CN102292437B - 生产酶产品的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过发酵曲霉属菌株而获得的具有多种酶活性的酶产品的生产方法。

Description

生产酶产品的方法

发明领域

本发明涉及通过用曲霉属深层发酵而生产具有多种酶活性的酶产品的方法。

发明背景

酶被广泛用于食品和饲料工业中，例如在水果和蔬菜加工工业中。

近年来，利用酶加工水果(包括浆果)醪液(Mash)已经变成果汁(例如，柑橘，苹果和梨)生产中的最新水平，因为最高的可能产量和通量已经成为了首要的。果胶(在所有水果中发现的天然物质)，作为细胞胶起作用而给予水果结构。在水果醪液中，果胶结合水以增加粘性，并使得通过压榨机或倾析器(decanter)在液体/固体分离中释放果汁变得困难。酶的使用允许生产者根据需求控制生产。

在柑橘水果加工中，酶的应用降低了果汁的粘性，消除了果汁浓缩和储存过程中胶凝化的风险，确保了高的混浊稳定性。在果肉提取过程中应用时，酶促进了果汁和固体的释放，提高了产量，并改善了成本效率。稳定的混浊(或者，在柠檬汁的情况中，成功的澄清)是终产品质量上乘的重要评测标准。在柑橘水果加工过程中利用酶时也可以回收柑橘属精油。除了提供有价值的商品外，柑橘属精油的回收从可持续性的角度来看是重要的，其确保了废水中杀菌油的低含量，用于改善的废水生物可降解能力，并减少了整体上的水消耗。酶也被用于高澄清度的苹果和梨汁的生产，其依赖于淀粉和果胶内容物的完全分解。这是通过在澄清和过滤之前向果汁中加入果胶酶和降解淀粉的酶实现的。通过在压榨和果汁分离之前加入到水果醪液中，果胶酶引起醪液粘性的降低，导致增加的果汁产量和优化的加工能力。更少的废果渣和水果压榨机更容易清洁是另外的有附加值的优点。另外，在葡萄酒生产中，酶被用于将有价值的成分如芳香、颜色和单宁从葡萄转移到葡萄酒中。酶还可帮助保持葡萄酒的质量，有时保存许多年。它们也减少发酵时间并促进澄清，过滤和稳定化。

如上面所提到的，在果汁生产过程中，酶制备物通常被用于水果的提取和液化以及果汁澄清的步骤中。商业的酶制备物含有主要是果胶酶(例如，多聚半乳糖醛酸酶，果胶酯酶，果胶裂解酶)以及少量其它水解酶(如阿拉伯聚糖酶(arabinanases)、半乳聚糖酶和木聚糖酶)的混合物。各种果胶酶的底物是果胶，它们是由α-1，4-糖苷键D-半乳糖醛酸聚合物组成的高分子量(20-100kDa)的多聚半乳糖醛酸。一些糖醛酸基团用甲醇酯化了。多聚半乳糖醛酸主链被所谓的须状区(hairyregion)中断了，所述须状区由鼠李糖-半乳糖醛酸主链与富含阿拉伯糖的侧链组成。

果胶降解酶(如多聚半乳糖醛酸酶，果胶甲基酯酶，果胶裂解酶或果胶酸裂解酶)是重要的，特别是在水果和蔬菜加工中(例如果汁加工或葡萄酒制造中)，其中利用了它们催化果胶聚合物的主链降解的能力。

在自然中，果胶是作为高等植物细胞壁的组分存在的。它们在初生胞壁和胞间薄层中被发现，在那里它们被包埋在纤维素原纤维中。果胶的组成和甲基化程度在植物种类之间是可变的，并且还依赖于水果的年龄和成熟度。果胶最丰富的来源包括柠檬和桔子皮，其可含有高达30％的此种多糖。果胶酶可以通过水解α-1，4-糖苷键(多聚半乳糖醛酸内切酶和多聚半乳糖醛酸外切酶)或通过反式消除反应(果胶裂解酶)降解碳水化合物聚合物。果胶酯酶可以将高度酯化的果胶去甲基化成为多聚半乳糖醛酸。果胶裂解酶是特异于高度酯化的果胶的，多聚半乳糖醛酸酶水解低度酯化的果胶。因此，高度酯化的果胶可以由果胶裂解酶或果胶酯化酶与多聚半乳糖醛酸酶的组合来降解。

在水果和蔬菜加工的各种阶段中，果胶酶起了重要作用。最初，果胶酶被用于处理软的水果，以确保压榨时果汁和色素的高产量，以及澄清粗压榨果汁。多聚半乳糖醛酸酶被用作浸解(macerating)酶用于生产果肉蜜，所述果肉蜜是松散的细胞悬浮液，其是有限的果胶降解的结果(特别是在胞间薄层中)。需要数种果胶酶以及纤维素分解酶的组合以几乎完全地液化水果组织，从而促进提取。苹果汁的澄清可以例如通过果胶酯酶与多聚半乳糖醛酸酶的组合活性或通过果胶裂解酶(对其而言高度酯化的苹果果胶是理想的底物)而被改善。

在商业制备物中存在的大多数果胶酶是真菌起源的。黑曲霉(Aspergillus niger)对于工业生产果胶降解酶是非常重要的生物体。在黑曲霉中，各种果胶酶不是组成性地表达的。需要果胶或果胶分子的降解产物作为诱导物质。果胶酶生产的发酵条件常常产生广泛的果胶酶。此外，黑曲霉产生所述各种果胶酶的许多同功酶。数个已公布的专利描述了编码多聚半乳糖醛酸酶(EP 421 919，EP 0 388 593)，果胶裂解酶(EP 0 278 355，EP 0 353 188)和果胶酯酶(EP 0388 593)的基因已被分离，并且被用于构建超量生产的转化体。这些转化体允许生产在例如浸渍应用中、和在对各种果胶酶在例如液化和澄清的过程中的影响的研究中所需的特异性的酶。

也曾描述了来自液化处理后所获得的苹果汁的细胞壁多糖的分离和表征，在所述液化处理中，通过果胶溶解酶和纤维分解酶的联合作用而从苹果果肉释放果汁。这些细胞壁多糖类似于苹果果胶的须状区(具有富含阿拉伯糖的侧链的鼠李糖-半乳糖醛酸主链)，并且被称为经修饰的须状区(MHR)。须状区已知不仅存在于苹果中，也存在于胡萝卜、葡萄和草莓中，并且可能是果胶分子共有的部分。经修饰的须状区对于由存在于大多数纯的和工业的果胶酶和纤维素酶制备物中的酶引起的降解有抵抗性。已发现从棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)获得的商业粗制酶制备物能够使这些片段的鼠李半乳糖醛酸聚糖主链解聚。通过利用高效凝胶渗透色谱(HPGPC)测量分子量分布中的迁移而使得此活性可见。负责降解从苹果汁制备的经修饰的须状区的酶被称为鼠李糖半乳糖醛酸酶(rhamnogalacturonase)(RGase)。该酶可分裂(苹果)果胶的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖主链中的糖苷键，从而除了其它还没有被完全鉴别出的反应产物外，还产生了由半乳糖醛酸、鼠李糖和半乳糖构成的一系列寡聚物，其中以鼠李糖在非还原末端，因此将此新酶命名为鼠李糖半乳糖醛酸酶(RG-ase)。

US 5,591,620描述了编码鼠李糖半乳糖醛酸酶(RG-ase)的曲霉基因的分离和过量表达RG-ase的重组曲霉菌株的构建。这些菌株可被用于商业生产RG-ase。

EP1658359描述了包含由橄榄或橄榄组分组成的物质和含有至少一种果胶酯酶、至少一种多聚半乳糖醛酸内切酶和至少一种多聚半乳糖醛酸外切酶的酶混合物的制备物。在所述制备物中，果胶酯酶活性与多聚半乳糖醛酸内切酶活性的比例至少为0.13，并且果胶酯酶活性与多聚半乳糖醛酸外切酶活性的比例至少为0.3。

WO 2008/117301涉及通过发酵生产多酶体系的方法。WO2008/117301也描述了在优化条件下利用米曲霉(Aspergillusoryzae)MTCC 5154，用于通过深层发酵而生产多酶体系。所描述的产品是不同的酶(例如α-淀粉酶，淀粉葡糖苷酶，羧甲基纤维素酶，果胶酶，β半乳糖苷酶和木聚糖酶)的混合物。

在“Aspergillus Enzymes Involved in Degradation of Plant CellWall Polysaccharies”，Microbiology and Molecular Biology Reviews，Dec.2001，p.497-522 de Vries等人描述了由曲霉产生的参与植物细胞壁多糖降解的不同类别的酶、编码这些酶的基因、和这些基因的调控。此外还描述了从曲霉属菌株检测到的细胞壁降解活性。

WO97/43423描述了从粗制的、混合的酶制备物果胶酶146纯化α葡糖醛酸酶，其作为源自具有参考编号4M146的曲霉属菌株的果胶酶来源在市场上被出售。

还可以得到含有许多不同的降解性酶的商业制备物。

然而，由于在工业加工中，最高可能的产量和通量越来越重要，仍然需要更有效的提供酶溶液的方法。

发明概要

在一个方面，提供了生产酶产品的方法以及由所述方法获得的酶产品，所述方法包括下述步骤：在包含含有果胶和阿拉伯聚糖的植物材料的发酵培养基中深层发酵曲霉属菌株以获得发酵培养液，和任选地从所述发酵培养液中回收无细胞培养液形式的酶产品。

在一个方面，提供了至少包含下列酶活性的酶产品：

多聚半乳糖醛酸内切酶活性，

多聚半乳糖醛酸外切酶活性，

果胶酯酶活性，

果胶裂解酶活性，

纤维素酶活性，

木聚糖酶活性和

阿拉伯聚糖酶活性

并且其中所述酶产品是由曲霉属菌株的深层发酵获得的表达产品。

在一个方面，提供了生产酶产品的方法以及由所述方法获得的酶产品，所述方法包括下列步骤：在发酵培养基中深层发酵塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)菌株以获得发酵培养液，并任选地从所述发酵培养液中回收无细胞培养液形式的酶产品。在一个方面，所述发酵培养基包含含有果胶和阿拉伯聚糖的植物材料。

在一个方面，提供了包含根据本发明的酶产品、酶载体和任选地稳定剂和/或防腐剂的酶产品制备物。

在一个方面，提供了可由根据本发明的方法获得的酶产品。

在一个方面，提供了具有保藏登记号CBS123488的塔宾曲霉，或其衍生物或后代。

在一个方面，提供了具有保藏登记号CBS123488的分离的塔宾曲霉，或其衍生物或后代。

在一个方面，提供了与具有保藏登记号CBS123488的塔宾曲霉菌株具有基本上相同的特征的真菌培养物。

在其它方面，提供了用于深层发酵曲霉属菌株的发酵培养基，所述培养基包含甜菜果肉和麸。

附图说明

图1显示了如下文中标题“测试”下“测试2”中所述而制成的AJDU标准曲线。

图2如下文中标题“测试”下“测试9”中所述而制成的的葡萄糖标准曲线。

图3如下文中标题“测试”下“测试11”中所述而制成的木聚糖标准曲线。

图4显示了利用如实施例4中所述的表面发酵方法发酵产生的酶产品的蛋白质特征谱。

图5显示了利用如实施例4中所述的根据本发明的深层发酵方法的3种发酵产生的酶产品的蛋白质特征谱。

图6显示了利用如实施例4中所述的根据本发明的深层发酵方法和表面发酵方法发酵产生的酶产品的蛋白质特征谱。

图7显示了实施例4中制备的凝胶扫描。

图8显示了在位点1的两个表面发酵处(样品1-2)和在位点1的2个深层发酵处(样品3-4)以及在位点2的7个深层发酵处(样品5-11)获得的浓缩酶产品的酶活性。

发明详述

在一个方面，提供了生产酶产品的方法，所述方法包括下列步骤：在包含含有果胶和阿拉伯聚糖的植物材料的发酵培养基中深层发酵曲霉属菌株以获得发酵培养液，和任选地从所述发酵培养液中回收无细胞培养液形式的酶产品。另一方面，提供了生产酶产品的方法，所述方法包括下列步骤：在包含含有果胶和阿拉伯聚糖的植物材料的发酵培养基中深层发酵曲霉属菌株以获得发酵培养液，和从所述发酵培养液中回收无细胞培养液形式的酶产品。在又一个方面，提供了生产酶产品的方法，所述方法包括下列步骤：在包含甜菜果肉和麦麸的发酵培养基中深层发酵曲霉属菌株以获得发酵培养液，和从所述发酵培养液中回收无细胞培养液形式的酶产品。

在一个方面，提供了生产酶产品的方法和由所述方法获得的酶产品，所述方法包括下列步骤：在发酵培养基中深层发酵塔宾曲霉菌株以获得发酵培养液，和任选地从所述发酵培养液中回收无细胞培养液形式的酶产品。在另一方面，提供了生产酶产品的方法，所述方法包括下列步骤：在发酵培养基中深层发酵塔宾曲霉菌株以获得发酵培养液，和从所述发酵培养液中回收无细胞培养液形式的酶产品。在又一个方面，提供了生产酶产品的方法，所述方法包括下列步骤：在包含含有果胶和阿拉伯聚糖的植物材料的发酵培养基中深层发酵塔宾曲霉菌株以获得发酵培养液，和从所述发酵培养液中回收无细胞培养液形式的酶产品。

将使用的包含果胶和阿拉伯聚糖的植物材料可以是包含果胶和阿拉伯聚糖的任何植物材料，例如甜菜果肉或谷麸或其组合。

在另一方面，所述植物材料包含甜菜果肉。在另一方面，所述植物材料包含谷麸(如麦麸)。在又一个方面，谷麸(例如麦麸)和甜菜果肉的混合物被用作所述植物材料。

不愿被任何理论所限，相信包含果胶和阿拉伯聚糖(例如麦麸和/或甜菜果肉)的植物材料对所产生的酶产品的组成有影响。还相信，所述植物材料(例如麦麸和/或甜菜果肉中)的阿拉伯聚糖含量直接地或间接地涉及所获得的酶产品的相对较高的阿拉伯聚糖酶的含量。此种高阿拉伯聚糖酶含量，以及其它的酶活性，被认为对于酶产品的应用(例如在所述酶产品的水果相关的和/或葡萄酒的应用中)是重要的。

在一个方面，所述植物材料包含甜菜果肉。在另一方面，发酵培养基包含1-30％w/w范围内的甜菜果肉，例如2-8％w/w范围内的甜菜果肉，或者例如3-7％w/w范围内的甜菜果肉。在另一方面，所述甜菜果肉具有0.5-20％w/w的糖含量，或者例如2-8％w/w的糖含量。在另一方面，所述甜菜果肉具有5-40％w/w的阿拉伯聚糖含量。已发现，特别有用的甜菜果肉类型是未糖蜜化的甜菜果肉。

在一个方面，所述植物材料包含谷麸。在另一方面，所述植物材料是谷麸和甜菜果肉的混合物。在又一方面，所述谷麸是麦麸。在另外的方面，所述麦麸具有2-20％w/w的阿拉伯聚糖含量。术语“发酵”在本申请的情境中指通过在发酵培养基/培养物中生长微生物而生产物质(例如酶)。

在一个方面，所述曲霉属菌株作为一种单一的曲霉属菌株培养物而被发酵。在另一方面，所述曲霉培养物是塔宾曲霉菌株的一种单一培养物。在又一方面，所述曲霉属菌株(例如塔宾曲霉菌株)未经遗传修饰(非GMO)。在又一个方面，所述曲霉菌株(例如塔宾曲霉菌株)还未经自我克隆(self-cloned)。在一个方面，所述塔宾曲霉菌株具有的保藏登记号为CBS123488。在又一方面，所述曲霉属菌株(例如塔宾曲霉菌株)已经遗传修饰(GMO)。

在一个方面，在发酵过程中pH的范围是2.7-6.5。在一个方面，在发酵过程中pH的范围是3-4.5。在另一方面，在发酵过程中pH的范围是3-4。在又一方面，在发酵过程中pH的范围是3.2-3.7。在又一方面，在发酵过程中pH的范围是3.3-3.7。在发酵过程中，pH谱可以保持恒定或者可以在所述的范围内变化。在一个方面，在发酵过程中保持pH，使得pH最多在±1的pH-范围内变化，例如在±0.8的pH范围内，例如在±0.6的pH范围内，或者例如在±0.5的pH范围内，例如在±0.3的pH范围内，例如在±0.25的pH范围内，例如在±0.2的pH范围内，例如在±0.15的pH范围内，例如在±0.1的pH范围内，例如在±0.05的pH范围内。在一个方面，起始pH是例如，7.0，6.5，6.0，5.5，或5.0，而最终的pH是例如4.5，4.0，3.5或3.0。

本领域已知，在发酵器/生物反应器中的不同位置处，pH可以变化。此外，这些pH的变化可取决于培养基/培养液的粘性，其通常在发酵开始时比发酵将近结束时更粘。

在一个方面，在发酵过程中，温度在25-40℃的范围内。在另一方面，在发酵过程中，温度在28-34℃的范围内。在发酵过程中，温度谱可保持恒定或在所述区间内变化。

在又一方面，所述发酵是作为需氧发酵进行的。

在一个方面，所述发酵培养基还包含硫酸铵和/或硝酸钾。

在一个方面，提供了至少包含下列酶活性的酶产品：

i.多聚半乳糖醛酸内切酶活性

ii.多聚半乳糖醛酸外切酶活性

iii.果胶酯酶活性

iv.果胶裂解酶活性

v.1，3-β-葡聚糖酶活性(或纤维素酶或昆布多糖酶或其任意组合)

vi.木聚糖酶活性

vii.阿拉伯聚糖酶活性和

viii.任选地阿拉伯呋喃糖苷酶活性

并且其中所述酶产品是通过深层发酵曲霉属菌株而获得的表达产品。

在根据本发明的一方面，所述酶产品是来自发酵培养液的无细胞培养液的形式。在这方面的变体中，所述酶产品存在于发酵培养液中。

在一个方面，提供了至少包含下列酶活性的酶产品：

i.多聚半乳糖醛酸内切酶活性

ii.多聚半乳糖醛酸外切酶活性

iii.果胶酯酶活性

iv.果胶裂解酶活性

v.纤维素酶活性

vi.木聚糖酶活性和

vii.阿拉伯聚糖酶活性和

viii.任选地阿拉伯呋喃糖苷酶。

并且其中所述酶产品是由深层发酵曲霉属菌株而获得的表达产品。在另一方面，所述曲霉属菌株是单一培养物。

在一个方面，所提供的酶产品还包含选自下列的一种或多种活性：鼠李糖半乳糖醛酸酶活性，半纤维素酶活性，葡糖淀粉酶活性，全淀粉酶(holoamylase)活性和昆布多糖酶活性。

在另一方面，所述酶产品还包含鼠李糖半乳糖醛酸酶活性。在另一方面，所述酶产品还包含半纤维素酶活性。在另一方面，所述酶产品还包含葡糖淀粉酶活性。在另一方面，所述酶产品还包含全淀粉酶活性。在另一方面，所述酶产品还包含昆布多糖酶活性如，1，3-β-葡聚糖酶。在另一方面，所述酶产品还包含淀粉酶活性。

所述酶产品也可包含半纤维素裂解活性。

在其它方面，所述酶产品是由深层发酵曲霉属菌株的一种单一培养物而获得的表达产品。

在另一方面，提供了至少包含下列酶的酶产品

i.归类在EC 3.2.1.15中的多聚半乳糖醛酸内切酶

ii.归类在EC3.2.1.67中的多聚半乳糖醛酸外切酶

iii.归类在EC3.1.1.11中的果胶酯酶

iv.归类在EC4.2.2.10中的果胶裂解酶

v.归类在EC3.2.1.4中的纤维素酶

vi.归类在EC3.2.1.8中的木聚糖酶和

vii.归类在EC3.2.1.99中的阿拉伯聚糖酶，和

viii.任选地归类在EC3.2.1.55中的阿拉伯呋喃糖苷酶

并且其中所述酶产品是由深层发酵曲霉属菌株而获得的表达产品。

在一个方面，与使用包含谷类/麦麸和甜菜果肉丸粒的类似发酵培养基、通过相同培养物的表面发酵而制备的酶产品中的多聚半乳糖醛酸外切酶活性相比，通过深层发酵制备的酶产品具有更高的多聚半乳糖醛酸外切酶活性，例如通过深层发酵比表面发酵高1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9或2.0倍(如测试5所测量的)。在另一方面，与使用包含谷类/麦麸和甜菜果肉丸粒的类似发酵培养基、通过相同培养物的表面发酵而制备的酶产品中的总酶活性相比(如测试1所测量的)，通过深层发酵制备的酶产品具有更高的总酶活性(如测试1所测量的)，例如通过深层发酵比表面发酵高1.2，1.3，1.4，1.5，1.6或1.7倍。

在本申请的一些实施方案中，本方法和/或产品提供了包括但不限于下述的一项或多项的优势：更高的产量，改善的过程控制，改善的pH控制(不依赖于缓冲剂和/或缓冲能力)，改善的通风，改善的无菌性，不需要的微生物/污染物的生长的减少，在培养基制备过程中不需要的反应的减少(例如Maillard反应，即氨基酸和还原糖之间在加热时的化学反应)。

在本申请的一些实施方案中，本发明的其它优势是：酶活性存在于发酵培养液的液体/水性/溶解的部分中，这与表面发酵相反，在表面发酵中必须用适当的缓冲剂提取固体培养基以收获酶/酶活性。

在一个方面，本申请中通过深层发酵所提供的酶产品具有一种或多种更高的酶活性，例如选自下列的一种或多种活性：多聚半乳糖醛酸内切酶活性，多聚半乳糖醛酸外切酶活性，果胶酯酶活性，果胶裂解酶活性，1，3-β-葡聚糖酶/纤维素酶/昆布多糖酶活性，木聚糖酶活性，阿拉伯聚糖酶活性，阿拉伯呋喃糖苷酶活性，鼠李糖半乳糖醛酸酶活性，葡糖淀粉酶活性，淀粉酶活性，全淀粉酶活性，阿拉伯呋喃糖苷酶活性，根据测试1的QVC粘度测定活性，根据测试2的苹果汁去果胶化单位，和/或根据测试3的果胶反式消去酶(Pectin transeliminase)活性。

不愿被任何理论所限，相信选自多聚半乳糖醛酸内切酶活性，多聚半乳糖醛酸外切酶活性，果胶酯酶活性，果胶裂解酶活性，1，3-β葡聚糖酶活性，纤维素酶活性，昆布多糖酶活性，木聚糖酶活性，阿拉伯聚糖酶活性，阿拉伯呋喃糖苷酶活性，鼠李糖半乳糖醛酸酶活性，葡糖淀粉酶活性，淀粉酶活性，全淀粉酶活性，阿拉伯呋喃糖苷酶活性中的一种或多种酶活性显示出与下列一项或多项的线性或近似线性的相关性：根据测试1测量的QVC粘度测定活性，根据测试2的苹果汁去果胶化单位活性和/或根据测试3的果胶反式消去酶活性/果胶裂解酶活性。在一个方面，如“测试3”中所述的果胶裂解酶活性/果胶反式消去酶活性被用于关联或预测本酶产品或本酶制备物的酶活性。

另一方面，所述酶产品是由深层发酵曲霉属菌株(例如曲霉属菌株的一种单一培养物)而获得的表达产品。在一个方面，用于所述深层发酵的培养基包含甜菜果肉。在一个方面，用于所述深层发酵的培养基包含谷麸，例如麦麸。在一个方面，用于深层发酵的培养基包含1-30％(w/w)范围内的甜菜果肉。

在本发明的一方面，所述酶产品包含

i.一种或多种多聚半乳糖醛酸内切酶，

ii.一种或多种多聚半乳糖醛酸外切酶，

iii.一种或多种果胶酯酶，

iv.一种或多种果胶裂解酶，

v.一种或多种昆布多糖酶，

vi.一种或多种木聚糖酶，

vii.一种或多种阿拉伯聚糖酶和

viii.任选地一种或多种阿拉伯呋喃糖苷酶。

在本发明的一方面，所述酶产品包含

i.一种或多种多聚半乳糖醛酸内切酶，

ii.一种或多种多聚半乳糖醛酸外切酶，

iii.一种或多种果胶酯酶，

iv.一种或多种果胶裂解酶，

v.一种或多种纤维素酶，

vi.一种或多种木聚糖酶，

vii.一种或多种阿拉伯聚糖酶和

viii.任选地一种或多种阿拉伯呋喃糖苷酶。

在另一方面，所述酶产品还包含鼠李糖半乳糖醛酸酶。

在另一方面，所述酶产品还包含一种或多种半纤维素酶，例如归类在EC3.1.1.73中的阿魏酸酯酶。

在又一方面，所述酶产品包含归类在EC 3.2.1.1，EC 3.2.1.2，EC3.2.1.3，EC 3.2.1.20，EC 3.2.1.60，EC 3.2.1.68，EC 3.2.1.98或EC 3.2.1.133中的一种或多种淀粉酶。

在又一方面，所述酶产品包含归类在EC3.2.1.3或EC3.2.1.20中的一种或多种葡糖淀粉酶。

在又一方面，所述酶产品包含归类在EC3.2.1.133中的一种或多种全淀粉酶。

在本发明的一方面，根据本发明的酶产品至少包含下列酶：

i.一种或多种多聚半乳糖醛酸内切酶，

ii.一种或多种多聚半乳糖醛酸外切酶，

iii.一种或多种果胶酯酶，

iv.一种或多种果胶裂解酶，

v.一种或多种纤维素酶，

vi.一种或多种木聚糖酶，

vii.一种或多种阿拉伯聚糖酶，

viii.一种或多种鼠李糖半乳糖醛酸酶，

ix.一种或多种葡糖淀粉酶，

x.一种或多种淀粉酶，

xi.一种或多种全淀粉酶和

xii.任选地一种或多种阿拉伯呋喃糖苷酶。

在本发明的一方面，多聚半乳糖醛酸内切酶活性是如“测试6”中所述测定的。在本发明的另一方面，多聚半乳糖醛酸外切酶活性是如“测试5”中所述测定的。在本发明的另一方面，果胶酯酶活性是如“测试7”中所述测定的。在本发明的另一方面，果胶裂解酶活性是如“测试3”中所述测定的。在本发明的另一方面，阿拉伯聚糖酶活性是如“测试8”中所述测定的。在本发明的另一方面，纤维素酶活性是如“测试9”中所述测定的。在本发明的另一方面，木聚糖酶活性是如“测试11”中所述测定的。

如上所述，根据本发明的酶产品还可包含一种或多种其它活性。在本发明的一方面，淀粉酶活性是如“测试12”中所述测定的。在本发明的一方面，葡糖淀粉酶活性是如“测试14”中所述测定的。在本发明的一方面，全淀粉酶活性是如“测试13”中所述测定的。在本发明的另一方面，昆布多糖酶活性是如“测试10”中所述测定的。

在另一方面，提供了具有下列酶活性的酶产品，例如如在标题“测试”下描述的下列测试中所测量的：多聚半乳糖醛酸内切酶活性，并且具有至少下列活性：多聚半乳糖醛酸外切酶活性，果胶酯酶活性，果胶裂解酶活性，阿拉伯聚糖酶活性，纤维素酶活性，和木聚糖酶活性，其中所述酶产品是通过深层发酵曲霉属菌株的一种单一培养物而获得的天然表达产品。

在本申请中与术语“酶产品”可互换使用的术语“酶复合物”在本申请的情境中指包含数种酶的混合物的产品或复合物，所述数种酶具有不同的酶活性和/或被归类在不同的酶委员会(Enzyme Commission)编号(EC编号)下。在另一方面，所述酶复合物也包含副活性(sideactivity)。在一个方面，所述“酶复合物”或“酶产品”是通过深层发酵获得的(任选地浓缩的)基本上无细胞的发酵培养液。在另一方面，所述“酶复合物”或“酶产品”仍然存在于通过深层发酵获得的、包含细胞的发酵培养液中。

在本申请的情境中，术语“副活性”指酶对于不是其主要底物的其它底物可能具有的一种或多种另外的活性，或者其是指酶产品可能具有的其主要活性以外的其它活性。

术语“不同的酶”或“具有不同酶活性的酶”指具有如由本领域技术人员所知的标准方法所测定的不同底物特异性的酶，或者其中所述酶具有相同的酶底物特异性但是在典型的酶参数(例如，如由常规方法所测量的最佳pH、最佳温度、Km或Ip(等电点))上不同。

因此，在一个方面，两种或多种酶活性可以是具有一种或多种副活性的一种或多种酶的结果。

根据本发明的酶产品优选地由单一培养物通过多重表达而表达。

在一个方面，所述酶产品因而可通过单一培养物的发酵而获得，其中所述单一培养物指生长自一种生物体的培养物。根据本发明的培养物优选是基本上纯的，例如至少90％纯(按重量)，优选至少95％纯(按重量)，更优选至少97％纯(按重量)，甚至更优选至少99％纯(按重量)。将要理解，“基本上纯的培养物”可含有更小量的其它生物体，例如相同菌株的其它克隆或其它菌株。

果胶是非常复杂的，并且发现根据本发明的包含各种具有不同活性的酶的酶产品非常适于果胶的降解。

在本发明的一方面，根据本发明的酶产品包含足够的副活性以降解非果胶多糖化合物，例如由在标题“测试”下描述的“测试1”或“测试2”所测量的。

在本发明的另一方面，根据本发明的酶产品含有降解非常复杂的非果胶多糖化合物所需的副活性，如由“测试1”所测定的。

在本发明的一方面，根据本发明的酶产品包含至少10种不同的副活性。

在本发明的一方面，根据本发明的酶产品包含至少15种不同的副活性。

在本发明的一方面，根据本发明的酶产品包含至少20种不同的副活性。

在本发明的一方面，根据本发明的酶产品包含至少60种不同的副活性。

多聚半乳糖醛酸内切酶被归类在EC3.2.1.15中，并且催化果胶酸和其它聚半乳糖醛酸中(1-＞4)-α-D-半乳糖苷连接的随机水解。

许多不同的酶属于此类别，包括D-半乳糖醛酸酶，内切-D-聚半乳糖醛酸酶，内切-D-半乳糖醛酸酶，内切聚半乳糖醛酸裂解酶。

多聚半乳糖醛酸内切酶(EC 3.2.1.15)水解聚半乳糖醛酸链中的(内部)糖苷连接，形成寡聚半乳糖醛酸片段。

“聚半乳糖醛酸酶活性”指水解聚半乳糖醛酸链中的糖苷连接的能力。

多聚半乳糖醛酸内切酶(EC.3.2.1.15)活性指水解聚半乳糖醛酸链中的内部糖苷连接的能力，这与多聚半乳糖醛酸外切酶(EC.3.2.1.67)活性相反，后者指通过水解(末端)糖苷连接而从聚半乳糖醛酸链释放末端聚半乳糖醛酸的能力。

多聚半乳糖醛酸外切酶活性可如下文所述被测定，其中1单位的多聚半乳糖醛酸外切酶活性被定义为下述的酶量：其能够在30℃、在50mM乙酸钠缓冲液中、pH4.2、以0.25％(w/v)的底物浓度，从作为模式底物的聚半乳糖醛酸(Sigma)中释放1摩尔还原糖末端/分钟。

多聚半乳糖醛酸内切酶活性可以通过在含有0.1％(w/v)聚半乳糖醛酸(pH4)(Sigma，P3850)的琼脂平板上点一滴培养基来定性地确定。在于30℃孵育至少30分钟后，用4M HCl淹没平板。在混浊的背景中，多聚半乳糖醛酸内切酶活性作为白色的晕被显现出来。备选地，通过用0.02％(w/v)钌红溶液孵育而将平板染色。在那种情况下，多聚半乳糖醛酸内切酶活性被显示为红色背景中的白点。

介由如以前所描述的(Parenicova等人，在Eur.J.biochem，251，72-80，1998中，标题是“pgaE encodes a fourth member of theendopolygalacturonase gene family from Aspergillus niger”)比色检测还原糖释放而定量测定多聚半乳糖醛酸外切酶的催化活性。在30℃、在50mM的乙酸钠缓冲液中、pH4.2、以0.25％(w/v)的聚半乳糖醛酸(Sigma)作为模式底物而进行水解反应。酶活性被表达为U/mg，1单位相应于所释放的1摩尔还原末端/分钟。

在本发明的一方面，所述产品的多聚半乳糖醛酸内切酶活性是通过如下文中标题“测试”下所描述的“测试6”测量的。此方法测量所述活性对于聚半乳糖醛酸酶的物理影响，即粘性的降低。此方法对于内切酶活性是特异性的，因为任何外切酶活性(糖的产生)对于粘性将具有很小的影响或没有影响。

在本发明的另一方面，所述产品的多聚半乳糖醛酸外切酶活性是通过如下文中标题“测试”下所描述的“测试5”测量的。此方法测量还原基团以及因此测量外切酶活性。

在一个方面，所述酶产品具有比多聚半乳糖醛酸外切酶活性更高的多聚半乳糖醛酸内切酶活性。在本发明的另一方面，所述酶产品在多聚半乳糖醛酸外切酶活性和多聚半乳糖醛酸内切酶活性之间具有的比例为1∶1至8∶1，例如2∶1至6∶1之间，例如3∶1至6∶1之间。通过在“测试5”中测量多聚半乳糖醛酸外切酶活性和在“测试6”中测量多聚半乳糖醛酸内切酶活性可确定所述比例。

如在“测试6”中所述，一个单位的多聚半乳糖醛酸内切酶活性被定义为在测试条件下(pH3.5和30℃)将水解底物、降低溶液粘性、以改变1个无量纲单位的相对流动性/每分钟的酶量。

如在“测试5”中所述的，1单位的多聚半乳糖醛酸外切酶活性被定义为在测试的条件下(pH3.5和50℃)产生1μmole D-半乳糖醛酸当量/分钟的酶量。

在一个方面，多聚半乳糖醛酸外切酶和多聚半乳糖醛酸内切酶之间的比例为至少约1∶1，至少2∶1或至少3∶1，如通过“测试5”的方法与“测试6”的方法相比较而由单位确定所定义的。

在另一方面，根据本发明的酶产品具有果胶酯酶活性。在本发明的一方面，所述产品的果胶酯酶活性是通过由果胶酯酶催化的反应测量的，所述反应涉及果胶混合物(例如，同聚半乳糖醛酸)中甲酯化的D-半乳糖苷糖醛酸(D-galactosiduronic acid)单位的脱酯化，得到酸性的果胶和甲醇，然后，所述酸性果胶是果胶解聚酶的底物。

果胶酯酶(果胶甲酯酶)被归类在EC3.1.1.11中并催化反应：

果胶+n H2O＜＝＞n甲醇+果胶酸酯

果胶酯酶也被称为果胶去甲氧基酶，果胶甲氧基酶和果胶甲基酯酶。

在本发明的一方面，所述产品的果胶酯酶活性是如下文中标题“测试”下描述的“测试7”中所测量的。

一个单位的果胶酯酶活性被定义为在“测试7”的条件下(pH4.6和30℃)或其它特定pH和温度水平下，催化1μmole的甲基酯键水解(释放1μmole果胶酸)/分钟的酶量。

在另一方面，根据本发明的酶产品具有果胶裂解酶活性(1→4)-6-O-甲基-α-D-聚半乳糖醛酸裂解酶。

果胶裂解酶也被称为果胶反式消去酶，内切-果胶裂解酶，果胶甲基反式消去酶，果胶裂合酶(pectolyase)或聚甲基半乳糖醛酸反式消去酶。

果胶裂解酶(果胶反式消去酶)被归类为EC4.2.2.10。此酶催化(1-＞4)-α-D-聚半乳糖醛酸甲酯的裂解，以得到在其非还原末端具有4-脱氧-6-O-甲基-α-D-半乳糖-4-enuronosyl基团的寡糖。

在本发明的一方面，根据本发明的酶产品的果胶裂解酶活性是由4，5-不饱和寡聚半乳糖醛酸酯的生成来测量的，所述4，5-不饱和寡聚半乳糖醛酸酯是由果胶的半乳糖醛酸残基之间的内部α-1，4键的随机裂解引起的。

可通过酶促水解苹果果胶底物中半乳糖醛酸残基之间的内部α-1，4键来确定果胶裂解酶的活性，例如下文中在标题“测试”下的“测试3”中所述的。反应的进展(特征是4，5-不饱和寡聚半乳糖醛酸酯的增加)继以利用分光光度计的吸光度的增加(由于不饱和键的形成)。酶活性是由238nm处吸光度的增加/单位时间来计算的。

可在pH3.5和30℃下进行所述测试，或者可就酶的其它表征和说明在不同的pH和温度值下进行所述测试。

一个单位的果胶裂解酶活性被定义为在测试的条件下(pH3.5和30℃)得到ΔOD_238nm.min^-1增加的酶量(对于总测试体积校正的)。

在一个方面，根据本发明的酶产品具有阿拉伯聚糖酶活性。术语“阿拉伯糖酶”和术语“阿拉伯聚糖酶”在本申请中被可互换地使用，两者均描述了被归类在EC3.2.1.99中的阿拉伯聚糖酶。系统命名是5-α-L-阿拉伯聚糖5-α-L-阿拉伯聚糖水解酶，但是它有数个其它的名称，例如阿拉伯聚糖内切-1，5-α-L-阿拉伯糖苷酶，和内切-1，5-α-L-阿拉伯聚糖酶，内切-α-1，5-阿拉伯聚糖酶，阿拉伯聚糖内切酶，1，5-α-L-阿拉伯聚糖和1，5-α-L-阿拉伯聚糖水解酶。阿拉伯糖酶内切水解(1-＞5)-阿拉伯聚糖中的(1-＞5)-α-阿拉伯呋喃糖苷连接。阿拉伯聚糖酶也作用于阿拉伯聚糖。

在本发明的一方面，根据本发明的酶产品的阿拉伯聚糖酶活性(或阿拉伯糖酶活性)是由如下文中标题“测试”下描述的“测试8”所测定的。可以在pH3.5和50℃下利用甜菜阿拉伯聚糖作为底物进行该测试，并且可就酶的其它表征和说明在不同的pH和温度值下进行所述测试。酶活性是由540nm处吸光度的增加/单位时间来计算的。

一个单位的阿拉伯聚糖酶活性被定义为在测试条件下(pH3.5和50℃)得到ΔOD_540nm.min^-1增加的酶量(对于总的测试体积校正的)。

在一个方面，根据本发明的酶产品具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性。术语“阿拉伯呋喃糖苷酶”描述了被归类在EC 3.2.1.55中的阿拉伯呋喃糖苷酶。其系统命名是α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶。其它名称是α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，阿拉伯呋喃糖苷酶和阿拉伯糖苷酶。

阿拉伯呋喃糖苷酶作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷，含有(1，3)-和/或(1，5)-连接的α-L-阿拉伯聚糖，阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖。

在本发明的一方面，根据本发明的酶产品的阿拉伯呋喃糖苷酶活性是由如下文中标题“测试”下描述的“测试16”所测定的。可以在pH5.0和50℃下利用对硝基苯α-L-阿拉伯呋喃糖苷进行该测试，并且可就酶的其它表征和说明在不同的pH和温度值下进行所述测试。反应的产物，对硝基苯，是比色测定的(在调整pH后)。酶活性是由对硝基苯酚的浓度和400nm处的吸光度之间的关系来计算的。

一个单位的α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶活性被定义为在测试条件下(pH5.0和50℃(或如所指定的))从对硝基苯α-L-阿拉伯呋喃糖苷产生1μmole对硝基苯/分钟的酶量。

在一个方面，根据本发明的酶产品具有纤维素裂解活性。纤维素酶的系统命名是4-(1，3；1，4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶和纤维素裂解酶或纤维素酶，被归类在EC3.2.1.4中。纤维素酶内切水解例如纤维素，地衣多糖和谷物β-D-葡聚糖中的(1-＞4)-β-D-糖苷连接，并且也将水解还含有1，3-连接的β-D-葡聚糖中的1，4-连接。纤维素酶还有其它的名称，例如内切-1，4-β-D-葡聚糖酶，β-1，4-葡聚糖酶，β-1，4-内切葡聚糖水解酶，纤维素酶A，cellulosin AP，内切葡聚糖酶D，碱性纤维素酶，纤维素酶A 3，纤维素糊精酶，9.5纤维素酶，微晶粉末纤维素酶，全细胞酶SS(pancellase SS)和1，4-(1，3；1，4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶。

在本发明的一方面，根据本发明的酶产品的纤维素酶活性是由如下文中标题“测试”下描述的“测试9”所测定的。可以在pH3.5或pH5和50℃下，利用CMC作为底物进行该测试，可就酶的其它表征和说明在不同的pH和温度值下进行所述测试。酶活性是由540nm处的吸光度增加/单位时间来计算的。

一个单位的纤维素酶活性被定义为在测试条件下(pH3.5和50℃)得到ΔOD_540nm.min^-1增加的酶量(对于总的测试体积校正的)。

木聚糖酶被归类在EC3.2.1.8，EC3.2.1.32，EC3.2.1.136和EC3.2.1.156，EC3.2.1.8，EC3.2.1.136和EC3.2.1.156中，活性可例如，如“测试11”中所述被测量。

内切-1，4-β-木聚糖酶被归类在EC 3.2.1.8中，该酶引起木聚糖中的1，4-β-D-木聚糖苷键的内切水解。

在一个方面，根据本发明的酶产品具有如下文中标题“测试”下描述的“测试11”所测量的内切-1，4-β-木聚糖酶活性。

可在pH3.5或pH5和50℃下利用木聚糖作为底物进行“测试11”，或者可就酶的其它表征和说明在不同的pH和温度值下进行所述测试。酶活性是由540nm处由木聚糖引起的吸光度增加/单位时间来计算的。

在本申请中，一个单位的木聚糖酶活性被定义为在测试11的条件下(pH3.5和50℃)得到ΔOD_540nm.min^-1增加的酶量(对于总的测试体积校正的)。

在一个方面，根据本发明的酶产品具有鼠李糖聚半乳糖醛酸酶活性，如，例如Suykerbuyk等人在“Cloning，sequence and expressionof the gene coding for rhamnogalacturonase of Aspergillusaculeatus；a novel pectinolytic enzyme”Appl.Microbiol.Biotechnol(1995)43：861-870中所描述的而测量的。

在本发明的一方面，所述酶产品还包含被归类在EC3.1.1.73中的半纤维素酶(或阿魏酸酯酶)。

半纤维素裂解酶或半纤维素酶被归类在EC3.1.1.73中，并且被接受的命名是阿魏酸酯酶。它们催化反应：阿魏酰基-多糖+H₂O＝阿魏酸+多糖，其中阿魏酸是4-羟基-3-甲氧基肉桂酸。半纤维素裂解酶的系统命名是4-羟基-3-甲氧基肉桂酰-糖水解酶。其还具有下列名称：阿魏酸酯酶，羟基肉桂酰酯酶，半纤维素酶辅助酶(accessary enzyme)；FAE-III，肉桂酰酯水解酶，FAEA，cinnAE，FAE-I，和FAE-II。这些酶催化来自酯化的糖的4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰基)基团的水解，所述酯化的糖通常是“天然”底物中的阿拉伯糖。对硝基苯乙酸和阿魏酸甲酯是较差的底物。所有的微生物阿魏酸酯酶都是被分泌到培养基中的。它们有时被称为半纤维素酶辅助酶类，因为它们辅助木聚糖酶和果胶酶来分解植物细胞壁半纤维素。

昆布多糖酶可以是被归类在E.C.3.2.1.6中的内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶或被归类在E.C.3.2.1.39中的葡聚糖内切-1，3-β-D-葡糖苷酶。内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶被归类在E.C.3.2.1.6中，其备选的名称是昆布多糖酶，内切-1，3-β-葡聚糖酶，内切-1，4-β-葡聚糖酶。底物包括昆布多糖，地衣多糖和谷物D-葡聚糖，并且当葡萄糖残基(其还原基团参与待水解的连接)本身在C-3被取代时，该酶催化β-D-葡聚糖中的(1-＞3)-或(1-＞4)-连接的内切水解。葡聚糖内切-1，3-β-D-葡糖苷酶具有备选的名称：(1-＞3)-β-葡聚糖内切水解酶，内切-1，3-β-葡聚糖酶和昆布多糖酶，其被归类在E.C.3.2.1.39中，并且水解底物(例如昆布多糖，副淀粉和茯苓聚糖)中(1-＞3)-β-葡聚糖中的(1-＞3)-β-D-葡糖苷连接。

淀粉酶将淀粉分解为糖。所有的淀粉酶均为糖苷水解酶并作用于α-1，4-糖苷键上。

α-淀粉酶(EC3.2.1.1)(CAS#9014-71-5)(备选名称：1，4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶；糖原酶)：所述α-淀粉酶作用在沿淀粉链的随机位置处并分解长链碳水化合物，最终由直链淀粉产生麦芽三糖和麦芽糖，或从支链淀粉产生麦芽糖，葡萄糖和有限糊精。β-淀粉酶(EC3.2.1.2)(备选名称：1，4-α-D-葡聚糖麦芽糖水解酶；糖原酶；糖原淀粉酶)是淀粉酶的另一种形式，其从非还原末端起作用，β-淀粉酶催化第二α-1，4-糖苷键的水解，并一次切割掉两个葡萄糖单位(麦芽糖)。

葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)(备选名称：葡聚糖1，4-α-葡糖苷酶；淀粉葡糖苷酶；外切-1，4-α-葡糖苷酶；葡糖淀粉酶；溶酶体-α-葡糖苷酶；1，4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶)：除了切割直链淀粉和支链淀粉非还原末端处最后的α(1，4糖苷连接)而产生葡萄糖外，葡糖淀粉酶将切割α(1-6)糖苷连接。

全淀粉酶活性是酸性麦芽糖生成活性。

“深层发酵”在本申请的情境中指本领域内的技术人员公知的发酵类型，其中微生物在液体培养基中深层发酵，优选使其经受搅拌，例如连续和剧烈的搅拌。所述发酵可在开放的罐或封闭的罐中进行，并且可以是批次型、给料批次型或连续型。在批次发酵中，生物体在已知量的培养基中生长确定的时期，然后可在进一步加工之前将细胞群从液体中分离；而在连续培养中，培养基可以根据产物形成的速度和新鲜培养基的流入而被取出。在给料批次型发酵中，将至少一种限制生长的化合物(例如营养底物)在发酵过程中补给到发酵培养液中。

具有相似活性的产物可以通过曲霉属的表面发酵而获得，然而，表面发酵的操作在实际中是困难的，并且酶产品有待从表面被纯化或提取。此外，为了避免其它微生物的感染，通过本领域技术人员公知的方法(例如热处理或通过酸性pH处理)来灭菌用于深层发酵的液体培养基比灭菌用于表面发酵的固体培养基更简单。为了使培养基保持最佳的pH值和/或恒定的pH值，通过加入pH调节剂而在深层发酵过程中控制和调节pH值也是更方便的。由于这些和其它的原因，深层发酵因此在工业规模中是比表面发酵优选得多的方法。

在一个方面，所述菌株来自黑曲霉组。在另一方面，所述菌株是塔宾曲霉。塔宾曲霉是黑曲霉组的成员。

在又一个方面，提供了具有保藏登记号CBS123488的塔宾曲霉或其衍生物或后代。

在又一个方面，用于发酵的菌株与具有保藏登记号CBS123488的塔宾曲霉菌株具有基本上相同的特征。

在另一方面，所述菌株是具有保藏登记号CBS123488的塔宾曲霉。

在本发明的情境中，短语“基本上相同的特征”指该菌株具有与保藏在Centraalbureau voor Schimmelcultures，Uppsalalaan 8，NL-3584CT乌特勒支，荷兰/P.O.Box 85167，NL-3508 AD乌特勒支，荷兰的，具有保藏登记号CBS123488的塔宾曲霉的一个或多个(优选全部)特征。所述具有保藏登记号CBS123488的塔宾曲霉被给予了下列登记号：CBS123488塔宾曲霉4M 146，并且保藏日期是2008年9月30日。

将理解的是，根据本发明而使用的真菌菌株可以是上述经保藏的菌株的培养物，但也可以是具有与上述经分离和保藏的菌株基本上相同的特性的菌株的培养物。在优选的实施方案中，所述菌株是经保藏的菌株或其后代。

在本发明的一方面，曲霉属菌株的单一真菌培养物选自：黑曲霉(Aspergillus niger)402(例如CBS120.49)，黑曲霉hennebergii(Aspergillus niger hennebergii)(例如CBS117.80)，炭黑曲霉(Aspergillus carbonarius)(例如CBS 112.80，CBS420.64)，黑曲霉nanus(Aspergillus niger nanus)(例如CBS136.52，CBS117.48)，臭曲霉(Aspergillus foetidus)(例如CBS121.78，CBS 618.78)，塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)(例如CBS11529)，中间黑曲霉(Aspergillus niger intermedius)(例如CBS559.65)和日本曲霉(Aspergillus japonicus)(例如CBS114.51，CBS621.78)，棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(例如CBS101.43，CBS115.80，CBS172.66，CBS119.49)，浅蓝灰曲霉(Aspergillus caesiellus)，亮白曲霉(Aspergillus candidus)，肉色曲霉(Aspergillus carneus)，棒曲霉(Aspergillus clavatus)，弯头曲霉(Aspergillus deflectus)，黄曲霉(Aspergillus flavus)，烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)，黑曲霉(Aspergillus niger)，赭曲霉(Aspergillus ochraceus)，米曲霉(Aspergillus oryzae)，寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)，青霉状曲霉(Aspergillus penicilloides)，局限曲霉(Aspergillusrestrictus)，酱油曲霉(Aspergillus sojae)，萨氏曲霉(Aspergillussydowi)，酱油曲霉(Aspergillus tamari)，Aspergillus terreusm，焦曲霉(Aspergillus ustus)，或者杂色曲霉(Aspergillusversicolor)。

在本发明的一方面，所述曲霉属菌株是未经遗传修饰的。

在本发明的一方面，提供了包含根据本发明的酶产品、酶载体和任选地稳定剂和/或防腐剂的酶产品制备物。

在本发明的又一方面，所述酶载体选自甘油或水。

在又一方面，所述制备物包含稳定剂。在一个方面，所述稳定剂选自无机盐，多元醇，糖及其组合。在一个方面，所述稳定剂是无机盐，例如氯化钾。在另一方面，所述多元醇是甘油或山梨醇。在又一方面，所述糖是小分子碳水化合物，特别是数种甜味糖中的任何糖，例如葡萄糖，果糖和蔗糖。

在又一个方面，所述制备物包含防腐剂。在一个方面，所述防腐剂是对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，苯甲酸酯，山梨酸酯或其它食品许可的防腐剂，或其混合物。

根据本发明的酶产品具有数个优势，例如在果汁的生产中。在一个方面，由于更容易的液体/固体分离和更高的果汁产量，提供了增加的产量。在一个方面，不论使用什么设备(卧式压榨机，带式压榨机或倾淅器)，由于醪液和次级醪液的粘性降低，而提供了更高的容量。在一个方面，提供了更少的果渣，因为更高的果汁产量对剩余果渣的量有直接的影响。在一个方面，提供了压榨机的更容易的清洁。在一个方面，提供了果汁中更少的果胶。在一个方面，提供了快速、有效的醪液粘性的降低。在一个方面，提供了所有系统中良好的固体/液体分离和高的果汁产量。在一个方面，提供了果汁和浓缩物中高度有效的颜色提取和稳定的颜色。

在本发明的一方面，根据本发明的酶产品制备物中的果胶裂解酶活性在50-10.000U/g的范围内，优选在75-7000U/g的范围内，并且更优选在100-5000U/g的范围内，例如，如下文所述的“测试3”中所测量的。

另一方面，根据本发明的酶产品制备物中的果胶酯酶活性在10-10000U/g的范围内，优选在100-7000U/g的范围内，并且更优选在500-3000U/g的范围内，例如，如下文所述的“测试7”中所测量的。

在又一个方面，根据本发明的酶产品制备物中的阿拉伯聚糖酶活性在10-8000U/g的范围内，优选在50-4000U/g的范围内，更优选在100-2500U/g的范围内，例如，如下文所述的“测试8”中所测量的。

在又一个方面，根据本发明的酶产品制备物中的纤维素酶活性在10-5000U/g的范围内，优选在50-4000U/g的范围内，并且更优选在100-2000U/g的范围内，例如，如下文所述的“测试9”中所测量的。

在又一个方面，根据本发明的酶产品制备物中的内切-1，4-木聚糖酶活性在10-10.000U/g的范围内，优选在50-10.000U/g的范围内，并且更优选在100-7000U/g的范围内，例如，如在“测试11”的条件下(pH3.5和50℃)所测量的。

在一个方面，所述酶产品被用于生产果汁浓缩物和葡萄酒。

根据本发明的酶产品可被用于作为果汁中天然存在的酶的补充，并且可加速和提高苹果、梨、葡萄和柑橘水果的加工。

在本发明的一方面，所述酶产品可被用在例如柑橘水果加工中，其中酶的应用降低了果汁的粘性，消除了果汁浓缩和存储过程中胶凝化的风险，并且确保了高的混浊稳定性。在果肉萃取过程中应用时，根据本发明的酶产品促进了果汁和固体的释放，增加了产量，并改善了成本效率。稳定的混浊(或者，在柠檬汁的情况中，成功的澄清)是终产品质量上乘的重要评测标准。

在柑橘水果加工过程中利用酶时也可以回收柑橘属精油。除了提供有价值的商品外，柑橘属精油的回收从可持续性的角度来看是重要的，其确保了废水中杀菌油的低含量，用于改善的废水生物可降解能力，并减少了整体上的水消耗。在本发明的一个方面，所述酶产品被用于柠檬汁的澄清。在本发明的一个方面，所述酶产品在柑橘属水果加工中被用于果肉/核清洗、柑橘属果汁的粘性降低和/或皮提取。

高澄清度苹果和梨汁的生产取决于淀粉和果胶内容物的完全分解。这可通过在澄清和过滤之前，向果汁中加入酶产品而实现。在压榨和果汁分离之前被加入到水果醪液中，所述酶产品可引起醪液粘性的降低，导致增加的果汁产量和优化的加工能力。更少的果渣和更容易清洁水果压榨机可以是其它有附加值的优点。在本发明的一方面，所述酶产品被用于苹果和梨醪液的浸渍。在本发明的一方面，所述酶产品被用于在最初的压榨后提取苹果果渣。在本发明的一方面，所述酶产品被用于苹果和梨汁中淀粉的降解。在本发明的一方面，所述酶产品被用于果汁(特别是苹果汁)中果胶的降解。在本发明的一个方面，所述酶产品被用于果汁(特别是梨汁)中果胶和阿拉伯聚糖的降解。

葡萄酒制造者需要年复一年地生产高质量的葡萄酒，无论天气的年度变化如何。根据本发明的酶产品可辅助有价值的成分(例如芳香、颜色和单宁)从葡萄转移到葡萄酒中，并且可帮助保持葡萄酒的质量，有时保存许多年。所述酶产品也可减少发酵时间并促进澄清，过滤和稳定化。

本发明也针对源自上述方法的任何产品。此类产品包括源自植物材料的饮料，例如果汁、咖啡、茶、啤酒、葡萄酒、苹果酒和营养制备物以及用于食品的成分，例如，用于婴儿食品、和新的浸渍和/或液化产品。

在一个方面，提供了酶产品或酶产品制备物用于降解植物材料的用途，例如其中所述植物材料是植物细胞，例如其中所述植物材料是植物细胞壁或其部分；例如用于释放化合物，例如其中所述化合物是生物学活性的化合物或其前体，例如其中所述化合物是药学活性的化合物。在一个方面，所述植物材料是经遗传修饰的。在另一方面，提供了所述酶产品用于降解废物的用途。在又一个方面，提供了所述酶产品在果汁和/或葡萄酒制造的过程中、在水果的提取和/或液化和/或果汁澄清的步骤中的用途。

所述酶产品和/或酶产品制备物的其它应用包括下述应用：其中需要从植物材料(例如水果)中提取颜色/色素，例如浆果(例如，黑醋栗、红醋栗、圆醋栗、酸果蔓、蓝莓、黑莓、覆盆子、杂交草莓(boysenberry)、桑椹、草莓等)的红颜色，或其它水果(例如，番石榴、果榄属(lucuma)、石榴、猕猴桃、葡萄、南瓜、葫芦、黄瓜、甜瓜、橙子、柠檬、酸橙、葡萄柚、香蕉、桑橙、菠萝、无花果、苹果、温柏、梨、蔷薇果、桃子、樱桃、枣椰子、芒果、油桃、李子、杏等)。所述酶产品和/或酶产品制备物的其它应用包括从葡萄提取颜色用于果汁或葡萄酒的生产，例如红葡萄酒和玫瑰葡萄酒的生产。在来自植物材料的颜色/色素提取物中，通常希望提取尽可能多的颜色/色素。

最终的制备物中，根据本发明的酶产品的浓度依赖于所设想的用途。

在使用的制备物中，所述酶产品通常的使用剂量是4-300ppm。对于许多用途而言，通过稀释或浓缩调节所述酶产品，使其达到约300-600U/g的活性，如由“测试3”作为果胶裂解酶活性而测量的。在将酶产品调节到约300-600U/g的果胶裂解酶活性(如由“测试3”所测量的)后，然后确定剩余的酶活性。然而，任何酶的活性/克当然取决于由发酵获得的酶产品或最终制备物的稀释度或浓度。

如果所述酶产品的酶活性在100-800U/g(果胶裂解酶单位)的范围内，那么最终应用中的活性可被计算为：

最小值：4ppm(g/吨)的100U/g的产品在最终的应用中产生的酶浓度：0.4U/kg

最大值：300ppm的800U/g的产品在最终的应用中产生的酶浓度：240U/kg

具体应用中的相关剂量取决于温度、pH和保持时间。

在本发明的一方面，应用产品中的浓度每公斤产品是0.001U/Kg-10.000U/kg，其中所述应用产品例如是果汁，如苹果、梨、葡萄或柑橘水果。

在本发明的一方面，应用产品中的浓度每公斤产品是0.005U/kg-5.000U/kg，其中所述应用产品例如是果汁，如苹果、梨、葡萄或柑橘水果。在本发明的一方面，应用产品中的浓度每公斤产品是0.05U/kg-2000U/kg。

在本发明的一方面，应用产品中的浓度每公斤产品是0.1U/kg-500U/kg，其中所述应用产品例如是果汁，如苹果、梨、葡萄或柑橘水果。在本发明的一方面，提供了含有根据本发明的酶产品制备物的果汁，例如苹果、梨、葡萄或柑橘果汁。

在本发明的一方面，提供了用于生产根据本发明的酶产品的方法。

在一个方面，提供了生产酶产品的方法，所述方法包括下列步骤：在培养基中深层发酵塔宾曲霉以获得发酵培养液，和任选地从所述发酵培养液中回收无细胞培养液形式的酶产品。在另一方面，提供了包括下列步骤的方法：在培养基中深层发酵塔宾曲霉的一种单一培养物以获得发酵培养液，和任选地从所述发酵培养液中回收无细胞培养液形式的酶产品。

在一个方面，提供了酶产品的生产方法，其中所述方法包括下列步骤：在包含甜菜果肉的培养基中深层发酵曲霉以获得发酵培养液，和任选地从所述发酵培养液中回收无细胞培养液形式的酶产品。在另一方面，提供了包括下述步骤的方法：在包含甜菜果肉的培养基中深层发酵曲霉的一种单一培养物以获得发酵培养液，和任选地从所述发酵培养液中回收无细胞培养液形式的酶产品。

在另一方面，所述发酵包括下列步骤：

a.在接种培养基中生长所述曲霉菌株(例如曲霉培养物)以获得接种物，和

b.将所述接种物加入到包含含有果胶和阿拉伯聚糖的植物材料的发酵培养基中。

在一个方面，所述接种培养基包含甜菜果肉和/或谷麸例如麦麸。在一个方面，所述接种培养基包含甜菜果肉和谷麸例如麦麸。

在本发明的一方面，提供了通过深层发酵生产酶产品的方法，其包括下列步骤：

a.在通风的种子底物培养基中(任选地包含谷麸和/或甜菜果肉)生长曲霉的一种单一培养物以获得接种物，所述底物培养基具有的pH在2-8的范围内，

b.将所述接种物加入到包含谷麸和甜菜果肉的发酵培养基中，并在空气中孵育所述经接种的发酵培养基以获得发酵培养液，和

c.从所述发酵培养液中回收酶产品。

在本发明的另一方面，提供了生产酶产品的方法，其包括下列步骤：

a.在任选地包含谷麸和/或甜菜果肉的通风种培养基中使曲霉的一种单一培养物生长10-60小时以获得接种物，所述培养基具有的pH在2-8的范围内，

b.以10-20％(v/v)范围内的浓度将所述接种物加入到包含谷麸和甜菜果肉的发酵培养基中，并在空气中孵育所述发酵培养基20-140小时以获得发酵培养液，和

c.从所述发酵培养液中回收酶产品。

在第一个步骤(a)中，在含有之前经灭菌的原材料和水的培养基中培育或生长生产菌株。用于发酵过程的培养基可由许多不同的原材料制成。在本发明的一方面，用于生长所述真菌培养物以获得接种物的培养基包含甜菜果肉和任选地谷麸。在一个方面，通过酸性pH处理而使所述培养基被灭菌，例如通过2-7范围内的pH、2.25-6范围内的pH、2.5-5范围内的pH、3-4范围内的pH、或约3.5的pH的处理。在另一方面，通过酸性pH处理而使所述培养基被灭菌，例如通过pH值为至少2、至少2.5或至少3的pH处理。

在本发明的另一方面，在步骤(b)中用于所述深层发酵的发酵培养基包含谷麸。在本发明的另一方面，用于所述深层发酵的培养基包含谷麸和甜菜果肉二者。

本发明可用于工业规模中的任何深层发酵，例如用于任何具有至少5L的培养基的发酵。在另一方面，所述发酵可在50L、500L、5000L、50000L或150m³的培养基中进行。

在一个方面，本发明涉及通过根据本发明的方法可获得的酶产品。

在本发明的一方面，在发酵过程中加入泡沫抑制剂。作为抗泡沫剂的例子可提及的有基于聚丙二醇的混合物，例如Erol DF 6000K(CAS009082-00-2)或例如，SIN260。

在本发明的一方面，步骤(a)和/或步骤(b)中的pH在2-8的范围内。在本发明的一方面，步骤(a)和/或步骤(b)中的pH在2.5-6的范围内。在本发明的一方面，步骤(a)和/或步骤(b)中的pH在3-4.5的范围内，例如在3-4的范围内，例如在3.2-3.7的范围内，例如在3.3-3.7的范围内。在本发明的一方面，步骤(a)和/或步骤(b)的pH在3.3-3.7的范围内。

在本发明的一方面，步骤(a)和/或步骤(b)中的温度在25-40℃的范围内。在本发明的一方面，步骤(a)和/或步骤(b)中的温度在28-34℃范围内。

在本发明的一方面，所述深层发酵是作为需氧发酵进行的。

在本发明的一方面，在步骤(a)中在包含谷麸和甜菜果肉的通风种培养基(所述培养基具有2-8范围内的pH)中生长曲霉培养物10至60小时。在另一方面，生长时期是15-50小时，例如20-40小时。

在本发明的一方面，步骤(b)中的pH被调节为pH2-8，例如2.5-6，例如pH 3-4。在步骤(b)中，在20-45℃的温度范围内孵育所述培养物。在本发明的一方面，在步骤(b)中，在25-35℃的温度范围内孵育所述培养物。在本发明的另一方面，在步骤(b)中，在28-34℃的温度范围内孵育所述培养物。在一个方面，在通风过程中，在步骤(b)中孵育所述培养物40-140小时。在另一方面，在步骤(b)中孵育所述培养物60-120个小时，例如在通风过程中孵育70-110个小时。

在发酵过程中温度谱在所述间隔内可保持恒定或变化。

在本发明的一方面，步骤(a)中生长培养物的培养基和步骤(b)中的发酵培养基均包含谷麸和甜菜果肉。

在另一方面，所述培养基包含硝酸钾。在另一方面，所述培养基包含硫酸铵。在另一方面，所述培养基包含硫酸铵和硝酸钾二者。在另一方面，所述培养基包含谷麸、甜菜果肉、硫酸铵和水中的硝酸钾。

在本发明的一方面，谷麸是以麦麸丸粒的形式。麦麸丸粒可由麦麸制成，所述麦麸是生产面粉和粗磨粉的副产品，其主要由外壳和比例可变的胚乳组成，通过加入合适的粘合剂(例如，1-3％(w/w)的糖蜜、脂肪或胶状粘土)，然后在制粒机或挤压机中、在高压下挤压所述组合物以形成圆柱形状的丸粒。丸粒通常具有与原始植物残留物相同的特征，特别是在产品的油和水含量方面。取决于其来源，在压榨丸粒(expellerpellet)和提取粉状丸粒(extraction meal pellet)之间进行区分。

麸是谷粒的硬的外层，且包含组合的糊粉和谷皮。其与胚芽一起是整个谷粒的完整部分，并且可作为精制谷物生产中研磨的副产品而被生产。麸尤其富含饮食纤维并且可含有显著量的淀粉、蛋白质、维生素和膳食矿物质。麸的相对高的油含量使其经受酸败作用，这是它为什么经常在储存或进一步加工之前从谷粒中被分离的原因之一。麸本身可被热处理以增加其寿命。

当麸从谷粒中被除去时，它们失去其一部分的营养价值。麸存在于任何谷粒中并且可从任何谷粒中被研磨出来，所述谷粒包括稻、玉米、小麦、玉蜀黍、燕麦、大麦和粟。

稻麸是稻研磨过程(棕色稻到白色稻的转换)中的副产品。稻组成了禾本科(Poaceae)(或禾本科(Gramineae))的稻属，普通的稻被归类为水稻(Oryza sativa)。

在本申请的情境中，术语“麦麸”涉及包含麦粒的硬外层的产品，并且包含组合的糊粉和谷皮。在一个方面，麦麸具有2-20％w/w含量的阿拉伯聚糖。在一个方面，麦麸具有5-15％w/w的阿拉伯聚糖含量。在一个方面，麦麸包含至少2％w/w的阿拉伯聚糖，例如至少3％w/w的阿拉伯聚糖，例如至少4％w/w的阿拉伯聚糖，或例如至少5％w/w的阿拉伯聚糖。

在另一方面，所述麦麸在发酵培养基中存在于3-7％w/w的范围内。另一方面，所述麦麸在发酵培养基中存在于3.5-6％w/w的范围内。在另一方面，麦麸在发酵培养基中存在于4-5％w/w的范围内。

在一个方面，麦麸中的面粉浓度是低的。

类似地，相信甜菜果肉丸粒优选地应该是未经糖蜜处理过的。商业上可得的产品(例如，“pulpetter”)被相信是合适的。也相信，可被丸粒吸收的水的量可以是质量的指示，例如在水中吸收约4x其重量的能力(好的质量)与例如约2x(低质量)相比。

由于原材料质量可能的变化(批次与批次，季节与季节，供应者与供应者等)，建议在较小的规模上就其用于制备酶产品的可适用性测试这些原材料。

在本发明的一方面，甜菜果肉被用于a)的基底培养基和b)的发酵培养基中。甜菜(Beta vulgaris L.)是藜(Chenopodiaceae)科的成员，其是根中含有高浓度蔗糖的植物。商业上其为了糖而被生长。甜菜直接涉及甜菜根，牛皮菜和饲料甜菜，都是传自海甜菜的培育。

在本发明的一方面，甜菜果肉是以甜菜丸粒或干燥的甜菜果肉或粒化的甜菜果肉的形式。

甜菜果肉是从切片的甜菜中提取了糖后余留下来的植物材料。收获后，甜菜被拖运到工厂，在那里它们被倾倒在通常是混凝土“平板”的接收区上，在那里它们被移动成为大的堆。甜菜从所述堆中被移动到中央通道或沟槽中，在那里其被洗涤而朝向加工厂。在加工厂处接收后，甜菜根被洗涤，被机械地切成称作甜菜丝的细条，并被递送至称作浸提器(diffuser)的机器以提取糖内容物成为水溶液。浸提器是许多米的长管，其中甜菜切片在一个方向移动，而热水在相反的方向移动。移动可以是通过旋转的螺旋或者整个部件旋转，而且水和甜菜丝移动通过内部的腔。有不同的浸提器的设计，例如水平的旋转，倾斜的螺旋，或垂直的螺旋“塔”。较少见的设计利用甜菜丝的移动带，伴随着水被泵到所述带的顶上并且倾泻而过。通常，甜菜丝和水的流速的比率是1比2。通常，甜菜丝花费约90分钟以通过浸提器，而水仅用45分钟。这些都是逆流交换方法，与如若甜菜丝仅留在热水箱中相比，所述方法利用更少的水从甜菜丝中提取更多的糖。离开浸提器的液体被称为原果汁。取决于氧化作用的量，原果汁的颜色由黑变化为暗红，而氧化作用的量本身取决于浸提器的设计。所使用的甜菜丝或果肉在有约95％的水分但蔗糖含量低时离开浸提器。利用螺旋压榨器，湿果肉然后被压榨到湿度降至75％。这回收了从果肉压出的液体中的其它蔗糖，并且减少了干燥果肉所需的能量。经压榨的果肉可被干燥和出售，例如作为动物饲料。此植物材料然后可被制成丸粒以提高其营养价值和处理特性。它是高纤维的且独特性在于其纤维是极易消化的。

在本发明的另一方面，甜菜果肉是从Danisco Sugar A/S获得的甜菜丸粒的形式。在本发明的另一方面，甜菜果肉是从Nordic Sugar获得的Fibrex甜菜丸粒的形式。

甜菜果肉可以是经糖蜜化的，或未糖蜜化的，优选未糖蜜化的如Fibrex糖蜜或糖浆是将甘蔗或甜菜加工成糖时的粘稠糖浆副产品。糖蜜的质量取决于甘蔗或甜菜的成熟度，提取的糖的量，和提取方法。

在本发明的一方面，用于深层发酵的底物包含的甜菜果肉在1-30％w/w的范围内。在另一方面，用于深层发酵的底物包含的甜菜果肉在1-20％，2-20％，1-15％，1-10％，3-15％的范围内。在另一方面，甜菜果肉在2-8％w/w的范围内存在于发酵培养基中。在另一方面，甜在3-7％w/w的范围内存在于发酵培养基中。在另一方面，甜菜果肉在4-7％w/w的范围内存在于发酵培养基中。在另一方面，甜菜果肉在3.5-6％w/w的范围内存在于发酵培养基中。在另一方面，甜菜果肉在4-6％w/w的范围内存在于发酵培养基中。在另一方面，甜菜果肉在4-5％w/w的范围内存在于发酵培养基中。在一个方面，甜菜果肉以至少2％w/w、例如至少3％w/w或例如至少4％w/w的量存在于发酵培养基中。

在本发明的一方面，所使用的甜菜果肉中的糖含量大约在0.5-20％(w/w)的范围内。在另一方面，所述甜菜果肉具有1-10％w/w的糖含量。在另一方面，甜菜果肉在干燥的基础上具有2-8％w/w的糖含量。在一个方面，所使用的甜菜果肉中的糖含量为至少0.5％w/w，例如至少2％w/w，例如至少4％w/w，例如至少6％w/w，或例如至少8％w/w的量。

在本发明的其它方面，所使用的甜菜果肉中的果胶含量在干燥的基础上在大约8-35％w/w的范围内，在大约12-28％(w/w)的范围内，在干燥基础上在大约15-22％w/w的范围内。在一个方面，所使用的甜菜果肉中的果胶含量为至少9％w/w，例如至少11％w/w，例如至少13％w/w，或例如至少15％w/w的量。

在本发明的一方面，甜菜果肉在干燥的基础上具有1.5-40％w/w的阿拉伯聚糖含量。在本发明的一方面，甜菜果肉在干燥的基础上具有5-40％w/w的阿拉伯聚糖含量。在本发明的一方面，甜菜果肉在干燥的基础上具有10-30％w/w或5-30％w/w的阿拉伯聚糖含量。这些范围可取决于所使用的甜菜果肉的特定类型而变化。在一个方面，甜菜果肉包含至少1.5％w/w的阿拉伯聚糖，例如至少2％w/w的阿拉伯聚糖，例如至少3％w/w的阿拉伯聚糖，例如至少4％w/w的阿拉伯聚糖，例如至少5％w/w的阿拉伯聚糖，例如至少6％w/w的阿拉伯聚糖，例如至少7％w/w的阿拉伯聚糖，例如至少8％w/w的阿拉伯聚糖，例如至少9％w/w的阿拉伯聚糖，或例如至少10％w/w的阿拉伯聚糖。

在一个方面，待用于发酵培养基中的、包含果胶和阿拉伯聚糖的植物材料是谷麸(例如麦麸)和甜菜果肉的混合物，所述谷麸(例如麦麸)和甜菜果肉的比例为大约20∶80至80∶20，30∶70至70∶30，40∶60至60∶40，或45∶55至55∶45(w∶w)。在另一方面，谷麸(例如麦麸)和甜菜果肉的混合物的比例为大约50∶50；大约45∶55；大约55∶45；大约40∶60；大约60∶40；大约30∶70；大约70∶30；大约20∶80；大约80∶20(w∶w)。在一个方面，所述混合物含有比谷麸(例如麦麸)更多的甜菜果肉，例如比例为大约51∶49至60∶40或大约51∶49至55∶40(w/w)。在一个方面，混合物含有比谷麸(例如麦麸)更多的甜菜果肉，例如比例为大约51∶49，大约52∶48至大约53∶47，或大约54∶46(w∶w)。

在其它方面，甜菜果肉和麦麸各自在发酵培养基中存在的范围是3-7％w/w。在另一方面，甜菜果肉和麦麸各自在发酵培养基中存在的范围是3.5-6％w/w。在另一方面，甜菜果肉和麦麸各自在发酵培养基中存在的范围是4-6％w/w。在另一方面，甜菜果肉和麦麸各自在发酵培养基中存在的范围是4-5％w/w，例如各自以大约4％w/w，大约4.2％w/w，大约4.3％w/w，大约4.4％w/w，大约4.5％w/w，大约4.6％w/w，大约4.7％w/w，大约4.8％w/w，大约4.9％w/w，或大约5.0％w/w的量存在。

在本申请的情境中，术语“培养液”和“培养基”指含有各种用于生长(发酵)微生物培养物的营养物的液体培养基。

在本发明的一方面，所使用的发酵培养基包含谷麸例如麦麸和甜菜果肉。在一些实施方案中，已发现在发酵培养基中使用谷麸(如麦麸)和甜菜果肉产生具有高的总酶活性和许多不同的酶活性(在不同的酶以及许多不同的副活性方面)的酶产品。在一些实施方案中，也已发现，在发酵培养基中使用谷麸(如麦麸)和甜菜果肉产生具有酶活性(例如阿拉伯呋喃糖苷酶和阿拉伯聚糖酶)的酶产品。

在本发明的其它方面，步骤(b)中所使用的发酵培养基具有下列组成：谷麸，甜菜果肉，硫酸铵和硝酸钾。可通过加入硫酸来调节培养基的pH。

可使用不同的方法来决定发酵何时完成。发酵后可测量培养基的粘性。这对于本领域内的技术人员而言是通常的实践，测量可通过使用Vibro Viscometer SV-10型号的粘度计(A&D公司)而进行。发酵开始时的粘性通常＞150mPa.s例如＞200m Pa.s，并且当粘性＜150mPa.s(例如在100mPa.s以下，在75mPa.s以下或在50mPa.s以下)时可停止发酵。

在本发明的一方面，所使用的发酵培养基具有如下组成：

成分	比例(w/w％)
		麦麸	3-8
甜菜果肉丸粒	2-10
		硫酸铵	0-1.0例如0.3-1.0
硝酸钾	0.1-0.6

在本发明的一方面，使用硫酸和/或氢氧化纳调节pH。

发酵后，可通过使用常规的方法来回收酶产品，其中生物质从上清液中被分离，其中所述生物质包括细胞和“余留物”(例如麦麸和甜菜果肉丸粒的“余留物”)。

在一个方面，回收过程的目的是分离生物质，纯化、浓缩和稳定所需的酶混合物。果胶裂解酶是细胞外的，并且在发酵过程中形成的酶因此被分泌到了液体中(上清液)。

加工所收获的发酵培养液的第一个目的是从所述培养液中分离细胞。此种分离通常是如下实现的：通过过滤(例如通过使用旋转真空过滤器)，继而通过浓缩(通常是通过超滤或蒸发进行的)。

在有高纯度要求的产品的情况中，下游过程经常要求特殊的步骤以除去不需要的杂质。这可通过选择性沉淀或吸收杂质或结晶(通过结晶可获得极纯的酶产品)来进行。

在分离了生物质以后，根据所需的强度可浓缩酶产品的上清液。所述上清液可以被浓缩，例如5倍、10倍、15倍或20倍。可利用超滤来达到所需的强度。通过超滤，酶产品的上清液可被分离成为浓缩的上清液和渗透物，所述渗透物主要是纯水。然后，可将酶产品的浓缩上清液过滤灭菌以获得经浓缩和灭菌的酶产品。

在本发明的一方面，特别是当所述产品意欲用于食品工业中时，可用食品级的制剂和防腐剂使来自上述步骤的浓缩酶产品标准化和稳定化。在所述方法的这一部分中，所述制备物的酶活性可被标准化至所需的商业水平用于目的商业酶制备物并且可就pH调节所述制备物。在一些实施方案中，将完成的酶产品的pH调整到例如pH3.5被认为会提高所述完成的产品的稳定性/可储存性。

可应用抛光过滤步骤，其中可使用珍珠岩和/或硅藻土。可通过下列方法中的任一项进行所述抛光过滤：薄饼滤器(pancake filter)，过滤筒或通过压滤机。

所述酶产品可例如通过喷雾干燥或冷冻干燥而被干燥。可能需要载体用于干燥，例如麦芽糖糊精或KCl。

可使用常规的手段和本领域中已知的方法将所述酶产品配制为液体，粉末或使其粒化。

利用塔宾曲霉菌株生产过滤物/上清液(其为了使用可被浓缩)形式的根据本发明的酶产品的方法的一个实施方案被阐释如下：

上面的“甜菜丸粒”指“甜菜果肉丸粒”

根据本发明的其它实施方案：

1.至少包含下列酶活性的酶复合物：

i.多聚半乳糖醛酸内切酶活性

ii.多聚半乳糖醛酸外切酶活性

iii.果胶酯酶活性

iv.果胶裂解酶活性

v.纤维素酶活性

vi.木聚糖酶活性和

vii.阿拉伯聚糖酶活性

并且其中所述酶复合物是由深层发酵曲霉属菌株而获得的表达产品。

2.根据实施方案1的酶复合物，其中所述酶复合物是深层发酵曲霉属菌株的一种单一培养物而获得的表达产品。

3.根据实施方案1-2中任一项的酶复合物，其还包含鼠李糖半乳糖醛酸酶活性。

4.根据实施方案1-3中任一项的酶复合物，其还包含半纤维素酶活性。

5.根据实施方案1-4中任一项的酶复合物，其还包含葡糖淀粉酶活性。

6.根据实施方案1-5中任一项的酶复合物，其还包含全淀粉酶活性。

7.根据实施方案1的酶复合物，其中所述菌株来自黑曲霉(Aspergillus niger)组。

8.根据实施方案1的酶复合物，其中所述菌株是塔宾曲霉。

9.根据实施方案7的酶复合物，其中所述菌株是具有保藏登记号CBS123488的塔宾曲霉。

10.根据实施方案1-9中任一项的酶复合物，其中用于所述深层发酵的培养基包含甜菜果肉。

11.根据实施方案1-9中任一项的酶复合物，其中用于所述深层发酵的培养基包含谷麸，例如麦麸。

12.根据实施方案1-11中任一项的酶复合物，其中用于所述深层发酵的培养基包含1-30％(w/v)范围内的甜菜果肉。

13.根据实施方案1-12中任一项的酶复合物，其具有比多聚半乳糖醛酸外切酶活性更高的多聚半乳糖醛酸内切酶活性。

14.根据实施方案1-13中任一项的酶复合物，其中所述曲霉属菌株是未经遗传修饰的。

15.包含根据实施方案1-14中任一项的酶复合物、酶载体和任选地稳定剂和/或防腐剂的酶复合物制备物。

16.生产酶复合物的方法，所述方法包括下列步骤：

在培养基中深层发酵塔宾曲霉以获得发酵培养液，和从所述发酵培养液中回收无细胞培养液形式的酶复合物。

17.生产酶复合物的方法，所述方法包括下列步骤：

在包含甜菜果肉的培养基中深层发酵曲霉以获得发酵培养液，和从所述发酵培养液中回收无细胞培养液形式的酶复合物。

18.根据实施方案16-17中任一项的方法，其中所述发酵包括下列步骤：

a.在培养基中生长所述培养物以获得接种物，和

b.向包含甜菜果肉和/或谷麸的发酵培养基中加入所述接种物。

19.根据实施方案16-18中任一项的方法，其中用于获得所述接种物的培养基包含甜菜果肉。

20.根据实施方案16-19中任一项的方法，其中发酵过程中的pH在2-8的范围内。

21.根据实施方案16-19中任一项的方法，其中发酵步骤中的pH在2.5-6的范围内。

22.根据实施方案16-19中任一项的方法，其中发酵过程中的pH在3-4的范围内。

23.根据实施方案16-19中任一项的方法，其中发酵过程中的pH在3.3-3.7的范围内。

24.根据实施方案16-23中任一项的方法，其中发酵过程中的温度在25-40℃的范围内。

25.根据实施方案16-23中任一项的方法，其中发酵过程中的温度在28-34℃的范围内。

26.根据实施方案16-25中任一项的方法，其中所述发酵是作为需氧发酵进行的。

27.根据实施方案16-26中任一项的方法，其中用于所述发酵的培养基包含甜菜果肉和谷麸。

28.根据实施方案16-27中任一项的方法，其中所述培养基还包含硫酸铵和/或硝酸钾。

29.根据实施方案16-28中任一项的方法，其中用于深层发酵的培养基包含1-30％(按重量)范围内的甜菜果肉。

30.根据实施方案16-29中任一项的方法，其中所获得的酶复合物是如实施方案1-15中任一项所定义的。

31.由根据实施方案16-29中任一项的方法可获得的酶复合物。

32.具有保藏登记号CBS123488的塔宾曲霉或其衍生物或后代。

33.具有保藏登记号CBS123488的经分离的塔宾曲霉或其衍生物或后代。

34.与具有保藏登记号CBS123488的塔宾曲霉菌株具有基本上相同的特征的真菌培养物。

35.实施方案34的培养物，其中所述培养物具有与所述经保藏的菌株相同的特性。

36.实施方案34的培养物，其中所述培养物是所述经保藏的菌株或其后代。

本申请中提及的所有出版物通过引用而被并入。除非本申请中另外说明或由语境来看明显矛盾，术语“a”、“an”和“the”以及类似的指称对象，如在描述本发明的情境中所使用的，将被解释为涵盖了单数和复数。除非本申请中另外说明，本申请中数值范围的列举仅仅意在作为个别地引用落入该范围内的各个单独数值的速记方法，并且各个单独的数值被并入说明书中，就像其在本申请中被个别列举一样。除非另外说明，本申请中所提供的所有精确的值代表相应的近似值(例如，关于特定的因子或测量所提供的所有精确示例值可被认为也提供了相应的近似测量值，适当时，用“大约”修饰)。“大约”或“～”可以例如是本领域中已知的常见的分析变化和/或例如+/-1、5或10％的变化。

对于本发明的所述方法和系统的各种修饰和变化对于本领域技术人员而言将是显然的而不偏离本发明的范围和精神。虽然与特定的优选实施方案相关联而描述了本发明，应当理解，所要求保护的发明不应被过度地限制于此类特定实施方案。的确，在下列权利要求的范围内意欲包含对于生物化学、微生物和分子生物学或相关领域的技术人员而言显而易见的、对用于实施本发明的所述模式的各种修饰。

实施例

一般方法：

a)在含有麦麸(5％W/W)、甜菜果肉丸粒(5％W/W)、硫酸铵(0.5％W/W)、水中的硝酸钾(0.3％W/W)的灭菌培养基(将pH调节至pH 3-4)中生长塔宾曲霉培养物。在25-35℃的温度范围内孵育所述培养物24到48小时的时期，并且在搅拌过程中以0.3至1vvm(体积/体积/分钟)的无菌空气通气，以获得接种物。

b)将在步骤(a)中获得的接种物以10-20％(V/V)范围内的浓度加入发酵培养基中，继而发酵60-120小时范围内的时期。搅拌培养基并以0.3-1vvm的空气通风，以获得发酵培养液。

c)利用鼓式真空过滤器分离在步骤(b)中获得的培养液。

实施例1

材料：

从A/S(批次113104)获得的麦麸，

从Danisco Sugar A/S(批次113117)获得的、由从甜菜生产糖的干燥残留物获得的甜菜果肉丸粒，

硫酸铵(No.062174，DSM Fibre Intermediates标准产品)，

硝酸钾(No.002888，A/S标准产品)。

发酵罐：

种发酵罐：5m³，来自Randers RustfriA/S，和来自Lightning的搅拌器，155rpm 9.5kW

主发酵罐：50m³，来自Randers RustfriA/S，和来自Lightning的搅拌器，180rpm 100kW

鼓式真空过滤器：24m²过滤器，来自M&J Separation Division。

膜滤器：Alfa Laval Nordic A/S型：滤器517829型GR70PE 6338/40

在5m³的发酵罐中如下制备塔宾曲霉4M 146(CBS 123488)的种培养物：将所述生物体接种到接种培养基中，并且在30±0.5℃、伴以搅拌和无菌通气(0.5vvm)孵育36小时。用于孵育的特别设计的起始培养基含有：

成分	比例kg
		麦麸	176
甜菜果肉丸粒	177
		硫酸铵	16
硝酸钾	8
		水	3400

通过使用水蒸汽来加热发酵培养基，从而取决于起始培养基的温度而另外加入50-300kg(例如100kg)的水。

通过加入硫酸和氢氧化钠将培养基的pH控制在3.5。

在50m³的发酵罐中制备的用于发酵的特别设计的培养基含有：

成分	比例kg
		麦麸	1806
甜菜果肉丸粒	1709
		硫酸铵	160
硝酸钾	80
		水	34000

通过使用水蒸汽来加热发酵培养基，从而取决于起始培养基的温度而另外加入400-8000kg(例如2500kg)的水。

用种培养物(10％v/v)接种所述培养基，在30±0.5℃，在搅拌过程中伴以0.5vvm的空气供给而进行76小时。通过加入硫酸和氢氧化钠将pH控制在3.5。

发酵完成后，在鼓式真空过滤器上分离培养液，并在膜超滤器上以15倍浓缩滤液。

实施例2

在5m³的发酵罐中如下制备塔宾曲霉4M 146(CBS 123488)的种培养物：将所述生物体接种到接种培养基中，并且在30±0.5℃、伴以搅拌和空气供给(0.5vvm)孵育33小时。用于孵育的特别设计的培养基含有：

成分	比例kg
		麦麸	161
甜菜果肉丸粒	167
		硫酸铵	16
硝酸钾	8
		水	3400

通过使用水蒸汽来加热发酵培养基，从而取决于起始培养基的温度而另外加入50-300kg(例如100kg)的水。

通过加入硫酸和氢氧化钠将培养基的pH控制在3.5。

在50m³的发酵罐中制备的用于发酵的特别设计的培养基含有：

成分	比例kg
		麦麸	1806
甜菜果肉丸粒	1612
		硫酸铵	160
硝酸钾	80
		水	34000

通过使用水蒸汽来加热发酵培养基，从而取决于起始培养基的温度而另外加入400-8000kg(例如2500kg)的水。

用种培养物(10％v/v)接种所述培养基，在30±0.5℃，在搅拌过程中伴以0.5vvm的空气供给而进行70小时。

通过向50m³的发酵罐中加入硫酸和氢氧化钠将培养基的pH控制在3.5。

发酵完成后，在鼓式真空过滤器上分离培养液，并在膜超滤器上以15倍浓缩滤液。

实施例3

在5m³的发酵罐(Randers RustfriA/S)中、在不同的pH值下进行发酵。如实施例2中所描述的进行发酵，用硫酸和氢氧化钠调节pH。在pH3.5，测试了两种不同的菌株(黑曲霉4M147)*。通过测试1测量了各个批次的活性，结果在表1中给出。

表1：在不同的pH下发酵

*黑曲霉4M147。

**未测量

实施例4

如实施例1中所述进行了三次独立的发酵，通过层析比较了酶产品的蛋白质谱。

制备果胶酶样品，在PD-10柱上脱盐。

如制造商(Amersham Bio.)所述准备PD-10柱并用20mM Tris/HCl缓冲液，pH8.0(缓冲液A)平衡。将2.5ml的样品脱盐并保持在5℃。

在MonoQ柱上鉴别果胶酶样品。

如制造商(Amersham Bio.)所述准备柱(MonoQ HR5/5)并用20mMTris/HCl缓冲液，pH8.0(缓冲液A)平衡。以1.5ml/min的流速将经脱盐的样品(50μl)施加到所述柱上。用缓冲液A洗涤柱，并用20mMTris/HCl(pH8.0)中的0-0.6M线性梯度的NaCl洗脱所结合的蛋白质。

用活性校正吸收。如由QVC粘度测定方法(测试1)所确定的。

在图5中显示了来自使用深层发酵的3次不同发酵的酶产品的蛋白质谱并且图4中显示了来自使用表面发酵的发酵的酶产品的蛋白质谱。将表面发酵的蛋白质谱与深层发酵的蛋白质谱进行比较，显示在图6中。

使用凝胶和蛋白质数据来定量利用深层发酵方法生产的三个批次的浓缩物。将这些样品与利用表面发酵方法生产的浓缩物进行比较。

活性和蛋白质数据

如下文描述的“测试15.b”中所述，通过氮分析(转化6.25g蛋白质/g氮)就TCA和总蛋白质测量所述样品。

凝胶数据

未经TCA失活而制备样品，并使用0.221mg/U的估算的TCA蛋白质/活性值、基于同等活性而将所述样品加载到SDS-NuPAGE凝胶上。以如下方式设定所述凝胶：

结果

对于所有的样品，tca/总蛋白质和活性/tca蛋白质的比例是相似的。凝胶显示，所述3个批次的深层发酵样品具有相似的条带样式。发酵菌株产生了多种酶，有的不是单一的活性条带，而是多个活性条带。凝胶扫描显示在图7中。

实施例5

在下面的测试1-3和5-15中测量了实施例2的浓缩滤液，结果显示在下表中。

请注意许多酶活性是在如下实验条件下测量的：例如接近水果/和葡萄酒应用中的“现实生活条件”的温度和pH，例如pH低至3.5和温度高至60℃。

实施例6

如实施例1中所描述的进行了6次不同的发酵。上表中显示了在不同批次酶产品的浓缩发酵物中所确定的酶活性，其是根据如实施例5中所述的相同的测试所测量的。

实施例6

通过在两个不同的生产位点(位点1和位点2)深层发酵，如实施例1所述进行了9次不同的发酵(发酵3-11)。图8中显示了在不同批次酶产品的浓缩发酵物中所确定的酶活性，并且其是根据如实施例5中所述的相同的测试所测量的。用与深层发酵所用的相同的培养基通过表面发酵进行2次不同的发酵(发酵1-2)，并且如同对于深层发酵所进行的来测量酶活性。

测试

测试1：QVC粘度测定的活性确定

方法

以已知的pH，温度和时间将酶加入已知量的苹果汁中，继以巴氏灭菌。如果没有给出其它参数，则使用了pH 3.75，50℃和60min的反应时间作为标准。过滤后，通过从移液管中的流动时间来确定粘度。通过与具有已知活性的标准酶的流动时间(run time)进行比较来确定活性。

果汁是由苹果制成的；金冠苹果(50％)、Cox桔苹(25％)和拉宝(Lobo)(25％)，并巴氏灭菌(95℃，3分钟)。测试之前，将pH调整到pH 3.75(HCl或NaOH)。果汁的流动时间为至少50秒。

从Pectozyme PowerMash(Danisco 1247062)制备酶标准，平均为具有已知活性的30个产品。将来自30个产品的此混合物用作标准。

在确定流动时间(一式两份)之前，将果汁与酶混合并且在50℃孵育60分钟。纯果汁和完全水解的果汁也被包括在测试中。通过向25ml果汁中加入2ml的未稀释的Pectozyme PowerMash并在50℃孵育60分钟而制成完全水解的果汁。

当使用25℃的水时，所使用的移液管需要具有20-21秒的流动时间。

用果汁将所有的酶样品在50℃孵育60分钟，继以在沸水中热处理5分钟。

将样品冷却到25℃并过滤。在用移液管确定流动时间之前，将样品的温度稳定在25.0℃。

由用与已知浓度(通过稀释标准而获得)的标准酶溶液相混合的果汁获得的流动时间制成标准曲线。所述标准曲线被制作为活性与流动时间之间的关系。

然后，从流动时间与活性的所述关系中找到酶的活性。

根据一方面/实施方案，根据其QVC粘度测定的活性使酶产品标准化。

测试2.苹果汁脱果胶化单位(AJDU)

原理

此测试是基于在pH3.5和在55℃时，使单一强度的、未澄清的苹果汁底物脱果胶化所需的时间。通过果胶的异丙醇沉淀来确定终点。通过在测试条件下，将未知样品的脱果胶化时间与已知活性的酶标准的脱果胶化时间相关联来确定苹果汁脱果胶化单位(AJDU)。

所需的试剂

D，L-苹果酸(C₄H₆O₅)，≥99.5％。供应商：Merck Ltd Product no：1003820250.M.W.：134.09g/mol。

氢氧化钠(NaOH)：‘AnalaR’。供应商：Merck Ltd(BDH)Productno：10252。M.W.：40.00g/mol。

异丙醇(C₃H₈O)，‘Rectapur’。供应商：Merck Ltd(BDH)Productno：20 839.322.M.W.：60.10g/mol。

酶参考标准：已知AJDU活性的酶

苹果汁溶液的制备

用D，L-苹果酸或氢氧化钠(10％w/v)将未澄清的苹果汁的pH调节到pH3.50并过滤(布氏漏斗(Buckner funnel)，玻璃微纤维GF/A过滤器)。

方法

制备5个酶参考标准的稀释液用于标准曲线。各个最终的溶液将在不少于90分钟且不多于150分钟的时间内达到终点。在水中稀释酶产品以达到在测试条件下在100分钟至140分钟之间得到终点的浓度。

向试管中加入2.0ml的异丙醇。90分钟后，将1.0ml的等分试样从反应管转移到含有异丙醇的管中。轻轻混合并在2分钟后评估试管。如果未达到反应终点，取决于脱果胶化的程度(见上)，果胶沉淀将作为从细颗粒到粘胶的任何东西出现。2分钟后没出现沉淀意味着已到达了反应终点。必须在100分钟到150分钟之间到达反应终点。用经调整的酶稀释液重复所述测试直到反应时间在这一范围内。

计算

利用确定的单一强度的苹果汁底物，将未知样品的脱果胶化时间与已知活性的果胶酶标准的脱果胶化时间相关联而确定苹果汁脱果胶化单位(AJDU/ml)。

通过沿x-轴标绘稀释的酶标准溶液的浓度(AJDU/1000l)和沿y轴标绘相应的终点(分钟)制成图1中所示的标准曲线。

用AJDU/ml为x-值而终点为y-值，通过此特别标准获得了下列斜率和y截距：

m＝-152694；i＝249.21

由下面的公式进行AJDU的计算。例如作为示例，如果酶产品被稀释到0.000004599g/ml的浓度。终点是130分钟。

$\mathrm{AJDU}/g=\frac{130-249.21}{-152694\×0.000004599}=\underset{\‾}{\underset{\‾}{167.2}}$

所有结果被限制到终点的一位数的准确度。

测试3.果胶反式消去酶(苹果果胶反式消去方法)

原理

果胶反式消去酶(果胶裂解酶，EC4.2.2.10)的测试是基于苹果果胶底物中半乳糖醛酸残基之间的内部α-1，4键的酶促水解。4，5-不饱和寡聚半乳糖醛酸酯的逐步增加之后是利用分光光度计在238nm处的吸光度的增加。由238nm处吸光度的增加/单位时间来计算酶活性。

在pH3.5和30℃进行标准测试，可就酶的其它表征和说明在不同的pH和温度值进行所述测试。

单位定义

一个单位的果胶反式消去酶活性被定义为在测试条件下(pH3.5和30℃)，得到ΔOD_238nm.min^-1增加的酶产品的量(对于总测试体积校正的)。

材料

NYL过滤装500ml，0.45μm(Nalgene)，真空泵；或者，备选地对于更小的底物体积，注射器50ml，针筒过滤器GD/X-0.45μm，(Whatman)

果胶(苹果)。供应商：Herbstreith&Fox KG.Product no：ClassicAU202(68-76％酯化)。

超纯细颗粒无水柠檬酸(C₆H₈O₇)。供应商：VWR国际有限公司(MerckLtd).产品号：1002474.M.W.：192.13。

氢氧化钠(NaOH)0.1mol/l(0.1N)，‘Titrisol’。供应商：VWR国际有限公司(Merck Ltd)。产品号：109956。

盐酸(HCl)0.1mol/l(0.1N)，‘Titrisol’。供应商：VWR国际有限公司(Merck Ltd)。产品号：109973。

酶参考标准，其是已知活性的酶。

所给出的试剂体积是示例。可根据需要制备不同的体积。水质量是玻璃蒸馏水或与之等同的。

试剂：

1.0.1M柠檬酸钠/HCl缓冲液，pH3.5

2.0.333％(w/v缓冲液中的溶液)果胶溶液(底物溶液)，

3.缓冲液中的酶产品稀释液。

进行进一步的稀释直至产生的ΔOD_238nm在0.030-0.035的范围内，以在测试的时间中保持反应速率线性。

方法

将酶产品与底物混合并由动力学程序继以OD_238nm。如果测量的ΔOD_238nm在0.030-0.035的范围之外，那么用更合适的酶稀释液重复测试。

所有的测试至少一式两份进行。

计算

1.从分光光度计动力学程序确定ΔOD_238nm/分钟。

2.如下计算活性：

其中：

E＝ΔOD_238nm/分钟(两次有效测量的平均值)

A＝总测试体积ml

V＝酶体积ml

W＝用于制作稀释的酶样品的酶重量g

D＝累加的稀释因子

测试4：鼠李糖聚半乳糖醛酸酶活性测试

为了分离经修饰的须状区，在Magimix Cuisine Systeme 3000中粉碎金冠苹果(10kg)，并用来自Quest International的酶制备物(生物果胶酶200L 0.05％)，在55℃，处理4小时。在8000g离心(SorvallRC-5B)30分钟后，超滤上清液，并在具有50.000的截止分子量的Pellicon微滤装置中浓缩。透析并冻干残留物。

通过分析酶促降解产品来表征所分离的多糖。将5ml在0.05M乙酸钠缓冲液(pH＝5.0)中的分离的经修饰须状区的0.2％溶液与10mu.l的酶制备物在50℃孵育2小时。在Dionex BioLC/HPAE层析系统上，或通过利用DNS方法来测量还原末端基团的增加而进行对所形成产品的分析。Dionex系统使用了Carbo Pac PA-1阴离子交换柱(25cm，4mmi.d.)和CarboPac PA-1 Guard。用25.mu.l的溶液(0.2％)加载所述柱，并用0.1N NaOH中的0-0.05M NaOAc线性梯度在50分钟中洗脱。流速是1.0ml/min并且利用PE检测仪监测该过程。

对于还原末端基团方法，如下制备DNS试剂：在400ml蒸馏水中悬浮20.0克的2-羟基-3，5-二硝基苯甲酸(Merck 800141)。伴随着连续的磁性搅拌，向此悬浮液中逐渐加入300ml的NaOH溶液(32克在300ml蒸馏水中)。将溶液小心加热到45℃直至其澄清。在连续搅拌下，加入罗谢尔盐(600g，K-Na-酒石酸盐，Merck 8087)。用蒸馏水将溶液稀释到2000ml，并在室温下储存在深色瓶中。利用DNS方法，将0.5ml的反应混合物(MHR和如上所述孵育2小时后的酶制备物)加入1.5ml的脱盐水(demi-water)和2ml的DNS溶液中。将此溶液煮沸10分钟，并在冷却到室温后测量543nm处的消光性。

测试5：多聚半乳糖醛酸酶活性测试

原理

多聚半乳糖醛酸酶的测试是基于比色测定α-1，4-半乳糖醛酸寡糖，通过利用3，5-二硝基水杨酸试剂来测量还原基团的增加。由还原基团的浓度(作为D-半乳糖醛酸.H₂O当量)与540nm处的吸光度之间的关系来计算酶活性。

在pH3.5进行标准测试，但可就酶的其它表征和说明在不同的pH值下进行所述测试。

单位定义

一个单位的多聚半乳糖醛酸酶活性被定义为在测试条件(pH3.5(或如指定的)和50℃)下产生1μmole D-半乳糖醛酸当量/分钟的酶量。

材料

聚半乳糖醛酸(BioChemika，～95％(酶的))。供应商：Sigma-Aldrich。产品号：81325。

D-(+)-半乳糖醛酸一水合物(BioChemika，≥97.0％)。供应商：Sigma-Aldrich。产品号：48280。M.W.：212.15。

无水乙酸钠‘AnalaR’。供应商：Merck Ltd(BDH)。产品号：10236。M.W.：82.03。

乙酸(“冰的”)‘AnalaR’。供应商：Merck Ltd(BDH)。产品号：10001。M.W.：60.05。

3，5-二硝基水杨酸GPR(3，5-二硝基-2-羟基苯甲酸)。供应商：MerckLtd(BDH)。产品号：28235。

氢氧化钠丸粒‘AnalaR’。供应商：Merck Ltd(BDH)。产品号：10252。M.W.：40.00。

(+)-酒石酸钾钠‘AnalaR’。供应商：Merck Ltd(BDH)。产品号：10219。M.W.：282.22。

1M乙酸钠缓冲液中的1.4％(w/v溶液)多聚半乳糖醛酸(PGA)溶液，pH3.5(底物溶液)

在氢氧化钠丸粒(32g/L)/酒石酸钾钠(600g/L)缓冲液中的3，5-二硝基水杨酸(DNS)溶液

0.10M乙酸钠缓冲液，pH3.5

D-半乳糖醛酸标准溶液(0.60mg/ml)

方法

使用0，0.015，0.3，0.45，0.6mg/ml的D-半乳糖醛酸·H₂O制作D-半乳糖醛酸·H₂O标准曲线。以如在酶评估中相同的量加入DNS。

将酶产品与底物溶液混合(在50℃，10min)，并通过加入DNS溶液和在95℃孵育5分钟来停止反应。在540nm测量光密度(OD_540nm)。

所述测试关于底物浓度与时间之间的关系是非线性的。

计算

如下计算多聚半乳糖醛酸外切酶活性：

其中：

T＝ΔOD_540nm测试

＝OD_540nmTEST-OD_540nm空白

m＝标准曲线的梯度(约1.0)

c＝标准曲线的y轴截距

212.15＝D-半乳糖醛酸·H₂O的分子量

10³＝转换成μmoles

A＝测试体积ml

V＝酶体积ml

t＝测试时间分钟

D＝实际的酶稀释因子(例如，1.000g稀释到1升D＝1000)

测试6.多聚半乳糖醛酸酶(PGA粘度测定方法：微型粘度计)测试

原理

由多聚半乳糖醛酸溶液的相对粘性的降低速度来测量酶活性。在pH3.5和30℃进行测试，可就酶的其它表征和说明在不同的pH值和温度下进行所述测试。

单位定义

一个单位的多聚半乳糖醛酸酶活性被定义为在测试条件(pH3.5(或如指定的)和30℃(或如指定的))下将水解底物、降低溶液粘性、以改变1个无量纲单位的相对流动性/每分钟的酶量。

材料

微型粘度计(例如，Haake微型粘度计或Rhovisc微型粘度计)和操作软件

超声波水浴

多聚半乳糖醛酸(BioChemika，～95％(酶的))。供应商：Sigma-Aldrich。产品号：81325

十二水合磷酸三钠‘GR用于分析’。供应商：Merck Chemicals(VWR)。产品号：106572。M.W.：380.18

一水合柠檬酸‘GR用于分析’。供应商：Merck Chemicals(VWR)。产品号：100244。M.W.：210.14

丙酮‘GR用于分析’。供应商：Merck Chemicals(VWR)。产品号：100014。M.W.：58.08

使用了灭菌玻璃器皿和水

如果需要，用无菌1.90％(w/v)柠檬酸溶液(底物溶液)将十二水合磷酸三钠缓冲液(1g/100ml)中的1.4％(w/v)多聚半乳糖醛酸(PGA)溶液调节到pH3.5

1.0M氢氧化钠溶液

1.90％一水合柠檬酸溶液(无菌)

微型粘度计的校准

在测量的开始和终止均对于水空白和底物溶液(底物空白)校准微型粘度计。

制备酶产品的酶稀释液，以在5-15分钟的测试测量期间(相应于在10分钟的测量期间内450-550ms的总Δ(滴下时间))得到：

在一段时间中，测试结果应该得到50ms.min^-1的平均Δ(滴下时间)/Δt，并且不偏向可接受范围的极端值。其它的必要的检测是稀释的酶溶液应该得到0.010-0.020范围内的斜率(相对流动性的变化/分钟)。

方法

使用相同体积的1.40％(w/v溶液)多聚半乳糖醛酸溶液(在底物空白的校准中测定的)，制备了包含2.20ml 1.40％(w/v溶液)多聚半乳糖醛酸溶液(pH3.5)和2.50ml无菌玻璃蒸馏水的测试溶液。

将校准的金球(0.1-2mPa.s)放置于清洁干燥的样品注射器中，并且将Teflon^TM密封塞在球后插入。

在30℃，将稀释的酶溶液加入底物测试溶液中。在刚好60秒后，通过注射器将测试溶液注入微型粘度计中。每30秒，微型粘度计将测量测试流出时间(T_t)。15分钟后测试将终止。为了获得0.010-0.020范围内的斜率，在5-15分钟的10分钟时期内总共减少的测试流出时间(T_t)将在450-550ms的范围内。

计算

F_r＝相对流动性

T_w＝水流出时间(ms)

T_s＝底物流出时间(ms)

T_t＝在时间t的测试流出时间(ms)

t＝测试时间(分钟)

t_1/2＝测试时间(t)减去1/2测试流出时间(T_t)(分钟)

DF＝稀释因子(例如，1g稀释到100ml，然后将1ml的此溶液稀释到200ml，得到DF＝20000)

5＝测试的总体积(ml)

V＝测试中的酶溶液体积(0.30ml)

对于各个测试流出时间(T_t)计算F_r值，并且相对于t_1/2绘图。通过进行回归分析确定直线的斜率(相对流动性的变化/分钟)，以获得最匹配的直线(回归系数(R²)是匹配优秀性的量度)。所述斜率与酶活性是成比例的(对于内切活性的测量而言，一系列实验点(即在不同的测试时间)的斜率是比源自一个F_r的单一计算更准确的)。

活性(u.ml^-1or u.g^-1)＝斜率xDFx(5/V)

测试7.果胶酯酶(滴定果胶法)

原理

果胶酯酶测试是基于高酯果胶(具有68-76％的酯化度的苹果果胶)中的甲基酯键的酶促水解的。通过碱量滴定中和被“释放”的半乳糖醛酸基团而使反应的pH保持恒定。在水溶液中、在30℃时半乳糖醛酸的pK_a约为3.5，因此认为多聚半乳糖醛酸的pK_a是相似的。通过碱量滴定而测量活性。在pH4.6和30℃进行测试，但是可就酶的其它表征和说明在不同的值进行所述测试。

单位定义

一个单位的果胶酯酶活性被定义为在测试条件(pH4.6和30℃)下或者如指定的，催化1μmole的甲基酯键水解(释放1μmole果胶酸)的酶量。

材料

果胶(苹果)。供应商：Herbstreith&Fox KG。产品号：ClassicAU202(68-76％酯化)。

六水氯化镁‘GR用于分析’。供应商：Merck Chemicals(VWR)。产品号：105833。M.W.：203.30

氢氧化钠丸粒‘GR用于分析’。供应商：Merck Chemicals(VWR)。产品号：106469。M.W.：40.00

0.50％(w/v溶液)苹果果胶，含有10mM的MgCl₂.6H₂O，pH4.6(底物溶液)

0.020M氢氧化钠溶液

酶产品的稀释液

方法

向苹果果胶底物溶液(30℃，pH 4.60)中加入酶稀释液，使用自动恒pH滴定仪以使pH保持在4.6(0.020M氢氧化钠溶液)。记录5分钟中消耗的0.020M氢氧化钠溶液；但是，在计算中仅使用2.0-4.0时间段内的消耗。利用5分钟反应时期中的应答来检测反应速率的线性。

计算

如下计算活性：

其中：

T＝在2.0-4.0分钟之间加入的0.020M的氢氧化钠溶液的体积(ml)

C＝氢氧化钠溶液的浓度(M)

10³＝从滴定的体积ml转换到μmole

t＝测试时间(分钟)

V＝测试中的稀释的酶体积(ml)

W＝未稀释的酶被稀释的重量或体积(g或ml)

D＝酶稀释因子(即，未稀释的酶被稀释的量)

pK_a＝多聚半乳糖醛酸的pK_a

pH＝测试，和对照，pH

测试8.阿拉伯聚糖酶测试

原理

阿拉伯聚糖酶活性的测试是基于利用3，5-二硝基水杨酸试剂测量所产生的还原基团的增加的比色测定。由还原基团的浓度(作为阿拉伯聚糖酶当量)与540nm处的吸光度之间的关系来计算酶活性。

在pH3.5进行测试，但是可就酶的其它表征和说明在不同的pH值下进行所述测试。

单位定义

一个单位的阿拉伯聚糖酶(阿拉伯聚糖酶(内切-1，5-α-L-阿拉伯聚糖酶))活性被定义为在测试条件(pH3.5(或如指定的)和50℃)下，产生1μmole的阿拉伯糖当量/分钟的酶量。

材料

Megazyme甜菜阿拉伯聚糖

阿拉伯糖Sigma A3131M.W.：150.1

无水乙酸钠‘AnalaR’。供应商：Merck Ltd(BDH)。产品号：10236。M.W.：82.03

乙酸(“冰的”)‘AnalaR’。供应商：Merck Ltd(BDH)。产品号：10001。M.W.：60.05

3，5-二硝基水杨酸GPR(3，5-二硝基-2-羟基苯甲酸)。供应商：MerckLtd(BDH)。产品号：28235

氢氧化钠丸粒‘AnalaR’。供应商：Merck Ltd(BDH)。产品号：10252。M.W.：40.00

(+)-酒石酸钾钠‘AnalaR’。供应商：Merck Ltd(BDH)。产品号：10219。M.W.：282.22

0.1M乙酸钠缓冲液中的1.5％(w/v溶液)阿拉伯聚糖溶液，pH3.5(底物溶液)

3，5-二硝基水杨酸(DNS)溶液。20g/L的DNS在缓冲液中，所述缓冲液含有32g/L氢氧化钠丸粒和600g/L(+)-酒石酸钾钠。

阿拉伯糖标准溶液(0.50mg/ml)

方法

将酶产品稀释成为样品，并且利用浓度为0，0.125，0.25，0.375，和0.5mg/ml的阿拉伯糖制成葡萄糖标准曲线。

在50℃，将0.25ml的酶溶液与1.75ml的底物溶液(1.5％w/v)混合，并且在10分钟后通过加入DNS溶液终止反应。随后加热到95℃5分钟。

在540nm测量不同样品的光密度(OD_540nm)。

计算

由图2所示的标准曲线确定酶活性。

如下计算活性：

其中：

T＝ΔOD_540nm测试

＝OD_540nm测试-OD_540nm空白

m＝标准曲线的梯度(约1.0)

c＝标准曲线的y轴截距(总是负的并且大约-0.02)

150.13＝阿拉伯糖的分子量

10³＝转换成μmole

A＝测试体积ml

V＝酶体积ml

t＝测试时间分钟

D＝实际的酶稀释因子(例如，对于1.000g稀释到1升D＝1000)

测试9.纤维素酶(DNS CMC方法)测试

原理

纤维素酶的测试是基于羧甲基纤维素(CMC)(其为β-1，4-葡聚糖)中1，4-β-D-葡糖苷键的酶促内切水解。通过利用3，5-二硝基水杨酸试剂测量所产生的还原基团的增加而比色测定反应产物(β-1，4-葡聚糖寡糖)。由还原基团的浓度(作为葡萄糖当量)与540nm处的吸光度的关系计算酶活性。

在pH 5.0进行测试，但是可就酶的其它表征和说明在不同的pH值进行所述测试。

单位定义

一个单位的纤维素酶活性被定义为在测试条件(pH5.0(或如指定的)和50℃)下，产生1μmole葡萄糖当量/分钟的酶量。

材料

羧甲基纤维素。供应商：Megazyme Ltd。产品号：CM-纤维素4M

D-葡萄糖‘AnalaR’。供应商：Merck Ltd(BDH)。产品号：10117。M.W.：180.16

无水乙酸钠‘AnalaR’。供应商：Merck Ltd(BDH)。产品号：10236。M.W.：82.03

乙酸(“冰的”)‘AnalaR’。供应商：Merck Ltd(BDH)。产品号：10001。M.W.：60.05

3，5-二硝基水杨酸GPR(3，5-二硝基-2-羟基苯甲酸)。供应商：MerckLtd(BDH)。产品号：28235。

氢氧化钠丸粒‘AnalaR’。供应商：Merck Ltd(BDH)。产品号：10252。M.W.：40.00

(+)-酒石酸钾钠‘AnalaR’。供应商：Merck Ltd(BDH)。产品号：10219。M.W.：282.22

0.1M乙酸钠缓冲液中的1.5％(w/v溶液)羧甲基纤维素(CMC)溶液，pH5.0(底物溶液)。

3，5-二硝基水杨酸(DNS)溶液。20g/L的DNS在缓冲液中，所述缓冲液含有32g/L的氢氧化钠丸粒和600g/L的(+)-酒石酸钾钠

葡萄糖标准溶液(0.50mg/ml)

方法

将酶产品稀释成为样品，并且利用浓度为0，0.125，0.25，0.375，和0.5mg/ml的葡萄糖制成图2中所示的葡萄糖标准曲线。

在50℃，将0.25ml的酶溶液与1.75ml的底物溶液(1.5％w/v)混合，并且在10分钟后通过加入DNS溶液终止反应。随后加热到95℃5分钟。

在540nm测量不同样品的光密度(OD_540nm)。

计算

由图2中所示的标准曲线确定酶活性。

如下计算活性：

其中：

T＝ΔOD_540nm测试

＝OD_540nm测试-OD_540nm空白

m＝标准曲线的梯度(约1.0)

c＝标准曲线的y轴截距(总是负并且大约-0.02)

180.16＝葡萄糖的分子量

10³＝转换成μmole

A＝测试体积ml

V＝酶体积ml

t＝测试时间分钟

D＝实际的酶稀释因子(例如，对于1.000g稀释到1升D＝1000)

测试10.昆布多糖酶(DNS地衣多糖方法)

原理

由昆布多糖酶催化的反应涉及1，3-β-D-葡聚糖中1，3-葡糖苷键的内切水解。底物包括地衣多糖，副淀粉和茯苓聚糖。通过利用3，5-二硝基水杨酸试剂测量所产生的还原基团的增加而比色测定反应的产物(β-1，3-葡聚糖寡糖)。由还原基团的浓度(作为葡萄糖当量)与540nm处的吸光度之间的关系计算酶活性。

在pH5.0和50℃进行此测试，但是可就酶的其它表征和说明在不同的pH值和温度下进行所述测试。

单位定义

一个单位的昆布多糖酶活性被定义为在测试条件(pH5.0和50℃(或如指定的))下产生1μmole葡萄糖当量/分钟的酶量。

材料

参见上面关于纤维素酶活性测试给出的材料。

地衣多糖(来自褐藻(Laminaria digitata))。供应商：Sigma-Aldrich Co.Ltd。产品号：L9634

1.00％(w/v溶液)地衣多糖溶液(底物溶液0.1M乙酸钠缓冲液，pH5.0)

在50℃，将0.25ml稀释的酶溶液与1.75ml的地衣多糖溶液混合10分钟并且通过加入2ml DNS溶液终止反应。

使用0，0.125，0.25，0.5和0.75mg/ml的葡萄糖溶液制成标准曲线。

在540nm测量光密度(OD_540nm)。

计算

如下计算活性：

其中：

T＝ΔOD_540nm测试

＝OD_540nm测试-OD_540nm空白

m＝标准曲线的梯度(约1.0)

c＝标准曲线的y轴截距(总是负的且大约-0.03)

180.16＝葡萄糖的分子量

10³＝转换成μmole

A＝测试体积ml

(在实施例5中使用了2.00ml)

V＝酶体积ml

(在实施例5中使用了0.25ml)

t＝测试时间分钟

(在实施例5中用了10分钟)

D＝酶稀释因子(例如，对于1g稀释到1升D＝1000)

测试11.内切-1，4-β-木聚糖酶(DNS桦木木聚糖方法)

原理

由内切-1，4-β-木聚糖酶催化的反应涉及木聚糖(例如，桦木木聚糖或经取代的谷木聚糖(如小麦阿糖基木聚糖))中1，4-β-D-木聚糖苷键的内切水解，形成β-1，4-木聚糖寡糖。

通过利用3，5-二硝基水杨酸试剂测量所产生的还原基团的增加而比色测定反应的产物(β-1，4-木聚糖寡糖)。由还原基团的浓度(作为木聚糖当量)与540nm处的吸光度之间的关系来计算酶活性。

在pH3.5进行标准测试，但是可就酶的其它表征和说明在不同的pH值下进行所述测试。

单位定义

一个单位的内切-1，4-β-木聚糖酶活性被定义为在测试条件(pH3.5(或者如指定的)和50℃)下产生1μmole木聚糖当量/分钟的酶量。

材料

参见上面关于纤维素酶活性测试给出的材料列表

桦木木聚糖。供应商：Sigma Chemical Co。产品号：X0502

D(+)-木聚糖‘AnalaR’。供应商：Merck Ltd(BDH)。产品号：10372M.W.：150.13

0.1乙酸钠缓冲液中的1.5％(w/v溶液)桦木木聚糖溶液，pH4.0(底物溶液)

木聚糖标准溶液(0.50mg/ml)

方法

在50℃，将0.25ml稀释的酶溶液与1.75ml的桦木木聚糖溶液混合10分钟，通过加入2ml DNS溶液终止反应，随后加热到95℃5分钟。在540nm处测量光密度(OD_540nm)。

由0.125，0.250，0.375，0.500mg/ml木聚糖制成标准曲线(参见图3)

计算

如下计算活性：

$\mathrm{Activity}(u.{\mathrm{ml}}^{-1}\mathrm{or\; u}.g^{-1})=\frac{T-c}{m}\×A\×\frac{1}{150.13}\×{10}^3\×\frac{1}{V}\×\frac{1}{t}\×D$

其中：

T＝ΔOD_540nm测试

＝OD_540nm测试-OD_540nm空白

m＝标准曲线的梯度(约1.0)

c＝标准曲线的y轴截距(总是负的且大约-0.02)

150.13＝木聚糖的分子量

10³＝转换成μmole

A＝测试体积ml

(在实施例5中使用了2.00ml)

V＝酶体积ml

(在实施例5中使用了0.25ml)

t＝测试时间分钟

(在实施例5中用了10分钟)

D＝实际的酶稀释因子(例如，对于1.000g稀释成1升D＝1000)

测试12.α-淀粉酶(真菌)(Ceralpha方法用于真菌α-淀粉酶，使用 淀粉酶HR试剂)

原理

使用淀粉酶HR试剂(CER 07/00，ICC标准号303)，利用用于真菌α-淀粉酶的Megazyme的Ceralpha方法进行α-淀粉酶的测试。所述测试是基于在存在过量水平的热稳定α-葡糖苷酶时，确定的寡糖“非还原端封闭的对硝基苯麦芽七糖苷(p-nitrophenyl maltoheptoaside)”(BPNPG7)的酶促水解。测试是在pH5.4下进行的。然而，可就测试不同的α-淀粉酶以及酶的其它表征和说明而在不同的pH值进行所述测试。淀粉酶HR试剂的特征是掺入了热稳定的α-葡糖苷酶，这意味着可在更宽的pH值范围(pH5.2-7.0)中和直至60℃的温度下进行测试。

单位定义

一个单位的α-淀粉酶活性(命名为Ceralpha单位)被定义为在测试条件(pH5.4(或如指定的)和40℃)下，在存在过量的热稳定α-葡糖苷酶时产生1μmole来自BPNPG7的对硝基苯的酶量。

材料

淀粉酶HR(高范围)测试试剂。供应商：Megazyme InternationalIreland Ltd.产品号：R-AMHR4

DL-苹果酸(DL-羟基丁二酸)。供应商：Sigma-Aldrich有限公司。产品号：M0875。M.W.：134.09

氢氧化钠丸粒‘AnalaR’。供应商：Merck Ltd(BDH)。产品号：10252。M.W.：40.00

氯化钠‘AnalaR’。供应商：Merck Ltd(BDH)。产品号：10241。M.W.：58.44

2水合氯化钙‘AnalaR’(二水合氯化钙)。供应商：Merck Ltd(BDH)。产品号：10070。M.W.：147.02

正磷酸三钠‘AnalaR’(十二水合正磷酸三钠)。供应商：MerckLtd(BDH)。产品号：10384。M.W.：380.12

对硝基苯(10μmole/ml溶液)(4-硝基苯)。供应商：Sigma-Aldricn有限公司。产品号：104-1

通过在10.0ml的玻璃蒸馏水中溶解一小瓶淀粉酶HR试剂而制成底物溶液(淀粉酶HR试剂)

1M和0.05M苹果酸缓冲液，pH5.4

终止试剂(1％(w/v溶液)(无水)正磷酸三钠溶液)

通过在1％(w/v溶液)(无水)正磷酸三钠溶液(pH11.0)中稀释对硝基苯溶液(10μmoles/ml溶液)200倍而制成1％(w/v溶液)(无水)正磷酸三钠溶液(pH11.0)中的50μM的对硝基苯标准。

稀释的酶溶液的制备

Megazyme推荐，最小以稀释50倍起始(例如，1ml/g配制为50ml)用0.05M的苹果酸缓冲液(pH5.4)制备所有的酶溶液。用0.05M苹果酸缓冲液(pH5.4)进行随后的稀释，直至获得适用于测试的稀释液。

方法

应该用1％(w/v溶液)(无水)正磷酸三钠溶液(pH11.0)中的50μM对硝基苯标准来使所使用的分光光度计标准化。此溶液应该给出的光密度在400nm处(OD400nm)＝0.905(因为在1％(w/v溶液)(无水)正磷酸三钠溶液(pH11.0)中、在400nm处对硝基苯的EM＝18.1x103)。

在40℃，将0.10ml的底物溶液(淀粉酶HR试剂)与0.10ml稀释的测试酶溶液混合10分钟，通过加入1.50ml的终止试剂(1％(w/v溶液)(无水)正磷酸三钠溶液)终止反应。在400nm处测量光密度(OD_400nm)。

计算

如下计算活性：

其中：

T＝ΔOD_400nm测试

＝OD_400nm测试-OD_400nm空白

18.1＝在1％(w/v溶液)的(无水)正磷酸三钠溶液(pH11.0)中、在400nm处对硝基苯的EmM＝18.1

A＝总的测试体积ml

(在实施例3中使用了1.70ml)

V＝酶体积ml

(在实施例3中使用了0.10ml)

t＝测试时间分钟

(在实施例3中用了10分钟)

D＝总的酶稀释因子(例如，对于1g稀释到1升：D＝1000)

测试13：α-全淀粉酶酶活性

原理

允许酶样品与标准淀粉溶液在指定条件下反应。通过淀粉的碘染色能力下降的速度来测量α-全淀粉酶活性的量。

材料：

氢氧化钠溶液，10％(w/v)

缓冲溶液，pH3.8(143ml/L的冰乙酸(99.7％CH₃COOH，S.G＝1.05)。用10％的氢氧化钠溶液调节到pH3.8。

乙酸，5.0M

碘，5.00％和0.1％溶液

淀粉底物溶液，1.25％

方法：

稀释酶产品。在测试中所使用的稀释液应含有0.02-0.1单位/ml。

在60℃、在水中将4.0ml淀粉底物溶液等分试样与9.9ml 0.003％的碘溶液混合10分钟。加入1ml去离子水等分试样，并且在10分钟后、在用水将分光光度计调节到0后，在650nm处测量吸光度。

计算

取决于样品尺寸是g还是ml，活性是u/g或u/ml。

测试14：葡糖淀粉酶活性(GAU)

此测试是基于葡糖淀粉酶催化对硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)水解成为葡萄糖和对硝基苯的能力。在碱性pH时，硝基苯形成与葡糖淀粉酶的活性成比例的黄色，并且通过利用酶标准在400nm处对其进行监测。

所需的试剂：

0.1M的乙酸钠缓冲液，pH4.3

0.1M硼砂溶液

1.1mg/ml的PNPG底物(Sigma N1377)

由已知GAU活性的许多葡糖淀粉酶制成标准制备物。使用乙酸钠缓冲液(0.1M)稀释标准酶，从而使其净吸光度落在测试的线性范围内。

方法：

将250μl的乙酸缓冲液与200μl的酶样品混合，加入500μl底物溶液，10分钟后在30℃测量A₄₀₀。

通过吸光度与GAU的关联来确定活性，如通过标准曲线所测定的。

测试15：蛋白质的测定

通过使用BCA^TM蛋白质测试试剂盒#23225(提供有使用说明，来自Pierce，Meridian Rd，Rockford，IL，USA(测试15a))或TCA蛋白质测定(测试15b)的标准测试来测定总蛋白质，例如下文所述：

通过测量样品的氮含量测定总蛋白质。用g蛋白质/g氮的转换因子将百分比的氮含量转换为蛋白质。用30％的三氯乙酸(TCA)溶液沉淀所分析的蛋白质，随后在1N的氢氧化钠中重构。用ECS 4010元素分析仪或EA 1108元素分析仪进行分析。测定了重构样品中的氮含量，并且基于利用已知蛋白质浓度的标准而计算蛋白质。

测试16.α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶(对硝基苯α-L-阿拉伯呋喃糖苷方 法)

原理

由α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶催化的反应涉及水解α-L-阿拉伯糖苷的非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基处的末端键。此酶作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，3)-和/或(1，5)-连接的α-L-阿拉伯聚糖，阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖上。

α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶的测试是基于对硝基苯α-L-阿拉伯呋喃糖苷的酶促水解。所述测试是“两点”而不是“连续监测”方法。酶活性的计算是基于只在孵育时期的开始和结束时进行的测量。比色测定(在pH调节后)反应的产物对硝基苯。由对硝基苯和400nm处的吸光度之间的关系计算酶活性。

当标准测试在pH5.0和50℃下进行时，可就酶的其它表征和说明在不同的pH值和温度下进行所述测试。在此情形中，仅改变了缓冲溶液的pH(下面标注)或温度。

单位定义

一个单位的α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶活性被定义为在测试条件(pH5.0和50℃)下，从对硝基苯α-L-阿拉伯呋喃糖苷产生1μmole对硝基苯/分钟的酶量。

所需的试剂

在所有的情况中，重要的是试剂的特性和纯度，而不是供应商。

对硝基苯α-L-阿拉伯呋喃糖苷(Sigma-Aldrich Co.Ltd)。产品号：N 3641。M.W.：271.2

无水乙酸钠‘AnalaR’。供应商：Merck Ltd(BDH)。产品号：10236。M.W.：82.03

乙酸(“冰的”)‘AnalaR’。供应商：Merck Ltd(BDH)。产品号：10001。M.W.：60.05

甘油(ACS试剂)。供应商：Sigma-Aldrich Co.Ltd。产品号：G 7032。M.W.：75.07。

氢氧化钠溶液40％w/v。供应商：Merck Ltd(BDH)。产品号：19153。M.W.：40.00。

试剂制备

所给出的试剂体积是示例。可根据需要制备不同的体积。

1.对硝基苯-α-L-阿拉伯呋喃糖苷溶液(底物溶液)

在200ml Pyrex^TM玻璃烧杯中加入准确称量的100mg的对硝基苯α-L-阿拉伯呋喃糖苷，并加入50ml的玻璃蒸馏水。将所述烧杯置于加热器/搅拌器装置的热平板上并温和加热，同时搅拌，以溶解对硝基苯α-L-阿拉伯呋喃糖苷。将所述溶液转移到100ml的容量瓶中，用少量的玻璃蒸馏水仔细地冲洗Pyrex^TM烧杯，并用冲洗液和玻璃蒸馏水使容量瓶中的体积达到100ml。将此溶液储存在5℃，最长4星期(为了更长时期地储存底物溶液，可以冷冻溶液的等分试样)。

2.1M乙酸钠缓冲液，pH5.0(储备缓冲液)

由溶解82.03g无水乙酸钠并用玻璃蒸馏水使其达到1000ml而制备1M的乙酸钠溶液。冰乙酸的浓度是17.5M。通过用玻璃蒸馏水稀释57.2g或54.5ml的冰乙酸到1000ml而制备1M的乙酸。准确地混合70ml的1M乙酸钠溶液与30ml的1M乙酸。使用经校准的pH计来检测pH是pH 5.0。如果需要，调节pH。

3.0.2M乙酸钠缓冲液，pH5.0(稀释缓冲液)

将10ml的1M乙酸钠缓冲液(pH5.0)移取到50ml有刻度的容量瓶中。使用玻璃蒸馏水使体积达到50ml。

4.0.4M甘油溶液，pH10.8(终止试剂)

准确地称量6.006g甘油到Pyrex^TM 250ml玻璃烧杯中，并加入100ml的玻璃蒸馏水。将所述烧杯置于加热器/搅拌器装置上并搅拌以溶解甘油。利用经校准的pH计，使用40％(w/v)的氢氧化钠溶液调节至pH10.8。将所述溶液转移到200ml的玻璃容量瓶中，并用玻璃蒸馏水使体积达到200ml。此溶液可在环境温度下被无限期地储存。

稀释的酶溶液的制备：

用玻璃蒸馏水，从粉末或液体酶制备物制备所有的酶溶液。通过避免大的稀释步骤而使测试稀释误差最小化，包括小的体积或重量。在制备酶稀释液时，称量出最初的酶样品是更加准确的(甚至对于液体样品而言)。如果这样做了，在液体样品的情况中，因此需要测量所述液体在20℃的比重。

由于所述测试是“两点”而不是“连续监测”方法，确保不同的酶系统和条件下孵育时期内的线性是重要的。在底物浓度、pH、温度和测试时间的标准测试条件下，已表明所述测试在ΔOD_400nm测试(T)＝0.20-1.50的范围内是线性的。然而，为了良好的实施，在ΔOD_400nm测试(T)＝0.400-0.800的确定范围内进行所述测试。

方法

每次酶样品测试包括三种分析：一式两份的测试(TEST)分析和空白(BLANK)分析。所给出的过程描述了单个酶样品的分析。

1.将三个标准玻璃试管置于试管架中。将三个试管中的两个标记为测试并将另一个管标记为空白。向各个试管中加入下列：

2.将所有三个试管置于50℃水浴中并允许其平衡恰好5分钟。

3.使用250μl固定体积的移液管，通过向每个标记为测试的试管中直接加入0.25ml稀释的酶溶液而开始测试，使用10秒的时间间隔，用涡旋试管混合器快速混合所述内容物并将试管放回50℃水浴中。

4.在恰好10分钟后，使用同样的10秒时间间隔，通过向各个标记为测试的试管中加入4ml 0.4M的甘油溶液(pH10.8)(终止试剂)并利用涡旋试管混合器混合来终止反应。

5.向标记为空白的试管中加入4ml 0.4M的甘油溶液(pH10.8)(终止试剂)并混合，随后加入0.25ml的稀释的酶溶液。使用涡旋试管混合器混合。

6.移去试管并在25℃水浴中冷却。在1cm的玻璃比色皿中相对于水空白测量400nm处的吸光度。取决于可获得单光束还是双光束分光光度计，可相对于水或相对于OD400nm空白进行测量。然而，相对于水进行测量的优势在于其鉴别出用OD400nm空白样品时的任何问题。

7.使用1cm路径长度的玻璃比色皿，测量不同的样品在400nm处的光密度(OD400nm)。

●对于所测量的一式两份的测试，测定OD400nm测试；

●测定OD400nm空白

8.重复其中所获得的ΔOD_400nm测试(T)在0.400-0.800范围外的任何测试。

计算

ΔOD400nm测试(T)＝OD400nm测试-OD400nm空白

其中：

T＝OD_400nm测试-OD_400nm空白

18300＝对硝基苯的摩尔消光系数(1cm路径长度)

V＝7.25(测试中的总液体体积，ml)

1000＝转换为升

10⁶＝转换为μmoles

t＝10(分钟)

1u＝1μmol.min^-1

E＝0.25(稀释的酶样品的体积ml)

D＝酶稀释因子，例如对于1ml稀释到1升D＝1000

生物材料的保藏

塔宾曲霉4M 146菌株根据布达佩斯条约的条款被保藏在Centraalbureau voor Schimmelcultures，Uppsalalaan 8，NL-3584 CT乌特勒支，荷兰/P.O.Box 85167，NL-3508 AD乌特勒支，荷兰，并被给予下列登记号：

保藏登记号：保藏日期：

CBS 123488 2008年9月30日

Claims (26)

1.生产酶产品的方法，所述方法包括下列步骤：

在包含含有谷麸和甜菜果肉的植物材料的发酵培养基中深层发酵保藏登记号为CBS123488的塔宾曲霉菌株以获得发酵培养液，其中所述发酵培养基包含1-30％w/w范围内的甜菜果肉。

2.根据权利要求1的方法，其中以无细胞培养液的形式从所述发酵培养液中回收所述酶产品。

3.根据权利要求1的方法，其中所述发酵培养基包含2-8％w/w范围内的甜菜果肉。

4.根据权利要求1的方法，其中所述发酵培养基包含3-7％w/w范围内的甜菜果肉。

5.根据权利要求1的方法，其中所述甜菜果肉具有0.5-20％w/w的糖含量。

6.根据权利要求1的方法，其中所述甜菜果肉具有2-8％w/w的糖含量。

7.根据权利要求1的方法，其中所述甜菜果肉具有5-40％w/w的阿拉伯聚糖含量。

8.根据权利要求1的方法，其中所述甜菜果肉是未糖蜜化的。

9.根据权利要求1的方法，其中所述植物材料是谷麸与甜菜果肉的混合物。

10.根据权利要求1的方法，其中所述发酵培养基中的植物材料是谷麸与甜菜果肉以20:80至80:20的比例的混合物。

11.根据权利要求1的方法，其中所述谷麸是麦麸。

12.根据权利要求10的方法，其中所述麦麸具有2-20％w/w的阿拉伯聚糖含量。

13.根据权利要求1的方法，其中所述塔宾曲霉菌株是未经遗传修饰的(非-GMO)。

14.根据权利要求1的方法，其中所述塔宾曲霉菌株未被自我克隆。

15.根据权利要求1的方法，其中发酵过程中的pH在3-4.5的范围内。

16.根据权利要求1的方法，其中发酵过程中的pH在3-4的范围内。

17.根据权利要求1的方法，其中发酵过程中的pH在3.2-3.7的范围内。

18.根据权利要求1的方法，其中发酵过程中的温度在25-40℃的范围内。

19.根据权利要求1的方法，其中发酵过程中的温度在28-34℃的范围内。

20.根据权利要求1的方法，其中所述发酵是作为需氧发酵进行的。

21.根据权利要求1的方法，其中所述发酵培养基还包含硫酸铵和/或硝酸钾。

22.根据权利要求1的方法，其中所述发酵包括下列步骤：

a.在接种培养基中生长所述塔宾曲霉菌株以获得接种物，和

b.将所述接种物加入所述发酵培养基中。

23.根据权利要求22的方法，其中所述接种培养基包含谷麸和/或甜菜果肉。

24.根据权利要求22-23中任一项的方法，其中所述接种培养基包含麦麸。

25.用于生产酶产品的方法，其中所述酶产品包含至少下列酶活性：

i.多聚半乳糖醛酸内切酶活性

ii.多聚半乳糖醛酸外切酶活性

iii.果胶酯酶活性

iv.果胶裂解酶活性

v.纤维素酶活性

vi.木聚糖酶活性和

vii.阿拉伯聚糖酶活性

并且其中所述酶产品是由深层发酵保藏登记号为CBS123488的塔宾曲霉菌株而获得的表达产品，

所述方法包括下列步骤：在包含含有谷麸和甜菜果肉的植物材料的发酵培养基中深层发酵所述塔宾曲霉菌株以获得发酵培养液，其中所述发酵培养基包含1-30％w/w范围内的甜菜果肉。

26.根据权利要求25的方法，其中所述植物材料是谷麸与甜菜果肉的混合物。