CN104878054B - 一种无载体固定化黑曲霉生产低聚异麦芽糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种无载体固定化黑曲霉生产低聚异麦芽糖的方法，通过培养黑曲霉（Aspergillus niger）M1收集菌丝体后，将其与助滤剂以适宜重量比混合，搅拌均匀后装入填充柱反应器中，制得无载体固定化细胞填充柱，通过流加方式生产有效三糖（IG+P+IG3）含量为35～70%的低聚异麦芽糖。本发明采用的黑曲霉（Aspergillus niger）M1，所产α‑葡萄糖苷酶为胞内酶，因此菌体细胞即为酶的天然载体，无需再使用其它传统的有机或无机载体对菌体进行固定化。与传统载体固定化细胞技术相比，这种无载体固定化技术具有工艺操作简便、辅助材料消耗少、不用特殊设备、菌体细胞使用寿命长、生产强度大等优点。
Description
技术领域
本发明属于低聚糖生产技术领域，特别涉及到一种无载体固定化黑曲霉生产低聚异麦芽糖的方法。
背景技术
低聚异麦芽糖（Isomaltooligosaccharides, IMO），是由一系列聚合度为2-10的葡聚糖组成的混合物，它们的分子中均至少带有1个α-(1,6)糖苷键，其中含量较多的成分为异麦芽糖（Isomaltose，IG）、潘糖（Panose，P）和异麦芽三糖（Isomaltotriose，IG3），这三种组分称之为有效三糖，其含量高低是评价低聚异麦芽糖产品质量的主要指标，也是影响产品应用范畴和市场价格的关键因素。IMO是目前应用最广泛、需求量最大的低聚糖类功能性甜味剂，具有低热量、抗龋齿、促进机体肠道双歧杆菌增殖等特殊生理功能，现已广泛应用于食品、医药及保健品、饲料等行业，国内年消费量达数万吨。
目前，低聚异麦芽糖工业化生产的经典工艺是先将淀粉原料经液化、糖化后，再用游离的α-葡萄糖苷酶进行转苷制备。该生产工艺最早是由日本企业（天野株式会社、林原生工）创立，是目前最成熟、应用最广的低聚异麦芽糖主流生产工艺。近年来对于该工艺的改进，主要集中在α-葡萄糖苷酶固定化及重复使用、简化合并糖化转苷工序并缩短该过程时间以及IMO产品中有效三糖含量的提高上。其中，固定化α-葡萄糖苷酶相对于游离α-葡萄糖苷酶，具有更好的稳定性和重复使用性，可大幅度降低生产成本，因此得到了更加广泛的研究和发展。
固定化细胞技术是在上世纪七十年代在固定化酶基础上发展起来的一项新型生物技术。固定化细胞与固定化酶法相比，操作更加方便，省去了酶的分离纯化过程，可进一步节约生产费用；保持了酶的原始状态，提高了其稳定性，进一步减少了酶活性损失。多国研究人员尝试将固定化细胞技术应用于低聚异麦芽糖制备，以期简化生产工艺、降低生产成本。然而，由于目前报道的微生物来源α-葡萄糖苷酶多为胞外酶，而菌体细胞被固定后，其所分泌的酶仍将以游离酶形式存在，无法充分发挥固定化细胞的优势。因此，目前固定化技术生产低聚异麦芽糖仍集中于固定化酶领域。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种无载体固定化黑曲霉生产低聚异麦芽糖的方法。本发明方法提供的无载体固定化黑曲霉细胞可实现连续化制取有效三糖（IG+P+IG3）含量35～70%的低聚异麦芽糖，生产工艺简便、生产成本低。
本发明采用的黑曲霉（Aspergillus niger）M1，其所产α-葡萄糖苷酶为胞内酶，而不是胞外酶，因此该菌株十分适用于固定化细胞技术。此外，由于菌体细胞即为酶的天然载体，而无需再使用其它传统的有机或无机载体对菌体进行固定化，可通过无载体固定化技术制备低聚异麦芽糖。与传统载体固定化细胞技术相比，这种无载体固定化细胞技术具有操作简便、辅助材料消耗少、只需添加少量助滤剂、反应器中菌体浓度高、生产强度大、连续使用寿命长等显著优点。目前，利用无载体固定化细胞技术生产低聚异麦芽糖的研究尚未见报道。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
（1）液体培养黑曲霉（Aspergillus niger）M1，收集菌丝体；
（2）将上述黑曲霉菌丝体与助滤剂以重量比为1：（0～10）混合，搅拌均匀，然后装入填充柱反应器中，制成无载体固定化细胞填充柱（菌丝体能够自己交联成团装结构，无需再使用其它传统的有机或无机载体对菌体进行固定化）；
（3）将固形物质量百分含量5～50%的麦芽糖浆调节pH4～4.5，然后流加至上述无载体固定化细胞填充柱，反应温度45～65℃，反应时间3～24h后，收集填充柱流出液，即制得有效三糖（IG+P+IG3）含量为35～70%的低聚异麦芽糖。
所述黑曲霉（Aspergillus niger）M1，保藏编号CCTCC NO:M2014421，保藏日期为2014年9月23日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学。
所述步骤（1）的具体方法为：以黑曲霉（Aspergillus niger）M1为发酵菌种，在30～35℃条件下在培养24h～48h后，发酵液经离心或膜分离技术收集菌体；所述膜分离技术为真空抽滤、板框过滤或超滤中的任意一种。
所述步骤（2）中的助滤剂为硅藻土、高岭土、珍珠岩、硅胶粉、酸性白土、活性炭、纤维素或锯屑中的一种或其组合物。
所述步骤（3）中固形物质量百分含量5～50%的麦芽糖浆为利用薯类淀粉或谷类淀粉，例如木薯淀粉、马铃薯淀粉、红薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉或大米淀粉经α-淀粉酶或真菌淀粉酶液化，然后用β-淀粉酶或真菌淀粉酶糖化后制取；或市售麦芽糖浆产品。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明采用的黑曲霉（Aspergillus niger）M1，其所产α-葡萄糖苷酶为胞内酶，因此菌体细胞即为酶的天然载体，其能够自己交联成团装结构，无需再使用其它传统的有机或无机载体对菌体进行固定化。与传统载体固定化细胞技术相比，本发明工艺操作简便、辅助材料消耗少、只需添加少量助滤剂或膨松剂、无需特殊设备、固定化细胞可重复连续使用2个月以上、生产强度大，特别适用于工业化连续生产。
2、本发明提供的无载体固定化黑曲霉（Aspergillus niger）M1细胞，其α-葡萄糖苷酶活力高，可在55～65℃条件下进行转苷反应，转苷时间短，转苷后料液有效三糖（IG+P+IG3）含量可达35～70%，优于传统工艺，特别适用于生产低聚异麦芽糖不同品质的产品。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。
实施例1：无载体固定化黑曲霉生产低聚异麦芽糖的方法1
1、利用黑曲霉制备菌丝体：以黑曲霉（Aspergillus niger）M1为发酵菌种，32℃条件下培养36h后，发酵液经真空抽滤收集菌体。
2、制备无载体固定化细胞填充柱：将上述黑曲霉（Aspergillus niger）M1菌体细胞与助滤剂硅藻土按质量比1：1混合，搅拌均匀，然后按柱体积的50%装入柱体内，制得无载体固定化细胞填充柱。
3、生产低聚异麦芽糖：将固形物质量百分含量20%的麦芽糖浆调节pH4.0，循环连续流加至上述无载体固定化细胞填充柱，反应温度55℃，填充柱中麦芽糖浆：无载体固定化细胞体积比为2：1，麦芽糖浆在柱体中的反应时间为3h，收集填充柱流出液即为低聚异麦芽糖浆；经高效液相色谱仪测定，有效三糖（IG+P+IG3）含量为39.52%。麦芽糖浆是以木薯淀粉经α-淀粉酶液化，β-淀粉酶糖化后制取。
实施例2：无载体固定化黑曲霉生产低聚异麦芽糖的方法2
1、利用黑曲霉制备菌丝体：以黑曲霉（Aspergillus niger）M1为发酵菌种， 35℃条件下培养36h后，发酵液经板框过滤收集菌体。
2、制备无载体固定化细胞填充柱：将上述黑曲霉（Aspergillus niger）M1菌体细胞与助滤剂硅藻土按质量比1：1混合，搅拌均匀，然后按柱体积的50%装入柱体内，制得无载体固定化细胞填充柱。
3、生产低聚异麦芽糖：将固形物质量百分含量30%的麦芽糖浆调节pH4.0，循环连续流加至上述无载体固定化细胞填充柱，反应温度60℃，填充柱中麦芽糖浆：无载体固定化细胞体积比为2：1，麦芽糖浆在柱体中的反应时间为6h，收集填充柱流出液即为低聚异麦芽糖浆；经高效液相色谱仪测定，有效三糖（IG+P+IG3）含量为68.35%。麦芽糖浆为市售产品，生产公司为肇庆焕发生物科技有限公司。
实施例3：无载体固定化黑曲霉生产低聚异麦芽糖的方法3
1、利用黑曲霉制备菌丝体：以黑曲霉（Aspergillus niger）M1为发酵菌种， 33℃条件下培养40h后，发酵液经离心收集菌体。
2、制备无载体固定化细胞填充柱：将上述黑曲霉（Aspergillus niger）M1菌体细胞不与任何助滤剂混合，直接按柱体积的50%装入柱体内，制得无载体固定化细胞填充柱。
3、生产低聚异麦芽糖：将固形物质量百分含量10%的麦芽糖浆调节pH4.5，循环连续流加至上述无载体固定化细胞填充柱，反应温度50℃，填充柱中麦芽糖浆：无载体固定化细胞体积比为2：1，麦芽糖浆在柱体中的反应时间为6h，收集填充柱流出液即为低聚异麦芽糖浆；经高效液相色谱仪测定，有效三糖（IG+P+IG3）含量为47.82%。麦芽糖浆是以玉米淀粉经α-淀粉酶液化，β-淀粉酶糖化后制取。
实施例4：无载体固定化黑曲霉生产低聚异麦芽糖的方法4
1、利用黑曲霉制备菌丝体：以黑曲霉（Aspergillus niger）M1为发酵菌种， 30℃条件下培养48h后，发酵液经真空抽滤收集菌体。
2、制备无载体固定化细胞填充柱：将上述黑曲霉（Aspergillus niger）M1菌体细胞与助滤剂硅藻土和高岭土组合（1：1）按质量比1：2混合，搅拌均匀，然后按柱体积的50%装入柱体内，制得无载体固定化细胞填充柱。
3、生产低聚异麦芽糖：将固形物质量百分含量30%的麦芽糖浆调节pH4.0，循环连续流加至上述无载体固定化细胞填充柱，反应温度60℃，填充柱中麦芽糖浆：无载体固定化细胞体积比为2：1，麦芽糖浆在柱体中的反应时间为8h，收集填充柱流出液即为低聚异麦芽糖浆；经高效液相色谱仪测定，有效三糖（IG+P+IG3）含量为58.16%。麦芽糖浆是以小麦淀粉经α-淀粉酶液化，β-淀粉酶糖化后制取。
实施例5：无载体固定化黑曲霉生产低聚异麦芽糖的方法5
1、利用黑曲霉制备菌丝体：以黑曲霉（Aspergillus niger）M1为发酵菌种， 35℃条件下培养24h后，发酵液经超滤收集菌体。
2、制备无载体固定化细胞填充柱：将上述黑曲霉（Aspergillus niger）M1菌体细胞与助滤剂硅藻土、高岭土和珍珠岩组合（1：1：1）按质量比1：3混合，搅拌均匀，然后按柱体积的50%装入柱体内，制得无载体固定化细胞填充柱。
3、生产低聚异麦芽糖：将固形物质量百分含量40%的麦芽糖浆调节pH4.0，循环连续流加至上述无载体固定化细胞填充柱，反应温度60℃，填充柱中麦芽糖浆：无载体固定化细胞体积比为1.5：1，麦芽糖浆在柱体中的反应时间为8h，收集填充柱流出液即为低聚异麦芽糖浆；经高效液相色谱仪测定，有效三糖（IG+P+IG3）含量为70.57%。麦芽糖浆为市售产品，生产公司为肇庆焕发生物科技有限公司。
实施例6：无载体固定化黑曲霉生产低聚异麦芽糖的方法6
1、利用黑曲霉制备菌丝体：以黑曲霉（Aspergillus niger）M1为发酵菌种， 32℃条件下培养36h后，发酵液经离心收集菌体。
2、制备无载体固定化细胞填充柱：将上述黑曲霉（Aspergillus niger）M1菌体细胞与助滤剂硅藻土和酸性白土组合（1.5：1）按质量比1：1.5混合，搅拌均匀，然后按柱体积的50%装入柱体内，制得无载体固定化细胞填充柱。
3、生产低聚异麦芽糖：将固形物质量百分含量25%的麦芽糖浆调节pH4.5，循环连续流加至上述无载体固定化细胞填充柱，反应温度55℃，填充柱中麦芽糖浆：无载体固定化细胞体积比为1.8：1，麦芽糖浆在柱体中的反应时间为15h，收集填充柱流出液即为低聚异麦芽糖浆；经高效液相色谱仪测定，有效三糖（IG+P+IG3）含量为53.38%。麦芽糖浆是以大米淀粉经α-淀粉酶液化，β-淀粉酶糖化后制取。
实施例7：无载体固定化黑曲霉生产低聚异麦芽糖的方法7
1、利用黑曲霉制备菌丝体：以黑曲霉（Aspergillus niger）M1为发酵菌种， 32℃条件下培养36h后，发酵液经离心收集菌体。
2、制备无载体固定化细胞填充柱：将上述黑曲霉（Aspergillus niger）M1菌体细胞与助滤剂高岭土按质量比1：5混合，搅拌均匀，然后按柱体积的70%装入柱体内，制得无载体固定化细胞填充柱。
3、生产低聚异麦芽糖：将固形物质量百分含量5%的麦芽糖浆调节pH4.5，循环连续流加至上述无载体固定化细胞填充柱，反应温度55℃，填充柱中麦芽糖浆：无载体固定化细胞体积比为1.2：1，麦芽糖浆在柱体中的反应时间为24h，收集填充柱流出液即为低聚异麦芽糖浆；经高效液相色谱仪测定，有效三糖（IG+P+IG3）含量为35.96%。麦芽糖浆是以木薯淀粉经α-淀粉酶液化，β-淀粉酶糖化后制取。
实施例8：无载体固定化黑曲霉生产低聚异麦芽糖的方法8
1、利用黑曲霉制备菌丝体：以黑曲霉（Aspergillus niger）M1为发酵菌种， 32℃条件下培养36h后，发酵液经离心收集菌体。
2、制备无载体固定化细胞填充柱：将上述黑曲霉（Aspergillus niger）M1菌体细胞与助滤剂珍珠岩按质量比1：0.5混合，搅拌均匀，然后按柱体积的60%装入柱体内，制得无载体固定化细胞填充柱。
3、生产低聚异麦芽糖：将固形物质量百分含量15%的麦芽糖浆调节pH4.5，循环连续流加至上述无载体固定化细胞填充柱，反应温度65℃，填充柱中麦芽糖浆：无载体固定化细胞体积比为1.5：1，麦芽糖浆在柱体中的反应时间为10h，收集填充柱流出液即为低聚异麦芽糖浆；经高效液相色谱仪测定，有效三糖（IG+P+IG3）含量为65.06%。麦芽糖浆是以马铃薯淀粉经α-淀粉酶液化，β-淀粉酶糖化后制取。
实施例9：无载体固定化黑曲霉生产低聚异麦芽糖的方法9
1、利用黑曲霉制备菌丝体：以黑曲霉（Aspergillus niger）M1为发酵菌种， 32℃条件下培养36h后，发酵液经离心收集菌体。
2、制备无载体固定化细胞填充柱：将上述黑曲霉（Aspergillus niger）M1菌体细胞与助滤剂硅藻土、活性炭和锯屑组合（1：1：0.5）按质量比1：8混合，搅拌均匀，然后按柱体积的50%装入柱体内，制得无载体固定化细胞填充柱。
3、生产低聚异麦芽糖：将固形物质量百分含量20%的麦芽糖浆调节pH4.0，循环连续流加至上述无载体固定化细胞填充柱，反应温度50℃，填充柱中麦芽糖浆：无载体固定化细胞体积比为2：1，麦芽糖浆在柱体中的反应时间为8h，收集填充柱流出液即为低聚异麦芽糖浆；经高效液相色谱仪测定，有效三糖（IG+P+IG3）含量为42.55%。麦芽糖浆为市售产品，生产公司为肇庆焕发生物科技有限公司。
实施例10：无载体固定化黑曲霉生产低聚异麦芽糖的方法10
1、利用黑曲霉制备菌丝体：以黑曲霉（Aspergillus niger）M1为发酵菌种， 32℃条件下培养36h后，发酵液经离心收集菌体。
2、制备无载体固定化细胞填充柱：将上述黑曲霉（Aspergillus niger）M1菌体细胞与助滤剂硅胶粉、酸性白土和纤维素组合（0.5：0.5：1）按质量比1：10混合，搅拌均匀，然后按柱体积的50%装入柱体内，制得无载体固定化细胞填充柱。
3、生产低聚异麦芽糖：将固形物质量百分含量20％的麦芽糖浆调节pH4.0，循环连续流加至上述无载体固定化细胞填充柱，反应温度55℃，填充柱中麦芽糖浆：无载体固定化细胞体积比为1.5：1，麦芽糖浆在柱体中的反应时间为12h，收集填充柱流出液即为低聚异麦芽糖浆；经高效液相色谱仪测定，有效三糖(IG+P+IG3)含量为40.32％。麦芽糖浆为市售产品， 生产公司为肇庆焕发生物科技有限公司。
Claims (1)
1.一种无载体固定化黑曲霉生产低聚异麦芽糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）液体培养黑曲霉（Aspergillus niger）M1，收集菌丝体；以黑曲霉（Aspergillus niger）M1为发酵菌种，在30～35℃条件下在培养24h～48h后，发酵液经离心或膜分离技术收集菌体；所述膜分离技术为真空抽滤、板框过滤或超滤中的任意一种；
（2）将上述黑曲霉菌丝体与助滤剂以重量比为1：（0～10）混合，搅拌均匀，然后装入填充柱反应器中，制成无载体固定化细胞填充柱；所述助滤剂为高岭土、珍珠岩、硅胶粉、酸性白土、活性炭或锯屑中的一种或其组合物；
（3）将固形物质量百分含量5～25%的麦芽糖浆调节pH4～4.5，然后流加至上述无载体固定化细胞填充柱，反应温度45～65℃，反应时间3～15h后，收集填充柱流出液，即制得有效三糖（IG+P+IG3）含量为35～70%的低聚异麦芽糖；所述固形物质量百分含量5～25%的麦芽糖浆为利用薯类淀粉或谷类淀粉经α-淀粉酶或真菌淀粉酶液化，然后用β-淀粉酶或真菌淀粉酶糖化后制取，或市售麦芽糖浆产品；
所述黑曲霉（Aspergillus niger）M1，保藏编号CCTCC NO：M2014421，保藏日期为2014年9月23日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |