CN109355317A - 一种把根皮苷转化为根皮素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种把根皮苷转化为根皮素的方法，包括如下步骤：将含根皮苷的原料溶解于乙醇或水溶液中，加入纤维素复合酶与果胶复合酶的混合酶，酶解温度为45～55℃，酶解时间10～96小时，酶解结束后灭活，固液分离，得到根皮素产品。本发明通过混合酶的使用，解决单一酶酶解不完全的问题，提高根皮苷转化率，实现了根皮苷转化率提高至95％以上；本发明得到的根皮素为白色，省略了传统的工艺如酸解工艺需脱色的步骤，进一步降低生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是一种把根皮苷转化为根皮素的方法。
背景技术
根皮素(phloretin)，又名三羟苯酚丙酮，CAS号60～82～2，属于二氢查尔酮化合物。根皮素在天然植物中的含量稀少、提取率低下，限制了根皮素的发展和应用，因此，对根皮素进行合成与纯化的相关研究满足科研和市场需求，具有重要意义。
目前，根皮素的工业化生产主要采用酸碱水解或酶解的方法转化根皮苷为根皮素，如：中国专利CN103351291B公开了一种天然根皮苷半合成制备根皮素工艺；该发明将根皮苷粗品置于不锈钢反应釜，溶解于5％的强碱性溶液简单精制过滤得到根皮苷盐溶液，转入带夹套搪瓷反应釜，并在低温下加入路易斯酸和金属催化剂，约35℃反应10～15h。再降温至0℃析晶，抽虑、去离子水洗涤得到根皮素粗晶。该技术由于反应条件剧烈，产生更多杂质多造成纯化困难，同时容易改变物质结构等转化率低等；另外采用该工艺所得产品颜色为略带粉红色或棕红色，产品水溶液分散效果不好。同时，采用强酸强碱带来严重环境污染，高含量根皮苷水溶性不好，要想从高含量根皮苷获得根皮素是较为困难。
又如：中国专利CN101701226A公开了一种酶解法生产根皮素的方法，其包括如下步骤：将根皮苷质量含量为10％～80％的根皮苷原料溶于去离子水中；加入活化的sino-β水解酶，所述根皮苷原料与所述sino-β水解酶的质量比为1～50∶1，在20℃～90℃，在搅拌下，酶解反应5～72小时；迅速升温到60℃～100℃灭活15～35分钟；固液分离，固体经干燥，得根皮素。
目前现有的技术的应用有一定的限制，如采用酸碱水解法，虽然具有成本低的优势，但存在强酸强碱残留、环境污染、转化专一性差和产品需脱色等不足；采用酶解法则需要商品水解酶，且酶不能回收重复利用，导致工艺成本过高，同时该水解酶作为原料，成本较高，不易于工业化大生产。本发明可以克服酸碱水解和单一酶水解法的不足，具有反应条件温和、专一性强、生产成本低和环境友好的优点。
发明内容
为克服现有的克服酸碱水解和纯酶水解法的不足，本发明提供了一种把根皮苷转化为根皮素的方法，所述方法包括如下步骤：
一种把根皮苷转化为根皮素的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤一：溶解，将含根皮苷的原料溶解于乙醇或水中；
步骤二：酶解，在步骤1溶液中加入纤维素复合酶与果胶复合酶的混合酶，所述混合酶与根皮苷原料的质量比为1:10～40，酶解温度为45～55℃，酶解时间10～96小时；
步骤三：灭活，酶解结束后将反应液加热到75～100℃，10～45分钟；
步骤四：固液分离，得固体物质为根皮素；
优选的，步骤一所述乙醇，为酸性乙醇，pH值为3.5～5.5；
优选的，所述酸性乙醇，制备方法为使用盐酸调配而成；
优选的，所述步骤一中所述乙醇体积百分比浓度为0～5％；
优选的，步骤一所述将含根皮苷的原料溶解于乙醇中，其含根皮苷的原料与乙醇质量比为1:10～40；
优选的，步骤一所述含根皮苷的原料，其根皮苷质量含量为80％～99％；
优选的，步骤二所述混合酶与根皮苷原料的质量比为1:15～25；
优选的，步骤二所述混合酶与根皮苷原料的质量比为1:15～20；
优选的，步骤二所述纤维素复合酶与果胶复合酶的质量比为1∶1～100；
优选的，步骤二所述纤维素复合酶与果胶复合酶的质量比为1∶1～10；
优选的，步骤二所述纤维素复合酶与果胶复合酶的质量比为1∶1～5；
优选的，所述步骤二酶解反应过程中每隔0.5～2小时持续通入氮气1～5分钟；
优选的，所述步骤二中酶解温度为46～48℃，酶解时间30～40小时；
优选的，所述步骤三中加热温度为78～83℃，灭活时间为20～30分钟。
本发明所采用的的根皮苷可以通过以下方式获得：1)自制：以富含根皮苷的原料经水或乙醇提取纯化后获得；2)在市面上直接购买。
本发明的优点：
1.根皮苷转化率为95％，产品为类白色干粉，1％水溶液具有良好分散效果。
2.本发明得到的根皮素为白色，克服了传统的工艺如酸解工艺得到的根皮素为红棕色，若要获得白色的根皮素还必须进行脱色这一步骤。
3.通过纤维素复合酶与果胶复合酶混合酶的使用，解决单一酶酶解不完全的问题，同时克服传统方法存在有机物残留或酸、碱残留的不足，提高根皮苷转化率，实现了根皮苷转化率从20％提高至95％以上。
4.克服了从高含量根皮苷获得根皮素较为困难的现状，采用本技术方案，可以从根皮苷含量为80-99％的原料中获得高纯度的根皮素。
附图说明
图1根皮素标准品HPLC图谱。
图2实施例3转化产物HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述；以下实施例用
于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实施例与对比例中，如无特别说明，乙醇浓度均以体积百分比计。
实施例1
于反应罐中加入水，使用盐酸调配PH值至3.5，按含根皮苷的原料与水质量比为1∶10的比例，将含80％质量分数根皮苷的干粉加入反应罐中。加热至45℃，加入纤维素复合酶与果胶复合酶的混合酶，混合酶与根皮苷原料的质量比为1∶10，纤维素复合酶与果胶复合酶的质量比为1∶1，45℃保温酶解10小时；每隔0.5小时从溶液底部持续通入氮气1分钟，得到酶解料液；将得到的酶解料液加热到75℃，灭活10分钟；采用布袋离心机进行固液分离，得到根皮素湿晶，干燥后得到干粉根皮素产品。根皮苷转化率为91.4％，根皮素纯度95.1％。
实施例2
于反应罐中加入浓度为0.5％乙醇水溶液，使用盐酸调配PH值至5.5，，按含根皮苷的原料与乙醇质量比为1∶40的比例，将含92.5％质量分数根皮苷的干粉加入反应罐中。加热至55℃，加入纤维素复合酶与果胶复合酶的混合酶，混合酶与根皮苷原料的质量比为1∶40，纤维素复合酶与果胶复合酶的质量比为1∶100，55℃保温酶解96小时；每隔2小时从溶液底部持续通入氮气5分钟，得到酶解料液；将得到的酶解料液加热到100℃，灭活45分钟；采用抽滤灌进行固液分离，得到根皮素湿晶，干燥后得到干粉根皮素产品。根皮苷转化率为95.3％，根皮素纯度97.5％。
实施例3
于反应罐中加入浓度为5％乙醇水溶液，使用盐酸调配PH值至4.5，按含根皮苷的原料与乙醇质量比为1∶25的比例，将含99％质量分数根皮苷的干粉加入反应罐中。加热至52℃，加入纤维素复合酶与果胶复合酶的混合酶，混合酶与根皮苷原料的质量比为1：25，纤维素复合酶与果胶复合酶的质量比为1∶2，52℃保温酶解20小时；每隔1小时从溶液底部持续通入氮气3分钟，得到酶解料液；将得到的酶解料液加热到80℃，灭活30分钟；采用板框压滤机进行固液分离，得到根皮素湿晶，干燥后得到干粉根皮素产品。根皮苷转化率为96.1％，根皮素纯度99.1％。
实施例4
于反应罐中加入浓度为2.5％乙醇水溶液，使用盐酸调配PH值至4，浓度为乙醇水溶液，按含根皮苷的原料与乙醇质量比为1∶30的比例，将含93％质量分数根皮苷的干粉加入反应罐中。加热至46℃，加入纤维素复合酶与果胶复合酶的混合酶，混合酶与根皮苷原料的质量比为1：15，纤维素复合酶与果胶复合酶的质量比为1∶60，46℃保温酶解30小时；每隔1.5小时从溶液底部持续通入氮气4分钟，得到酶解料液；将得到的酶解料液加热到78℃，灭活20分钟；采用布袋离心机进行固液分离，得到根皮素湿晶，干燥后得到干粉根皮素产品。根皮苷转化率为96％，根皮素纯度95.5％。
实施例5
于反应罐中加入浓度为1.9％乙醇水溶液，使用醋酸调配PH值至4.5，按含根皮苷的原料与乙醇质量比为1∶15的比例，将含95.7％质量分数根皮苷的干粉加入反应罐中。加热至48℃，加入纤维素复合酶与果胶复合酶的混合酶，混合酶与根皮苷原料的质量比为1：35，纤维素复合酶与果胶复合酶的质量比为1∶5，48℃保温酶解40小时；每隔0.8小时从溶液底部持续通入氮气4分钟，得到酶解料液；将得到的酶解料液加热到83℃，灭活30分钟；采用板框压滤机进行固液分离，得到根皮素湿晶，干燥后得到干粉根皮素产品。根皮苷转化率为95.5％，根皮素纯度98.2％。
实施例6
于反应罐中加入浓度为5％乙醇水溶液，使用硫酸调配PH值至3.5，按含根皮苷的原料与乙醇质量比为1∶40的比例，将含92.8％质量分数根皮苷的干粉加入反应罐中。加热至47℃，加入纤维素复合酶与果胶复合酶的混合酶，混合酶与根皮苷原料的质量比为1：25，纤维素复合酶与果胶复合酶的质量比为1∶10，47℃保温酶解35小时；每隔0.5小时从溶液底部持续通入氮气3分钟，得到酶解料液；将得到的酶解料液加热到80℃，灭活25分钟；采用抽滤灌进行固液分离，得到根皮素湿晶，干燥后得到干粉根皮素产品。根皮苷转化率为96％，根皮素纯度95.9％。
实施例7
于反应罐中加入为3％乙醇水溶液，使用醋酸调配PH值至5.5，按含根皮苷的原料与乙醇质量比为1∶15的比例，将含91.7％质量分数根皮苷的干粉加入反应罐中。加热至53℃，加入纤维素复合酶与果胶复合酶的混合酶，混合酶与根皮苷原料的质量比为1：20，纤维素复合酶与果胶复合酶的质量比为1∶75，53℃保温酶解65小时；每隔1.5小时从溶液底部持续通入氮气5分钟，得到酶解料液；将得到的酶解料液加热到75℃，灭活45分钟；采用布袋离心机进行固液分离，得到根皮素湿晶，干燥后得到干粉根皮素产品。根皮苷转化率为95％，根皮素纯度98％。
实施例8
于反应罐中加入浓度为0.5％乙醇水溶液，使用盐酸调配PH值至4，按含根皮苷的原料与乙醇质量比为1∶15的比例，将含81％质量分数根皮苷的干粉加入反应罐中。加热至55℃，加入纤维素复合酶与果胶复合酶的混合酶，混合酶与根皮苷原料的质量比为1：28，纤维素复合酶与果胶复合酶的质量比为1∶1，55℃保温酶解32小时；每隔1.4小时从溶液底部持续通入氮气2分钟，得到酶解料液；将得到的酶解料液加热到92℃，灭活25分钟；采用板框压滤机进行固液分离，得到根皮素湿晶，干燥后得到干粉根皮素产品。根皮苷转化率为94％，根皮素纯度96％。
实施例9
于反应罐中加入乙醇水溶液，按含根皮苷的原料与乙醇质量比为1∶15的比例，将根皮苷的干粉加入反应罐中。加热至45℃，加入纤维素复合酶与果胶复合酶的混合酶，混合酶与根皮苷原料的质量比为1：10，45℃保温酶解10小时；将得到的酶解料液加热到75℃，灭活10分钟；固液分离后，得到根皮素湿晶，干燥后得到干粉根皮素产品。根皮苷转化率为92％，根皮素纯度93％。
实施例10
于反应罐中加入水溶液，按含根皮苷的原料与水质量比为1∶40的比例，将根皮苷的干粉加入反应罐中。加热至55℃，加入纤维素复合酶与果胶复合酶的混合酶，混合酶与根皮苷原料的质量比为1：40，55℃保温酶解96小时；将得到的酶解料液加热到100℃，灭活45分钟；固液分离后，得到根皮素湿晶，干燥后得到干粉根皮素产品。根皮苷转化率为90％，根皮素纯度91％。
对比例1～2用于评价纤维素复合酶、果胶复合酶单一酶对根皮苷转化率的影响
对比例1：采用纤维素复合酶取代实施例3中的纤维素复合酶与果胶复合酶的混合酶，其它步骤同实施例3。
具体操作如下：
于反应罐中加入浓度为5％乙醇水溶液，使用盐酸调配PH值至4.5，按含根皮苷的原料与乙醇质量比为1∶25的比例，将含99％质量分数根皮苷的干粉加入反应罐中。加热至52℃，加入纤维素复合酶，纤维素复合酶与根皮苷原料的质量比为1：25，52℃保温酶解20小时；每隔1小时从溶液底部持续通入氮气3分钟，得到酶解料液；将得到的酶解料液加热到80℃，灭活30分钟；采用板框压滤机进行固液分离，得到根皮素湿晶，干燥后得到干粉根皮素产品。根皮苷转化率为23％，根皮素纯度88％。
对比例2：采用果胶复合酶取代实施例3中的纤维素复合酶与果胶复合酶的混合酶，其它步骤同实施例3。
具体操作如下：
于反应罐中加入浓度为5％乙醇水溶液，使用盐酸调配PH值至4.5，按含根皮苷的原料与乙醇质量比为1∶25的比例，将含99％质量分数根皮苷的干粉加入反应罐中。加热至52℃，加入果胶复合酶，果胶复合酶与根皮苷原料的质量比为1：25，52℃保温酶解20小时；每隔1小时从溶液底部持续通入氮气3分钟，得到酶解料液；将得到的酶解料液加热到80℃，灭活30分钟；采用板框压滤机进行固液分离，得到根皮素湿晶，干燥后得到干粉根皮素产品。根皮苷转化率为23％，根皮素纯度92％。
对比例3～4用于评价sino-β水解酶对根皮苷转化率的影响
对比例3：采用中国专利CN101701226A“酶解法生产根皮素的方法”中使用的sino-β水解酶取代实施例3中的纤维素复合酶与果胶复合酶的混合酶，其它步骤同实施例3。
具体操作如下：
于反应罐中加入浓度为5％乙醇水溶液，使用盐酸调配PH值至4.5，按含根皮苷的原料与乙醇质量比为1∶25的比例，将含99％质量分数根皮苷的干粉加入反应罐中。加热至52℃，加入sino-β水解酶，sino-β水解酶与根皮苷原料的质量比为1：25，52℃保温酶解20小时；每隔1小时从溶液底部持续通入氮气3分钟，得到酶解料液；将得到的酶解料液加热到80℃，灭活30分钟；采用板框压滤机进行固液分离，得到根皮素湿晶，干燥后得到干粉根皮素产品。根皮苷转化率为55％，根皮素纯度93％。
对比例4：采用中国专利CN101701226A“酶解法生产根皮素的方法”中使用的sino-β水解酶取代实施例3中的纤维素复合酶与果胶复合酶的混合酶，酶前处理及反应条件参考中国专利CN101701226A最佳的反应条件，其它步骤同实施例3。
具体操作如下：
于反应罐中加入浓度为5％乙醇水溶液，使用盐酸调配PH值至4.5，按含根皮苷的原料与乙醇质量比为1∶25的比例，将含99％质量分数根皮苷的干粉加入反应罐中。加热至90℃，加入经过在pH＝4.0，温度20℃活化90分钟的sino-β水解酶，sino-β水解酶与根皮苷原料的质量比为1∶1，90℃保温酶解5小时；每隔1小时从溶液底部持续通入氮气3分钟，得到酶解料液；将得到的酶解料液加热到100℃，灭活15分钟；采用板框压滤机进行固液分离，得到根皮素湿晶，干燥后得到干粉根皮素产品。根皮苷转化率为70％，根皮素纯度94％。
对比例5～6用于评价β-葡萄糖苷酶对根皮苷转化率的影响
对比例5：采用中国专利CN105838745A“一种双酶法转化根皮苷制备黄色素的方法”中使用的β-葡萄糖苷酶取代实施例3中的纤维素复合酶与果胶复合酶的混合酶，其它步骤同实施例3。
具体操作如下：
于反应罐中加入浓度为5％乙醇水溶液，使用盐酸调配PH值至4.5，按含根皮苷的原料与乙醇质量比为1∶25的比例，将含99％质量分数根皮苷的干粉加入反应罐中。加热至52℃，加入β-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷酶与根皮苷原料的质量比为12％，52℃保温酶解20小时；每隔1小时从溶液底部持续通入氮气3分钟，得到酶解料液；将得到的酶解料液加热到80℃，灭活30分钟；采用板框压滤机进行固液分离，得到根皮素湿晶，干燥后得到干粉根皮素产品。根皮苷转化率为18％，根皮素纯度93％。
对比例6：采用中国专利CN105838745A“一种双酶法转化根皮苷制备黄色素的方法”中使用的β-葡萄糖苷酶取代实施例3中的纤维素复合酶与果胶复合酶的混合酶，酶前处理及反应条件参考中国专利CN105838745A最佳的反应条件，其它步骤同实施例3。
具体操作如下：
于反应罐中加入浓度为5％乙醇水溶液，使用盐酸调配PH值至4.5，按含根皮苷的原料与乙醇质量比为1∶25的比例，将含99％质量分数根皮苷的干粉加入反应罐中。加热至30℃，加入β-葡萄糖苷酶，β-葡萄糖苷酶与根皮苷原料的质量比为1∶25，30℃保温酶解4小时；每隔1小时从溶液底部持续通入氮气3分钟，得到酶解料液；将得到的酶解料液加热到80℃，灭活5分钟；采用板框压滤机进行固液分离，得到根皮素湿晶，干燥后得到干粉根皮素产品。根皮苷转化率为19％，根皮素纯度91％。
结果与讨论
1、酶解根皮苷转化率
统计实施例和对比例酶促根皮苷转化率及根皮素纯度，如果如下：
通过实验可知：
(1)纤维素复合酶与果胶复合酶混合酶的使用是提高根皮素转化率及纯度最关键的因素，混合酶与含根皮苷原料的使用比例、混合酶中纤维素复合酶与果胶复合酶的混合比例，直接影响了根皮素的转化率及纯度。根据实验数据，混合酶与含根皮苷原料的优选使用比例是1:15～25，最佳使用比例是1:15～20。混合酶中纤维素复合酶与果胶复合酶的混合优选比例为1:1～10，最佳使用比例是1:1～5。
(2)溶解过程使用的酸性乙醇为次要影响因素，使用不调节酸度的乙醇溶液虽然转化效果优于现有技术，但比不上在酸性条件下进行酶解的效果。
(3)从上表可知，本发明通过纤维素复合酶与果胶复合酶混合酶的使用，解决单一酶酶解不完全的问题，提高根皮苷转化率，实现了根皮苷转化率从20％提高至95％以上。本发明所得根皮素转化产物HPLC图谱见图2，其中图1为标准品。
2、产品根皮素色泽比较
将实施例及对比例所得产品分别放置于黑色的实验桌上，通过国际标准色卡判断其颜色的深浅，记录结果如下：
| 颜色 | 颜色 | ||
| 实施例1 | 类白色 | 对比例1 | 浅粉红色 |
| 实施例2 | 类白色 | 对比例2 | 浅粉红色 |
| 实施例3 | 纯白色 | 对比例3 | 灰白色 |
| 实施例4 | 纯白色 | 对比例4 | 灰白色 |
| 实施例5 | 雪白色 | 对比例5 | 浅红色 |
| 实施例6 | 雪白色 | 对比例6 | 浅红色 |
| 实施例7 | 类白色 | ||
| 实施例8 | 纯白色 | ||
| 实施例9 | 雪白色 | ||
| 实施例10 | 类白色 |
从上表可知，本发明所制得的产品为类白色、纯白色、雪白色干粉，而对照组为浅红色、浅粉红色、灰白色等，若要获得白色的根皮素还必须进行脱色这一步骤，进一步提高了工业化的成本，因此，本发明具有良好的工业化应用前景，其可以应用于药品、食品、化妆品等行业，也可以用作甜味剂矫正剂。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (14)
1.一种把根皮苷转化为根皮素的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤一：溶解，将含根皮苷的原料溶解于乙醇或水中；
步骤二：酶解，在步骤1溶液中加入纤维素复合酶与果胶复合酶的混合酶，所述混合酶与根皮苷原料的质量比为1:10～40，酶解温度为45～55℃，酶解时间10～96小时；
步骤三：灭活，酶解结束后将反应液加热到75～100℃，10～45分钟；
步骤四：固液分离，得固体物质为根皮素。
2.如权利要求1所述的一种把根皮苷转化为根皮素的方法，其特征在于，步骤一所述乙醇，为酸性乙醇，pH值为3.5～5.5。
3.如权利要求2所述的一种把根皮苷转化为根皮素的方法，其特征在于，所述酸性乙醇，制备方法为使用盐酸调配而成。
4.如权利要求1所述的一种把根皮苷转化为根皮素的方法，其特征在于，所述步骤一中所述乙醇体积百分比浓度为0～5％。
5.如权利要求1所述的一种把根皮苷转化为根皮素的方法，其特征在于，步骤一所述将含根皮苷的原料溶解于乙醇中，其含根皮苷的原料与乙醇质量比为1:10～40。
6.如权利要求1所述的一种把根皮苷转化为根皮素的方法，其特征在于，步骤一所述含根皮苷的原料，其根皮苷质量含量为80％～99％。
7.如权利要求1所述的一种把根皮苷转化为根皮素的方法，其特征在于，步骤二所述混合酶与根皮苷原料的质量比为1:15～25。
8.如权利要求7所述的一种把根皮苷转化为根皮素的方法，其特征在于，步骤二所述混合酶与根皮苷原料的质量比为1:15～20。
9.如权利要求1所述的一种把根皮苷转化为根皮素的方法，其特征在于，步骤二所述纤维素复合酶与果胶复合酶的质量比为1∶1～100。
10.如权利要求9所述的一种把根皮苷转化为根皮素的方法，其特征在于，步骤二所述纤维素复合酶与果胶复合酶的质量比为1∶1～10。
11.如权利要求10所述的一种把根皮苷转化为根皮素的方法，其特征在于，步骤二所述纤维素复合酶与果胶复合酶的质量比为1∶1～5。
12.如权利要求1所述的一种把根皮苷转化为根皮素的方法，其特征在于，所述步骤二酶解反应过程中每隔0.5～2小时持续通入氮气1～5分钟。
13.如权利要求1所述的一种把根皮苷转化为根皮素的方法，其特征在于，所述步骤二中酶解温度为46～48℃，酶解时间30～40小时。
14.如权利要求1所述的一种把根皮苷转化为根皮素的方法，其特征在于，所述步骤三中加热温度为78～83℃，灭活时间为20～30分钟。
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