양을 위한 혐기배지 제조장치 |
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| KR1020170119605A Division KR101863685B1 (ko) | 2017-09-18 | 2017-09-18 | 절대혐기성 고세균 및 극한 환경미생물 배양을 위한 혐기배지 제조장치 |
Publications (1)
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|---|---|
| KR20120079735A true KR20120079735A (ko) | 2012-07-13 |
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| KR (1) | KR20120079735A (ko) |
Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| KR20160104377A (ko) * | 2015-02-26 | 2016-09-05 | 고려대학교 산학협력단 | 바이오가스 미생물의 군집을 유도하여 바이오가스를 생산하는 방법 및 이에 따라 생성된 바이오가스 |
-
2011
- 2011-01-05 KR KR1020110001092A patent/KR20120079735A/ko not_active Ceased
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|---|---|---|---|---|
| KR20160104377A (ko) * | 2015-02-26 | 2016-09-05 | 고려대학교 산학협력단 | 바이오가스 미생물의 군집을 유도하여 바이오가스를 생산하는 방법 및 이에 따라 생성된 바이오가스 |
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Legal Events
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Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20170223 Patent event code: PE09021S01D |
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