CN101979529B - 从麸皮中提取液态β-淀粉酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从麸皮中提取液态β-淀粉酶的方法，该方法以麸皮为原料，包括浸提、初滤、预富集、精滤、超滤浓缩、调配、酶活力调整等步骤。本发明能够有效增加超滤浓缩前滤液中β-淀粉酶的含量，减小膜过滤过程中的酶损失，提高回收率。且滤渣经风干或晒干后，仍可作饲料使用，进而降低生产成本，实现循环经济生产模式。

Description

从麸皮中提取液态β-淀粉酶的方法

技术领域

本发明涉及液态β-淀粉酶的提取方法，属于食品领域。

背景技术

β-淀粉酶(1，4-α-D-glucan maltohydrolase，EC 3.2.1.2)是一种外切型淀粉酶，作用于淀粉时，能从α-1，4糖苷键的非还原性末端顺次切下一个麦芽糖单位，生成麦芽糖及大分子的β-界限糊精，其对可溶性淀粉的水解率一般在50～60％左右。

β-淀粉酶广泛存在于大麦、小麦、大豆、甘薯等高等植物和一些微生物中。大麦和小麦中含量高，甘薯含量仅为大麦的1/2左右。由于微生物发酵法生产的β-淀粉酶活力低，成本高，而且，从细菌大规模生产β-淀粉酶是困难的。为此，工业上使用的β-淀粉酶都为植物来源。

β-淀粉酶能将淀粉转化为麦芽糖这一特性以及麦芽糖能够广泛应用于糖果、饮料、啤酒发酵甚至医药领域，因此引起了知名企业、科研院所及广大科研人员的注意，产生了一批专利成果或专利申请，如芬兰达尼斯科制糖公司的《提取β-淀粉酶的方法》(专利公开号CN 1491279A)、Suomen Sokeri Oy的《Process for the extraction of beta-amylase from barley grains》(US4675296)、中国科学院昆明植物研究所的《大豆β-淀粉酶的制备工艺》(专利公开号CN 1225943A)以及卢强福的《食品级高活力β-淀粉酶的生产方法》(专利公开号CN 101319205A，CN 101451127A)。

不过，由于直接从大麦、小麦、大豆、甘薯等植物原料中提取β-淀粉酶，原料成本高，单纯用于提取β-淀粉酶并不划算，难以实现持续化的商业利润。而麸皮为小麦加工面粉的副产物，大多直接当饲料使用，但麸皮中β-淀粉酶含量高，如果能成功实现从麸皮中工业化提取β-淀粉酶，势必带来巨额商业利润。此外，经提取β-淀粉酶后的麸皮“废料”，经晒干或风干后仍可作为饲料使用。因此，开发以麸皮为原料高效提取β-淀粉酶的新工艺具有十分诱人的商业前景。

无锡赛德生物工程有限公司的《液态β-淀粉酶制剂的制备方法》(专利公开号CN 101323849A)提出了一种从麸皮中提取β-淀粉酶的方法，但其存在以下问题：超滤浓缩前的滤液中β-淀粉酶含量不高，浓缩时酶活力损失大，回收率低。

发明内容

本发明所要解决的技术提供一种从麸皮中提取液态β-淀粉酶的方法，该方法能够有效增加超滤浓缩前滤液中β-淀粉酶的含量，减小膜过滤过程中的酶损失，提高回收率。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：以麸皮为原料，其工艺包括浸提、初滤、预富集、精滤、超滤浓缩、调配、酶活力调整，具体步骤如下：

(I)浸提

(A)浸提水的配制：按质量体积比在水中分别加入山梨酸钾：0.2～0.5％(w/v)、Na₂S₂O₅：0.2～1.2％(w/v)、NaHSO₃：0.2～1.0％(w/v)和Na₂S₂O₃：0～1％(w/v)；分别调节溶液酸度为4.0～7.0，温度为30～60℃；

(B)按料液质量体积比1∶5～10(w/v)，将麸皮加到步骤(A)配制的浸提水中，浸提0.5～10小时；

(II)初滤

浸提后，过100目的双层滤布，收集初滤液；滤渣经少量浸提水淋洗后所得淋洗液与初滤液合并，得合并液；

(III)预富集

(A)按料液质量体积比1∶5～10(w/v)，将麸皮加到步骤(II)得到的淋洗液和初滤液的合并液中，浸提0.5～10小时；

(B)重复步骤(II)及步骤(III)之(A)2～9次后，过100目的双层滤布，收集滤液；

(IV)精滤

将步骤(III)所得滤液过均匀涂有1.5～3％(w/v)硅藻土的300目滤布，进行板框过滤；或者以1000～4000rpm离心10-40分钟后，取上清液；得精滤液；

(V)超滤浓缩

精滤液通过超滤膜进行超滤浓缩，超滤膜排阻分子量1～8万道尔顿，滤温控制在5～15℃；可得酶活力在50万U/mL以上的液态β-淀粉酶；

(VI)调配

将超滤浓缩所得β-淀粉酶置于配方罐，加入1～8％(w/v)麦芽糊精，0.1～0.5％(w/v)山梨酸钾，搅拌混匀；

(VII)酶活力调整

测定配方罐内的酶活力，调节酶活力至不同商业β-淀粉酶的规格要求。

作为一种优选方案，所述步骤(I)之(A)中，浸提水按质量体积比在水中分别加入山梨酸钾：0.2～0.5％(w/v)、Na₂S₂O₅：0.5～1.0％(w/v)、NaHSO₃：0.3～0.6％(w/v)和Na₂S₂O₃：0～1％(w/v)配制而成。

本发明与现有技术相比较，由于最初浸提后的初滤液及淋洗液已分别含有一定量的β-淀粉酶，当将其合并充当下一次浸提的浸提液时，再次过滤的滤液和淋洗的淋洗液就含有更高浓度的高活力β-淀粉酶，如此反复循环数次，浸提后过滤的滤液中β-淀粉酶富集得越来越多，精滤所得的精滤液浓度必然会相应增大。因此再通过超滤膜进行浓缩时，滤膜吸附所造成的损失将会大大降低。根据上述制备工艺，可以生产出10万U/mL、15万U/mL、20万U/mL、30万U/mL等规格的液态β-淀粉酶。产品为棕褐色液体，无异味，能与水任意比互溶。产品作用的适宜温度为50～60℃，适宜酸度为pH4.0～7.0。该产品的热稳定性好，室温下保存8个月，酶活丧失不到5％。在产品中加入麦芽糊精和山梨酸钾，能进一步提高产品的稳定性。通过高效液相色谱表征酶解产物和对可溶性淀粉的水解率实验，酶解终产品不含葡萄糖，对可溶性淀粉的水解率为60％左右。这些充分说明该酶的纯度高，不含α-淀粉酶。此外，滤渣经风干或晒干后，仍可作饲料使用，进而降低生产成本，实现循环经济生产模式。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。实施例的酶活力测定采用如下DNS法：

1试剂

1.10.2M pH6.0的磷酸缓冲液

取磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O，国药集团化学试剂有限公司，AR)71.63g，磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O，国药集团化学试剂有限公司，AR)31.20g，用蒸馏水溶解使体积近1000mL，再用酸度计将溶液pH值调至6.0，定容至1000mL。1.2250mL 2％(w/v)的可溶性淀粉溶液

称取5.000±0.010g可溶性淀粉(洛阳化学试剂厂，AR)于小烧杯中，加少量蒸馏水(约20～30mL)，用玻璃棒调成浆料状，沿玻棒慢慢加到煮沸的蒸馏水(约150mL)中，烧杯和玻棒用少量蒸馏水洗涤2～3次，洗涤液一并归到煮沸的蒸馏水中，沸腾3min。待淀粉溶液透明澄清后，取下，加入步骤1.1配制的0.2M pH6.0的磷酸缓冲液25mL，冷至室温，转入250mL容量瓶中，用蒸馏水定容。

1.3DNS试剂

称取3，5-二硝基水杨酸(湖州菱湖精细化学试剂厂，CP)6.3g，苯酚(天津瑞金特化学品有限公司，AR)5g，无水亚硫酸钠(天津博迪化工有限公司，AR)5g，固体氢氧化钠(天津恒兴化学试剂有限公司，AR)10.48g，四水合酒石酸钾钠(洛阳化学试剂厂，AR)71.62g，用蒸馏水溶解后，定容至1000mL，于棕色瓶保存，放置两周后使用(说明：若有沉淀，应抽滤后使用)。

2.方法

2.1麦芽糖标准曲线

准确称取于105～110℃干燥至恒重(约2小时)的麦芽糖100mg，用蒸馏水溶解，定容至50mL容量瓶中，配成2mg/mL的麦芽糖标准溶液。按表1比例操作后，将各试管置于沸水浴中反应15min，迅速冷至室温。加入10.5mL蒸馏水稀释，摇匀，于550nm处比色测定。以OD值(y)为纵坐标，麦芽糖含量(mg)为横坐标，作麦芽糖标准曲线，线性回归方程为y＝Ax+B，相关系数在0.99以上方可。该曲线用于计算酶与淀粉反应过程中生成的还原糖量，进而计算酶活力。

表1麦芽糖标准曲线的操作

2.2酶活力方法测定

将一定稀释倍数(n倍)的酶液和步骤1.2配制的2％(w/v)的可溶性淀粉溶液9.9mL，分别于50℃水浴中预热3～5min。取0.1mL酶液(对照为0.1mL可溶性淀粉溶液)加到9.9mL 2％(w/v)的可溶性淀粉溶液中反应15min。取上述反应液0.1mL到1.5mL DNS+0.4mL蒸馏水试剂中，摇匀，沸水浴15min后，取出。迅速冷至室温，加入10.5mL蒸馏水，摇匀，于550nm处测OD值(OD值在0.1-0.65之间有效，超过0.70表明可溶性淀粉近水解完，酶液应稀释)，还原糖折算成麦芽糖量表示。

酶活力单位定义：在50℃、pH 6.0条件下，每小时水解2％(w/v)可溶性淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶量为一个酶活力单位(1U)。

2.3酶活力的计算

$\frac{(\mathrm{OD}-B)}{A}\×\frac{10}{0.1}\×\frac{1.0}{0.1}\×\frac{60}{15}\×n$ (U/mL或U/g)

式中：

——0.1mL反应液中的麦芽糖量/mg

——0.1mL酶液15分钟水解9.9mL2％可溶性淀粉生成麦芽糖量/mg

——将0.1mL酶液转化为1.0mL酶液

——15分钟转化为1小时

n——稀释倍数

实施例1

(I)浸提

(A)浸提水的配制：按质量体积比在水中分别加入山梨酸钾：0.3％(w/v)、Na₂S₂O₅：0.5％(w/v)、NaHSO₃：1.0％(w/v)和Na₂S₂O₃：0.1％(w/v)；分别调节溶液酸度为5.0，温度为50℃；

(B)将200kg麸皮加到1600L步骤(A)配制的浸提水中，浸提1.0小时；

(II)初滤

浸提后，过100目的双层滤布，收集初滤液；滤渣经400L浸提水淋洗后所得淋洗液与初滤液合并，得合并液，合并液体积约1600L；

(III)预富集

(A)将200Kg麸皮加到步骤(II)得到的合并液中，浸提1.0小时；

(B)重复步骤(II)及步骤(III)之(A)4次后，过100目的双层滤布，收集滤液；

(IV)精滤

将步骤(IV)所得滤液过均匀涂有2％(w/v)硅藻土的300目滤布，进行板框过滤；得精滤液；

(V)超滤浓缩

精滤液通过超滤膜进行超滤浓缩，超滤膜排阻分子量2万道尔顿，滤温控制在15℃；可得酶活力在50万U/mL以上的液态β-淀粉酶；

(VI)调配

将超滤浓缩所得β-淀粉酶置于配方罐，加入3％(w/v)麦芽糊精，0.3％(w/v)山梨酸钾，搅拌混匀；

(VII)酶活力调整

测定配方罐内的酶活力，调节酶活力至10万U/mL、15万U/mL、20万U/mL、30万U/mL等规格。

实施例2

(I)浸提

(A)浸提水的配制：按质量体积比在水中分别加入山梨酸钾：0.3％(w/v)、Na₂S₂O₅：1.0％(w/v)、NaHSO₃：0.3％(w/v)和Na₂S₂O₃：0.2％(w/v)；分别调节溶液酸度为5.0，温度为50℃；

(B)将1000kg麸皮加到10000L步骤(A)配制的浸提水中，浸提1.0小时；

(II)初滤

浸提后，过100目的双层滤布，收集初滤液；滤渣经2500L浸提水淋洗后所得淋洗液与初滤液合并，得合并液，合并液体积约10000L；

(III)预富集

(A)将1000Kg麸皮加到步骤(II)得到的合并液中，浸提1.0小时；

(B)重复步骤(II)及步骤(III)之(A)7次后，过100目的双层滤布，收集滤液；

(IV)精滤

将步骤(IV)所得滤液过过4000rpm的离心机离心20分钟，取上清液进；得精滤液；

(V)超滤浓缩

精滤液通过超滤膜进行超滤浓缩，超滤膜排阻分子量2万道尔顿，滤温控制在15℃；可得酶活力在50万U/mL以上的液态β-淀粉酶；

(VI)调配

将超滤浓缩所得β-淀粉酶置于配方罐，加入8％(w/v)麦芽糊精，0.3％(w/v)山梨酸钾，搅拌混匀；

(VII)酶活力调整

测定配方罐内的酶活力，调节酶活力至10万U/mL、15万U/mL、20万U/mL、30万U/mL等规格。

Claims (2)

1.一种从麸皮中提取液态β-淀粉酶的方法，包括浸提、初滤、预富集、精滤、超滤浓缩、调配、酶活力调整步骤，其特征在于：

I、浸提

A.浸提水的配制：按质量体积比在水中分别加入山梨酸钾：0.2-0.5％、Na₂S₂O₅：0.2-1.2％、NaHSO₃：0.2-1.0％和Na₂S₂O₃：0-0.2％；分别调节溶液酸度为4.0-7.0，温度为30-60℃；

B.按料液质量体积比1：5-10，将麸皮加到步骤A配制的浸提水中，浸提0.5-10小时；

II、初滤

浸提后，过100目的双层滤布，收集初滤液；滤渣经少量浸提水淋洗后所得淋洗液与初滤液合并，得合并液；

III、预富集

A.按料液质量体积比1：5-10，将麸皮加到步骤II得到的淋洗液和初滤液的合并液中，浸提0.5-10小时；

B.重复II步骤及III之A步骤4-7次后，过100目的双层滤布，收集滤液；

IV、精滤

将步骤IV所得滤液过均匀涂有1.5-3％硅藻土的300目滤布，进行板框过滤；或者以1000-4000rpm离心10-40分钟后，取上清液；得精滤液；

V、超滤浓缩

精滤液通过超滤膜进行超滤浓缩，超滤膜排阻分子量1-2万道尔顿，滤温控制在5-15℃；可得酶活力在50万U/mL以上的液态β-淀粉酶；

VI、调配

将超滤浓缩所得β-淀粉酶置于配方罐，加入1-8％麦芽糊精，0.1-0.5％山梨酸钾，搅拌混匀；

VII、酶活力调整

测定配方罐内的酶活力，调节酶活力至不同商业β-淀粉酶的规格要求。

2.如权利要求1所述的从麸皮中提取液态β-淀粉酶的方法，其特征在于所述I之A步骤中，浸提水按质量体积比在水中分别加入山梨酸钾：0.2-0.5％、Na₂S₂O₅：0.5-1.0％、NaHSO₃：0.3-0.6％和Na₂S₂O₃：0-0.1％配制而成。