CN103484512A - 一种固定化细胞生产高功能性三糖含量的低聚异麦芽糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种固定化细胞生产高功能性三糖含量的低聚异麦芽糖的方法。该方法以淀粉为原料，经液化、糖化制得麦芽糖浆，并采用固定化黑曲霉细胞技术与模拟移动床色谱分离技术联产制备高功能性三糖含量低聚异麦芽糖。本方法中糖化液经过固定化细胞转苷后异麦芽糖（IG₂）、潘糖（P）和异麦芽三糖（IG₃）三种功能性组分总量达到60%以上，固定化细胞底物转化率高于固定化酶，所得产品的指标远远高于国内外同类产品，经色谱分离后三种功能性组分可达90%以上，同时大大缩短反应时间，操作便利，适合大规模连续化生产。

Description

一种固定化细胞生产高功能性三糖含量的低聚异麦芽糖的方法

技术领域

本发明涉及一种固定化细胞生产高功能性三糖含量的低聚异麦芽糖的方法，特别涉及一种利用固定化细胞与模拟移动床色谱分离技术联产制备高功能性三糖含量低聚异麦芽糖的方法，属于淀粉糖生产技术领域。

背景技术

低聚异麦芽糖是功能性低聚糖中产量最大、应用最广泛的一种糖，在人体大肠中不能被有害菌利用，但能有效促进双歧杆菌的增殖，从而促进胃肠道蠕动，改善胃肠道微生态环境，提高机体免疫力，分解肠内毒素与致癌物质，同时低聚异麦芽糖还具有防龋齿的功能，可降低人体内胆固醇和血脂水平。

目前，低聚异麦芽糖是以淀粉为原料采用多种酶联合作用经过液化、糖化、转苷等操作，以生产尽可能多的异麦芽糖（IG₂）、潘糖（P）和异麦芽三糖（IG₃）等功能性成分。市场上低聚异麦芽糖产品主要有两种规格，分别是IMO‐50型（IG₂+P+IG₃+G_n≥50%，IG₂+P+IG₃≥35%）和IMO‐90型（IG₂+P+IG₃+G_n≥90%，IG₂+P+IG₃≥45%），其中IG₂、P、IG₃是体现低聚异麦芽糖功能性的主要成分，其含量高低反映了产品质量的好坏，也影响产品的应用和价格前景。

采用传统工业化生产工艺生产的产品存在诸多问题，产品中功能性三糖的含量不高，糖化转苷后三糖含量维持在35‐40%之间，即使经过发酵纯化也难以突破50%，同时，转葡萄糖苷酶采用进口产品，成本过高，并且糖化、发酵时间过长，料液透射比降低，产生异味，难以实现连续化生产。

固定化细胞技术起源于20世纪70年代，是在固定化酶的基础上发展起来的新技术，固定化细胞能在固定后继续进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，并且代替游离细胞以及固定化酶来生产所需产品，正越来越受到更多关注。固定化细胞技术与固定化酶法相比可以省去酶的分离纯化工作，减少酶活性损失，同时固定在细胞环境中的酶比纯化后的酶更为稳定。

目前固定化技术生产低聚异麦芽糖集中于固定化酶领域，而固定化细胞及与模拟移动床色谱分离技术联产低聚异麦芽糖尚未见研究报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种固定化细胞生产高功能性三糖含量的低聚异麦芽糖的方法。

术语说明

IG₂+P+IG₃：异麦芽糖、潘糖和异麦芽三糖占干物质的质量百分比。

DE值：还原糖（以葡萄糖计）占糖浆干物质的质量百分比。

本发明的技术方案如下：

一种固定化细胞生产高功能性三糖含量的低聚异麦芽糖的方法，包括如下步骤：

（1）将产α‐转葡萄糖苷酶菌株采用海藻酸钠‐氯化钙‐壳聚糖法固定化，制备固定化细胞，然后按柱体积的20～80%向柱体内装入固定化细胞，制得固定化细胞柱；

所述步骤（1）中的α‐转葡萄糖苷酶菌株为黑曲霉（Aspergillus niger）BLB‐28菌株；

（2）将淀粉质原料经过液化、糖化得到麦芽糖质量百分含量40～90%、固形物质量百分含量30～55%的麦芽糖浆；

（3）调节步骤（2）制得的麦芽糖浆pH为3.5～6.0，通入步骤（1）制得的固定化细胞柱，固定化细胞柱中麦芽糖浆：固定化细胞体积比为（3～10）：1，麦芽糖浆通入速度为0.5～12倍固定化细胞（装柱）体积/h，持续循环反应20～60h，收集获得IG₂+P+IG₃不小于60%的低聚异麦芽糖粗液；

（4）将步骤（3）制得的低聚异麦芽糖粗液经纯化、干燥，制得低聚异麦芽糖。

所述步骤（1）中的α‐转葡萄糖苷酶菌株为黑曲霉（Aspergillus niger）BLB‐28菌株，保藏号为CGMCC No.5143，购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）。经研究发现，该菌株与其他菌株相比是高转葡萄糖苷酶表达量的菌株，同时所产转葡萄糖苷酶为胞外酶，在菌株被固定后底物无需通过细胞膜在胞外即可实现高效转化。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中的海藻酸钠‐氯化钙‐壳聚糖法固定化的具体步骤为：

取α‐转葡萄糖苷酶菌株的种子液，滤除质量百分比为10%～40%的水分，制得除水种子液，然后加入质量百分比浓度为3%的海藻酸钠溶液，除水种子液：海藻酸钠溶液的质量比为1：（1～5），搅拌均匀，然后向质量浓度为3%的氯化钙溶液中匀速滴加，固定4～12h后，取出固定化的胶珠颗粒，清洗后，浸入pH5～7的氯化钙和壳聚糖的混合液中，氯化钙质量百分比浓度为0.5～3%，壳聚糖质量百分比浓度为0.1～2%，继续浸泡6‐12h，清洗后，即得。

根据本发明优选的，所述步骤（2）中的淀粉质原料为玉米淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉、碎米淀粉。

根据本发明优选的，所述步骤（2）中的液化为二次喷射液化。进一步优选的，淀粉乳质量浓度为20～40%，pH值5.5～6.5，高温α-淀粉酶的添加量为0.2～0.8L/吨淀粉，一次喷射液化温度108℃，二次喷射液化温度125℃，液化液DE值为10～22%。

根据本发明优选的，所述步骤（2）中的糖化，糖化酶为质量占40～60%的真菌淀粉酶、质量占20～40%的β‐淀粉酶和质量占5～20%的普鲁兰酶混合后的复合糖化酶，复合糖化酶添加量为每吨淀粉0.15～0.5L，反应温度58～60℃，反应时间12～24h。

根据本发明优选的，所述步骤（4）中的纯化，步骤如下：

将步骤（3）制得的低聚异麦芽糖粗液浓缩至固形物质量百分比含量为55～65%，在压力0.2～0.4MPa、温度55～75℃、水耗比1：（1.5～2）、每小时进料量1.5～2.5m³的条件下，经色谱分离，制得IG₂+P+IG₃含量90%以上的低聚异麦芽糖浆和葡萄糖含量75%以上的葡萄糖浆。

根据本发明优选的，所述步骤（4）中的干燥为经过真空蒸发干燥浓缩至固形物质量百分含量50～60%的液体产品，或经真空蒸发干燥制得的液体产品继续经真空干燥或喷雾干燥至固态产品。

有益效果

1、本发明采用固定化黑曲霉细胞技术生产低聚异麦芽糖，将环境因素对酶活的影响降到最低，为α‐转葡萄糖苷酶提供稳定高效的产酶环境，底物转化效率高，无需进行其他纯化处理，转苷后料液功能性三糖含量＞60%，远远高于传统工艺，对三糖含量无特殊要求的产品可无需色谱分离，直接浓缩出料；

2、采用海藻酸钠‐氯化钙‐壳聚糖固定化方法，操作步骤简便，同时固定化细胞机械强度高，固定化细胞可重复使用40批无破碎，重复使用60批以上轻微破碎，有利于工业化生产实施；

3、料液无需活性炭脱色，不需离子交换柱脱盐，一次浓缩后进入色谱分离，使整个工艺简化，操作便利；

4、低聚异麦芽糖粗液进入连续模拟移动床进行色谱分离，耗水减少，每小时进料量增加，分离效率加快，缩短工艺时间，分离出残留的葡萄糖，既提高低聚异麦芽糖的产品纯度，同时回收葡萄糖，藕联生产高果糖浆，提高原材料利用率。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

生物材料来源

黑曲霉（Aspergillus niger）BLB‐28菌株，该菌株保藏号为CGMCC No5143，购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

真菌淀粉酶购自诺维信公司，该产品为液态，酶活2500FAU/g；

β‐淀粉酶购自诺科生化工程有限公司，该产品为液态，酶活3000MANU/g；

普鲁兰酶购自杰能科公司，该产品为液态，酶活1000ASPU/g。

设备说明

色谱分离系统为购自法国诺华赛公司Applexion型号的色谱分离装置。

实施例1

一种固定化细胞生产高功能性三糖含量的低聚异麦芽糖的方法，步骤如下：

（1）将含有黑曲霉（Aspergillus niger）BLB‐28菌株的种子液，滤除质量百分比为10%的水分，然后与质量浓度为3%的海藻酸钠以1：1的体积比混合均匀，再均匀滴入质量浓度为3%的氯化钙溶液中固定4h，取出固定化的胶珠颗粒，清水洗净，浸入pH5‐7、含质量浓度为0.5%氯化钙和质量浓度为0.1%壳聚糖的混合溶液，再浸泡6h，然后按柱体积的20%向柱体内装入固定化细胞，制得固定化细胞柱；

（2）采用玉米淀粉调浆，调浆浓度为20%（质量浓度），并调节pH为5.5，加入高温α‐淀粉酶，添加量为每吨淀粉添加0.2L，然后送入液化喷射器，一次喷射温度108℃，二次喷射液化温度125℃，出料DE值为11.2%，制得液化液；

向液化液中加入复合糖化酶（其中真菌淀粉酶的质量占40%、β‐淀粉酶的质量占40%、普鲁兰酶的质量占20%），添加量为每吨淀粉加入复合糖化酶0.4L，在58～60℃下，保温反应12h，制得麦芽糖质量百分含量40.7%、固形物质量百分含量22%的麦芽糖浆；

（3）调节步骤（2）制得的麦芽糖浆pH为3.5，通过蠕动泵将麦芽糖浆送入步骤（1）制得的固定化细胞柱中，控制固定化细胞柱中麦芽糖浆与固定化细胞的体积比为3：1，调节蠕动泵流速为0.5倍装柱体积/h，持续循环反应20h，收集出料料液即为低聚异麦芽糖粗液；经测定，IG₂+P+IG₃含量为60.35%，详见表1；

（4）将步骤（3）制得的低聚异麦芽糖粗液浓缩至固形物质量百分比含量为55%，进入色谱分离系统，色谱运行压力0.2MPa，温度55℃，水耗比1：1.5，每小时进料1.5m³，得到的低聚异麦芽糖浆经过高效液相检测，IG₂+P+IG₃含量为90.7%，葡萄糖质量百分比含量为0.33%，详见表1；通过真空蒸发器浓缩至固形物质量百分比含量50%，制得IG₂+P+IG₃含量＞90%的低聚异麦芽糖。同时经色谱分离系统后获得葡萄糖质量百分比含量为75.2%的葡萄糖浆。

实施例2

一种固定化细胞生产高功能性三糖含量的低聚异麦芽糖的方法，步骤如下：

（1）将含有黑曲霉（Aspergillus niger）BLB‐28菌株的种子液，滤除质量百分比为40%的水分，然后与质量浓度为3%的海藻酸钠以1：5的体积比混合均匀，再均匀滴入质量浓度为3%的氯化钙溶液中固定12h，取出固定化的胶珠颗粒，清水洗净，浸入pH5‐7、含质量浓度为3%氯化钙和质量浓度为2%壳聚糖的混合溶液，再浸泡12h，然后按柱体积的80%向柱体内装入固定化细胞，制得固定化细胞柱；

（2）采用玉米淀粉调浆，调浆浓度为40%（质量浓度），并调节pH为6.5，加入高温α‐淀粉酶，添加量为每吨淀粉添加0.8L，然后送入液化喷射器，一次喷射温度108℃，二次喷射液化温度125℃，出料DE值为21.5%，制得液化液；

向液化液中加入复合糖化酶（其中真菌淀粉酶的质量占60%、β‐淀粉酶的质量占30%、普鲁兰酶的质量占10%），添加量为每吨淀粉加入复合糖化酶1.0L，在58～60℃下，保温反应24h，制得麦芽糖质量百分含量87.3%、固形物质量百分含量51%的麦芽糖浆；

（3）调节步骤（2）制得的麦芽糖浆pH为6.0，通过蠕动泵将麦芽糖浆送入步骤（1）制得的固定化细胞柱中，控制固定化细胞柱中麦芽糖浆与固定化细胞的体积比为10：1，调节蠕动泵流速为12倍装柱体积/h，持续循环反应60h，收集出料料液即为低聚异麦芽糖粗液；经测定，IG₂+P+IG₃含量为65.12%，详见表1；

（4）将步骤（3）制得的低聚异麦芽糖粗液浓缩至固形物质量百分比含量为65%，进入色谱分离系统，色谱运行压力0.4MPa，温度75℃，水耗比1：2，每小时进料2.5m³，得到的低聚异麦芽糖浆经过高效液相检测，IG₂+P+IG₃含量为91.9%，葡萄糖质量百分比含量为0.42%；通过真空蒸发器浓缩至固形物质量百分比含量60%，制得IG₂+P+IG₃含量＞90%的低聚异麦芽糖。同时经色谱分离系统后获得葡萄糖质量百分比含量78.31%的葡萄糖浆。

实施例3

一种固定化细胞生产高功能性三糖含量的低聚异麦芽糖的方法，步骤如下：

（1）将含有黑曲霉（Aspergillus niger）BLB‐28菌株的种子液，滤除质量百分比为20%的水分，然后与质量浓度为3%的海藻酸钠以1：2的体积比混合均匀，再均匀滴入质量浓度为3%的氯化钙溶液中固定6h，取出固定化的胶珠颗粒，清水洗净，浸入pH5‐7、含质量浓度为2%氯化钙和质量浓度为1%壳聚糖的混合溶液，再浸泡12h，然后按柱体积的70%向柱体内装入固定化细胞，制得固定化细胞柱；

（2）采用玉米淀粉调浆，调浆浓度为32%（质量浓度），并调节pH为6.3，加入高温α‐淀粉酶，添加量为每吨淀粉添加0.3L，然后送入液化喷射器，一次喷射温度108℃，二次喷射液化温度125℃，出料DE值为18.8%，制得液化液；

向液化液中加入复合糖化酶（其中真菌淀粉酶的质量占60%、β‐淀粉酶的质量占25%、普鲁兰酶的质量占15%），添加量为每吨淀粉加入复合糖化酶0.6L，在58～60℃下，保温反应20h，制得麦芽糖质量百分含量55.7%、固形物质量百分含量35%的麦芽糖浆；

（3）调节步骤（2）制得的麦芽糖浆pH为4.5，通过蠕动泵将麦芽糖浆送入步骤（1）制得的固定化细胞柱中，控制固定化细胞柱中麦芽糖浆与固定化细胞的体积比为8：1，调节蠕动泵流速为9倍装柱体积/h，持续循环反应55h，收集出料料液即为低聚异麦芽糖粗液；经测定，IG₂+P+IG₃含量为64.77%，详见表1；

（4）将步骤（3）制得的低聚异麦芽糖粗液浓缩至固形物质量百分比含量为58%，进入色谱分离系统，色谱运行压力0.3MPa，温度65℃，水耗比1：2，每小时进料2.5m³，得到的低聚异麦芽糖浆经过高效液相检测，IG₂+P+IG₃含量为91.7%，葡萄糖质量百分比含量为0.32%；通过真空蒸发器浓缩至固形物质量百分比含量55%，制得IG₂+P+IG₃含量＞90%的低聚异麦芽糖。同时经色谱分离系统后获得葡萄糖质量百分比含量77.37%的葡萄糖浆。

对比例1

一种低聚异麦芽糖的制备方法，步骤如下：

（1）玉米淀粉调浆，调浆浓度为32%（质量浓度），并调节pH为6.3，加入高温α‐淀粉酶，添加量为0.3L/吨淀粉，将淀粉乳送入液化喷射器，一次喷射温度108℃，二次喷射液化温度125℃，出料DE值为18.8%，制得液化液；

（2）向液化液中加入复合糖化酶（其中真菌淀粉酶的质量占60%、β‐淀粉酶的质量占25%、普鲁兰酶的质量占15%），添加量为每吨淀粉加入复合糖化酶0.6L，在58～60℃下，保温反应20h，制得麦芽糖质量百分含量55.7%、固形物质量百分含量35%的麦芽糖浆；

（3）调节上述麦芽糖浆pH为4.5，加入现有市售α‐转葡萄糖苷酶，每吨淀粉加入1.0Lα‐转葡萄糖苷酶，在58～60℃下，保温48h后，取样灭酶活，经测定，IG₂+P+IG₃含量为35.78%；

对比例2

一种低聚异麦芽糖的制备方法，步骤如下：

（1）玉米淀粉调浆，调浆浓度为32%（质量浓度），并调节pH为6.3，加入高温α‐淀粉酶，添加量为0.3L/吨淀粉，将淀粉乳送入液化喷射器，一次喷射温度108℃，二次喷射液化温度125℃，出料DE值为18.8%，制得液化液；

（2）向液化液中加入复合糖化酶（其中真菌淀粉酶的质量占60%、β‐淀粉酶的质量占25%、普鲁兰酶的质量占15%），添加量为每吨淀粉加入复合糖化酶0.6L，在58～60℃下，保温反应20h，制得麦芽糖质量百分含量55.7%、固形物质量百分含量35%的麦芽糖浆；

（3）调节麦芽糖浆pH为4.5，通过蠕动泵将麦芽糖浆送入固定化α‐转葡萄糖苷酶柱中，固定化酶装柱体积为整个柱体积的70%；α‐转葡萄糖苷酶的固定化方法采用现有固定化技术，具体步骤可参见中国专利文献CN102296032A（申请号201110254748.0）中说明书实施例5的方法。

（4）调节蠕动泵流速为9倍装柱体积/h，该过程持续55h，收集出料料液，经测定，IG₂+P+IG₃含量为44.32%。

对比例3

一种BLB‐28种子液制备低聚异麦芽糖的方法，步骤如下：

（1）玉米淀粉调浆，调浆浓度为32%（质量浓度），并调节pH为6.3，加入高温α‐淀粉酶，添加量为0.3L/吨淀粉，将淀粉乳送入液化喷射器，一次喷射温度108℃，二次喷射液化温度125℃，出料DE值为18.8%，制得液化液；

（2）向液化液中加入复合糖化酶（其中真菌淀粉酶的质量占60%、β‐淀粉酶的质量占25%、普鲁兰酶的质量占15%），添加量为每吨淀粉加入复合糖化酶0.6L，在58～60℃下，保温反应20h，制得麦芽糖质量百分含量55.7%、固形物质量百分含量35%的麦芽糖浆；

（3）调节麦芽糖浆pH为4.5，并向其中加入黑曲霉BLB‐28种子液，控制麦芽糖浆与种子液体积比为3：1，保温48h后，取样灭菌，经测定，其组分：IG₂+P+IG₃的质量百分比含量为48.1%；

表1低聚异麦芽糖（IMO）组分分析表

游离细胞经固定化后，往往都涉及到细胞本身的变化或微环境的改变，从而使细胞的催化动力学性质发生改变，最终影响酶的天然活力，但目前一般均是小幅降低酶活或基本不变。但本发明在黑曲霉细胞种子液固定后，细胞继续进行生长繁殖，同时固定化过程中的操作大大增加了细胞膜的通透性，使细胞产生的转葡萄糖苷酶更快的分泌到胞外，大大加快了与外界的底物作用生成产物的速度，同时柱式反应使固定化细胞附近的底物浓度较高，最终使低聚异麦芽糖的产率大幅提高。

Claims (8)

1.一种固定化细胞生产高功能性三糖含量的低聚异麦芽糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将产α‐转葡萄糖苷酶菌株采用海藻酸钠‐氯化钙‐壳聚糖法固定化，制备固定化细胞，然后按柱体积的20～80%向柱体内装入固定化细胞，制得固定化细胞柱；

所述步骤（1）中的α‐转葡萄糖苷酶菌株为黑曲霉（Aspergillus niger）BLB-28菌株；

（2）将淀粉质原料经过液化、糖化得到麦芽糖质量百分含量40～90%、固形物质量百分含量30～55%的麦芽糖浆；

（3）调节步骤（2）制得的麦芽糖浆pH为3.5～6.0，通入步骤（1）制得的固定化细胞柱，固定化细胞柱中麦芽糖浆：固定化细胞体积比为（3～10）：1，麦芽糖浆通入速度为0.5～12倍固定化细胞体积/h，持续循环反应20～60h，收集获得IG₂+P+IG₃不小于60%的低聚异麦芽糖粗液；

（4）将步骤（3）制得的低聚异麦芽糖粗液经纯化、干燥，制得低聚异麦芽糖。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的海藻酸钠-氯化钙-壳聚糖法固定化的具体步骤为：

取α-转葡萄糖苷酶菌株的种子液，滤除质量百分比为10%～40%的水分，制得除水种子液，然后加入质量百分比浓度为3%的海藻酸钠溶液，除水种子液：海藻酸钠溶液的质量比为1：（1～5），搅拌均匀，然后向质量浓度为3%的氯化钙溶液中匀速滴加，固定4～12h后，取出固定化的胶珠颗粒，清洗后，浸入pH5～7的氯化钙和壳聚糖的混合液中，氯化钙质量百分比浓度为0.5～3%，壳聚糖质量百分比浓度为0.1～2%，继续浸泡6～12h，清洗后，即得。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的淀粉质原料为玉米淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉、碎米淀粉。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的液化为二次喷射液化。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，淀粉乳质量浓度为20～40%，pH值5.5～6.5，高温α-淀粉酶的添加量为0.2～0.8L/吨淀粉，一次喷射液化温度108℃，二次喷射液化温度125℃，液化液DE值为10～22%。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的糖化，糖化酶为质量占40～60%的真菌淀粉酶、质量占20～40%的β-淀粉酶和质量占5～20%的普鲁兰酶混合后的复合糖化酶，复合糖化酶添加量为每吨淀粉0.15～0.5L，反应温度58～60℃，反应时间12～24h。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中的纯化，步骤如下：

将步骤（3）制得的低聚异麦芽糖粗液浓缩至固形物质量百分比含量为55～65%，在压力0.2～0.4MPa、温度55～75℃、水耗比1：（1.5～2）、每小时进料量1.5～2.5m³的条件下，经色谱分离，制得IG₂+P+IG含量90%以上的低聚异麦芽糖浆和葡萄糖含量75%以上的葡萄糖浆。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中的干燥为经过真空蒸发干燥浓缩至固形物质量百分含量50～60%的液体产品，或经真空蒸发干燥制得的液体产品继续经真空干燥或喷雾干燥至固态产品。