CN105018359B - 一种酵母菌的用途及天然对香豆酸的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酵母菌的用途及天然对香豆酸的生产方法，该酵母菌为Rhodotorula sp.OMK‑2，其用于生产天然对香豆酸。天然对香豆酸的生产方法，其是利用酵母菌Rhodotorula sp.OMK‑2，采用微生物发酵法生产。发酵法包括菌种活化、种子培养、发酵、提取等步骤。本发明采用发酵法生产天然对香豆酸，采用天然原料葡萄糖、氨基酸等，经过微生物代谢生成目标产物的一种方法，该工艺属于低温低压，比较安全，操作简单，污染少，是一个安全环保的生产方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种天然对香豆酸的生产方法。
背景技术
对香豆酸，即对羟基肉桂酸，系统命名为3-(4-羟基苯基)-2丙烯酸。淡黄色晶体，熔点214摄氏度，分子量164，溶于醚、热醇和热水，微溶于苯，不溶于石油醚。对香豆酸广泛存在于各种植物蔬菜中，像青椒、胡萝卜、番茄、大蒜中都含有丰富的对香豆酸。
对香豆酸的用途有：
1、医药：可作为药品，对香豆酸对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、大肠杆菌及绿脓杆菌均有不同程度的抑制作用；动物实验证明，对香豆酸不仅降血脂作用，还有阻止胃癌发生，减少粥状动脉硬化发生的作用。
2、农业：在农药行业用于生产植物生长促进剂、长效杀菌剂和果蔬保鲜防腐剂。此外，对羟基肉桂酸还可用于测定铀和饥的化学试剂，用于生产感光树脂的主要原料乙烯塞油挂四。
3、化妆品：对羟基肉桂酸对酪氨酸酶单酚酶和二酚酶活性均有抑制作用，导致单酚酶活力和二酚酶活力下降50％，用在化妆品里面抑制黑色素的生成。
由于对羟基香豆酸的广泛用途，因此，需要有工业化的对羟基香豆酸生产方法以满足市场需求。现有的对羟基香豆酸的生产方法众多，主要方法有：1、提取法：从甘蔗渣和玉米麸皮中提取，该方法虽然提取出来的对羟基香豆酸为天然的，但产率低，成本高；2、对羟基苯甲醛和丙二酸经knoevenagel缩合制得，该方法的主要缺陷在于产品不是天然的，应用场所会受限制，此外，生产过程污染大、成本高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酵母菌的用途及天然对香豆酸的生产方法，以解决现有技术中存在的上述问题。
本发明提供的技术方案如下：
一种酵母菌Rhodotorula rubra OMK-2，从肉桂种植园土壤中筛选出来，该菌已于2015年5月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为湖北省武汉市，武汉大学，保藏号为CCTCC M 2015327。申请人发现该酵母菌菌株具有生产天然对香豆酸的能力，并将其应用于天然对香豆酸的生产。
一种酵母菌Rhodotorula sp.OMK-2的用途，其用于生产天然对香豆酸。
一种天然对香豆酸的生产方法，其是利用酵母菌Rhodotorula sp.OMK-2生产。
一种天然对香豆酸的生产方法，其中，所述的生产方法为微生物发酵法。
一种天然对香豆酸的生产方法，包括如下步骤：
1)在无菌条件下从甘油管中划一满环菌液均匀涂布于固体斜面培养基上，在生化培养箱中于26-30度培养24-48小时；其中，所述的菌液为酵母菌Rhodotorula sp.OMK-2；
固体斜面培养基配方包括如下成分：葡萄糖1.0-3.5％，磷酸二氢钾0.1-1.0％，氯化钠0.05-0.3％，酵母浸粉0.1-1.0％，玉米浆0.1-1.0％；
2)种子培养：在无菌条件下从培养好的固体斜面上用接种铲划一满环长势良好的菌株接入无菌种子培养基中，该种子培养基初始pH 5-8，在培养温度28-35℃，转速200-500rpm的条件下培养菌体到对数生长期；
种子培养基配方包括如下成分：葡萄糖1.0-3.5％、磷酸二氢钾0.1-1.0％、尿素0.1-0.6％、硫酸镁0.05-0.5％、氯化钠0.05-0.3％、酵母浸粉0.1-1.0％和玉米浆0.1-1.0％；
3)、发酵：将培养至对数生长期的种子液在无菌条件下以5-15％的体积比接入发酵培养基；发酵培养基初始pH 6.8-7.2.0，在温度30-40℃，搅拌转速200-500rpm，通气量1:0.5的条件下发酵70-100h；发酵配方包括如下组分：
葡萄糖2.0-5.0％、磷酸二氢钾0.1-0.5％、尿素0.1-0.5％、硫酸镁0.05-0.5％、氯化钠0.05-3％、酵母浸粉0.1-1.0％、硫酸铵0.1-0.5％、酪氨酸1.0-2.0％。
4)提取：从发酵液中提取所需的对香豆酸。
在本发明的较佳实施例中，步骤4)的步骤如下：发酵结束后，发酵液升温，把菌灭活，然后进行陶瓷膜过滤除菌体，膜过滤液用有机溶剂萃取或膜过滤液经过浓缩，然后浓缩液直接用稀酸酸化、低温结晶进行对香豆酸分离提纯。
在本发明的较佳实施例中，所述的升温为升至60-90度。
本发明提供了一种酵母菌，其可用于发酵法生产天然对香豆酸。发酵时采用天然原料葡萄糖、氨基酸等，经过微生物代谢生成目标产物，该工艺低温低压，比较安全，操作简单，污染少，是一个安全环保的生产方法。
附图说明
图1为实施例3的HPLC图，证明所得的产物为对香豆酸。
具体实施方式
1、菌种
从中国海南省海口市肉桂种植园树林下土壤中分离出一株具有天然对香豆酸生产能力的菌株Rhodotorula sp.OMK-2，该菌已于2015年5月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2015327。
该菌细胞卵形，菌落橘黄色，圆形，边缘整齐，表面光滑。可利用葡萄糖、蔗糖、核糖和阿拉伯糖，不能利用L-山梨醇、麦芽糖醇和赤藻糖醇。该菌株的18s rRNA和26s rRNA序列与红酵母标准株的18s rRNA和26s rRNA序列有99％的相似性，该菌鉴定为红酵母属。
2、菌种活化
在无菌条件下从甘油管中划一满环菌液均匀涂布于固体斜面培养基上，在生化培养箱中于26-30度培养24-48小时。固体斜面培养基配方如下：(％)
葡萄糖1.0-3.5、磷酸二氢钾0.1-1.0、氯化钠0.05-0.3、酵母浸粉0.1-1.0、玉米浆0.1-1.0。
3、种子培养
在无菌条件下从培养好的固体斜面上用接种铲划一满环长势良好的菌株接入无菌种子培养基中，该种子培养基初始pH 5-8，在培养温度28-35℃，转速200-500rpm的条件下培养菌体到对数生长期。种子培养基配方如下：(％)
葡萄糖1.0-3.5、磷酸二氢钾0.1-1.0、尿素0.1-0.6、硫酸镁0.05-0.5、氯化钠0.05-0.3、酵母浸粉0.1-1.0、玉米浆0.1-1.0。
4、发酵工艺
将培养至对数生长期的种子液在无菌条件下以10％的体积比接入发酵培养基。发酵培养基初始pH7.0，在温度30-40℃，搅拌转速200-500rpm，通气量1:0.5的条件下发酵70-100h。发酵配方如下：(％)
葡萄糖2.0-5.0、磷酸二氢钾0.1-0.5、尿素0.1-0.5、硫酸镁0.05-0.5、氯化钠0.05-3、酵母浸粉0.1-1.0、硫酸铵0.1-0.5、酪氨酸1.0-2.0。
5、提取工艺
发酵结束后，发酵液升温至80℃把菌灭活，然后进行陶瓷膜过滤除菌体，膜过滤液用有机溶剂(如乙酸乙酯)萃取或膜过滤液经过浓缩，然后浓缩液直接用稀酸酸化低温结晶等方式进行天然对香豆酸分离提纯。
实施例1：天然对香豆酸发酵(三角瓶震荡发酵)
配制种子培养基，其培养基组成如下(g/L)：葡萄糖30，磷酸二氢钾5，尿素4，硫酸镁0.8，氯化钠2.5，酵母浸粉5，玉米浆5，溶剂为水，初始PH7.0。121℃灭菌30min。
配制发酵培养基，其培养基组成如下(g/L)：葡萄糖30，磷酸二氢钾5，尿素5，硫酸镁0.6，酵母浸粉8，硫酸铵3，酪氨酸20，溶剂为水，初始PH7，121℃灭菌30min。
种子的制备：无菌转移低温甘油管Rhodotorula sp.OMK-2菌株于新鲜、无菌固体平板上，30℃活化2天，挑取菌落接种于500ml三角瓶做种子培养，瓶中种子培养基的体积为50ml，摇床转速200rpm，30℃培养24h，得到种子液。
天然对香豆酸的发酵：取配制好的发酵培养基50ml倒入500ml的无菌三角瓶中，然后接入培养好的种子液7.5ml进行发酵，发酵温度33℃，摇床转速220rpm。发酵100h后用HPLC法测定发酵液中天然对香豆酸的浓度为10g/L。
实施例2：天然对香豆酸的发酵(搅拌反应器发酵)
种子培养基、发酵培养基配制同实施例1.
种子的制备：无菌转移低温甘油管Rhodotorula sp.OMK-2菌株于新鲜、无菌固体平板上，30℃活化2天，挑取菌落接种于装有1.8L种子培养基的3L种子罐进行种子培养，通风搅拌转速300rpm，30℃培养24h，得到种子液。
天然对香豆酸的发酵：将配制好的发酵培养基10.2L装入20L发酵罐中，121℃灭菌30min，然后将培养好的1.8L种子液接入20L发酵罐中进行发酵，发酵温度33℃，搅拌转速400rpm，通气比1：0.5。发酵周期90h。发酵结束用HPLC法测定发酵液中天然对香豆酸的浓度为15g/L。
实施例3：天然对香豆酸的提取
取实施例1中的50ml发酵液，水浴升温至80度，保温30min，灭活菌体。发酵液进行5000rpm离心出去菌体，然后用稀酸调节PH至3-5，静止5min，加50ml乙酸乙酯萃取，分层，有机相用旋转蒸发仪把乙酸乙酯悬干得天然对香豆酸成品0.4g。其HPLC图见图1。
实施例4：天然对香豆酸的提取
取实施例2中12L发酵液，60度进行陶瓷膜膜过滤，收集滤液10L。滤液用稀酸调PH3-5，酸化后的膜过滤液静置4h，离心，干燥，最终得到天然对香豆酸127.5g。
Claims (7)
1.一种酵母菌Rhodotorula rubra OMK-2,其菌种保藏号为CCTCC NO: M 2015327。
2.如权利要求1所述的一种酵母菌Rhodotorula rubra OMK-2的用途，其用于生产天然对香豆酸。
3.一种天然对香豆酸的生产方法，其特征在于：其是利用权利要求1所述的酵母菌Rhodotorula rubra OMK-2生产。
4.如权利要求3所述的一种天然对香豆酸的生产方法，其特征在于：所述的生产方法为微生物发酵法。
5.一种天然对香豆酸的生产方法，包括如下步骤：
1)在无菌条件下从甘油管中划一满环菌液均匀涂布于固体斜面培养基上，在生化培养箱中于26-30度培养24-48小时；其中，所述的菌液为权利要求1所述的酵母菌Rhodotorularubra OMK-2；
固体斜面培养基配方包括如下成分：葡萄糖1.0-3.5％，磷酸二氢钾0.1-1.0％，氯化钠0.05-0.3％，酵母浸粉0.1-1.0％，玉米浆0.1-1.0％；
2)种子培养：在无菌条件下从培养好的固体斜面上用接种铲划一满环长势良好的菌株接入无菌种子培养基中，该种子培养基初始pH 5-8，在培养温度28-35℃，转速200-500rpm的条件下培养菌体到对数生长期；
种子培养基配方包括如下成分：葡萄糖1.0-3.5％、磷酸二氢钾0.1-1.0％、尿素0.1-0.6％、硫酸镁0.05-0.5％、氯化钠0.05-0.3％、酵母浸粉0.1-1.0％和玉米浆0.1-1.0％；
3)、发酵：将培养至对数生长期的种子液在无菌条件下以5-15％的体积比接入发酵培养基；发酵培养基初始pH 6.8-7.2，在温度30-40℃，搅拌转速200-500rpm，通气量1:0.5的条件下发酵70-100h；发酵配方包括如下组分：
葡萄糖2.0-5.0％、磷酸二氢钾0.1-0.5％、尿素0.1-0.5％、硫酸镁0.05-0.5％、氯化钠0.05-3％、酵母浸粉0.1-1.0％、硫酸铵0.1-0.5％和酪氨酸1.0-2.0％；
4)提取：从发酵液中提取所需的天然对香豆酸。
6.如权利要求5所述的一种天然对香豆酸的生产方法，其特征在于，步骤4)的步骤如下：发酵结束后，发酵液升温，把菌灭活，然后进行陶瓷膜过滤除菌体，膜过滤液用有机溶剂萃取或膜过滤液经过浓缩，然后浓缩液直接用稀酸酸化、低温结晶进行天然对香豆酸分离提纯。
7.如权利要求6所述的一种天然对香豆酸的生产方法，其特征在于：所述的升温为升至60-90度。
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