CN103789286A - 一种淀粉酶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种淀粉酶的制备方法。本发明以大麦芽为原料经过大麦芽的粉碎、淀粉酶的浸提、浸提液的初滤、淀粉酶的富集、浸提液沉淀、浸提液精滤、超滤浓缩、调配、二次精滤、最后进行无菌包装。经过条件优选，本发明制备的淀粉酶的酶活力不低于70万U/ml，纯度高，稳定性好，具有广阔的应用前景。

Description

一种淀粉酶的制备方法

技术领域

本发明涉及一种淀粉酶的制备方法，具体来说涉及从大麦芽中提取淀粉酶的方法。

背景技术

麦芽中的主要贮藏物质是淀粉，其中包括20％～40％直链淀粉和60％～80％支链淀粉。同时麦芽中与淀粉降解密切相关的淀粉酶有α-淀粉酶、β-淀粉酶和极限糊精酶等[Wolfgang K.啤酒工艺实用技术[M].北京：中国轻工业出版社，1998；Macgergor A.W.，Bazin S.L.，Macri L.J.，et al..Modellingthe contribution of alpha-amylase，beta-amylase and limit dextrinase to starchdegradation during mashing[J].Journal of Cereal Science，1999，29：161-169]。

α-淀粉酶是一种内切型淀粉水解酶。它可将淀粉分子链内的α-1，4葡萄糖甙键任意水解，但不能水解α-1，6葡萄糖甙键。α-淀粉酶作用直链淀粉时，生成麦芽糖、葡萄糖和小分子糊精；作用支链淀粉时，生成α-糊精、麦芽糖、葡萄糖和异麦芽糖。α-淀粉酶广泛分布于动物(唾液、胰脏等)、植物(麦芽、山萮菜)及微生物。α-淀粉酶是淀粉及以淀粉为材料的工业生产中最重要的一种酶，现在已广泛应用于淀粉加工业、烘焙工业、发酵工业、造纸工业和饲料工业等领域，具有非常广阔的市场前景。目前，α-淀粉酶以微生物发酵法生产居多。

β-淀粉酶是一种外切酶。它从淀粉的非还原端1，4-α-葡聚糖甙键开始，按一个葡萄糖单位依次降解淀粉，使切下的麦芽糖还原性末端的葡萄糖残基构型转变成β型，故称为β-淀粉酶。β-淀粉酶作用淀粉时的主要产物为麦芽糖和少量的糊精[邬显章.酶的工业生产技术[M].吉林：吉林科学技术出版社，1973：384.王海明.β-淀粉酶与高辅料啤酒酿造[J].啤酒科技，2000，(6)：6-9]。β-淀粉酶广泛存在于大麦、小麦、玉米、大豆、高粱、甘薯等高等植物。一些微生物通过发酵也能产生β-淀粉酶。微生物发酵法生产的β-淀粉酶活力低，成本较高。而从植物中提取的β-淀粉酶活性较高，在食品加工、发酵、医药及纺织行业有着重要的应用价值。我国主要以麦芽作为β-淀粉酶来源生产β-淀粉酶制剂。

何艳克的研究表明在麦芽中，淀粉酶活性以β-淀粉酶为主[何艳克.大麦芽淀粉酶分类评价及极限糊精酶活性研究[D].广东，华南理工大学，2011.]，则在麦芽中提取淀粉酶，也是以提取β-淀粉酶为主，且活性较高，为我国主要的生产方法。

目前已有很多研究和专利报道了从微生物中提取α-淀粉酶[陈波，李大力，杨树林.酸性α-淀粉酶生产菌株的筛选和酶的纯化及酶的性质研究[J].食品科学，2005，26(5)：119-122.王红梅.黑曲霉PZ301产耐酸性α-淀粉酶的固态发酵条件及酶的分离纯化研究[D].安徽，安徽农业大学，2011.曾丽娟.类芽孢杆菌属菌株产生淀粉酶的分离纯化及对淀粉结合域CBM25的初步研究[D].广西，广西大学，2010.一株A-淀粉酶抑制剂生产菌及A-淀粉酶抑制剂的制备方法与应.CN 101139569.⑤双水相萃取分离纯化α-淀粉酶的方法.CN 102220300B.]，同时也有很多专利公开了从麸皮、大豆和薯类等植物中提取β-淀粉酶[大豆β-淀粉酶制备工艺.CN 1088754C.液态β-淀粉酶制剂的制备方法.CN 101323849 B.从薯类细胞组织中提取β-淀粉酶的方法.CN 101451127 B.从麸皮中提取液态β-淀粉酶的方法.CN101979529 B.]，但从麦芽中提取淀粉酶还鲜有报道。据文献报道，从小麦、麸皮、大麦、大豆、麦芽、甘薯、细菌所含的β-淀粉酶比较来看，麦芽β-淀粉酶比上述常见高等植物中β-淀粉酶含量明显要高，且其活力高，淀粉易于回收，经济效益好。因此本发明以大麦芽为原料，采用科学合理的提取方法，提取了产量高、纯度高和酶活力高的淀粉酶，并将其制成了酶制剂。

发明内容

为了从大麦芽中制备高产率和高纯度的淀粉酶，本发明提供了一种淀粉酶的制备方法，主要包括以下步骤：

(一)大麦芽粉碎

将大麦芽置于粉碎机中粉碎，粉碎产物过80目筛，收集筛下物。称量、定额包装，并标明名称、重量、批号等内容备用。

(二)浸提

(1)浸提液配制：100L纯化水加入偏亚硫酸氢钠0.25kg、焦亚硫酸钠0.25kg、亚硫酸钠0.25kg，硫代硫酸钠0.25kg和山梨酸钾0.05kg，充分混匀备用。

(2)淀粉酶提取：称取10kg大麦芽粉碎物进入步骤(1)配制的浸提液中，另加入0～5g纤维素复合酶，充分混匀后，在常压下，加热并控制温度为20～45℃，调节pH值为5，搅拌提取4～20小时。

(三)初滤

将得到的混合物料通过200～300目的过滤机加压过滤，将淀粉酶的粗提取液与大麦芽粉碎物分离开来。

(四)富集

(1)按料液质量体积比1∶8(w/v)，将大麦芽粉碎物加到步骤(三)得到的淀粉粗提取液中，按步骤(二)的方法浸提4～20小时；

(2)重复步骤(三)及步骤(四)的(1)3次后，将得到的混合物料通过200～300目的过滤机加压过滤，收集滤液。

(五)沉淀

将0.15％氯化钙加入到步骤(四)富集所得的淀粉酶粗提取液中，搅拌15～25分钟后，将其静置6～8小时，待浆液沉淀分层后，收集上清液，进一步除杂。

(六)精滤

将2kg硅藻土加入到经沉淀处理后的淀粉酶提取液中，充分混合，进一步除去清液中所含的大部分淀粉、果胶和大分子糖类。然后，过精滤板框进行精滤。

(七)超滤浓缩

将步骤(六)所得精滤液进入超滤浓缩器进行超滤浓缩，浓缩液中加入氯化铝(PAC)0.03％聚凝并调整pH到4.0-6.0，过滤去除杂质，滤液进行二次超滤，超滤浓缩的温度控制在20℃以下，超滤浓缩所采用的为4英寸卷式膜，截流分子量为10K道尔顿。可得酶比活力达45～78万U/ml的淀粉酶浓缩液。

(八)调配

将超滤浓缩所得淀粉酶浓缩液置于调配罐中，加入1％-8％(w/v)麦芽糊精，0.1％-0.5％(w/v))山梨酸钾、0.2％-1％苯甲酸钠，搅拌混匀。

(九)二次精滤

在步骤(八)所得的淀粉酶溶液中加入硅藻土，过精滤板框进行精滤。

(十)无菌包装

将步骤(九)得到的淀粉酶溶液通过孔径为0.15μm～0.25μm的微管过滤机进行过滤除菌后，进行无菌罐装，即得到淀粉酶成品。

根据本发明的淀粉酶制备方法所得的淀粉酶成品是无菌包装的淀粉酶浓缩液。

本发明淀粉酶制备方法中使用了纤维素复合酶，该纤维素复合酶的主要酶活力成分为β-葡聚糖酶活不低于8000U/g、纤维素酶活不低于200U/g、中性蛋白酶活不低于500U/g、木聚糖酶活不低于3000U/g。

本发明淀粉酶制备方法中使用的纤维素复合酶包括选自如下物种属的纤维素复合酶组成的组：腐质霉属、镰孢霉属、毁丝霉属、曲霉属、青霉属、木霉属。

优选地，本发明淀粉酶制备方法中纤维素复合酶的使用量是3g(相当于大麦芽干重的0.03％)。

优选地，本发明淀粉酶制备方法中的浸提步骤中的浸提温度为30℃。

优选地，本发明淀粉酶制备方法中的浸提步骤中的浸提时间为8小时。

本发明提供的淀粉酶制备方法制备的淀粉酶浓缩液的酶活力不低于30万U/ml，优选不低于70万U/ml。

本发明与现有技术相比优点和有益效果如下：

(1)在淀粉酶提取过程中，浸提液中增加了新的还原剂成分，促进淀粉酶的释放，增加了淀粉酶的产率；

(2)在淀粉酶提取过程中，加入了降低浆黏度的纤维素复合酶，促进淀粉酶释放，增加了淀粉酶的产率；

(3)在淀粉酶提取过程中增加了富集步骤，增加了淀粉酶的产率；

(4)在淀粉酶提取过程中增加了氯化钙沉淀和二次超滤以及调配后二次精滤的步骤，均有利于淀粉酶的提纯，提高了淀粉酶的纯度。

综上所述，本发明提供的从大麦芽中提取淀粉酶的方法能够制备高产率，高纯度的淀粉酶。

附图说明

图1不同纤维素复合酶的加酶量对淀粉酶浓缩液酶活力的影响；

图2不同浸提温度对淀粉酶浓缩液酶活力的影响；

图3不同浸提时间对淀粉酶浓缩液酶活力的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式并不局限实施例表示的范围。

实施例1 一种从大麦芽中提取淀粉酶的方法

从大麦芽中提取淀粉酶的方法包括以下步骤：

(一)大麦芽粉碎

将大麦芽置于粉碎机中粉碎，粉碎产物过80目筛，收集筛下物。称量、定额包装，并标明名称、重量、批号等内容备用。

(二)浸提

(1)浸提液配制：100L纯化水加入偏亚硫酸氢钠0.25kg、焦亚硫酸钠0.25kg、亚硫酸钠0.25kg，硫代硫酸钠0.25kg和山梨酸钾0.05kg，充分混匀备用。

(2)淀粉酶提取：称取10kg大麦芽粉碎物进入步骤(1)配制的浸提液中，另加入0～5g纤维素复合酶，充分混匀后，在常压下，加热并控制温度为20～45℃，调节pH值为5，搅拌提取4～20小时。

(三)初滤

将得到的混合物料通过200～300目的过滤机加压过滤，将淀粉酶的粗提取液与大麦芽粉碎物分离开来。

(四)富集

(1)按料液质量体积比1∶8(w/v)，将大麦芽粉碎物加到步骤(三)得到的淀粉粗提取液中，按步骤(二)的方法浸提4～20小时；

(2)重复步骤(三)及步骤(四)的(1)3次后，将得到的混合物料通过200～300目的过滤机加压过滤，收集滤液。

(五)沉淀

将0.15％氯化钙加入到过滤得到的滤液中，搅拌15～25分钟后，将其静置6～8小时，待浆液沉淀分层后，收集上清液，进一步除杂。

(六)精滤

将2kg硅藻土加入到经沉淀处理的淀粉酶提取液中，充分混合，进一步除去清液中所含的大部分淀粉、果胶和大分子糖类。然后，过精滤板框进行精滤。

(七)超滤浓缩

将步骤(六)所得精滤液进入超滤浓缩器进行超滤浓缩，浓缩液中加入氯化铝(PAC)0.03％聚凝并调整pH到4.0-6.0，过滤去除杂质，滤液进行二次超滤，超滤浓缩的温度控制在20℃以下，超滤浓缩所采用的为4英寸卷式膜，截流分子量为10K道尔顿。可得酶比活力达45～78万U/ml的淀粉酶浓缩液。

(八)调配

将超滤浓缩所得淀粉酶浓缩液置于调配罐中，加入1-8％(w/v)麦芽糊精，0.1-0.5％(w/v)山梨酸钾、0.2％-1％苯甲酸钠，搅拌混匀。

(九)二次精滤

在步骤(八)中的淀粉酶溶液中加入硅藻土，过精滤板框进行精滤。

(十)无菌包装

将步骤(九)得到的淀粉酶容液通过孔径为0.15～0.25μm的微管过滤机进行过滤除菌后，进行无菌罐装，即得到淀粉酶成品。

实施例2 纤维素复合酶的加入量对浓缩酶液中淀粉酶活力的影响

操作步骤：

(一)大麦芽粉碎同实施例1。

(二)浸提

(1)浸提液配制：100L纯化水加入偏亚硫酸氢钠0.25kg、焦亚硫酸钠0.25kg、亚硫酸氢钠0.25kg，硫代硫酸钠0.25kg和山梨酸钾0.05kg，充分混匀备用。

(2)淀粉酶提取：称取10kg大麦芽粉碎物加入到步骤(1)配制的浸提液中，分别加入0、1、2、3、4、5g纤维素复合酶(β-葡聚糖酶活不低于8000U/g、纤维素酶活不低于200U/g、中性蛋白酶活不低于500U/g、木聚糖酶活不低于3000U/g)，分六组进行试验。充分混匀后，在常压下，加热并控制温度为30℃，调节pH值为5，搅拌提取10小时。

(三)初滤同实施例1。

(四)富集同实施例1。

(五)沉淀同实施例1。

(六)精滤同实施例1。

(七)超滤浓缩同实施例1。

(八)调配同实施例1。

(九)二次精滤同实施例1。

(十)分别对加入不同量纤维素复合酶的淀粉酶浓缩提取液的酶活力进行测定。

1.试剂

(1)2％淀粉溶液

(2)0.4mol/L氢氧化钠

(3)pH5.6柠檬酸缓冲液称取柠檬酸20.01g，溶解后定容1000ml，为A液。称取柠檬酸钠29.41g，溶解后定容至1000ml，为B液。取A液13.7ml与B液26.3ml混匀，即为pH5.6之缓冲液。

(4)3，5-二硝基水杨酸精确称取1g3，5-二硝基水杨酸溶于20ml1mol/L氢氧化钠中，加入50ml蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100ml，盖紧瓶塞，防止CO₂进入。

2.酶活力测定方法

(1)标准曲线的制作(见下表)

①取7支20ml具塞刻度试管，预先洁净灭菌干燥，编号，按表加入试剂。

②摇匀，至沸水浴中煮沸5分钟。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20ml，以1号管作为空白调零点，在520nm的波长下比色测定吸光度值。并建立通过吸光度值求麦芽糖含量的回归方程。

表1标准麦芽糖溶液成分表及OD测定值

(2)酶液中淀粉酶活力测定

a取预先洁净灭菌干燥试管，编号；

b取步骤(九)的浓缩酶液1ml于各只试管中，于60℃水浴中预热5分钟柠檬酸淀粉缓冲液同时在60℃水中预热5分钟；

c取柠檬酸淀粉缓冲液1ml加入试管中，于60℃水浴中保温30分钟；

d加入1.5ml3，5-二硝基水杨酸，沸水中5分钟，加入氢氧化钠溶液终止反应，加蒸馏水至20ml；

e摇匀，用分光光度计测定OD₅₂₀nm值。在上述条件下以单位体积样品在30分钟释放1mg麦芽糖所需的酶量为一个麦芽糖单位表示酶活性。

在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量按下列公式计算酶活力

酶活力测定公式：

淀粉酶活力=麦芽糖含量(mg)*淀粉酶原液总体积(ml)/所加淀粉质量

每个样品按下表所示步骤操作，在反应过程中，从加入底物开始，向每支管中加入试剂的时间间隔要绝对一致：

表2样品酶活力测定步骤

反应后的试样在室温下静置10分钟，如出现混浊需在离心机上以4000rpm离心10分钟，上清液以标准空白调零，在分光光度计520nm波长处测定样品空白(A₀)和样品溶液(A)的吸光值，A-A₀为实测吸光值。用直线回归方程计算样品淀粉酶的活性。

(3)活力计算

酶活力单位定义：在60℃、PH5.6条件下，每小时从2％的可溶性淀粉溶液中释放出1mg麦芽糖的酶量定义为1个酶活力单位(U)

淀粉酶活性U按下式计算：

$U=\frac{K\×(A-A_0)\×F}{S\×(30\÷60)\×180}$

其中：U——样品淀粉酶活性，U/ml；

K——标准曲线斜率；

F——样品溶液反应前的总量，ml；

S——样品测试量；表1中S=1ml；

601小时为60分钟；

30——反应时间，分钟。

分别对加入不同量纤维素复合酶的淀粉酶浓缩液的酶活力测定结果见图1。由图1可得，当纤维素复合酶的加入量在3g以下时，淀粉酶的活力随其加入量的增加而增大；当其加入量大于3g时，淀粉酶的活力随其加入量的增加不再明显增加。

实施例3 提取温度对浓缩酶液中淀粉酶活力的影响

操作步骤：

(一)大麦芽粉碎同实施例1。

(二)浸提

(1)浸提液配制：100L纯化水加入偏亚硫酸氢钠0.25kg、焦亚硫酸钠0.25kg、亚硫酸氢钠0.25kg，硫代硫酸钠0.25kg和山梨酸钾0.05kg，充分混匀备用。

(2)淀粉酶提取：称取10kg大麦芽粉碎物进入步骤(1)配制的浸提液中，加入3g纤维素复合酶(β-葡聚糖酶活不低于8000U/g、纤维素酶活不低于200U/g、中性蛋白酶活不低于500U/g、木聚糖酶活不低于3000U/g)，充分混匀后，在常压下，加热并控制温度分别为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，分六组进行试验。调节pH值为5，搅拌提取10小时。

(三)初滤同实施例1。

(四)富集同实施例1。

(五)沉淀同实施例1。

(六)精滤同实施例1。

(七)超滤浓缩同实施例1。

(八)调配同实施例1。

(九)二次精滤同实施例1。

(十)分别对不同提取温度所得淀粉酶浓缩提取液的酶活力进行测定。

方法同实施例2第(十)步。

分别对不同提取温度所得淀粉酶浓缩提取液的酶活力测定结果见图2。由图2可得，提取时控制温度为30℃时获得的浓缩液酶活力最高。

实施例4 提取时间对浓缩酶液中淀粉酶活力的影响

操作步骤：

(一)大麦芽粉碎同实施例1。

(二)浸提

(1)浸提液配制：100L纯化水加入偏亚硫酸氢钠0.25kg、焦亚硫酸钠0.25kg、亚硫酸氢钠0.25kg，硫代硫酸钠0.25kg和山梨酸钾0.05kg，充分混匀备用。

(2)淀粉酶提取：称取10kg大麦芽粉碎物进入步骤(1)配制的浸提液中，加入3g纤维素复合酶(β-葡聚糖酶活不低于8000U/g、纤维素酶活不低于200U/g、中性蛋白酶活不低于500U/g、木聚糖酶活不低于3000U/g)，充分混匀后，在常压下，加热并控制温度分别为30℃，调节pH值为5，搅拌提取时间分别为4、8、12、16、20小时，分五组进行试验。

(三)初滤同实施例1。

(四)富集同实施例1。

(五)沉淀同实施例1。

(六)精滤同实施例1。

(七)超滤浓缩同实施例1。

(八)调配同实施例1。

(九)二次精滤同实施例1。

(十)分别对不同提取时间所得淀粉酶浓缩提取液的酶活力进行测定。

方法同实施例2第(十)步。

分别对不同提取温度所得淀粉酶浓缩提取液的酶活力测定结果见图3。由图3可得，在8小时以下时，随着提取时间的延长酶活力增大，当提取时间大于8小时时，淀粉酶的活力随其延长不再明显增大。

综合实施例2、3、4的结果可得，本发明所述的一种从大麦芽中提取淀粉酶的方法，重点在于浸提步骤，其优选方法为：浸提时加入纤维素复合酶3g(相当于大麦芽干重的0.03％)，浸提温度为30℃，浸提时间为8小时。所得到的淀粉酶浓缩液的酶活力在70万U/ml以上。

实施例5 浸提液中还原剂的成分对浓缩酶液中淀粉酶活力的影响

方法1：

(一)大麦芽粉碎同实施例1。

(二)浸提

(1)浸提液配制：100L纯化水加入偏亚硫酸氢钠0.25kg、焦亚硫酸钠0.25kg、亚硫酸氢钠0.25kg，硫代硫酸钠0.25kg和山梨酸钾0.05kg，充分混匀备用。

(2)淀粉酶提取：称取10kg大麦芽粉碎物进入步骤(1)配制的浸提液中，加入3g纤维素复合酶(β-葡聚糖酶活不低于8000U/g、纤维素酶活不低于200U/g、中性蛋白酶活不低于500U/g、木聚糖酶活不低于3000U/g)，充分混匀后，在常压下，加热并控制温度分别为30℃，调节pH值为5，搅拌提取时间分别为8小时。

(三)初滤同实施例1。

(四)富集同实施例1。

(五)沉淀同实施例1。

(六)精滤同实施例1。

(七)超滤浓缩同实施例1。

(八)调配同实施例1。

(九)二次精滤同实施例1。

(十)对淀粉酶浓缩提取液的酶活力进行测定，测定方法同实施例2第(十)步。

对比实验-方法2：

(一)大麦芽粉碎同实施例1。

(二)浸提

(1)浸提液配制：100L纯化水加入亚硫酸钠0.25kg，硫代硫酸钠0.25kg和山梨酸钾0.05kg，充分混匀备用。

(2)淀粉酶提取：称取10kg大麦芽粉碎物进入步骤(1)配制的浸提液中，加入3g纤维素复合酶(β-葡聚糖酶活不低于8000U/g、纤维素酶活不低于200U/g、中性蛋白酶活不低于500U/g、木聚糖酶活不低于3000U/g)，充分混匀后，在常压下，加热并控制温度分别为30℃，调节pH值为5，搅拌提取时间分别为8小时。

(三)初滤同实施例1。

(四)富集同实施例1。

(五)沉淀同实施例1。

(六)精滤同实施例1。

(七)超滤浓缩同实施例1。

(八)调配同实施例1。

(九)二次精滤同实施例1。

(十)对淀粉酶浓缩提取液的酶活力进行测定，测定方法同实施例2第(十)步。

结果如下：

表3浸提液中还原剂成分对浓缩酶液中淀粉酶活力的影响

	方法1	方法2
			酶活1(U/ml)	75万	62万
酶活2(U/ml)	72万	58万
			平均值(U/ml)	73.5万	60万

表3中的结果表明，本发明中使用的还原剂成分(偏亚硫酸氢钠0.25kg、焦亚硫酸钠0.25kg、亚硫酸氢钠0.25kg，硫代硫酸钠0.25kg和山梨酸钾0.05kg)比现有技术中使用的还原剂成分(亚硫酸氢钠0.25kg，硫代硫酸钠0.25kg和山梨酸钾0.05kg)能明显提高淀粉酶的产率(以酶活力表示)。

实施例6 提取过程中的富集步骤对浓缩酶液中淀粉酶活力的影响

方法1同实施例5中的方法1

对比试验-方法3

(一)大麦芽粉碎同实施例1。

(二)浸提

(1)浸提液配制：100L纯化水加入偏亚硫酸氢钠0.25kg、焦亚硫酸钠0.25kg、亚硫酸氢钠0.25kg，硫代硫酸钠0.25kg和山梨酸钾0.05kg，充分混匀备用。

(2)淀粉酶提取：称取10kg大麦芽粉碎物进入步骤(1)配制的浸提液中，加入3g纤维素复合酶(β-葡聚糖酶活不低于8000U/g、纤维素酶活不低于200U/g、中性蛋白酶活不低于500U/g、木聚糖酶活不低于3000U/g)，充分混匀后，在常压下，加热并控制温度分别为30℃，调节pH值为5，搅拌提取时间分别为8小时。

(三)初滤同实施例1。

(四)沉淀同实施例1。

(五)精滤同实施例1。

(六)超滤浓缩同实施例1。

(七)调配同实施例1。

(八)二次精滤同实施例1。

(九)对淀粉酶浓缩提取液的酶活力进行测定，测定方法同实施例2第(十)步。

结果如下：

表4富集步骤对浓缩酶液中淀粉酶活力的影响

	方法1	方法3
			酶活1(U/ml)	75万	60万
酶活2(U/ml)	72万	57万
			平均值(U/ml)	73.5万	58.5万

表4中结果表明，在大麦芽提取淀粉酶的过程中增加富集步骤能明显提高淀粉酶的产率(以酶活力表示)。

实施例7 氯化钙沉淀步骤对对浓缩酶液中淀粉酶活力的影响

方法1同实施例5中的方法1

对比实验-方法4

(一)大麦芽粉碎同实施例1。

(二)浸提

(1)浸提液配制：100L纯化水加入偏亚硫酸氢钠0.25kg、焦亚硫酸钠0.25kg、亚硫酸氢钠0.25kg，硫代硫酸钠0.25kg和山梨酸钾0.05kg，充分混匀备用。

(2)淀粉酶提取：称取10kg大麦芽粉碎物进入步骤(1)配制的浸提液中，加入3g纤维素复合酶(β-葡聚糖酶活不低于8000U/g、纤维素酶活不低于200U/g、中性蛋白酶活不低于500U/g、木聚糖酶活不低于3000U/g)，充分混匀后，在常压下，加热并控制温度分别为30℃，调节pH值为5，搅拌提取时间分别为8小时。

(三)初滤同实施例1。

(四)富集同实施例1。

(五)精滤同实施例1。

(六)超滤浓缩同实施例1。

(七)调配同实施例1。

(八)二次精滤同实施例1。

(九)对提取的淀粉酶浓缩提取液的酶活力进行测定，测定方法同实施例2第(十)步。

结果如下：

表5氯化钙沉淀步骤对对浓缩酶液中淀粉酶活力的影响

	方法1	方法4
			酶活1(U/ml)	75万	62万
酶活2(U/ml)	72万	61万
			平均值(U/ml)	73.5万	61.5万

表5中结果表明，在大麦芽提取淀粉酶的过程中增加氯化钙沉淀步骤能明显提高淀粉酶的纯度(以酶活力表示)。

实施例8 二次超滤步骤对浓缩酶液中淀粉酶活力的影响

方法1同实施例5中的方法1

对比实验-方法5

(一)大麦芽粉碎同实施例1。

(二)浸提

(1)浸提液配制：100L纯化水加入偏亚硫酸氢钠0.25kg、焦亚硫酸钠0.25kg、亚硫酸氢钠0.25kg，硫代硫酸钠0.25kg和山梨酸钾0.05kg，充分混匀备用。

(2)淀粉酶提取：称取10kg大麦芽粉碎物进入步骤(1)配制的浸提液中，加入3g纤维素复合酶(β-葡聚糖酶活不低于8000U/g、纤维素酶活不低于200U/g、中性蛋白酶活不低于500U/g、木聚糖酶活不低于3000U/g)，充分混匀后，在常压下，加热并控制温度分别为30℃，调节pH值为5，搅拌提取时间分别为8小时。

(三)初滤同实施例1。

(四)富集同实施例1。

(五)沉淀同实施例1。

(六)精滤同实施例1。

(七)超滤浓缩仅超滤一次。

(八)调配同实施例1。

(九)二次精滤同实施例1。

(十)对提取的淀粉酶浓缩提取液的酶活力进行测定，测定方法同实施例2第(十)步。

结果如下：

表6二次超滤步骤对对浓缩酶液中淀粉酶活力的影响

	方法1	方法5
			酶活1(U/ml)	75万	65万
酶活2(U/ml)	72万	63万
			平均值(U/ml)	73.5万	64万

表6中结果表明，在大麦芽提取淀粉酶的过程中增加二次超滤步骤能明显提高淀粉酶的纯度(以酶活力表示)。

实施例9 二次精滤步骤对浓缩酶液中淀粉酶活力的影响

方法1同实施例5中的实施例1

对比实验-方法6

(一)大麦芽粉碎同实施例1。

(二)浸提

(1)浸提液配制：100L纯化水加入偏亚硫酸氢钠0.25kg、焦亚硫酸钠0.25kg、亚硫酸氢钠0.25kg，硫代硫酸钠0.25kg和山梨酸钾0.05kg，充分混匀备用。

(2)淀粉酶提取：称取10kg大麦芽粉碎物进入步骤(1)配制的浸提液中，加入3g纤维素复合酶(β-葡聚糖酶活不低于8000U/g、纤维素酶活不低于200U/g、中性蛋白酶活不低于500U/g、木聚糖酶活不低于3000U/g)，充分混匀后，在常压下，加热并控制温度分别为30℃，调节pH值为5，搅拌提取时间分别为8小时。

(三)初滤同实施例1。

(四)富集同实施例1。

(五)沉淀同实施例1。

(六)精滤同实施例1。

(七)超滤浓缩仅超滤一次。

(八)调配同实施例1。

(九)对提取的淀粉酶浓缩提取液的酶活力进行测定，测定方法同实施例2第(十)步。

结果如下：

表7二次精滤步骤对浓缩酶液中淀粉酶活力的影响

	方法1	方法6
			酶活1(U/ml)	75万	65万
酶活2(U/ml)	72万	63万
			平均值(U/ml)	73.5万	64万

表7中结果表明，在大麦芽提取淀粉酶的过程中增加二次精滤步骤能明显提高淀粉酶的纯度(以酶活力表示)。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种淀粉酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(一)大麦芽粉碎

将大麦芽置于粉碎机中粉碎，粉碎产物过80目筛，收集筛下物，称量、定额包装，并标明名称、重量、批号等内容备用；

(二)浸提

(1)浸提液配制：100L纯化水加入偏亚硫酸氢钠0.25kg、焦亚硫酸钠0.25kg、亚硫酸钠0.25kg，硫代硫酸钠0.25kg和山梨酸钾0.05kg，充分混匀备用；

(2)淀粉酶提取：称取10kg大麦芽粉碎物进入步骤(1)配制的所述浸提液中，另加入0～5g纤维素复合酶，充分混匀后，在常压下，加热并控制温度为20～45℃，调节pH值为5，搅拌提取4～20小时；

(三)初滤

将步骤(二)中的混合物料通过200～300目的过滤机加压过滤，将淀粉酶粗提取液与大麦芽粉碎物分离开来；

(四)富集

(1)按料液质量体积比1∶8(w/v)，将步骤(二)所述的大麦芽粉碎物加到步骤(三)所述的淀粉粗提取液中，按步骤(二)浸提4～20小时；

(2)重复步骤(三)及步骤(四)的(1)3次后，将得到的混合物料通过200～300目的过滤机加压过滤，收集滤液；

(五)沉淀

将0.15％氯化钙加入到步骤(四)所述的滤液中，搅拌15～25分钟后，将其静置6～8小时，待所述滤液沉淀分层后，收集上清液，进一步除杂；

(六)精滤

将2kg硅藻土加入到步骤(五)所述的上清液中，充分混合，进一步除去所述上清液中的大部分淀粉、果胶和大分子糖类，然后，过精滤板框进行精滤；

(七)超滤浓缩

将步骤(六)所得精滤液进入超滤浓缩器进行超滤浓缩，浓缩液中加入氯化铝(PAC)0.03％聚凝并调整pH到4.0-6.0，过滤去除杂质，滤液进行二次超滤，超滤浓缩的温度控制在20℃以下，超滤浓缩所采用的为4英寸卷式膜，截流分子量为10K道尔顿；

(八)调配

将超滤浓缩所得的所述淀粉酶浓缩液置于调配罐中，加入1％-8％(w/v)麦芽糊精，0.1％-0.5％(w/v)山梨酸钾、0.2％-1％苯甲酸钠，搅拌混匀；

(九)二次精滤

将步骤(八)所得的淀粉酶溶液加入硅藻土，过精滤板框进行精滤；

(十)无菌包装

将步骤(九)所得的淀粉酶溶液通过孔径为0.15μm～0.25μm的微管过滤机进行过滤除菌后，进行无菌罐装，即得到淀粉酶成品。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述淀粉酶成品是无菌包装的淀粉酶浓缩液。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述淀粉酶的酶活力不低于30万U/ml。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述纤维素复合酶的酶活力成分为β-葡聚糖酶活不低于8000U/g、纤维素酶活不低于200U/g、中性蛋白酶活不低于500U/g、木聚糖酶活不低于3000U/g。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述纤维素复合酶包括选自如下物种属的纤维素复合酶组成的组：腐质霉属、镰孢霉属、毁丝霉属、曲霉属、青霉属、木霉属。

6.根据权利要求1至3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述纤维素复合酶加入量为3g，相当于大麦芽干重的0.03％。

7.根据权利要求1至3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述浸提温度为30℃。

8.根据权利要求1至3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述浸提时间为8小时。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述淀粉酶的酶活力不低于70万U/ml。

10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述淀粉酶的酶活力不低于70万U/ml。

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