CN105087387B - 一株酵母菌及利用其发酵生产天然肉桂酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株酵母菌及利用其发酵生产天然肉桂酸的方法，该酵母菌为Rhodotorula sp.OMK‑1，其用于生产天然肉桂酸。天然肉桂酸的生产方法，其是利用酵母菌Rhodotorula sp.OMK‑1，采用发酵法生产。发酵法包括菌种活化、种子培养、发酵、提取等步骤。本发明采用微生物发酵法生产天然肉桂酸，采用天然原料葡萄糖、氨基酸等，经过微生物代谢生成目标产物的一种方法，该工艺属于低温低压，比较安全，操作简单，污染少，是一个安全环保的生产方法。

Description

一株酵母菌及利用其发酵生产天然肉桂酸的方法
技术领域
本发明涉及一种酵母菌以及天然肉桂酸的生产方法。
背景技术
肉桂酸，又名β-苯丙烯酸、3-苯基-2-丙烯酸。白色至淡黄色粉末，分子量148.17。微有桂皮香气。熔点，133；沸点，300，密度，1.245；折射率1.555(20℃)，溶于乙醇、甲醇；易溶于苯、醋酸、石油醚、二硫化碳及油类，微溶于水。天然肉桂酸主要用于香精香料、食品添加剂、医药工业、美容等方面：
1、香精香料：可作为芳香混合物，用于香皂、香波、洗衣粉、日用化妆品中。
肉桂酸本身就是一种香料，具有很好的保香作用，通常作为配香原料，可使主香料的香气更加清香挥发。肉桂酸的各种酯(如甲、乙、丙、丁等)都可用作定香剂，用于饮料、冷饮、糖果、酒类等食品。
肉桂酸用微生物酶法合成L-苯丙氨酸。L-苯丙氨酸是重要的食品添加剂—甜味阿斯巴甜(Aspartame)的主要原料。
2、食品添加剂：肉桂酸用微生物酶法合成L-苯丙氨酸。L-苯丙氨酸是重要的食品添加剂—甜味阿斯巴甜(Aspartame)的主要原料。英国联合利华在WO 0187080(2001，11.22)中介绍了肉桂酸和巴氏杀菌助剂组成，具有很强的杀菌、防腐作用。利用肉桂酸的防霉防腐杀菌可应用于粮食、蔬菜、水果中的保鲜、防腐。肉桂酸用于蜜饯中，能改善口感风味，尤其是在食品防腐保鲜上，具有无公害的环保防腐剂。替代(苯甲酸钠，山梨酸钾，等产品)还可用在葡萄酒中，使其色泽光鲜。
3、医药工业：可用于合成治疗冠心病的重要药物乳酸可心定和心痛平，及合成氯苯氨丁酸和肉桂苯哌嗪，用来制造“心可安”，局部麻醉剂、杀菌剂、止血药等。还可合成氯苯氨丁酸和肉桂苯哌嗪，用作脊锥骨骼松弛剂和镇痉剂。主要用于脑血栓，脑动脉硬化，冠状动脉硬化等病症。对肺腺癌细胞增殖有明显抑制作用。肉桂酸是A－5491人肺腺癌细胞有效的抑制剂，在抗癌方面具有极大的应用价值。
4、美容方面：酪氨基酸酶是黑色素合成关键酶，它启动了由酪氨酸转化为黑色素生物聚合体的级链反应，肉桂酸有抑制形成酪氨基酸酶的作用，对紫外线有一定的隔绝作用，能使褐斑变浅，甚至消失，是高级防晒霜中必不可少的成分之一。肉桂酸显著的抗氧化功效对于减慢皱纹的出现有很好的疗效。肉桂酸同时还具有很好的保香作用，通常作为配香原料，被用作日化香精中的定香剂。
合成肉桂酸的方法众多，主要合成方法如下：1、Perkin合成法；2、苯甲醛-丙酮法；3、苄叉二氯-无水醋酸钠法。这些方法或流程长，温度高，能耗大，收率低；或副产物多，分离纯化难，污染严重。4、肉桂醛氧化为肉桂酸法，以H2O2(浓度要求为90％～100％属危险品)、NaClO2等无机氧化物为氧化剂进行氧化，需要大量有机溶剂如丙腈、苯等，污染环境，不利于工业化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酵母菌的用途以及天然肉桂酸的生产方法，以解决现有技术中存在的上述问题。
本发明提供的技术方案如下：
本发明提供一种酵母菌Rhodotorula glutinis Harrison OMK-1，其是从肉桂种植园土壤中筛选出来的，该菌已于2015年5月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为湖北省武汉市，武汉大学，保藏号为CCTCC M 2015326。申请人发现该酵母菌菌株具有生产天然肉桂酸的能力，并将其应用于天然肉桂酸的生产。
前述的一种酵母菌Rhodotorula sp.OMK-1的用途，其用于生产天然肉桂酸。
一种天然肉桂酸的生产方法，其特征在于：其是利用酵母菌Rhodotorula sp.OMK-1生产。
一种天然肉桂酸的生产方法，其特征在于：所述的生产方法为发酵。
一种天然肉桂酸的生产方法，包括如下步骤：
1)在无菌条件下从甘油管中划一满环菌液均匀涂布于固体斜面培养基上，在生化培养箱中于26-30度培养24-48小时；其中，所述的菌液为酵母菌Rhodotorula sp.OMK-1；
固体斜面培养基配方包括如下成分：葡萄糖1.0-3.5％，磷酸二氢钾0.1-1.0％，氯化 钠0.05-0.3％，酵母浸粉0.1-1.0％；
2)种子培养：在无菌条件下从培养好的固体斜面上用接种铲划一满环长势良好的菌株接入无菌种子培养基中，该种子培养基初始pH 5-8，在培养温度28-35℃，转速200-500rpm的条件下培养菌体到对数生长期；
种子培养基配方包括如下成分：葡萄糖1.0-3.5％、磷酸二氢钾0.1-1.0％尿素0.1-0.6％硫酸镁0.05-0.5％、氯化钠0.05-0.3％、玉米浆0.1-1.0％、尿素0.1-0.6％、
3)、发酵：将培养至对数生长期的种子液在无菌条件下以5-15％的体积比接入发酵培养基；发酵培养基初始pH 6.8-7.2.0，在温度30-40℃，搅拌转速200-500rpm，通气量1:0.5的条件下发酵70-100h；发酵配方包括如下组分：
葡萄糖2.0-5.0％、磷酸二氢钾0.1-0.5％、尿素0.1-0.5％、硫酸镁0.05-0.5％、氯化钠0.05-3％、酵母浸粉0.1-1.0％、硫酸铵0.1-0.5％、苯丙氨酸1.0-2.0％。
4)提取：从发酵液中提取所需的天然肉桂酸。
在本发明的较佳实施例中，步骤4)的步骤如下：发酵结束后，发酵液升温，把菌灭活，然后进行陶瓷膜过滤除菌体，膜过滤液用有机溶剂萃取或膜过滤液经过浓缩，然后浓缩液直接用稀酸酸化、低温结晶进行天然肉桂酸分离提纯。
在本发明的较佳实施例中，所述的升温为升至60-90度。
本发明采用发酵法生产天然肉桂酸，采用天然原料葡萄糖、氨基酸等，经过微生物代谢生成目标产物的一种方法，该工艺属于低温低压，比较安全，操作简单，污染少，是一个安全环保的生产方法。
附图说明
图1为实施例3中的HPLC图，证明所得的产物为天然肉桂酸
具体实施方式
1、菌种
从中国海南省海口市肉桂种植园树林下土壤中分离出一株具有天然肉桂酸生产能力 的菌株Rhodotorula sp.OMK-1，该菌已于2015年5月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为湖北省武汉市，武汉大学，保藏号为CCTCC M 2015326。
该菌细胞卵形，菌落橘黄色，圆形，边缘整齐，表面光滑。可利用葡萄糖、蔗糖、核糖和阿拉伯糖，不能利用L-山梨醇、麦芽糖醇和赤藻糖醇。该菌株的18s rRNA和26s rRNA序列与红酵母标准株的18s rRNA和26s rRNA序列有99％的相似性，该菌鉴定为红酵母属
2、菌种活化
在无菌条件下从甘油管中划一满环菌液均匀涂布固体斜面培养基上，在生化培养箱中于28～30度培养24～48小时。固体斜面培养基配方如下：(％)
葡萄糖1.0-3.5，磷酸二氢钾0.1-1.0，氯化钠0.05-0.3，酵母浸粉0.1-1.0；
3、种子培养
在无菌条件下从培养好的固体斜面上用接种铲划一满环长势良好的菌株接入无菌种子培养基中，该种子培养基初始PH5～8，在培养温度28～35℃，转速150～500rpm的条件下培养菌体到对数生长期。种子培养基配方如下：(％)
葡萄糖1.0-3.5、磷酸二氢钾0.1-1.0、尿素0.1-0.6、硫酸镁0.05-0.5、氯化钠0.05-0.3、玉米浆0.1-1.0和尿素0.1-0.6
4、发酵工艺
将培养至对数生长期的种子液在无菌条件下以10％的体积比接入发酵培养基。发酵培养基初始PH7.0，在温度30～40℃，搅拌转速200～500rpm，通气量1:0.5的条件下发酵70～120h。发酵配方如下：(％)
葡萄糖2.0-5.0、磷酸二氢钾0.1-0.5、尿素0.1-0.5、硫酸镁0.05-0.5、氯化钠0.05-3酵母浸粉0.1-1.0、硫酸铵0.1-0.5、苯丙氨酸1.0-2.0。
5、提取工艺
发酵结束后，发酵液升温至80℃把菌灭活，然后进行陶瓷膜过滤除菌体，膜过滤液用有机溶剂(如乙酸乙酯)萃取或膜过滤液直接用稀酸酸化结晶等方式进行桂酸分离提纯。
实施例1：天然肉桂酸的生产(三角瓶震荡发酵)
配制种子培养基，其培养基组成如下(g/L)：葡萄糖30，磷酸二氢钾5，尿素4，硫酸镁0.8，氯化钠2.5，玉米浆5，尿素6，溶剂为水，初始PH7.0。121℃灭菌30min。
配制发酵培养基，其培养基组成如下(g/L)：葡萄糖30，磷酸二氢钾5，尿素5，硫酸镁0.6，酵母浸粉8，硫酸铵3，苯丙氨酸30，溶剂为水，初始pH7。121℃灭菌30min。
种子的制备：无菌转移低温甘油管Rhodotorula sp.OMK-1菌株于新鲜、无菌固体平板上，28℃活化2天，挑取菌落接种于500ml三角瓶做种子培养，瓶中种子培养基的体积为50ml，摇床转速180rpm，30℃培养24h，得到种子液。
天然肉桂酸的发酵：取配制好的发酵培养基50ml倒入500ml的无菌三角瓶中，然后接入培养好的种子液7.5ml进行发酵，发酵温度30℃，摇床转速200rpm。发酵100h后用HPLC法测定发酵液中天然肉桂酸的浓度为15g/L。
实施例2：天然肉桂酸的生产(搅拌反应器发酵)
种子培养基、发酵培养基配制同实施例1.
种子的制备：无菌转移低温甘油管Rhodotorula sp.OMK-1菌株于新鲜、无菌固体平板上，28℃活化2天，挑取菌落接种于装有1.8L种子培养基的3L种子罐进行种子培养，通风搅拌转速300rpm，30℃培养24h，得到种子液。
天然肉桂酸的发酵：将配制好的发酵培养基10.2L装入20L发酵罐中，121℃灭菌30min，然后将培养好的1.8L种子液接入20L发酵罐中进行发酵，发酵温度30℃，搅拌转速400rpm，通气比1；0.2。发酵周期110h。发酵结束用HPLC法测定发酵液中天然肉桂酸的浓度为20g/L。
实施例3：天然肉桂酸的提取
取实施案例1中的50ml发酵液，水浴升温至80度，保温30min，灭活菌体。发酵液进行5000rpm离心出去菌体，然后用稀酸调节PH至3～5，静止5min，加50ml乙酸乙酯萃取，分层，有机相用旋转蒸发仪把乙酸乙酯悬干得天然肉桂酸成品0.7g。其HPLC图见图1。
实施例4：天然肉桂酸的提取
取实施例2中12L发酵液，60度进行陶瓷膜膜过滤，收集滤液10L。滤液用稀酸调PH3～5，酸化后的膜过滤液静置4h，离心，干燥，最终得到天然肉桂酸216g。

Claims (7)

1.一种酵母菌Rhodotorula sp.OMK-1，其特征在于：其保藏编号为CCTCC M 2015326。
2.如权利要求1所述的一种酵母菌Rhodotorula sp.OMK-1的用途，其用于生产天然肉桂酸。
3.一种天然肉桂酸的生产方法，其特征在于：其是利用权利要求1所述的酵母菌Rhodotorula sp.OMK-1生产。
4.如权利要求3所述的一种天然肉桂酸的生产方法，其特征在于：所述的生产方法为微生物发酵法。
5.一种天然肉桂酸的生产方法，包括如下步骤：
1)在无菌条件下从甘油管中划一满环菌液均匀涂布于固体斜面培养基上，在生化培养箱中于26-30度培养24-48小时；其中，所述的菌液为酵母菌Rhodotorula sp.OMK-1,其保藏编号为CCTCC M 2015326；
固体斜面培养基配方包括如下成分：葡萄糖1.0-3.5％，磷酸二氢钾0.1-1.0％，氯化钠0.05-0.3％，酵母浸粉0.1-1.0％；
2)种子培养：在无菌条件下从培养好的固体斜面上用接种铲划一满环长势良好的菌株接入无菌种子培养基中，该种子培养基初始pH 5-8，在培养温度28-35℃，转速200-500rpm的条件下培养菌体到对数生长期；
种子培养基配方包括如下成分：葡萄糖1.0-3.5％、磷酸二氢钾0.1-1.0％、尿素0.1-0.6％、硫酸镁0.05-0.5％、氯化钠0.05-0.3％、玉米浆0.1-1.0％、尿素0.1-0.6％；
3)、发酵：将培养至对数生长期的种子液在无菌条件下以5-15％的体积比接入发酵培养基；发酵培养基初始pH 6.8-7.2，在温度30-40℃，搅拌转速200-500rpm，通气量1:0.5的条件下发酵70-100h；发酵培养基配方包括如下组分：
葡萄糖2.0-5.0％、磷酸二氢钾0.1-0.5％、尿素0.1-0.5％、硫酸镁0.05-0.5％、氯化钠0.05-3％、酵母浸粉0.1-1.0％、硫酸铵0.1-0.5％、苯丙氨酸1.0-2.0％；
4)提取：从发酵液中提取所需的天然肉桂酸。
6.如权利要求5所述的一种天然肉桂酸的生产方法，其特征在于，步骤4)的步骤如下：发酵结束后，发酵液升温，把菌灭活，然后进行陶瓷膜过滤除菌体，膜过滤液用有机溶剂萃取或膜过滤液经过浓缩，然后浓缩液直接用稀酸酸化、低温结晶进行天然肉桂酸分离提纯。
7.如权利要求6所述的一种天然肉桂酸的生产方法，其特征在于：所述的升温为升至60-90度。
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