CN108251311A - 一种可以将根皮苷转化为根皮素的真菌及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于将根皮苷转化为根皮素的真菌及其应用，该标准菌种的分类命名为长柄链格孢菌(Alternaria longipes)，购自中国中国科学院微生物研究所，保藏编号为AS3.2875。本发明还提供了基于该真菌转化制备根皮素的方法。本发明提供的真菌与传统的转化方法相比，产率高，无环境污染。

Description

一种可以将根皮苷转化为根皮素的真菌及其用途
技术领域
本发明属于微生物转化技术领域，涉及一种用于将根皮苷转化为根皮素的真菌及其用途。
背景技术
已知的是，根皮苷主要用于治疗糖尿病，而其去糖苷得到根皮素。根皮素是存在于苹果、梨等水果及多种蔬菜中天然的二氢查耳酮类物质，因在这些植物中的根茎和根皮中含量较为集中而得名。根皮素比根皮苷具有更广泛的生物活性和药理作用：降血糖、清除氧自由基、美白、心血管保护、抗肿瘤、抗炎、免疫抑制、弱的雌激素样活性等。因此广泛应用于保健品、药品、化妆品等行业，并受到国内外学者的广泛关注，特别是在美白和抗癌作用方面。
根皮素在自然界的分布较少，主要存在苹果、梨、荔枝等多汁植物的果皮、根茎及根皮，并且提取分离较为困难。目前根皮素的合成方法主要分为生物合成和化学合成，但这两种方法在不同程度上均存在着缺陷：得率低、副产物较多、有一定的污染等。
微生物转化是利用微生物代谢过程中产生的某个或某一系列的酶对底物特定部位（基因）进行的催化反应，这一过程避免了生物合成和化学合成过程中的缺点，为解决某些药用化合物的紧缺提供了新的途径。
因此，利用已有微生物定向转化根皮苷为根皮素，以使根皮素更好地应用于临床。
发明内容
基于此，本发明的目的是为了满足当前对根皮素的大量需求，提供了利用一株真菌将根皮苷转化为根皮素的方法，本发明的方法有助于根皮素的扩大生产，以满足当前市场对于根皮素的需求，进而为根皮素的临床深入研究提供物质基础。
为解决上述问题，本发明采用的技术方案如下：用于将根皮苷转化为根皮素的真菌采用现有菌种，该标准菌种的分类命名为长柄链格孢菌(Alternaria longipes )，保藏于天津市华泰至成医药科技发展有限公司研发部微生物实验室。
本发明所述的菌株购自中国中国科学院微生物研究所，保藏编号为AS3.2875。由于该菌种可通过现有渠道直接获得，故而该生物材料属于现有技术中可直接获得的材料，不需进行单独的生物保藏。
本发明提供了一种将根皮苷转化为根皮素的方法，该方法采用上述真菌进行转化。
优选地，所述方法包括以下步骤。
1）马铃薯液体培养基（PDA斜面培养基）及马铃薯琼脂斜面培养基（PDA斜面培养基）的配制：
选用市售新鲜马铃薯200 g，将马铃薯去皮，切制成小块状，加入适量水煮沸，计时30min。然后将马铃薯水煮液纱布过滤，加水至1000 mL。称取葡萄糖 20 g，溶于马铃薯水煮液中，即得马铃薯液体培养基。马铃薯液体培养基每200ml装入一个500ml的锥形瓶中，分装好后培养基封口，于1.06 kg/cm2压力下121 ℃湿热灭菌30 min，放凉以用来制备发酵液。取马铃薯液体培养基100 mL，加入琼脂2 g，加热溶解，并且趁热分装，每5 mL至每支15 mL试管中。将分装好的培养基用橡胶塞封口，于1.06 kg/cm2压力下121 ℃湿热灭菌30 min。灭菌后趁热取出试管，倾斜放置，待培养基凝固，冷却后即成马铃薯琼脂斜面培养基，以用来接种菌株。
2）真菌的培养：
将菌体制成104CFU/ml的菌悬液，将菌悬液加入到液体培养基中，其中菌悬液与液体培养基的比例为1:100，置于恒温振荡器上25-37℃培养1-4天；优选地，恒温振荡器转速为50-300 rpm/min，更优选地为100-200rpm/min，进一步优选地为160 rpm/min；优选地，培养温度为26-30℃，更优选地为28℃；优选地，培养时间为2d。
3）根皮苷的转化；
加入根皮苷溶液，使得发酵液中含根皮苷的浓度为0.01-0.3mg/ml，继续在转速为160rpm/min、温度为28℃的恒温振荡器上培养3-6d；优选地，发酵液加入根皮苷的浓度为0.3mg/ml；优选地，转化时间为3d。
4）根皮素的萃取：
发酵后的发酵液用等体积的水饱和正丁醇萃取，将萃取后的正丁醇层旋干，得到转化产物浸膏；优选地，将得到的转化产物浸膏用甲醇复溶，并进行HPLC检测。
优选地，在步骤2）中，所述菌悬液的浓度为104CFU/ml。
优选地，在步骤2）中，所述菌悬液与液体培养基的体积比为1:100。
优选地，在步骤4）中，所述发酵液用水饱和正丁醇萃取。
本发明的有益效果包括：
1. 本发明的方法为微生物转化法，因此不存在副产物，并且对环境没有污染；
2. 本发明的使用的长柄链格孢菌AS3.2875具有高产、性状稳定的特点，该菌株经过20代的传代，性能保持稳定；
3.本发明生产成本低，经济效益可观。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：（HPLC图）
图1根皮苷标准品HPLC图谱；
图2空白组HPLC图谱；
图3转化产物HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，根据下述实施例可以更好地理解本发明。然而，本领域技术人员应容易理解的是，实施例所描述的具体物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书所涵盖的本发明的范围。
实施例1 使用本发明的真菌制备根皮素
以从实验室分离购得的菌株为出发菌株，采用以下方法制备根皮素。
1）马铃薯液体培养基（PDA斜面培养基）及马铃薯琼脂斜面培养基（PDA斜面培养基）的配制：
选用市售新鲜马铃薯200 g，将马铃薯去皮，切制成小块状，加入适量水煮沸，计时30min。然后将马铃薯水煮液纱布过滤，加水至1000 mL。称取葡萄糖 20 g，溶于马铃薯水煮液中，即得马铃薯液体培养基。马铃薯液体培养基每200ml装入一个500ml的锥形瓶中，分装好后培养基封口，于1.06 kg/cm2压力下121 ℃湿热灭菌30 min，放凉以用来制备发酵液。取马铃薯液体培养基100 mL，加入琼脂2 g，加热溶解，并且趁热分装，每5 mL至每支15 mL试管中。将分装好的培养基用橡胶塞封口，于1.06 kg/cm2压力下121 ℃湿热灭菌30 min。灭菌后趁热取出试管，倾斜放置，待培养基凝固，冷却后即成马铃薯琼脂斜面培养基，以用来接种菌株。
2）真菌的培养：
将纯化后的菌体制成104CFU/ml的菌悬液，将菌悬液加入到液体培养基中，其中菌悬液与液体培养基的体积比为1：100，置于恒温振荡器上，恒温振荡器转速为160 rpm/min，28℃培养2天。
3）根皮苷的转化：
加入根皮苷溶液，使得发酵液中含根皮苷的浓度为0.1mg/ml，继续培养3d。
4）根皮素的萃取：
发酵后的发酵液用等体积的水饱和正丁醇萃取，将萃取后的正丁醇层旋干，得到转化产物浸膏。
将得到的转化产物浸膏用甲醇复溶，并进行HPLC检测分析。
结果显示，HPLC中转化菌株在保留时间78.56min 处有一个峰，与根皮素标准品保留时间相同；以此证明实验室已购的真菌菌株AS3.2875可以将根皮苷转化为根皮素。
实施例2 使用本发明的真菌菌株制备根皮素
以从实验室购得的菌株为出发菌株，采用以下方法制备根皮素。
1）马铃薯液体培养基（PDA斜面培养基）及马铃薯琼脂斜面培养基（PDA斜面培养基）的配制：
选用市售新鲜马铃薯200 g，将马铃薯去皮，切制成小块状，加入适量水煮沸，计时30min。然后将马铃薯水煮液纱布过滤，加水至1000 mL。称取葡萄糖 20 g，溶于马铃薯水煮液中，即得马铃薯液体培养基。马铃薯液体培养基每200ml装入一个500ml的锥形瓶中，分装好后培养基封口，于1.06 kg/cm2压力下121 ℃湿热灭菌30 min，放凉以用来制备发酵液。取马铃薯液体培养基100 mL，加入琼脂2 g，加热溶解，并且趁热分装，每5 mL至每支15 mL试管中。将分装好的培养基用橡胶塞封口，于1.06 kg/cm2压力下121 ℃湿热灭菌30 min。灭菌后趁热取出试管，倾斜放置，待培养基凝固，冷却后即成马铃薯琼脂斜面培养基，以用来接种菌株。
2）真菌的培养：
将纯化后的菌体制成104CFU/ml的菌悬液，将菌悬液加入到液体培养基中，其中菌悬液与液体培养基的体积比为1：100，置于恒温振荡器上，恒温振荡器转速为160 rpm/min，28℃培养2天。
3）根皮苷的转化：
加入根皮苷溶液，使得发酵液中含根皮苷的浓度为0.1mg/ml，继续培养3d。
4）根皮素的萃取：
发酵后的发酵液用等体积的水饱和正丁醇萃取，将萃取后的正丁醇层旋干，得到转化产物浸膏。
将得到的转化产物浸膏用甲醇复溶，并进行HPLC检测分析。
结果显示，HPLC中转化菌株在保留时间min处有一个峰，与根皮素标准品保留时间相同；以此证明实验室已购的真菌菌株AS3.2875可以将根皮苷转化为根皮素。

Claims (9)

1.一种用于将根皮苷转化为根皮素的真菌，其特征在于：所述真菌为长柄链格孢(Alternaria longipes )。
2.如权利要求1所述的真菌在制备根皮素中的用途。
3.一种将根皮苷转化为根皮素的方法，其特征在于，所述方法包括采用如权利要求1所述的真菌转化。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1）马铃薯液体培养基（PDA斜面培养基）及马铃薯琼脂斜面培养基（PDA斜面培养基）的配制：
选用市售新鲜马铃薯200 g，将马铃薯去皮，切制成小块状，加入适量水煮沸，30 min；然后将马铃薯水煮液纱布过滤，加水至1000 mL；称取葡萄糖 20 g，溶于马铃薯水煮液中，即得马铃薯液体培养基；马铃薯液体培养基每200ml装入一个500ml的锥形瓶中，分装好后培养基封口，于1.06 kg/cm2压力下121 ℃湿热灭菌30 min，放凉以用来制备发酵液；取马铃薯液体培养基100 mL，加入琼脂2 g，加热溶解，并且趁热分装，每5 mL至每支15 mL试管中；将分装好的培养基用橡胶塞封口，于1.06 kg/cm2压力下121 ℃湿热灭菌30 min；灭菌后趁热取出试管，倾斜放置，待培养基凝固，冷却后即成马铃薯琼脂斜面培养基，以用来接种菌株；
2）真菌的培养：
将纯化后的菌体制成104CFU/ml的菌悬液，将菌悬液加入到液体培养基中，其中菌悬液与液体培养基的体积比为1：100，置于恒温振荡器上，恒温振荡器转速为160 rpm/min，28℃培养2天；
3）根皮苷的转化：
加入根皮苷溶液，使得发酵液中含根皮苷的浓度为0.1mg/ml，继续培养3d；
4）根皮素的萃取：
发酵后的发酵液用等体积的水饱和正丁醇萃取，将萃取后的正丁醇层旋干，得到转化产物浸膏。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤2）中，所述恒温振荡器的转速为50-300 rpm/min，优选地为100-200rpm/min，更优选地为160 rpm/min。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，在步骤2）中，培养温度为26-30℃，更优选地为28℃。
7.根据权利要求4~6中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤2）中，所述菌悬液的浓度为104CFU/ml。
8.根据权利要求4~7中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤2）中，所述菌悬液与液体培养基的体积比为1:100。
9.根据权利要求4~8中任一项所述的方法，其特征在于，将得到的根皮素用甲醇复溶，进行HPLC检测和分析。
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