CN101160393B - 用于生产白藜芦醇或者其寡聚或糖苷结合衍生物的代谢改造细胞 - Google Patents

用于生产白藜芦醇或者其寡聚或糖苷结合衍生物的代谢改造细胞 Download PDF

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Abstract

通过以下途径产生白藜芦醇的重组微生物，其中苯丙氨酸解氨酶(PAL)由苯丙氨酸产生反式肉桂酸，肉桂酸4-羟化酶(C4H)由所述反式肉桂酸产生4-香豆酸，4-香豆酸CoA连接酶(4CL)由所述4-香豆酸产生4-香豆酰CoA，白藜芦醇合酶(VST)由所述4-香豆酰CoA产生所述白藜芦醇，或者其中L-苯丙氨酸或酪氨酸解氨酶(PAL/TAL)产生4-香豆酸，4-香豆酸CoA连接酶(4CL)由所述4-香豆酸产生4-香豆酰CoA，白藜芦醇合酶(VST)由所述4-香豆酰CoA产生所述白藜芦醇。所述微生物可以是酵母、真菌或者细菌，包括酿酒酵母、大肠杆菌、乳酸乳球菌、黑曲霉或者米曲霉。

Description

用于生产白藜芦醇或者其寡聚或糖苷结合衍生物的代谢改造细胞
技术领域
本发明一般涉及使用微生物细胞生产多酚白藜芦醇或者其寡聚或糖苷结合衍生物，如其β-葡糖苷云杉新苷。此外，还涉及产生白藜芦醇或其衍生物的天然存在或者重组微生物用于生产食品、饲料和饮料的用途。
背景技术
由微生物生产化学品已经是生物技术的一种重要应用。开发这样的生物制造方法的步骤一般可包括：1)选择合适的微生物宿主，2)消除引起副产物的代谢途径，3)在酶活性水平和转录水平上同时使所需途径失调，和4)过表达所需途径中的适当酶。在优选方面中，本发明已采用上述步骤的组合通过植物苯丙素(phenylpropanoid)途径的酶来重新定向来自苯丙氨酸或酪氨酸的碳流，所述途径提供所需白藜芦醇生物合成的必需前体。
白藜芦醇(或3，4，5-三羟基芪)是一种属于芪类植物抗毒素的植物酚，是低分子量的次级代谢产物，该次级代谢产物构成植物应答于感染或其它胁迫相关事件的主动防御机制。芪类植物抗毒素含有芪骨架(反式-1，2-二苯乙烯)作为其共有的基本结构：在该骨架上还可以加成其他基团(Hart and Shrimpton，1979，Hart，1981)。芪类不仅可见于某些树木(被子植物，裸子植物)中，而且可见于一些草本植物(桃金娘科(Myrtaceae)、葡萄科(Vitaceae)和豆科(Leguminosae中的物种)中。所述化合物对有害生物尤其是真菌、细菌和昆虫具有毒性。只有少数植物具有以提供对有害生物的充分抗性的量合成芪或产生芪的能力。
通过芪合酶实施基本芪骨架的合成。迄今为止，有两种酶已被划分为芪合酶：赤松素合酶和白藜芦醇合酶。目前，已经很详细地表征了落花生(Arachis hypogaea)白藜芦醇合酶，其多数特性已知(Schoppnerand Kindl，1984)。芪合酶使用的底物为丙二酰CoA、肉桂酰CoA或香豆酰CoA。这些物质存在于每种植物中，因为它们还用于其它重要植物组分如类黄酮、花色素和脂类的生物合成。
白藜芦醇(图1，反式)由两个紧密连接的苯环组成，因此属于多酚。尽管也存在于其它植物如桉树、云杉和百合以及其它食品如桑葚和落花生中，但是白藜芦醇最丰富的天然来源是用于酿酒的葡萄Vitisvinifera、美国葡萄(Vitis labrusca)和Vitis muscadine(rotundifolia)。所述化合物存在于藤(vine)、根、种子和茎中，但是在皮中其浓度最高(Celotti et al.，1996)，其中含有50-100μg/g。(Jang et al.1997)。与白葡萄酒的酿造相反，在红葡萄酒酿造期间，葡萄皮包含在葡萄汁中，因此白藜芦醇仅在红葡萄酒中有少量发现。除了其抗真菌特性以外，还公认白藜芦醇具有保护心脏和化学防癌的活性；它发挥植物雌激素、血小板聚集抑制剂(Kopp et al，1998；Gehm et al 1997；Lobo et al 1995)和抗氧化剂(Jang et al.，1997；Huang 1997)的作用。这些特性解释了所谓的法国悖论，即尽管缺乏锻炼并食用高脂肪膳食，但是饮用葡萄酒的法国人的冠心病发病率却很低。最近，已经显示白藜芦醇还可以活化酵母的SIR2基因以及类似的人基因SIRT1，它们在延长寿命方面都起到关键的作用。从那时起，人们的注意力就主要集中在白藜芦醇延长寿命的特性上(Hall，2003，Couzin，2004)。
美国健康协会(如生命延长基金会)正在推广此种药物巨大的有益效果，并由此推动可成功商品化的理想条件。当前的生产方法主要依赖于从葡萄浆果的皮中或者从紫菀科植物(knot weed)中提取白藜芦醇。这是一个劳动密集型方法，而且产量很低，因此这激励着人们去开发更高效、产量更高的新生产方法。
在植物中，苯丙素途径负责合成各种次级代谢化合物，包括木质素、水杨酸盐、香豆素、羟基肉桂酰氨(hydroxycinnamic amide)、色素、类黄酮和植物抗毒素。实际上，植物中白藜芦醇的形成通过苯丙素途径进行。L-苯丙氨酸解氨酶(PAL)通过非氧化脱氨基作用将氨基酸L-苯丙氨酸转化成反式肉桂酸(图2)。接着，通过细胞色素P450单加氧酶肉桂酸-4-羟化酶(C4H)与NADPH：细胞色素P450还原酶(CPR)结合使反式肉桂酸在对位羟基化，成为4-香豆酸(4-羟基肉桂酸)。随后通过4-香豆酸CoA连接酶(4CL)的作用将4-香豆酸活化成4-香豆酰CoA。最后，白藜芦醇合酶(VST)催化4-香豆酰CoA的苯丙烷单位与丙二酰CoA缩合，由此形成白藜芦醇。
最近，公开了可以由在葡萄汁中少量可见的4-香豆酸产生白藜芦醇的酵母(Becker et al. 2003)。通过共表达来自杂交杨树的异源辅酶A连接酶基因和葡萄白藜芦醇合酶基因(vstl)，实现了在酿酒酵母的实验室菌株中产生4-香豆酰CoA以及伴随的白藜芦醇。白藜芦醇合酶的另一底物丙二酰CoA已在酵母中内源性产生，其参与从头的脂肪酸生物合成。该研究表明，当在补充了4-香豆酸的合成培养基中培养时，酿酒酵母的细胞可以产生游离形式或葡糖苷结合形式的微量白藜芦醇。
然而，所述酵母不适合商业化应用，因为其白藜芦醇产量很低，并且需要添加只存在于少数工业培养基中的4-香豆酸。因此，为了促进和拓宽白藜芦醇作为药物和营养物(neutraceutical)的应用，非常期望获得可以直接由葡萄糖产生白藜芦醇而无需添加4-香豆酸的酵母。
最近的研究(Ro and Douglas，2004)描述了通过引入来自杨树的PAL、C4H和CPR来重建酿酒酵母中苯丙素途径的进入点(entrypoint)。其目的是评估包含PAL和C4H的多酶复合物(MEC)是否在进入苯丙素代谢的该进入点具有功能上的重要性。通过在所述重组酵母中添加[3H]-苯丙氨酸发现，多数经代谢的[3H]-苯丙氨酸掺入到4-[3H]-香豆酸中，并且通过抑制C4H活性而极大地降低了苯丙氨酸代谢。此外，仅表达PAL的系统极少将苯丙氨酸代谢成肉桂酸。当在三重表达系统中同时加入[3H]-苯丙氨酸和[14C]-反式肉桂酸时，没有证据显示将内源性合成的[3H]-反式肉桂酸输送到4-香豆酸。因此，在酵母中通过PAL和C4H催化的反应的从苯丙氨酸至4-香豆酸的高效碳流看来不需要通过MEC，并且PAL和C4H的完全生化偶联看来足以驱动碳流进入苯丙素途径。在另一研究中(Hwang et al.，2003)，通过表达含有各种异源苯丙素途径的三个基因(来自酵母深红酵母(Rhodotorula rubra)的PAL、来自放线菌天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的4CL以及来自甘草类植物刺甘草(Glycyrrhiza echinata)的查耳酮合酶(CHS))的人工基因簇实现了通过大肠杆菌产生植物特异性的黄烷酮。这些途径绕过了C4H，因为细菌4CL酶将辅酶A连接在反式肉桂酸以及4-香豆酸上。此外，来自深红酵母的PAL可利用苯丙氨酸和酪氨酸二者作为底物。因此，包含所述基因簇并在葡萄糖上生长的大肠杆菌细胞产生少量的两种黄烷酮：来自苯丙氨酸的生松素(0.29g/l)和来自酪氨酸的柚皮素(0.17g/l)。另外，它们的前体(4-香豆酸和反式肉桂酸)也有大量累积(分别为0.47和1.23mg/l)。此外，可以通过添加苯丙氨酸和酪氨酸来提高这些化合物的产量。
尽管来自双子叶植物的酶只能有效利用苯丙氨酸，但是一些研究表明，来自单子叶植物和一些微生物的PAL也利用酪氨酸(R
Figure 200680009533X_0
sler et al.，1997)。在这些反应中，所述酶活性命名为酪氨酸解氨酶(TAL，图3)。用TAL转化酪氨酸导致直接形成4-香豆酸，而没有C4H和CPR中间过程。尽管Km和转换数有很大差异，但这两种活性主要存在于同一多肽上，并且具有非常相似的催化效率。然而，来自植物的多数PAL/TAL酶偏好苯丙氨酸而不是酪氨酸。多数TAL的活性水平低于PAL的活性水平，但是这种差异的量级变化范围很广。例如，欧芹(parsley)的酶的Km对于苯丙氨酸为15-25μM，对于酪氨酸为2.0-8.0mM，转换数分别为22 S-1和0.3 S-1。相反，玉米的酶对于苯丙氨酸的Km比对于酪氨酸的Km只高15倍，转换数高约10倍。此外，在红酵母(red yeast)如粘红酵母(Rhodotorula glutinis)(红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides))和深红酵母中，TAL的催化活性接近PAL的催化活性，TAL/PAL的比值约为0.58。相信这些酵母的PAL酶发挥降解代谢功能降解苯丙氨酸，并且所形成的反式肉桂酸被转化成苯甲酸盐和其它细胞材料，而在植物中认为其仅是木质素、异黄酮类和其它的苯丙素类生物合成的调节酶。
最近，在细菌荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)中发现了一种开放读码框，其编码假想的生物合成酪氨酸解氨酶(TAL)，该酶参与光活黄蛋白生色团的生物合成(Kyndt et al.，2002)。这是第一次在细菌中发现PAL同源基因。分离了所述TAL基因并在大肠杆菌中过量产生。对于酪氨酸至4-香豆酸的转化的Km和kcat值分别是15.6μM和27.7s-1，针对L-苯丙氨酸至反式肉桂酸的转化的Km和kcat值分别是1277μM和15.1s-1。由于其Km较小而kcat稍大，相对于L-苯丙氨酸，该酶显示出对酪氨酸的强偏好性，其对于酪氨酸的催化效率(Km/kcat)高于苯丙氨酸约150倍。动力学研究已确定，在生理条件下，酪氨酸是该酶的天然底物，而L-苯丙氨酸不是。最近的研究描述了在大肠杆菌中异源共表达苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羟化酶、4-香豆酸CoA连接酶和查耳酮合成酶(Watts et al.，2004)，以用于产生类黄酮。然而，由于肉桂酸-4-羟化酶无功能，因此同时表达全部四种基因并不成功。然而，通过用克隆自球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的新酪氨酸解氨酶替代苯丙氨酸解氨酶和肉桂酸-4-羟化酶可以解决该问题，并引起二氢黄酮柚皮素的高水平产生。此外，还利用来自球形红细菌的酪氨酸解氨酶在大肠杆菌中异源产生4-香豆酸(即对羟基肉桂酸)(US-A-2004059103)。甚至，还描述了开发生物催化剂用于将葡萄糖转化成4-香豆酸的其他方法。US-A-2004023357公开了用来自酵母皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)的酪氨酸解氨酶在大肠杆菌和酿酒酵母中产生香豆酸。US-A-2001053847描述了将来自酵母粘红酵母的野生型PAL整合进大肠杆菌，强化了野生型PAL将酪氨酸直接转化成4-香豆酸的能力。此外，还有示例将来自酵母粘红酵母的野生型PAL加植物C4H和CPR整合进大肠杆菌和酿酒酵母。还描述了通过诱变野生型酵母粘红酵母的PAL开发TAL活性提高的生物催化剂(US-A-6521748)。前述专利均未指明掺入4CL和VST用于产生白藜芦醇。
最近，有证据显示丝状真菌米曲霉(A.oryzae)含有查耳酮合成酶(CHS)，该酶在植物中通常参与类黄酮比如柚皮素的生物合成(Seshime et al.，2005)。实际上，还显示米曲霉含有负责苯丙素-类黄酮代谢的一组主要基因，即PAL、C4H和4CL。然而，没有证据表明米曲霉包含芪合成酶，如白藜芦醇合酶。
本发明现提供具有包含至少一种酶活性的有效代谢途径的微生物，所述途径产生4-香豆酸，并由其产生白藜芦醇，或其寡聚体或糖苷结合衍生物。这样的微生物可以是天然存在的并且可以通过合适的筛选方法来分离，但是更优选是经遗传改造的。
优选地，在以内源性丙二酰CoA为底物的酶所催化的反应中产生所述白藜芦醇或衍生物，优选由4-香豆酰CoA产生所述白藜芦醇。
优选用白藜芦醇合酶由4-香豆酰CoA产生所述白藜芦醇或者衍生物，所述白藜芦醇合酶优选在所述微生物中由编码所述酶的核酸表达，所述核酸对于该微生物而言是非天然的。
一般在本文中，除非上下文中另外指出，提及白藜芦醇时也包括其寡聚或糖苷结合衍生物，尤其包括云杉新苷。
因此，在某些优选实施方案中，所述白藜芦醇合酶是来自以下植物的白藜芦醇合酶(EC 2.3.1.95)：属于落花生属(Arachis)的植物(如A.glabatra、落花生(A.hypogaea))、属于大黄属(Rheum)的植物(如圆叶大黄)、属于葡萄属的植物(例如，美国葡萄、V.riparaia、葡萄)或者松属、云杉属(Picea)、百合属(Lilium)、桉属(Eucalyptus)、爬山虎属(Parthenocissus)、白粉藤属(Cissus)、Calochortus、蓼属(Polygonum)、买麻藤属(Gnetum)、波萝蜜属(Artocarpus)、Nothofagus、刺葵属(Phoenix)、羊茅属(Festuca)、薹草属(Carex)、藜芦属(Veratrum)、羊蹄甲属(Bauhinia)或老虎刺属(Pterolobium)属中任一属的植物。
优选地，适当地通过酶在该酶催化的反应中由反式肉桂酸产生所述4-香豆酸，其中氧为底物，NADH或者NADPH为辅因子，NAD+或者NADP+为产物。
因此，可以通过肉桂酸4-羟化酶由反式肉桂酸产生所述4-香豆酸，所述酶优选在所述微生物中由编码所述酶的核酸表达，所述核酸对于该微生物而言是非天然的。
在某些优选实施方案中，包括上面段落中所述的，所述肉桂酸4-羟化酶是来自植物或微生物的肉桂酸-4-羟化酶(EC 1.14.13.11)。所述植物可以属于拟南芥属(Arabidopsis)，例如拟南芥；属于柑橘属(Citrus)的植物，例如甜橙(C.sinensis)、葡萄柚(C.x paradise)；属于菜豆属(Phaseolus)的植物，例如菜豆(P.vulgaris)；属于松属的植物，例如火炬松(P.taeda)；属于杨属(Populus)的植物，例如P.deltoids、P.tremuloides、P.trichocarpa；属于茄属(Solanum)的植物，例如马铃薯(S.tuberosum)；属于葡萄属的植物，例如葡萄；属于玉蜀黍属(Zea)属的植物，例如玉蜀黍(Z.mays)；或者其它属的植物，例如阿米属(Ammi)、海榄雌属(Avicennia)、山茶属(Camellia)、喜树属(Camptotheca)、长春花属(Catharanthus)、大豆属(Glycine)、向日葵属(Helianthus)、百脉根属(Lotus)、日中花属(Mesembryanthemum)、小立宛藓属(Physcomitrella)、芸香属(Ruta)、甘蔗属(Saccharum)、豇豆属(Vigna)。所述微生物可以是属于曲霉属的真菌，例如米曲霉。
优选地，在产生氨的酶催化反应中由酪氨酸产生所述4-香豆酸，并且适当地通过L-苯丙氨酸解氨酶或者酪氨酸解氨酶，例如来自酵母或细菌的酪氨酸解氨酶(EC 4.3.1.5)由酪氨酸产生所述4-香豆酸。适当地，所述酪氨酸解氨酶来自酵母深红酵母或者来自细菌荚膜红细菌。
任选地，在所述微生物中由编码所述酶的核酸表达所述酪氨酸解氨酶，所述核酸对于所述该微生物而言是非天然的。
或者，可以在产生氨的酶催化反应中由L-苯丙氨酸产生所述反式肉桂酸，并且适当地通过苯丙氨酸解氨酶由L-苯丙氨酸形成所述反式肉桂酸。
在某些优选实施方案中，所述L-苯丙氨酸解氨酶是来自植物或者微生物的L-苯丙氨酸解氨酶(EC 4.3.1.5)。所述的植物可以属于拟南芥属，例如拟南芥；属于芸苔属(Brassica)的植物，例如欧洲油菜(B.napus)、芜青(B.rapa)；属于柑橘属的植物，例如柑橘(C.reticulate)、C.clementinus、柠檬(C.limon)；属于菜豆属的植物，例如P.coccineus、菜豆(P.vulgaris)；属于松属的植物，例如北美短叶松(P.banksiana)、加州山松(P.monticola)、海岸松(P.pinaster)、欧洲赤松(P.sylvestris)、火炬松；属于杨属的植物，例如小叶杨(P.balsamifera)、P.deltoids、加杨(P.Canadensis)、P.kitakamiensis、P.tremuloides；属于茄属的植物，例如马铃薯；属于李属(Prunus)的植物，例如P.avium、桃；属于葡萄属的植物，例如葡萄；属于玉蜀黍属的植物，例如玉蜀黍或者其它属植物例如藿香属(Agastache)、凤梨属(Ananas)、天门冬属(Asparagus)、Bromheadia、竹属(Bambusa)、甜菜属(Beta)、桦木属(Betula)、Cucumis、山茶属、辣椒属(Capsicum)、决明属(Cassia)、长春花属、鹰嘴豆属(Cicer)、西瓜属(Citrullus)、咖啡属(Coffea)、南瓜属(Cucurbita)、狗牙根属(Cynodon)、胡萝卜属(Daucus)、石斛属(Dendrobium)、石竹属(Dianthus)、毛地黄属(Digitalis)、薯蓣属(Dioscorea)、桉属、Gallus、银杏属(Ginkgo)、大豆属、大麦属(Hordeum)、向日葵属、番薯属(Ipomoea)、莴苣属(Lactuca)、紫菜属(Lithospermum)、百脉根属、番茄属(Lycopersicon)、苜蓿属(Medicago)、苹果属(Malus)、木薯属(Manihot)、苜蓿属(Medicago)、日中花属(Mesembryanthemum)、烟草属(Nicotiana)、木犀榄属(Olea)、稻属(Oryza)、豌豆属(Pisum)、鳄梨属(Persea)、欧芹属(Petroselinum)、蝴蝶兰属(Phalaenopsis)、刚竹属(Phyllostachys)、小立碗藓属(Physcomitrella)、云杉属(Picea)、梨属(Pyrus)、栎属(Quercus)、萝卜属(Raphanus)、地黄属(Rehmannia)、悬钩子属(Rubus)、高粱属(Sorghum)、Sphenostylis、繁缕属(Stellaria)、笔花豆属(Stylosanthes)、小麦属(Triticum)、车轴草属(Trifolium)、小麦属、越桔属(Vaccinium)、豇豆属(Vigna)、百日菊属(Zinnia)。所述微生物可以是属于蘑菇属(Agaricus)的真菌，例如双孢蘑菇(A.bisporus)，属于曲霉属属的真菌，例如米曲霉、构巢曲霉(A.nidulans)、烟曲霉(A.fumigatus)，属于黑粉菌属(Ustilago)的真菌，例如玉蜀黍黑粉菌(U.maydis)，属于红细菌属(Rhodobacter)的细菌，例如荚膜红细菌(R.capsulatus)，属于红酵母属(Rhodotorula)的酵母，例如深红酵母(R.rubra)。适当地，在所述微生物中由编码所述酶的核酸表达所述L-苯丙氨酸解氨酶，所述核酸对于该微生物而言是非天然的。
优选地，在酶催化的反应中形成4-香豆酰CoA，其中ATP和CoA为底物，ADP为产物，并且适当地在由4-香豆酸CoA连接酶催化的反应中形成4-香豆酰CoA。
所述4-香豆酸CoA连接酶可以是来自植物、微生物或者线虫的4-香豆酸CoA连接酶(EC 6.2.1.12)。所述植物可以属于冷杉属(Abies)，例如百山祖冷杉(A.beshanzuensis)、日本冷杉(B.firma)、杉松(B.holophylla)；属于拟南芥属的植物，例如拟南芥；属于芸苔属的植物，例如欧洲油菜、芜青、甘蓝；属于柑橘属的植物，例如甜橙；属于落叶松(Larix)属的植物，例如欧洲落叶松(L.decidua)、L.gmelinii、西藏红杉(L.griffithiana)、喜马拉雅红杉(L.himalaica)、日本落叶松(L.kaempferi)、北美落叶松(L.laricina)、四川红杉(L.mastersiana)、美国西部落叶松(L.occidentalis)、红杉(L.potaninii)、新疆落叶松(L.sibirica)、怒江红杉(L.speciosa)；属于菜豆属的植物，例如P.acutifolius、荷包豆(P.coccineus)；属于松属的植物，例如华山松(P.armandii)、北美短叶松(P.banksiana)、海岸松(P.pinaster)；属于杨属的植物，例如小叶杨、毛白杨(P.tomentosa)、P.tremuloides；属于茄属的植物，例如马铃薯；属于葡萄属的植物，例如葡萄；属于玉蜀黍属的植物，例如玉蜀黍；或者其它属的植物例如藿香属、矮紫穗槐(Amorpha)、银杉属(Cathaya)、雪松属(Cedrus)，番红花属(Crocus)、羊茅属、大豆属、胡桃属(Juglans)、油杉属(Keteleeria)、紫菜属、黑麦草属(Lolium)、百脉根属、番茄属、苹果属、苜蓿属、日中花属、烟草属、Nothotsuga、稻属、天竺葵属(Pelargonium)、欧芹属、小立碗藓属、云杉属、李属、金钱松属(Pseudolarix)、黄杉属(Pseudotsuga)、蔷薇属(Rosa)、悬钩子属、Ryza、甘蔗属、碱蓬属(Suaeda)、盐芥属(Thellungiella)、小麦属、铁杉属(Tsuga)。所述微生物可以是属于曲霉属的丝状真菌，例如黄曲霉(A.flavus)、构巢曲霉(A.nidulans)、米曲霉、烟曲霉(A.fumigatus)，属于脉孢菌属(Neurospora)的丝状真菌，例如粗糙脉孢菌(N.crassa)，属于Yarrowia属的真菌，例如Y.lipolytica，属于球腔菌属(Mycosphaerella)的真菌，例如禾生球腔菌(M.graminicola)，属于分支杆菌属(Mycobacterium)的细菌，例如牛分支杆菌(M.bovis)、麻风分支杆菌(M.leprae)、结核分支杆菌(M.tuberculosis)，属于奈瑟菌属(Neisseria)的细菌，例如脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)，属于链霉菌属(Streptomyces)的细菌，例如天蓝色链霉菌(S.coelicolor)，属于红细菌属的细菌，例如荚膜红细菌，属于钩口线虫属(Ancylostoma)的线虫，例如锡兰钩口线虫(A.ceylanicum)，属于小杆线虫属(Caenorhabditis)的线虫，例如秀丽小杆线虫(C.elegans)，属于血矛线虫属(Haemonchus)的线虫，如捻转血矛线虫(H.contortus)；属于蚯蚓属(Lumbricus)的线虫，例如L.rubellus；属于Meilodogyne属的线虫，例如M.hapla，属于Strongyloidus属的线虫，例如S.rattii、S.stercoralis，属于Pristionchus属的线虫，例如P.pacificus。
任选地，已在所述微生物中重组引入了NADPH：细胞色素P450还原酶(CPR)。这可以是引入非植物微生物的植物CPR。或者，在所述微生物中过表达天然NADPH：细胞色素P450还原酶(CPR)。
在某些优选实施方案中，包括在上面段落中所述的，所述NADPH：细胞色素P450还原酶是来自以下植物的NADPH：细胞色素P450还原酶(EC 1.6.2.4)：属于拟南芥属的植物，例如拟南芥，属于柑橘属的植物，例如甜橙、葡萄柚，属于菜豆属的植物，例如菜豆，属于松属的植物，例如火炬松，属于杨属的植物，例如P.deltoides、P.tremuloides、P.trichocarpa，属于茄属的植物，例如马铃薯，属于葡萄属的植物，例如葡萄，属于玉蜀黍属的植物，例如玉蜀黍，或者其它属的植物例如阿米属、海榄雌属、山荼属、喜树属、长春花属、大豆属、向日葵属、百脉根属、日中花属、小立碗藓属、芸香属、甘蔗属、豇豆属。
尽管所述微生物可以是天然存在的，但优选将编码所述代谢途径中相应酶的至少一种遗传序列的至少一个拷贝重组引入所述微生物。
作为引入编码所述酶的编码序列的补充或替代，可以提供在所述生物中不与所述编码序列天然相关联的一种或多种表达信号，例如启动子序列。因此，任选地，将编码酪氨酸解氨酶的遗传序列的至少一个拷贝与表达信号有效连接，所述表达信号在所述生物中不与所述遗传序列天然相关联，和/或将编码L-苯丙氨酸解氨酶的遗传序列的至少一个拷贝与表达信号有效连接，所述表达信号在所述生物中不与所述遗传序列天然相关联。
任选地，可将编码肉桂酸4-羟化酶的遗传序列的至少一个拷贝(无论其是否是天然的)与表达信号有效连接，所述表达信号在所述生物中不与所述遗传序列天然相关联。
任选地，可将编码4-香豆酸-CoA连接酶的遗传序列的至少一个拷贝(无论其是否是天然的)与表达信号有效连接，所述表达信号在所述生物中不与所述遗传序列天然相关联。
任选地，可将编码白藜芦醇合酶的遗传序列的至少一个拷贝(无论其是否是天然的)与表达信号有效连接，所述表达信号在所述生物中不与所述遗传序列天然相关联。
表达信号包括位于编码序列上游(5’非编码序列)、内部或者下游(3’非编码序列)的核苷酸序列，并且其影响相关联编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或者翻译。这样的序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子和多聚腺苷酸化识别序列。
在某些方面中，本发明提供代谢改造微生物，其具有有效的代谢途径，其中第一种代谢物在由第一种酶催化的反应中转化成第二种代谢物，所述反应步骤产生氨，并且其中所述第二种代谢物在由第二种酶催化的反应中转化成第三种代谢物，其中氧为底物，NADPH或NADH为辅因子，NADP+或NAD+为产物，并且其中所述第三种代谢物在由第三种酶催化的反应中转化成第四种代谢物，其中ATP和CoA为底物，ADP为产物，并且所述第四种代谢物在由第四种酶催化的反应中转化成第五种代谢物，其中内源性丙二酰CoA为底物。
本发明还提供代谢改造的微生物，其具有有效的代谢途径，其中通过第一种酶催化将第一种代谢物转化成所述第三种代谢物，该反应步骤产生氨，而不涉及所述第二种酶，并且其中所述第三种代谢物在由所述第三种酶催化的反应中转化成所述第四种代谢物，其中ATP和CoA为底物，ADP为产物，并且其中所述第四种代谢物在由所述第四种酶催化的反应中转化成所述第五种代谢物，其中内源性丙二酰CoA为底物。
上述微生物包括这样的微生物：含有编码苯丙氨酸解氨酶并与表达信号有效连接的异源DNA序列的一个或多个拷贝，并且含有编码肉桂酸-4-羟化酶并与表达信号有效连接的异源DNA序列的一个或多个拷贝，并且含有编码4-香豆酸CoA连接酶并与表达信号有效连接的异源DNA序列的一个或多个拷贝，并且含有编码白藜芦醇合酶并与表达信号有效连接的异源DNA序列的一个或多个拷贝。
它们还包括这样的微生物：其中缺乏肉桂酸-4-羟化酶活性，并且含有编码酪氨酸解氨酶并与表达信号有效连接的异源DNA序列的一个或多个拷贝，并且含有编码4-香豆酸-CoA-连接酶并与表达信号有效连接的异源DNA序列的一个或多个拷贝，并且含有编码白藜芦醇合酶并与表达信号有效连接的异源DNA序列的一个或多个拷贝。
在本文中，术语“微生物”涉及显微镜可见的生物体，包括细菌，显微镜可见的真菌，包括酵母。
更具体地，所述微生物可以是真菌，更具体地为属于曲霉属的丝状真菌，例如黑曲霉、泡盛曲霉(A.awamori)、米曲霉、构巢曲霉(A.nidulans)；属于酵母属的酵母，例如酿酒酵母、克鲁弗酵母(S.kluyveri)、贝酵母(S.bayanus)、少孢酵母(S.exiguus)、S.sevazzi、葡萄汁酵母(S.uvarum)；属于克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的酵母，例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、马克斯克鲁维酵母马克斯变种(K.marxianus var.marxianus)、K.thermotolerans；属于假丝酵母属的酵母，例如产朊假丝酵母(C.utilis)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、白假丝酵母(C.albicans)、解脂假丝酵母(C.lipolytica)、C.versatilis；属于毕赤酵母属(Pichia)的酵母，例如树干毕赤酵母(P.stipidis)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、P.sorbitophila；或者其它的酵母属，例如隐球酵母属(Cryptococcus)、德巴利酵母属(Debaromyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia)、Yarrowia、接合酵母属(Zygosaccharomyce)或者裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)。就其它的微生物而言，合适的丝状真菌的非穷举名单提供如下：属于青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)、镰孢霉属(Fusarium)、梭链孢属(Fusidium)、赤霉属(Gibberella)、毛霉属(Mucor)、被孢霉属(Mortierella)、木霉属(Trichoderma)的物种。
就细菌而言，合适的细菌的非穷举名单给出如下：属于芽孢杆菌属的物种，属于埃希氏菌属的物种，属于乳杆菌属的物种，属于乳球菌属的物种，属于棒状杆菌属属的物种，属于醋酸杆菌属的物种，属于不动杆菌属的物种，属于假单胞菌属的物种等。
本发明优选的微生物可以是酿酒酵母、黑曲霉、米曲霉、大肠杆菌、乳酸乳球菌或枯草芽孢杆菌。
可以采用普遍公知的方法来培养所构建和改造的微生物，包括恒化器培养、分批培养、补料分批培养等。
因此，本发明包括用于产生白藜芦醇或者其寡聚或糖苷结合衍生物的方法，所述方法包括在基本没有外源4-香豆酸的情况下，使非植物细胞与碳底物接触，所述细胞具有在该条件下产生白藜芦醇或者其寡聚或糖苷结合衍生物的能力，其中所述微生物可选自真菌或细菌，尤其是酵母。
任选地，所述碳底物选自由单糖、寡糖和多糖组成的可发酵碳底物，例如葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、蔗糖、乳糖、赤藓糖、苏糖和/或核糖。作为补充或替代，所述碳底物可以选自不可发酵的碳底物，包括乙醇、乙酸盐、甘油和/或乳酸盐。作为补充或替代，所述不可发酵的碳底物可以选自氨基酸，可以是苯丙氨酸和/或酪氨酸。
在另一方面中，本发明包括通过异源表达编码苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸4-羟化酶、4-肉桂酸CoA连接酶和白藜芦醇合酶的核苷酸序列来生产白藜芦醇或者其寡聚或糖苷结合衍生物的方法，还包括通过异源表达编码酪氨酸解氨酶、4-香豆酸CoA连接酶和白藜芦醇合酶的核苷酸序列来产生白藜芦醇的方法。
这样产生的白藜芦醇或者其寡聚或糖苷结合衍生物可以在乳制品或者饮料(如啤酒)中作为营养物。
根据本发明产生的白藜芦醇可以是顺式白藜芦醇或者反式白藜芦醇，但是预计通常主要为反式形式。
附图说明
为了帮助理解本发明的上述内容，可参考附带的附图，其中：
图1显示反式白藜芦醇的化学结构；
图2显示利用作用于L-苯丙氨酸的苯丙氨酸解氨酶的苯丙素途径；和
图3显示利用作用于L-酪氨酸的苯丙氨酸解氨酶的另一途径。
图4显示在100g/l半乳糖上培养的酿酒酵母菌株FSSC-PALC4H4CLVST、FSSC-TAL4CLVST的提取物的HPLC层析图。其中包括60 ng纯白藜芦醇的层析图。
图5显示关于纯反式白藜芦醇以及在100g/l半乳糖上培养的酿酒酵母菌株FSSC-PALC4H4CLVST产生的反式白藜芦醇的UV吸收光谱。
图6显示来自在50g/l葡萄糖上培养的大肠杆菌菌株FSEC-TAL4CLVST和FSEC-对照的提取物的HPLC层析图。
图7显示来自在添加了20mg/l香豆酸的50g/l葡萄糖上培养的大肠杆菌菌株FSEC-TAL4CLVST和FSEC-对照的提取物的HPLC层析图。其中包括在菌株FSEC-TAL4CLVST中产生的反式白藜芦醇的UV吸收光谱。
本发明将通过以下的非限制性实施例来进一步描述和说明。
实施例
实施例1
分离编码PAL、TAL、C4H、CPR、4CL和VST的基因
使用表1中的引物通过PCR从拟南芥的cDNA(BioCat，Heidelberg，Germany)中分离苯丙氨酸解氨酶(PAL2)(Cochrane et al.，2004；SEQID NO：1、2)、肉桂酸4-羟化酶(C4H)(Mizutani et al.，1997；SEQ IDNO：3、4)和4-香豆酸：辅酶A连接酶(4CL1)(Hamberger and Hahlbrock2004；Ehlting et al.，1999；SEQ ID NO：5、6)。由于动力学参数分别有利于肉桂酸和香豆酰CoA(Cochrane et al.，2004；Hamberger andHahlbrock 2004；Ehlting et al.，1999)，因此PAL2和4CL1选自几种拟南芥同源物。
使用www.entelechon.com的在线服务回译工具，对来自圆叶大黄(Rheum tataricum)的白藜芦醇合酶(VST)的编码序列(Samappito etal.，2003；SEQ ID NO：7，8)和来自荚膜红细菌的酪氨酸解氨酶(TAL)的编码序列(Kyndt et al.，2002；SEQ ID NO：11、12)进行密码子优化，以用于在酿酒酵母中表达，分别得到序列SEQ ID NO：9、10和SEQ IDNO：13、14。在MWG Biotech构建用于装配合成基因的寡聚物，并使
表1.用于基因扩增的引物和限制性位点
用于基因扩增的引物★(限制性位点用下划线标示) 基因 限制性位点：引物 限制性位点：载体
5′-CGGAATTCTCATGGATCAAATCGAAGCAATGTT  PAL2  EcoR1  EcoR1
5′-CGACTACTAGTTAGCAAATCGGAATCGGAGC  PAL2  Spe1  Spe1
5′-CGCTCGAGAT ATGGACCTCCTCTTGCTGGA  C4H  Xho1  Xho1
5′-CGGGTACCTTAACAGTTCCTTGGTTTCATAAC  C4H  Kpn1  Kpn1
5′-GCTCTAGACCT ATGGCGCCACAAGAACAAGCAGTTT  4CL1  Xba1  Spe1
5′-GCGGATCCCCT TCACAATCCATTTGCTAGTTT TGCC  4CL1  BamH1  BglII
5′-CC GGATCCAAATGGCCCCAGAAGAGAGCAGG  VST  BamH1  BamH1
5′-CG CTCGAGTTAAGTGATCAATGGAACCGAAGACAG  VST  Xho1  Xho1
5′-CCGAATTCCCATGACCCTGCAATCTCAAACAGCTAAAG  TAL  ECoR1  ECoR1
5′-CCACTAGTTTAAGCAGGTGGATCGGCAGCT  TAL  Spe1  Spe1
5′-CCCTCGAGATCATGCCGTTTGGAATAGACAACACCGA  CPR1  Xho1  Xho1
5′-CCAAGCTTATCGGGCTGATTACCAGACATCTTCTTG  CPR1  HindIII  HindIII
5′-CCGGATCCCCATGTCCTCTTCTTCTTCTTCGTCAAC  AR2  Bamh1  Bamh1
5′-CCCTCGAGGTGAGTGTGTGGCTTCAATAGTTT  CG  AR2  Xho1  Xho1
★SEQ ID Nos 19-32
用对下文Martin et al.(2003)稍加改良的方法通过PCR装配所述合成基因。
将来自MWG的用于装配合成基因的引物溶于milliQ水中，浓度为100pmole/μl。将每种引物5μl的等分试样组合在总混合物中，随后用milliQ水稀释10倍。每50μl使用5μl经稀释的总混合物作为融合DNA聚合酶(Finnzymes)的模板，通过PCR装配所述基因。PCR程序如下：首先为98℃30秒；随后为98℃10秒、40℃1分钟和72℃1分钟/千碱基对的30个循环；最后为72℃5分钟。在1％琼脂糖凝胶上纯化20μl所得的PCR反应物。结果为PCR弥散条带，从琼脂糖凝胶上切下所需大小条带周围的区域，并应用QiaQuick凝胶提取试剂盒(Qiagen)对其进行纯化。使用表1中的外部引物(针对TAL和VST的)的最后一次PCR产生所需的TAL和VST基因。采用Quickchange定点诱变II试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)或者对来自几种不同大肠杆菌亚克隆的重叠的无差错DNA节段应用PCR来修正点突变。使用表1中的引物，分别从拟南芥cDNA(BioCat，Heidelberg)和酿酒酵母基因组DNA中分离来自拟南芥(AR2)(Mizutani and Ohta，1998；SEQ ID NO：17，18)和来自酿酒酵母(CPR1)(Aoyama et al.，1978；SEQID NO：15，16)的NADPH：细胞色素P450还原酶(CPR)。
实施例2
构建用于表达PAL的酵母载体
应用在5’突出端中含有EcoR1和Spe1限制性位点的正向和反向引物(表1)，通过PCR再扩增如实施例1所述分离的编码PAL的基因。用EcoR1/Spe1消化扩增的PAL PCR产物并将其连接进经EcoR1/Spe1消化的pESC-URA载体(Stratagene)，得到载体pESC-URA-PAL。通过对两个不同克隆进行测序来确认该基因的序列。
实施例3
构建用于表达PAL和C4H的酵母载体
应用在5’突出端中含有Xho1和Kpn1限制性位点的正向和反向引物，通过PCR扩增如实施例1所述分离的编码C4H的基因。用Xho1/Kpn1消化扩增的C4H PCR产物并将其连接进同样消化的pESC-URA-PAL载体。得到的质粒pESC-URA-PAL-C4H中含有反向(divergent)GAL1/GAL10启动子控制下的编码PAL和C4H的基因。通过对两个不同克隆进行测序来确认编码C4H的基因的序列。
实施例4
构建用于表达4CL的酵母载体
如实施例1所述分离编码4CL的基因。用Xba1/BamH1消化扩增的4CL PCR产物并将其连接进经Spe1/BglII消化的pESC-TRP载体(Stratagene)，得到载体pESC-TRP-4CL。对两个不同的pESC-TRP-4CL克隆进行测序以确认所克隆基因的序列。
实施例5
构建用于表达4CL和VST的酵母载体
如实施例1所述分离编码VST的基因。用BamH1/Xho1消化扩增的合成VST基因并将其连接进经BamH1/Xho1消化的pESC-TRP-4CL(实施例4)。得到的质粒pESC-TRP-4CL-VST中含有反向GAL1/GAL10启动子控制下的编码4CL和VST的基因。通过对两个不同的pESC-TRP-4CL-VST克隆进行测序来确认编码VST的基因的序列。
实施例6
构建用于表达TAL的酵母载体
如实施例1所述分离编码TAL的基因。用EcoR1/Spe1消化扩增的合成TAL基因并将其连接进经EcoR1/Spe1消化的pESC-URA载体。得到的质粒pESC-URA-TAL含有反向GAL1/GAL10启动子控制下的编码TAL的基因。通过对两个不同的pESC-URA-TAL克隆进行测序来确认序列。
实施例7
构建用于过表达酿酒酵母内源性CPR的酵母载体
如实施例1所述分离来自酿酒酵母的编码CPR的基因(CPR1)。用Xho1/HindIII消化扩增的CPR1基因并将其连接进经Xho1/HindIII消化的pESC-LEU载体(Stratagene)，得到载体pESC-LEU-CPR1。通过对两个不同的pESC-LEU-CPR1克隆进行测序来确认序列。
实施例8
构建用于过表达拟南芥CPR(AR2)的酵母载体
如实施例1所述分离来自拟南芥的编码CPR的基因(AR2)。用BamH1/Xho1消化扩增的AR2基因并将其连接进经BamH1/Xho1消化的pESC-LEU载体(Stratagene)，得到载体pESC-LEU-AR2。通过对两个不同的pESC-LEU-AR2克隆进行测序来确认序列。
实施例9
使用PAL、C4H、4CL和VST在酿酒酵母中表达通向白藜芦醇的途径
分别地或组合地应用如实施例2、3、4、5、6、7和8所述的载体来转化含有适当遗传标记的酵母菌株。根据本领域公知的方法来实施所述酵母细胞的转化，例如通过利用感受态细胞或者通过电穿孔(参阅如Sambrook et al.，1989)。在无尿嘧啶和/或色氨酸的培养基上选择转化体并且在相同的培养基上进行划线纯化。
分别用载体pESC-URA-PAL(实施例2)和pESC-URA-PAL-C4H(实施例3)转化酿酒酵母菌株CEN.PK 113-5D(MATa ura3)，分别得到菌株FSSC-PAL和菌株FSSC-PALC4H。用pESC-URA-PAL-C4H和pESC-TRP-4CL(实施例4)共转化酿酒酵母菌株FS01267(MATa trp1ura3)，将转化的菌株命名为FSSC-PALC4H4CL。还用pESC-URA-PAL-C4H和pESC-TRP-4CL-VST(实施例5)共转化相同的菌株，得到菌株FSSC-PALC4H4CLVST。
实施例10
使用TAL、4CL和VST在酿酒酵母中表达通向白藜芦醇的途径
分别用载体pESC-URA-TAL(实施例6)转化酿酒酵母菌株CEN.PK113-5D(MATa ura3)，得到菌株FSSC-TAL。用pESC-URA-TAL(实施例6)和pESC-TRP-4CL(实施例4)共转化酿酒酵母菌株FS01267(MATa trp1 ura3)，将转化的菌株命名为FSSC-TAL4CL。还用pESC-URA-TAL和pESC-TRP-4CL-VST(实施例5)共转化相同的菌株，得到菌株FSSC-TAL4CLVST。在无尿嘧啶和/或色氨酸的培养基上选择转化体并在同样的培养基上划线纯化。
实施例11
使用过表达的内源性CPR在酿酒酵母中表达通向白藜芦醇的途径
用载体pESC-URA-PAL-C4H(实施例3)、pESC-TRP-4CL(实施例4)和pESC-LEU-CPR1(实施例7)共转化酿酒酵母菌株FS01277(MATa  ura3 leu2 trp1)。转化的菌株命名为FSSC-PALC4H4CLVSTCPR。在无尿嘧啶和/或色氨酸的培养基上选择转化体并在同样的培养基上划线纯化。
实施例12
使用过表达的拟南芥CPR(AR2)在酿酒酵母中表达通向白藜芦醇的途径
用载体pESC-URA-PAL-C4H(实施例3)、pESC-TRP-4CL(实施例4)和pESC-LEU-AR2(实施例8)共转化酿酒酵母菌株FS01277(MATa ura3 leu2 trp1)。转化的菌株命名为FSSC-PALC4H4CLVSTAR2。在无尿嘧啶和/或色氨酸的培养基上选择转化体并在同样的培养基上划线纯化。
实施例13
在摇瓶中用重组酵母菌株进行发酵
用无菌接种环从琼脂平板中接种重组酵母菌株并在200ml确定成分的矿物培养基(Verduyn et al，1992)中培养，所述培养基含有维生素、微量元素、5g/l葡萄糖和40g/l或100g/l半乳糖。将500ml塞好的摇瓶在30℃以160rpm孵育3天。
实施例14
白藜芦醇的提取
通过5000g离心5分钟来收集细胞。将50ml上清液等分试样用20ml乙酸乙酯萃取一次。将乙酸乙酯冻干并将干产物重新溶于0.7ml甲醇并过滤至HPLC管中。将来自200ml培养基的细胞沉淀溶解在1-2ml水中，并分装在3个fastprep管中，用玻璃珠破碎。将来自三个管的粗提物合并在50ml sartorius管中的10ml 100％甲醇中，在暗冷室内于4℃在旋转室(rotary chamber)上提取48小时。48小时后，以5000g离心5分钟除去细胞碎片，并通过冻干过夜而除去甲醇。将干燥的残余物重新溶于1ml pH 5.4的磷酸-柠檬酸缓冲液中，并加入10单位来自杏仁的β-葡糖苷酶(Sigma)，以从推定的葡糖苷结合形式中释放白藜芦醇。在37℃下孵育该混合物3小时，随后用1ml的乙酸乙酯萃取2次。将合并的乙酸乙酯冻干，将干燥的残余物重新溶于0.7ml甲醇中，并过滤至HPLC管中。
实施例15
白藜芦醇的分析
薄层层析
开发了基于薄层层析的方法用于快速筛选分析，所述方法能够在同一TLC-板上快速分开肉桂酸、香豆酸和白藜芦醇。用500微升乙酸乙酯提取1ml含有细胞和上清液的培养物等分试样，并且用微型离心机以13000rpm离心30秒。干燥乙酸乙酯并重新溶于甲醇。在含有荧光指示剂的Silica G板(0.2mm Alugram SIL G/UV254，Macherey-Nagel)上分析该提取物。流动相为氯仿、乙酸乙酯和甲酸(25∶10∶1)的混合物。
HPLC
为了定量分析肉桂酸、香豆酸和白藜芦醇，通过高效液相层析(HPLC)Agilent Series 1100系统(Hewlett Packard)分离样品，然后在λ＝306nm处用uv-二极管阵列进行检测。以40℃应用Phenomenex(Torrance，CA，USA)Luna 3微米C18(100×2.00mm)柱。使用梯度乙腈和milliq水(两者都含有50ppm三氟乙酸)作为流动相，流量为0.4ml/min。在20分钟中，梯度谱从15％乙睛至100％乙睛呈线性分布。洗脱时间对于香豆酸约为3.4分钟，对于游离的反式白藜芦醇约为5.5分钟，对于肉桂酸约为6.8分钟。纯白藜芦醇标准品购自Caymanchemical company，而纯香豆酸和肉桂酸标准品购自Sigma。
结果
如实施例13中所述，在100g/l半乳糖上培养菌株FSSC-PALC4H4CLVST和FSSC-TAL4CLVST，并根据实施例14和15分析它们的胞内白藜芦醇含量。此外，把仅含有空载体pESC-URA和pESC-TRP的对照菌株FSSC-对照包括在内。HPLC分析显示菌株FSSC-PALC4H4CLVST和FSSC-TAL4CLVST含有保留时间为5.5分钟的组分，这与反式白藜芦醇一致(图4)。还通过UV吸收光谱证实了该结果，所述光谱与纯反式白藜芦醇的吸收光谱(图5)相似，其λmax约为306nm。因此，所述结果证明在酿酒酵母中存在活跃的苯丙素途径，所述途径引起在体内产生反式白藜芦醇。通过在分批和连续培养中在明确规定的培养条件下培养菌株和/或优化各个酶的表达/活性，很有可能改善白藜芦醇的产生。
实施例16
构建用于在大肠杆菌中表达TAL的细菌载体
通过PCR从质粒pESC-URA-TAL(实施例6)上再扩增如实施例1所述分离的编码TAL的基因，其中使用正向引物5′-CCG CTCGAG CGGATGACC CTG CAA TCT CAAACA GCT AAA G-3′SEQ ID NO 33和反向引物5′-GC GGATCC TTA AGC AGG TGG ATC GGC AGC T-3′SEQID NO 34，它们的5’突出端中分别含有限制性位点XhoI和BamHI。在基因的5’和3’末端引入限制性位点允许将限制性PCR产物连接进经XhoI和BamHI消化的pET16b载体(Novagen)，从而产生pET16b-TAL。pET16b载体含有氨苄青霉素抗性基因和T7启动子。因此，以上方案产生具有抗生素选择标记的载体，其含有在T7启动子控制下的编码TAL的基因。通过对一个pET16b-TAL克隆进行测序来确认编码TAL的基因的序列。
实施例17
构建用于在大肠杆菌中表达4CL和VST的细菌载体
用限制性酶BamHI和XhoI从经消化的质粒pESC-TRP-4CL-VST(实施例5)中切下如实施例1所述分离的编码VST的基因，所述质粒含有编码4CL和VST的基因。将VST基因连接进含有卡那霉素抗性基因的pET26b载体(Novagen)，用BamHI和SalI消化得到pET26b-VST。限制性酶XhoI和SalI具有相容性末端，这使得可以实现正确的连接。pET26b载体含有卡那霉素抗性基因和T7启动子。因此，上述方案产生具有抗生素选择标记的载体，其含有在T7启动子控制下的编码VST的基因。通过PCR从质粒pESC-URA-4CL-VST(实施例5)上再扩增如实施例1所述分离的编码4CL的基因，其中使用正向引物5′-TG CCATGG CAATGGCGCCAC AAGAACAAGC AGTTT-3′SEQ ID NO 35和反向引物5′-GC GGATCC CCT TCA CAA TCC ATT TGC TAG TTT TGCC-3′SEQID NO 36，它们的5’突出端中分别含有限制性位点NcoI和BamHI。在基因的5’和3’末端引入限制性位点允许将限制性PCR产物连接进经NcoI和BamHI消化的pET16b载体(Novagen)。得到的质粒pET16b-4CL含有在T7启动子控制下的编码4CL的基因。通过PCR从质粒pET16b-4CL上以一个片段扩增T7启动子和编码4CL的基因，其中使用正向引物5′-TTGCGGCCGC AAATCTCGATCC CGC GAA ATT AATACG-3′SEQ TDNO 37和反向引物5′-CG CTCGAG CCT TCA CAA TCC ATT TGC TAGTTT TGCC-3′SEQ ID NO 38，它们的5’突出端中分别含有限制性位点NotI和XhoI。在所述DNA片段的5’和3’末端引入限制性位点允许将限制性PCR产物连接进质粒pET26b-VST，所述质粒在连接前用NotI和XhoI消化。得到的质粒pET26b-VST-4CL含有两个基因4CL和VST，每一个均在单独的T7启动子控制之下。
实施例18
使用TAL、4CL和VST在大肠杆菌中表达通向白藜芦醇的途径
根据本领域公知的方法进行细菌细胞的转化，例如通过使用感受态细胞或者通过电穿孔(参阅如Sambrook et al.，1989)。用两种载体pET16b-TAL(实施例16)和pET26b-VST-4CL(实施例17)共转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)(Novagen)，得到菌株FSEC-TAL4CLVST。另外，用两种空载体pET16b(Novagen)和pET26b(Novagen)共转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，得到作为对照菌株的菌株FSEC-对照。在含有100μg/ml的氨苄青霉素和60μg/ml的卡那霉素的Luria-Bertani(LB)培养基上选择转化体。
实施例19
在摇瓶中用重组大肠杆菌菌株进行发酵
在玻璃管中，以160rpm和37℃在含有100μg/ml氨苄青霉素和60μg/ml卡那霉素的7ml LB培养基中培养大肠杆菌BL21(DE3)的预培养物。以指数生长的预培养物接种含有200ml LB培养基的500ml带挡板的摇瓶，并以160rpm和37℃孵育，所述培养基中补充了50g/l葡萄糖、5g/lK2HPO4、80μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素。5小时后，加入终浓度1mM的异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)，作为三种基因TAL、4CL和VST中每种基因之前的T7启动子的诱导物。在37℃下孵育48小时后，收集细胞、进行分离方案并分析所产生的白藜芦醇的存在情况。
实施例20
提取和分析大肠杆菌中的白藜芦醇
利用如实施例14和15所述的方法进行提取和分析。
结果
如实施例19所述在50g/l葡萄糖上培养菌株FSEC-TAL4CLVST和FSEC-对照，并按照实施例14和15分析其胞内白藜芦醇含量。HPLC分析显示菌株FSEC-TAL4CLVST的确含有一种数量可观的组分，其保留时间为3.4分钟，与香豆酸一致(图6)。然而，该提取物中不含有与反式白藜芦醇在相同时间洗脱的组分。因此，该结果表明酪氨酸解氨酶(TAL)实际上是有活性的，但是并没有引起产生可检测量的白藜芦醇。然而，未形成白藜芦醇可能是由于：i)香豆酸CoA连接酶(4CL)无功能；ii)白藜芦醇合酶(VST)无功能；iii)香豆酸水平过低，而这些是由非最佳培养条件、非最佳TAL表达/活性或由香豆酸向其他产物的支化导致的。为评估所述假说，在与实施例19所述相似但含有20mg/l香豆酸的培养基上培养菌株。其后对FSEC-TAL4CLVST提取物的HPLC分析确实显示在与反式白藜芦醇相同的保留时间附近有一串峰，而这在FS-对照的提取物中却没有观察到(图6)。实际上，保留时间为5.5分钟的峰的UV吸收光谱与纯反式白藜芦醇的光谱相似(图7)，而对照菌株中的峰却没有获得这样的光谱。因此，所述结果强烈提示在大肠杆菌中存在活跃的苯丙素途径，所述途径可引起产生白藜芦醇。通过在分批和连续培养中在明确规定的培养条件下培养菌株和/或优化各个酶的表达/活性，很有可能无需添加香豆酸而实现白藜芦醇生产。
实施例21
构建用于在乳酸乳球菌中表达PAL和C4H的细菌载体
以下实施例中使用的质粒pSH71和其衍生物为双功能性穿梭载体，具有来自大肠杆菌和乳酸乳球菌的多个复制起点。由此，宿主范围特异性涵盖了大肠杆菌和其它的乳酸菌物种。虽然在乳酸乳球菌中实施转化通常不会遇到问题，但是可以通过使用大肠杆菌作为构建重组质粒的中间宿主来克服推测在其它乳酸菌物种中存在的转化困难。所述质粒含有一种或多种标记基因，以允许从不带有它们的微生物中挑选出带有它们的微生物。用于乳酸乳球菌的选择系统基于显性标记，例如对红霉素和氯霉素的抗性，但是也已描述了基于涉及碳水化合物代谢的基因、肽酶和食品分级标记的系统。另外，所述质粒含有允许重组基因表达的启动子和终止子序列。合适的启动子取自乳酸乳球菌的基因，例如lacA。此外，所述质粒含有合适的独特限制性位点，以便于克隆DNA片段和随后对重组体进行鉴定。在以下实施例中，所述质粒含有或红霉素抗性基因(称为pSH71-ERYr)或氯霉素抗性基因(称为pSH71-CMr)。
使用5’突出端中含有适当限制性位点的正向和反向引物，通过PCR从质粒pESC-URA-PAL-C4H(实施例3)上再扩增如实施例1所述分离的编码PAL的基因。在基因的5’和3’末端引入所述限制性位点允许将限制性PCR产物连接进经消化的pSH71-ERYr载体，所述载体含有来自乳酸乳球菌的lacA启动子。得到的质粒pSH71-ERYr-PAL含有在来自乳酸乳球菌的lacA启动子控制下的编码PAL的基因。使用5’突出端中舍有适当限制性位点的正向和反向引物，通过PCR从质粒pESC-URA-PAL-C4H(实施例3)上再扩增如实施例1所述分离的编码C4H的基因。在基因的5’和3’末端引入所述限制性位点允许将限制性PCR产物连接进经消化的pSH71-CMr载体，得到pSH71-CMr-C4H。使用5’突出端中含有适当限制性位点的正向和反向引物，通过PCR从质粒pSH71-CMr-C4H上以一个片段再扩增lacA启动子和编码C4H的基因。在所述DNA片段的5’和3’末端引入所述限制性位点允许将限制性PCR产物连接进经消化的质粒pSH71-ERYr-PAL。得到的质粒pSH71-ERYr-PAL-C4H含有编码PAL和C4H的基因，每个基因均在各自lacA启动子的控制下。通过对两个不同的pSH71-ERYr-PAL-C4H克隆进行测序来确认编码PAL和C4H的基因的序列。
实施例22
构建用于在乳酸乳球菌中表达TAL的细菌载体
使用5’突出端中含有适当限制性位点的正向和反向引物，通过PCR从质粒pESC-URA-TAL(实施例6)上再扩增如实施例1所述分离的编码TAL的基因。在基因的5’和3’末端引入所述限制性位点允许将限制性PCR产物连接进经消化的pSH71-ERYr载体。得到的质粒pSH71-ERYr-TAL含有在来自乳酸乳球菌的lacA启动子控制下的编码TAL的基因。通过对两个不同的pSH71-ERYr-TAL克隆进行测序来确认编码TAL的基因的序列。
实施例23
构建用于在乳酸乳球菌中表达4CL和VST的细菌载体
使用5’突出端中含有适当限制性位点的正向和反向引物，通过PCR从质粒pESC-TRP-4CL-VST(实施例5)上再扩增如实施例1所述分离的编码4CL的基因。在基因的5’和3’末端引入所述的限制性位点允许将限制性PCR产物连接进经消化的pSH71-CMr载体。得到的质粒pSH71-CMr-4CL含有在来自乳酸乳球菌的lacA启动子控制下的编码4CL的基因。使用5’突出端中含有适当限制性位点的正向和反向引物，通过PCR从质粒pESC-TRP-4CL-VST(实施例5)上再扩增如实施例1所述分离的编码VST的基因。在基因的5’和3’末端引入所述限制性位点允许将限制性PCR产物连接进经消化的pSH71-ERYr载体。得到的质粒pSH71-ERYr-VST含有在来自乳酸乳球菌的lacA启动子控制下的编码VST的基因。使用5’突出端中含有适当限制性位点的正向和反向引物，通过PCR从质粒pSH71-ERYr-VST上以一个片段再扩增lacA启动子和编码VST的基因。在所述DNA片段的5’和3’末端引入所述限制性位点允许将限制性PCR产物连接进经消化的质粒pSH71-CMr-4CL。得到的质粒pSH71-CMr-4CL-VST含有编码4CL和VST的基因，每个基因均在各自lacA启动子的控制下。通过对两个不同的pSH71-CMr-4CL-VST克隆进行测序来确认编码4CL和VST的基因的序列。
实施例24
在乳酸乳球菌中表达通向白藜芦醇的途径
分别或者组合使用实施例21、22和23所述载体转化乳酸乳球菌菌株。根据本领域公知的方法进行细菌细胞的转化，例如通过使用感受态细胞或者通过电穿孔(参阅如Sambrook et al.，1989)。在含有抗生素红霉素和氯霉素的培养基上选择转化体并在同样的培养基上划线纯化。
分别使用载体pSH71-ERYr-TAL(实施例22)转化乳酸乳球菌菌株MG1363，得到菌株FSLL-TAL；使用pSH71-ERYr-PAL-C4H(实施例21)进行转化，得到菌株FSLL-PALC4H；使用pSH71-CMr-4CL-VST(实施例23)进行转化，得到菌株FSLL-4CLVST。此外，使用pSH71-ERYr-TAL(实施例22)和pSH71-CMr-4CL-VST(实施例23)共转化乳酸乳球菌菌株MG1363，转化的菌株命名为FSLL-TAL4CLVST。还使用pSH71-ERYr-PAL-C4H(实施例21)和pSH71-CMr-4CL-VST(实施例23)共转化同一菌株，得到菌株FSLL-PALC4H4CLVST。
实施例25
在发酵罐中用重组乳酸乳球菌菌株进行发酵
可以在以分批、补料分批或者恒化培养方式运转的发酵罐中培养所述重组酵母菌株。
分批和补料分批培养
在带挡板的生物反应器中以1.5升的工作体积在厌氧、需氧或者微量需氧条件下培养所述微生物。以30℃和350rpm孵育所有的培养物。通过自动添加10 M KOH来维持恒定的pH 6.6。在确定成分的MS10培养基中的乳糖上培养细胞以允许其在需氧条件下生长，所述培养基中补充了MnSO4(1.25×10-5g/l)，硫胺素(1mg/l)和DL-6，8-硫辛酸(2.5mg/l)。乳糖浓度为例如50g/l。用预培养物的细胞接种生物反应器，所述预培养物在30℃下在摇瓶中以3倍浓度K2HPO4和KH2PO4缓冲的上述培养基上培养。通过在接种前以N2(99.998％纯度)冲刷培养基和在培养期间维持通过生物反应器顶部空间的50ml/分钟的N2恒流来确保厌氧条件。用于微量需氧和需氧培养的生物反应器装备了用空气(DOT，100％)和N2(DOT，0％)校准的极谱氧气传感器。通过以1vvm的速率向生物反应器喷射空气以确保DOT高于80％来获得需氧条件。在微量需氧试验期间，通过以0.25vvm的速率向生物反应器喷射气体使DOT保持恒定为5％，所述气体由N2和大气的混合物组成。
恒化培养
在恒化培养中，可以在例如1L工作体积的Applikon实验发酵罐中以30℃和350rpm培养所述细胞。稀释速率(D)可设定为不同的值，例如0.050h-1、0.10h-1、0.15h-1或0.20h-1。采用补充有防沫剂(50μl/l)的上述培养基，通过自动添加5M的KOH来保持pH恒定，例如pH 6.6。乳糖浓度可设定为不同的值，例如3.0g/l、6.0g/l、12.0g/l、15.0g/l或者18.0g/l。接种生物反应器，使其初始生物量浓度为1mg/l，并且在指数生长期结束时打开给料泵。通过向生物反应器的顶部导入50ml/分钟的N2(99.998％纯度)来获得厌氧稳态。通过以250ml/分钟的速率向生物反应器喷射由N2(99.998％纯度)和大气以不同比例组成的气体，可以获得不同的缺氧稳态。通过向生物反应器喷射空气(100％DOT)和N2(0％DOT)来校准氧电极。对于所有的条件，气体在导入生物反应器之前都要经过无菌过滤。将废气导向通过冷却至低于-8℃的冷凝器，并使用声学气体分析器分析其CO2和O2体积含量。在至少5个停留时间之后，如果在最近的两个停留时间内生物量和发酵终产物的浓度保持不变(相对差小于5％)，则认为培养处于稳态。
实施例26
提取和分析乳酸乳球菌中的白藜芦醇
使用如实施例14和15所述的方法进行提取和分析。
实施例27
构建用于在属于曲霉属的物种中表达PAL和C4H的真菌载体
以下实施例中使用的质粒来自pARp1，其含有来自构巢曲霉的AMA1起始复制序列，所述序列在黑曲霉和米曲霉中也支持自主质粒复制(Gemset al.，1991)。此外，所述质粒为穿梭载体，含有大肠杆菌的复制序列，因此通过使用大肠杆菌作为构建重组质粒的中间宿主可以克服其在黑曲霉和米曲霉中固有的转化困难。所述质粒含有一种或多种标记基因，以允许从不带有它们的微生物中挑选出带有它们的微生物。所述选择系统可以基于显性标记，例如对潮霉素B、腐草霉素和博来霉素的抗性，或者可以为异源性标记，例如氨基酸和pyrG基因。此外，所述质粒含有允许重组基因表达的启动子和终止子序列。合适的启动子取自构巢曲霉基因，如alcA、glaA、amy、niaD和gpdA。此外，所述质粒含有合适的独特限制性位点，以便于克隆DNA片段和随后对重组体进行鉴定。以下实施例中使用的质粒含有强组成型gpdA-启动子和营养缺陷型标记，均来自构巢曲霉；含有涉及甲硫氨酸生物合成的基因methG的质粒被称为pAMA1-MET；含有涉及组氨酸生物合成的基因hisA的质粒被称为pAMA1-HIS。
使用5’突出端中含有适当限制性位点的正向和反向引物，通过PCR从质粒pESC-URA-PAL-C4H(实施例3)上再扩增如实施例1所述分离的编码PAL的基因。在基因的5’和3’末端引入所述限制性位点允许将限制性PCR产物连接进经消化的pAMA1-MET载体，其含有来自构巢曲霉的gpdA启动子。得到的质粒pAMA1-MET-PAL含有在来自构巢曲霉的gpdA启动子控制下的编码PAL的基因。使用5’突出端中含有适当限制性位点的正向和反向引物，通过PCR从质粒pESC-URA-PAL-C4H(实施例3)上再扩增如实施例1所述分离的编码C4H的基因。在基因的5’和3’末端引入所述限制性位点允许将限制性PCR产物连接进经消化的pAMA1-HIS载体，得到pAMA1-HIS-C4H。使用5’突出端中含有适当限制性位点的正向和反向引物，通过PCR从质粒pAMA1-HIS-C4H上以一个片段再扩增gpdA启动子和编码C4H的基因。在所述DNA片段的5’和3’末端引入所述限制性位点允许将限制性PCR产物连接进经消化的质粒pAMA1-MET-PAL。得到的质粒pAMA1-MET-PAL-C4H含有编码PAL和C4H的基因，每个基因均在各自来自构巢曲霉的pgdA启动子控制之下。通过对两个不同的pAMA1-MET-PAL-C4H克隆进行测序来确认编码PAL和C4H的基因的序列。
实施例28
构建用于在属于曲霉属的物种中表达TAL的真菌载体
使用5’突出端中含有适当限制性位点的正向和反向引物，通过PCR从质粒pESC-URA-TAL(实施例6)上再扩增如实施例1所述分离的编码TAL的基因。在基因的5’和3’末端引入所述限制性位点允许将限制性PCR产物连接进经消化的pAMA1-MET载体。得到的质粒pAMA1-MET-TAL含有在来自构巢曲霉的gpdA启动子控制下的编码TAL的基因。通过对两个不同的pAMA1-MET-TAL克隆进行测序来确定编码TAL的基因的序列。
实施例29
构建用于在属于曲霉属的物种中表达4CL和VST的真菌载体
使用5’突出端中含有适当限制性位点的正向和反向引物，通过PCR从质粒pESC-TRP-4CL-VST(实施例5)上再扩增如实施例1所述分离的编码4CL的基因。在基因的5’和3’末端引入所述限制性位点允许将限制性PCR产物连接至经消化的pAMA1-HIS载体，其含有来自构巢曲霉的gpdA启动子。得到的质粒pAMA1-HIS-4CL含有在来自构巢曲霉的gpdA启动子控制下的编码4CL的基因。使用5’突出端中含有适当限制性位点的正向和反向引物，通过PCR从质粒pESC-TRP-4CL-VST(实施例5)上再扩增如实施例1所述分离的编码VST的基因。在基因的5’和3’末端引入所述限制性位点允许将限制性PCR产物连接进经消化的pAMA1-MET载体，得到pAMA1-MET-VST。使用5’突出端中含有适当限制性位点的正向和反向引物，通过PCR从质粒pAMA1-MET-VST上以一个片段再扩增gpdA启动子和编码VST的基因。在所述DNA片段的5’和3’末端引入所述限制性位点允许将限制性PCR产物连接进经消化的质粒pAMA1-HIS-4CL。得到的质粒pAMA1-HIS-4CL-VST含有编码4CL和VST的基因，每个基因均在各自来自构巢曲霉的pgdA启动子控制之下。通过对两个不同的pAMA1-HIS-4CL-VST克隆进行测序来确认编码4CL和VST的基因的序列。
实施例30
在黑曲霉中表达通向白藜芦醇的途径
分别或组合使用实施例27、28和29中所述的载体转化黑曲霉菌株。按照本领域公知的方法进行真菌细胞的转化，例如电穿孔或者接合(参阅如Sambrook et al.，1989)。在无甲硫氨酸和/或组氨酸的基本培养基上挑选转化体。
分别用以下载体转化组氨酸和甲硫氨酸营养缺陷型黑曲霉菌株，例如菌株FGSC A919(参阅http://www.fgsc.net)：载体pAMA1-MET-TAL(实施例28)，得到菌株FSAN-TAL；载体pAMA1-MET-PAL-C4H(实施例27)，得到菌株FSAN-PALC4H；载体pAMA1-HIS-4CL-VST(实施例29)，得到菌株FSAN-4CLVST。此外，用pAMA1-MET-TAL(实施例28)和pAMA1-HIS-4CL-VST(实施例29)共转化黑曲霉菌株FGSC A919，转化的菌株称为FSAN-TAL4CLVST。还用pAMA1-MET-PAL-C4H(实施例27)和pAMA1-HIS-4CL-VST(实施例29)共转化同一菌株，得到菌株FSAN-PALC4H4CLVST。
实施例31
在米曲霉中表达通向白藜芦醇的途径
用载体pAMA1-MET-VST(实施例29)转化米曲霉菌株，产生菌株FSAO-VST，所述米曲霉菌株含有一组编码PAL、C4H和4CL的天然基因(Seshime et al.，2005)，并且为甲硫氨酸营养缺陷型。根据本领域公知的方法进行真菌细胞的转化，例如电穿孔或者接合(参阅如Sambrook etal.，1989)。在无甲硫氨酸的基本培养基上选择转化体。
实施例32
在发酵罐中用黑曲霉和米曲霉重组菌株进行发酵
可以在以分批、补料分批或者恒化培养方式运作的发酵罐中培养所述重组酵母菌株。
分批和补料分批培养
在带挡板的生物反应器中以1.5升的工作体积在需氧条件下培养所述微生物。以30℃500 rpm孵育全部培养物。通过自动添加10 M KOH维持恒定的pH 6.0，并且通过向生物反应器以1vvm的速率喷射空气来确保DOT高于80％，以获得需氧条件。在由以下组分组成的确定成分培养基中的葡萄糖上培养细胞，以允许在分批培养中进行培养：7.3g/l(NH4)2SO4、1.5g/l KH2PO4、1.0g/l MgSO4.7H2O、1.0g/l NaCl、0.1g/l CaCl2.2H2O、0.1ml/l Sigma防沫剂、7.2mg/l ZnSO4.7H2O、1.3mg/lCuSO4.5H2O、0.3mg/l NiCl2.6H2O、3.5mg/l MnCl2.4H2O和6.9mg/l FeSO4.7H2O。葡萄糖浓度为例如10、20、30、40或50g/l。为了允许在补料分批培养中进行培养，在分批阶段中培养基由以下组分组成：7.3g/l(NH4)2SO4、4.0g/lKH2PO4、1.9g/l MgSO4.7H2O、1.3g/l NaCl、0.10g/l CaCl2.2H2O、0.1ml/lSigma防沫剂、7.2 mg/lZnSO4.7H2O、1.3mg/l CuSO4.5H2O、0.3mg/lNiCl2.6H2O、3.5mg/l MnCl2.4H2O和6.9mg/l FeSO4.H2O。随后向反应器中补充如285g/kg葡萄糖和42g/kg(NH4)2SO4。用来自预分批的游离菌丝体接种分批和补料分批培养物。用2.109个孢子/l浓度的孢子接种pH 2.5的预分批培养物。通过在29g稻中繁殖冻干孢子来获得孢子，在所述稻中补充了以下组分：6ml15g/l蔗糖、2.3g/l(NH4)2SO4、1.0g/l KH2PO4、0.5g/l MgSO4.7H2O、0.50g/l NaCl、14.3mg/lZnSO4.7H2O、2.5mg/CuSO4.5H2O、0.50mg/l NiCl2.6H2O和13.8mg/l FeSO4.7H2O。以30℃繁殖孢子7-14天，以在稻粒上产生黑色孢子层，并且通过加入100ml无菌水中的0.1％Tween 20来收集孢子。对于所有条件而言，气体在导入生物反应器之前均经过无菌过滤。引导废气通过冷却至低于-8℃的冷凝器，并使用声学气体分析器分析其CO2和O2体积含量。
恒化培养
在恒化培养中，可以以30℃和500rpm在例如1.5L工作体积的Biostat B实验室发酵罐中培养细胞。通过自动添加10 M KOH保持恒定的pH 6.0，并通过以1vvm的速率向生物反应器喷射空气来确保DOT高于80％，以获得需氧条件。稀释速率(D)可设置为不同的值，例如0.050h-1、0.10h-1、0.15h-1或0.20h-1。通过自动添加10 M KOH来保持pH恒定，例如pH6.6，使用含有以下组分的基本生长培养基：2.5g/l(NH4)2SO4、0.75g/l KH2PO4、1.0g/l MgSO4.7H2O、1.0g/l NaCl、0.1g/l CaCl2.2H2O、0.1ml/lSigma防沫剂、7.2mg/l ZnSO4.7H2O、1.3mg/l CuSO4.5H2O、0.3mg/lNiCl2.6H2O、3.5mg/l MnCl2.4H2O和6.9mg/l FeSO4.7H2O。葡萄糖浓度可以设置为不同的值，例如3.0g/l、6.0g/l、12.0g/l、15.0g/l或者18.0g/l。用来自上所述预分批培养的游离菌丝体接种生物反应器，并且在指数生长期结束时开启给料泵。对于所有条件，气体在引入生物反应器之前均经过无菌过滤。引导废气通过冷却至低于-8℃的冷凝器，并使用声学气体分析器分析其CO2和O2体积含量。在至少5个停留时间之后，如果在最近的两个停留时间内葡萄糖生物量的浓度和废气的组成保持不变(相对差小于5％)，则认为培养处于稳态。
实施例33
提取和分析黑曲霉和米曲霉中的白藜芦醇
采用如实施例14和15中所述的方法进行提取和分析。
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以下是对在本文中出现的核苷酸和氨基酸序列的总结：
SEQ ID NO：1是来自拟南芥的核苷酸序列，编码苯丙氨酸解氨酶(PAL2)。
SEQ ID NO：2是由SEQ ID NO：1编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3是来自拟南芥的核苷酸序列，编码肉桂酸4-羟化酶(C4H)。
SEQ ID NO：4是由SEQ ID NO：3编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5是来自拟南芥的核苷酸序列，编码4-香豆酸：辅酶A连接酶(4CL1)。
SEQ ID NO：6是由SEQ ID NO：5编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7是来自圆叶大黄的核苷酸序列，编码白藜芦醇合酶(VST)。
SEQ ID NO：8是由SEQ ID NO：7编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9是来自圆叶大黄的核苷酸序列，编码白藜芦醇合酶(VST)，其经密码子优化用于在酿酒酵母中表达。
SEQ ID NO：10是由SEQ ID NO：9编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11是来自荚膜红细菌的核苷酸序列，编码酪氨酸解氨酶(TAL)。
SEQ ID NO：12是由SEQ ID NO：11编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：13是来自荚膜红细菌的核苷酸序列，编码酪氨酸解氨酶(TAL)的，其经密码子优化用于在酿酒酵母中表达。
SEQ ID NO：14是由SEQ ID NO：13编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：15是来自酿酒酵母的核苷酸序列，编码NADPH：细胞色素P450还原酶(CPR1)。
SEQ ID NO：16是由SEQ ID NO：15编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：17是来自拟南芥的核苷酸序列，编码NADPH：细胞色素P450还原酶(AR2)。
SEQ ID NO：18是由SEQ ID NO：17编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：19-32是出现在实施例1的表1中的引物序列。
SEQ ID NO：33-34是出现在实施例16中的引物序列。
SEQ ID NO：35-38是出现在实施例17中的引物序列。

Claims (21)

1.产生白藜芦醇的微生物，其具有有效代谢途径，所述途径产生4-香豆酸，并由其产生白藜芦醇或者其寡聚或糖苷结合衍生物，在该途径中4-香豆酸通过L-苯丙氨酸解氨酶和肉桂酸4-羟化酶的作用由L-苯丙氨酸产生，或者通过L-苯丙氨酸解氨酶或酪氨酸解氨酶的作用由酪氨酸产生，在由所述微生物中表达的4-香豆酸CoA连接酶所催化的反应中由所述香豆酸形成4-香豆酰CoA，并且其中白藜芦醇通过在所述微生物中表达的白藜芦醇合酶所催化的反应中由所述4-香豆酰CoA产生，其中内源性丙二酰CoA为底物。
2.根据权利要求1的微生物，其中所述白藜芦醇合酶在所述微生物中由编码所述酶的核酸表达，所述核酸对于该微生物而言是非天然的。
3.根据权利要求1的微生物，其中所述4-香豆酸通过肉桂酸4-羟化酶由反式肉桂酸产生。
4.根据权利要求3的微生物，其中所述肉桂酸4-羟化酶在所述微生物中由编码所述酶的核酸表达，所述核酸对于该微生物而言是非天然的。
5.根据权利要求1的微生物，其中所述酪氨酸解氨酶在所述微生物中由编码所述酶的核酸表达，所述核酸对于该微生物而言是非天然的。
6.根据权利要求1的微生物，其中苯丙氨酸解氨酶在所述微生物中由编码所述酶的核酸表达，所述核酸对于该微生物而言是非天然的。
7.根据权利要求1的微生物，其中已在所述微生物中过表达天然NADPH：细胞色素P450还原酶，或者其中已将NADPH：细胞色素P450还原酶重组引入所述微生物。
8.根据权利要求1的微生物，其中编码酪氨酸解氨酶的遗传序列的至少一个拷贝与表达信号有效连接，所述表达信号在所述生物中不与所述遗传序列天然相关联。
9.根据权利要求1的微生物，其中编码苯丙氨酸解氨酶的遗传序列的至少一个拷贝与表达信号有效连接，所述表达信号在所述生物中不与所述遗传序列天然相关联。
10.根据权利要求1的微生物，其中编码肉桂酸4-羟化酶的遗传序列的至少一个拷贝与表达信号有效连接，所述表达信号在所述生物中不与所述遗传序列天然相关联。
11.根据权利要求1的微生物，其中编码4-香豆酸CoA连接酶的遗传序列的至少一个拷贝与表达信号有效连接，所述表达信号在所述生物中不与所述遗传序列天然相关联。
12.根据权利要求1的微生物，其中编码白藜芦醇合酶的遗传序列的至少一个拷贝与表达信号有效连接，所述表达信号在所述生物体中不与所述遗传序列天然相关联。
13.根据权利要求1的微生物，所述微生物是真菌或者细菌。
14.根据权利要求1的微生物，所述微生物含有编码苯丙氨酸解氨酶并与表达信号有效连接的异源DNA序列的一个或多个拷贝，含有编码肉桂酸-4-羟化酶并与表达信号有效连接的异源DNA序列的一个或多个拷贝，含有编码4-香豆酸CoA-连接酶并与表达信号有效连接的异源DNA序列的一个或多个拷贝，并且含有编码白藜芦醇合酶并与表达信号有效连接的异源DNA序列的一个或多个拷贝。
15.根据权利要求1的微生物，所述微生物无肉桂酸-4-羟化酶活性，并且含有编码酪氨酸解氨酶并与表达信号有效连接的异源DNA序列的一个或多个拷贝，含有编码4-香豆酸CoA-连接酶并与表达信号有效连接的异源DNA序列的一个或多个拷贝，并且含有编码白藜芦醇合酶并与表达信号有效连接的异源DNA序列的一个或多个拷贝。
16.用于产生白藜芦醇或者其寡聚或糖苷结合衍生物的方法，包括使前述权利要求中任一项的微生物细胞与碳底物接触，以由此产生白藜芦醇。
17.根据权利要求16的方法，其中所述碳底物选自由单糖、寡糖和多糖组成的可发酵碳底物。
18.根据权利要求16的方法，其中所述碳底物选自乙醇、乙酸盐、油、乳酸盐和氨基酸组成的不可发酵的碳底物。
19.根据权利要求18的方法，其中所述不可发酵的碳底物选自苯丙氨酸和酪氨酸。
20.产生白藜芦醇或者其寡聚或糖苷结合衍生物的方法，所述方法通过异源表达编码苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸4-羟化酶、4-香豆酸CoA连接酶和白藜芦醇合酶的核苷酸序列来实现，或者通过异源表达编码酪氨酸解氨酶、4-香豆酸CoA连接酶和白藜芦醇合酶的核苷酸序列来实现。
21.根据权利要求16的方法，所述方法还包括使用所产生的白藜芦醇或者其寡聚或糖苷结合衍生物作为乳制品或者饮料中的营养物。
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