Aufgabe
der Erfindung war es daher, in einem Verfahren zur Ölgewinnung
eine Enzymmischung bereitzustellen mit deren Hilfe die Ausbeute
im Prozess der Olivenölgewinnung
signifikant erhöht
und der Prozess der Ölabtrennung
zudem erleichtert werden kann.
Beschreibung
der Erfindung
Diese
Aufgabe wird durch die Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte
Ausführungsformen
sind in den Unteransprüchen
angegeben.
Die
erfindungsgemäße Zusammensetzung
enthält
zunächst
eine Zusammensetzung bzw. Masse aus Oliven oder Olivenbestandteilen.
Prinzipiell können
darin verschiedene Bestandteile der Olivenfrucht in beliebigen Anteilen
vorhanden sein. Bei der praktischen Ölgewinnung wird es sich in
der Regel um eine Olivenmasse bzw. Olivenpulpe handeln, die die
Pericarpanteile der Olivenfrucht, d.h. das Epicarp und das Mesocarp
enthält.
Es können
jedoch auch Endocarpanteile enthalten sein. Vorzugsweise handelt
es sich um eine Masse, in der die Oliven bzw. Olivenbestandteile
bereits zerkleinert sind, insbesondere durch mechanische Verfahren wie
Vermahlen.
Weiterhin
kann es sich um eine Masse vor oder nach der ersten Entölung (Ölgewinnung)
handeln. Es hat sich jedoch überraschend
gezeigt, dass besonders gute Ergebnisse im Rahmen der vorliegenden
Erfindung erhalten werden, wenn es sich bei der Masse um eine bereits
vorentölte
Masse handelt, d.h. der erste Ölgewinnungsschritt
bereits erfolgt ist.
Die
erfindungsgemäße Zusammensetzung
enthält
weiterhin eine Enzymmischung, wobei überraschenderweise gefunden
wurde, dass bei einem Verhältnis
der Aktivität
der Pektinesterase(n) zur Aktivität der Endo-Polygalacturonase(n)
von mindestens 0,13, und einem Verhältnis der Aktivität der Pektinesterase(n)
zur Aktivität
der Exo-Polygalacturonase(n) von mindestens 0,3 besonders vorteilhafte
Eigenschaften bei der Ölgewinnung
erhalten werden. So hat sich unerwartet gezeigt, dass bei Einhaltung
dieser Verhältnisse
sowohl die Freisetzung des Öls
aus der Masse aus Oliven oder Olivenbestandteilen mengenmäßig erhöht, als
auch die Freisetzung und Abtrennung des wässrigen Anteils (der wässrigen
Phase) in dem Ölgewinnungsprozeß erleichtert
wird. Insgesamt lässt
sich die Ölausbeute überraschend
steigern.
Unter
einer Pektinesterase (PE) wird erfindungsgemäß ein Enzym der Klassifizierungsgruppe
EC 3.1.1.11 verstanden. Die Aktivität dieses Enzyms kann prinzipiell
anhand von dem Fachmann geläufigen
Standardmethoden bestimmt werden. Eine erfindungsgemäß verwendete
Methode ist im nachstehenden Methodenteil angegeben. Die erfindungsgemäß eingesetzte
Enzymmischung enthält
somit mindestens eine PE(-aktivität).
Unter
einer Endo-Polygalacturonase (Endo-PGase, Endopektinase) wird erfindungsgemäß ein Enzym der
Klassifizierungsgruppe EC 3.2.1.15 verstanden. Die Aktivität dieses
Enzyms kann prinzipiell anhand von dem Fachmann geläufigen Standardmethoden
bestimmt werden. Eine erfindungsgemäß verwendete Methode ist im
nachstehenden Methodenteil angegeben. Die erfindungsgemäß eingesetzte
Enzymmischung enthält
somit mindestens eine Endo-PGase(-aktivität).
Nach
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
beträgt
das Verhältnis
der Pektinesterase (PE) zur Aktivität der Endo-Polygalacturonase
mindestens 0,15, vorzugsweise mindestens 0,18.
Die
erfindungsgemäß eingesetzte
Enzymmischung enthält
weiterhin mindestens eine Exo-Polygalacturonase (Exo-PGAse, Exo-Pektinase),
wobei das Verhältnis
der Aktivität
der Pektinesterase(n) zur Aktivität der Exo-Polygalacturonase(n)
mindestens 0,3 beträgt.
Besonders bevorzugt ist ein Aktivitätsverhältnis von mindestens 0,33.
Erfindungsgemäß wird unter
einer Exo-PGase ein Enzym der Klassifizierungsgruppe EC 3.2.1.67
verstanden. Die Aktivität
dieses Enzyms kann prinzipiell anhand von dem Fachmann geläufigen Standardmethoden
bestimmt werden. Eine erfindungsgemäß verwendete Methode ist im
nachstehenden Methodenteil angegeben.
Es
wird angenommen, ohne dass die Erfindung auf diesen theoretischen
Mechanismus beschränkt wäre, dass
durch den relativ hohen Pektinesteraseanteil bei gleichzeitiger
Anwesenheit von Endo- und Exo-PGase(n) ein besonders effizienter
Aufschluss der hochmolekularen Polysaccharidstrukturen erzielt wird, in
denen das zu gewinnende Öl "eingeschlossen" ist: Es wird weiterhin
angenommen, dass durch die Pektinesterase die Zugänglichkeit
von Substraten der Endo- und der Exo-PGase sowie anderer polysaccharidspaltender
Enzyme verbessert wird. Dadurch kann offenbar auch der Abbau von
hochmolekularen Strukturen, mit denen das zu gewinnende Öl assoziiert
ist, beschleunigt werden. Per definitionem katalysiert Exo-PGase
die Freisetzung von D-Galacturonat-Monomeren aus 1,4-alpha-D-Galacturonid-Polymeren
durch Spaltung von endständigen
O-glycosidischen Bindungen. Wird Pektin als Substrat eingesetzt,
ist es wie auch bei der Endo-PGA notwendig, dass das etwaige Methylsäureester
der Polygalacturonsäure
zunächst
in die freie Säure bzw.
in deren Salz umgewandelt werden, damit sie der Exo-PGase als Substrat
zur Verfügung
steht. Die Einstellung des erfindungsgemäßen (Mindest-)Verhältnisses
zwischen Pektinesterase und Exo-PGase
ist in diesem Zusammenhang offenbar besonders vorteilhaft. Die Spaltung
der Säureester
durch die Pektinesterase entlang der Polysaccarid-Kette erfolgt
wohl statistisch. So wird die Kette im ersten Schritt der Endo-PGase
als Substrat zugänglich
gemacht, die die Kette anschließend
in Oligosaccharide zerteilt. Es ist möglich, dass die Exo-PGase hier
bereits eine endständige
Abspaltung durchführt,
jedoch nur solange, bis sie auf der Kette wiederum einen Methylsäureester
vorfindet. Ein weiterer endständiger
Abbau der Kette könnte
dann nur erfolgen, wenn dieser Methylsäureester in die Säure umgewandelt
wird. Das erfindungsgemäße Mindestverhältnis zwischen
PE und Endo-PGase kann dafür
sorgen, dass die statistische Spaltung der Methylsäureester
durch die PE so mit der Exo-PGase-Aktivität abgestimmt ist, dass diese
mit hoher Leistungsfähigkeit
ohne eine Einschränkung
der Umsätze
durch blockierende Methylester arbeiten kann. Auch sind weitere
günstige
Interaktionen zwischen den vorstehenden Enzymaktivitäten denkbar.
Besonders
bevorzugt ist das Verhältnis
der Aktivität
der Pektinesterase zur Aktivität
der Endo-Polygalacturonase nicht größer als etwa 1, insbesondere
als etwa 0,5, und das Verhältnis
der Aktivität
der Pektinesterase zur Aktivität
der Exo-Polygalacturonase nicht größer als etwa 1, insbesondere
als etwa 0,6.
Nach
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
enthält
die in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung
enthaltene Enzymmischung weiterhin mindestens eine Laminarinase
(β-1,3-Glucanase).
Erfindungsgemäß wird hierunter
ein Enzym der Klassifizierungsgruppe EC 3.2.1.39 verstanden. Die
Aktivität
dieses Enzyms kann prinzipiell anhand von dem Fachmann geläufigen Standardmethoden
bestimmt werden. Eine erfindungsgemäß verwendete Methode ist im
nachstehenden Methodenteil angegeben. Vorzugsweise beträgt das Verhältnis der
Aktivität
der Pektinesterase zur Aktivität
der Laminarinase mindestens 20, vorzugsweise mindestens 30.
Nach
einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform enthält die in
der erfindungsgemäßen Zusammensetzung
enthaltene Enzymmischung weiterhin mindestens eine Cellulase, insbesondere eine
C1-Cellulase. Hierunter wird erfindungsgemäß ein Enzym der Klassifizierungsgruppe
EC 3.2.1.91 verstanden. Die Aktivität dieses Enzyms kann prinzipiell
anhand von dem Fachmann geläufigen
Standardmethoden bestimmt werden. Eine erfindungsgemäß verwendete
Methode ist im nachstehenden Methodenteil angegeben. Besonders bevorzugt
beträgt
das Verhältnis
der Aktivität
der PE zur Aktivität
der Cl-Cellulase mindestens 75, vorzugsweise mindestens 100.
Nach
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
umfasst die in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung
enthaltene Enzymmischung somit mindestens sechs verschiedene Einzelaktivitäten, wobei
die bevorzugten Verhältnisse
der Einzelaktivitäten
sich überraschend
positiv auf die erhaltene Ölausbeute
und Phasentrennbarkeit aus wirken. Die bevorzugt enthaltenen Enzymaktivitäten sind
nachstehend nochmals aufgelistet:
exo-Polygalacturonase | (EC
3.2.1.67) |
endo-Polygalacturonase | (EC
3.2.1.15) |
Pektinlyase | (EC
4.2.2.10) |
Pektinesterase | (EC
3.1.1.11) |
C1-Cellulase | (EC
3.2.1.91) |
Laminarinase | (EC
3.2.1.39) |
Es
können
jedoch auch weitere Komponenten in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung
enthalten sein. In Bezug auf die enzymatischen Komponenten der Enzymmischung
können
beispielsweise weitere Zell- bzw. Zellwandstrukturen degradierende
Enzyme enthalten sein, wie beispielsweise, jedoch nicht beschränkend, Xylanase(n)
(EC 3.2.1.8) oder auch proteolytische Enzyme (vgl. Beschreibungseinleitung
und Enzymauflistung vor dem Methodenteil). Auch sind weitere Bestandteile
in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung
(neben der Masse und der Enzymmischung) nicht ausgeschlossen. Solche
Zusätze
sind dem einschläagigen
Fachmann geläufig
und umfassen beispielsweise Salze, Cofaktoren, Inhibitoren oder
Aktivatoren für
Enzyme, Stabilisatoren wie Glycerin, etc.
Wie
bereits erwähnt,
eignet sich die in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung enthaltene
Enzymmischung besonders vorteilhaft zur Erhöhung der Ausbeute in der Gewinnung
von Olivenöl
aus Olivenfrüchten oder
deren Bestandteilen, besonders in mechanisch-physikalischen Gewinnungsprozessen.
Besonders
bevorzugt sind erfindungsgemäß die folgenden
Enzymaktivitäten,
die wie im nachstehenden Methodenteil angegeben bestimmt werden
können:
- a. Pektinesterase: mehr als 300 U/ml, insbesondere
mehr als 320 U/ml
- b. Exo-Polygalacturonase: weniger als 1000 U/ml
- c. Endo-Polygalacturonase: zwischen 1500 und 2500 U/ml,
- d. Laminarinase: weniger als 15 U/ml, insbesondere weniger als
12 U/ml
- e. Cl-Cellulase: weniger als 3,3 U/ml
- f. Pektinlyase: zwischen etwa 25.000 und 100.000 U/ml
Die
einzelnen Enzyme sind kommerziell erhältlich (z.B. Firma Sigma-Aldrich
Chemie GmbH, München,
DE). Beispielhafte Enzymquellen sind nachstehend vor dem Methodenteil
angegeben. Es können
jedoch selbstverständlich
auch Enzyme aus anderen Quellen verwendet werden, solange sie die
entsprechende vorstehend angegebene Aktivität aufweisen. Nach einer bevorzugten
Ausführungsform
werden die Enzyme aus Kulturen bzw. dem Kulturüberstand von Mikrooganismen,
inbesondere von Bakterien und Pilzen gewonnen. Eine bevorzugte Quelle
sind Kulturen von Aspergillus, insbesondere von Aspergillus niger
Stämmen,
die mehrere oder sogar alle der in der erfindungsgemäßen Enzymmischung
enthaltenen Enzymaktivitäten
aufweisen.
Bezogen
auf die Masse aus Oliven bzw. Olivenbestandteilen werden erfindungsgemäß besonders
bevorzugt zwischen etwa 50 und 250 ml, vorzugsweise zwischen 100
und 175 ml, insbesondere zwischen 125 und 150 ml der vorstehend
bestehenden Enzymmischung pro Tonne Masse eingesetzt.
Bevorzugt
liegt dabei die Protein- bzw. Enzymkonzentration in der eingesetzten
Enzymmischung zwischen etwa 2 und 20 mg/l, vorzugsweise 2 und 12
mg/ml, insbesondere 3 und 10 mg/l. Die Proteinkonzentration kann
anhand von Standardverfahren z.B. photometrisch bestimmt werden.
Hieraus lassen sich einfach die bevorzugten ab soluten Gesamtaktivitäten der
einzelnen enthaltenen Enzyme pro Tonne der Masse aus Oliven bzw.
Olivenbestandteilen errechnen.
Nach
einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung
einer Enzymmischung wie vorstehend definiert zur Behandlung von
Massen aus Oliven oder Olivenbestandteilen, insbesondere von vorentölten Massen
bei der Ölgewinnung.
Als besonders vorteilhaft hat sich überraschend die Verwendung
bei der physikalischen bzw. mechanisch-physikalischen Ölgewinnung
herausgestellt. Wie eingangs ausgeführt, können bei diesen Verfahren hochwertigere Öle erhalten
werden, so dass sich die gemäß der vorliegenden Erfindung
gesteigerte Ölausbeute
als besonders lohnend darstellt.
Nach
einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zur Gewinnung von Öl aus
Massen aus Oliven oder Olivenbestandteilen, umfassend die folgenden
Schritte:
- a. Bereitstellen einer Masse aus
Oliven oder Olivenbestandteilen
- b. Zugabe einer Enzymmischung wie vorstehend definiert in flüssiger oder
fester Form
- c. Vermischen der Masse und der Enzymmischung
- d. Inkubation, insbesondere bei einer Temperatur zwischen 20
und 50 °C über 5 bis
120 min.
- e. Abtrennen der Ölphase
von der Masse.
Wie
bereits ausgeführt,
kann dabei jede dem Fachmann geläufige
Masse aus Oliven oder Olivenbestandteilen verwendet werden, wobei
es sich in der Regel um eine Masse aus vorzerkleinerten Oliven oder Olivenbestandteilen
handeln wird.
Die
Zugabe der Enzymmischungen kann in flüssiger oder fester Form erfolgen.
Aus Gründen
der Dosierbarkeit wird sich jedoch die Herstellung einer Enzymlösung, d.h.
einer flüssigen
Enzym mischung vor der Zugabe zu der Masse aus Oliven oder Olivenbestandteilen
empfehlen. Dabei kann z.B. von einer konzentrierten Stammlösung der
Enzymmischung ausgegangen werden, die kurz vor der Zugabe zur Masse
vorverdünnt wird.
Auch
das Vermischen der Masse und der Enzymmischung kann auf dem Fachmann
geläufige
herkömmliche
Weise erfolgen, z.B. durch Rühren.
Die
im Einzelfall optimale Enzyminkubationszeit und – temperatur kann vom Fachmann
einfach anhand routinemäßiger Versuche
bestimmt werden. In der Regel werden Temperaturen zwischen 20 und
50°C, vorzugsweise
von 25–45°C, insbesondere
30–45°C und Inkubationszeiten
zwischen 5 bis 120 min, vorzugsweise 10–100 min, insbesondere 30–90 min
zu guten Ergebnissen führen.
Die
Gewinnung des Öls
unter Abtrennung der Ölphase
kann auf jede beliebige, dem Fachmann geläufigen Weise geschehen, wobei
auch auf die in der Beschreibungseinleitung angeführten Verfahren
beispielhaft verwiesen wird.
Bei
der nachstehenden Methode zur Bestimmung der Aktivität der Endo-PGase
kann als Substrat auch anstelle von Pektinsäure (PGA) Pektin eingesetzt
werden. Auf diese Weise lässt
sich eine Gesamtaktivität
der Pektin-degradierenden Enzyme ermitteln. Im Rahmen der vorliegenden
Erfindung hat sich dabei gezeigt, dass sich besonders vorteilhafte
Eigenschaften bei der Ölgewinnung
zeigen, wenn in der eingesetzten Enzymmischung das Verhältnis der
PE zur wie vorstehend bestimmten Gesamtaktivität der Pektin-degradierenden
Enzyme in der Enzymmischung mindestens 0,035, vorzugsweise mindestens
0,04, insbesondere 0,05 beträgt.
Nach einer alternativen Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung daher auch eine Zusammensetzung,
enthal tend eine Masse aus Oliven oder Olivenbestandteilen und eine
Enzymmischung, worin das Verhältnis
der PE zur wie vorstehend bestimmten Gesamtaktivität der Pektin-degradierenden
Enzyme in der Enzymmischung mindestens 0,035, vorzugsweise mindestens
0,04, insbesondere 0,05 beträgt.
Die
Gesamtaktivität
der Pektin-degradierenden Enzyme liegt dabei vorzugsweise bei weniger
als 8000 U/ml, insbesondere weniger als 7000 U/ml. Die Aktivitätswerte
der anderen Enzyme sind vorzugsweise wie vorstehend angegeben. Auch
die Aktivitätsverhältnisse
von PE zu Exo-PGA, von PE zu Laminarinase und von PE zu C1-Cellulase
sind vorzugsweise wie vorstehend angegeben. Es können die gleichen Mengen an
Enzymgemisch wie vorstehend beschrieben eingesetzt werden. Quellen
für Enzyme:
a.
EC 3.2.1.15 | endo-PGAse,
z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. P4716, aus A. niger |
b.
EC 3.2.1.67 | exo-PGAse
(Kobayashi, T., Higaki, N., Yajima, N., Suzumatsu, A., Hagihara,
H., Kawai, H., und Ito, S. (2001) Biosci. Biotechnol. Biochem. 65,
S. 842–848) oder
von ASA Spezialenzyme GmbH, Wolfenbüttel, DE in Form von Exo-PGase-haltigen
Enzymlösungen |
c.
EC 3.1.1.11 | Pektinesterasen,
z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. P5400, aus Orangenschale |
d.
EC 3.4.23.1 | Pepsin,
z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. P7012, aus Schweinemagenschleimhaut |
e.
EC 3.4.22.2 | Papain,
z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. P4762, aus Papaya |
f.
EC 3.2.1.4 | Cellulase,
z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. C1184, aus A. niger |
g.
EC 3.2.1.1 |
α-Amylase,
z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. A6211, aus A. oryzae |
h.
EC 3.4.2x.yz |
Proteasen,
z.B. Pepsin und Papain, s.o. |
i.
EC 3.2.1.21 |
β-Glucosidase,
z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. G6906, rekombinant |
j.
EC 3.2.1.22 |
α-Galactosidase,
z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. G4408, aus A. niger |
k.
EC 3.2.1.23 |
β-Galactosidase,
z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. G3522, aus A. niger |
l.
EC 3.2.1.55 |
α-Arabinosidase |
m.
EC 3.2.1.24 |
α-Mannosidase,
z.B. Firma Sigma, Katalog-Nr. M7257,
aus Bohnen |
n.
EC 3.2.1.37 |
β-Xylosidase,
z.B. Firma Sigma, Katalog-Nr. X3501, aus A. niger |
o.
EC 3.2.1.52 |
β-N-Acetylglucosaminidase,
z.B. Firma Sigma, Katalog-Nr. A2264, aus Bohnen |
p.
EC 4.2.2.10 |
Pektin-Lyase,
z.B. Firma Sigma, Katalog-Nr. PP7052, aus A. niger |
q.
EC 3.2.1.6 |
Laminarinase,
z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. L5272, aus Trichoderma spec. |
r.
EC 3.2.1.8 |
Xylanase,
z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. X3876, aus Trichoderma veride |
Methodenteil: Bestimmung
der Enzymaktivitäten
(gemäß Methoden
der Firma ASA Spezialenzyme GmbH, Wolfenbüttel, DE)
1. Bestimmung der Exo-Polygalakturonase-(Pektinase-)Aktivität (Messung
der reduzierenden Zucker)
Testprinzip:
Exo-Polygalakturonase
(PGA) spaltet aus verseiftem Citruspektin Galakturonsäure-Einheiten
ab, die aufgrund der reduzierenden Aldehydgruppen nach Reaktion
mit 3,5-Dinitrosalicylsäure
(DNSS) photometrisch nachgewiesen werden können.
Beim
Erwärmen
von 3,5-Dinitrosalicylsäure
(DNSS) mit reduzierenden Zuckern in alkalischem Medium entsteht
3-Amino-5-nitrosalicylsäure
(Gl. 1). Dabei wird eine Nitrogruppe zur Aminogruppe reduziert,
während
die Aldehydgruppe des Monosaccharids zur Carboxylgruppe oxidiert
(Kakác
und Vejdelek, 1974).
Verschiedene
Zucker ergeben unterschiedliche Färbungen, deren Absorptionsmaximum
zwischen 500 und 550 nm liegt. So können mit diesem Test ebenfalls
Mono-, Di-, Oligo- und Polysaccharide sowie Methylpentosen und O-Methylsaccharide
erfasst werden.
Reagenzien:
DNSS-Phenol-Reagenz:
- – Lösung A:
38,55
g K-Na-tartrat in ein 200 ml Becherglas einwiegen und in 125 ml
dest. Wasser lösen,
in der Lösung werden
2,425 g NaOH (Plätzchen)
gelöst.
- – Lösung B:
1,
325 g 3, 5-Dinitrosalicylsäure
(C7H4N2O7; 2-Hydroxy-3,5-dinitrobenzoesäure) in einer braunen Schraubflasche
in 125 ml dest. Wasser lösen.
- – Lösung C:
1,05
g Phenol in 12,5 ml dest. Wasser lösen. Nacheinander 0,25 g NaOH
(Plätzchen)
und 1,05 g Na2SO4 zugeben
und unter Rühren
lösen.
- – Gebrauchslösung:
Lösung A und
Lösung
C werden (ohne nachspülen)
in Lösung
B gegossen und 10 min homogenisiert. Die Lösung vor Gebrauch mindestens
eine Nacht stehen lassen und stets im Dunkeln aufbewahren.
Substratlösung:
2,2%
verseifte Citruspektinlösung
in 0,1 M Na-Citrat, pH 4,4; Verseifungsmethode: Vorschrift nach
Boehringer Ingelheim, S.3
Standardlösung:
12,0
g/l Galakturonsäure
(GA) in dest. Wasser.
Durchführung
Proben:
0,9
ml Substratlösung
mit 0,1 ml Enzymlösung
mischen, bei 30°C
für 30
min inkubieren, danach sofort ins Eisbad stellen. 2,0 ml DNSS-Phenol-Reagenz
dazugeben und 5 min kochen. Gemisch für ca. 5 min im Eisbad abkühlen und
die Extinktion bei Raumtemperatur und 492 nm messen.
Blindwerte:
0,9
ml Substratlösung
mit 0,1 ml Wasser mischen, 2,0 ml DNSS-Phenol-Reagenz dazugeben und 5 min kochen.
Gemisch für
ca. 5 min im Eisbad abkühlen
und die Extinktion bei Raumtemperatur und 492 nm messen.
Standard:
1,0
ml verdünnte
Standardlösung
mit 2,0 ml DNSS-Phenol-Reagenz mischen und 5 min kochen. Gemisch
für ca.
5 min im Eisbad abkühlen
und die Extinktion bei Raumtemperatur und 492 nm messen.
Kalibrierung:
Verdünnungen
der Standardlösung
zur Erstellung der Kalibriergeraden:
- M(GA) = 194 g/mol
- tReaktion = 3 0 min
Herstellung der verseiften
Pektinlösung
2,2% (Pektinsäurelösung)
Eine
250 ml Flasche wird in einem Wasserbad auf 35°C eingestellt und Rührer mit
Rührmotor
darin befestigt. 2,2 g über
80% verestertes Citruspektin (v. Herbstreith und Fox KG , Pektin
Classic CF 201, 00302026 v. 30.04.03) werden darin mit 4 ml reinem
Alkohol unter langsamen Rühren
benetzt. Bei stärkerer Rührbewegung
werden daraufhin 50 ml dest. Wasser in die Mitte des Rührsoges
eingegossen und 20 min nachgerührt.
Es ist darauf zu achten, das dabei eine glatte viskose Lösung ohne
Klümpchen
entsteht. Danach werden unter Zeitnahme zur Verseifung aus einem
Tropftrichter 20 ml 0,5 N Natronlauge innerhalb von 5 min rasch
zugetropft. Nach einer gesamten verseifungszeit von genau 60 min
bei 35°C
un ter stetem Rühren
wird die Reaktion abgestoppt durch Zugabe von 10%-iger Zitronensäure aus
einer Stabpipette. Durch Zugabe von 3 ml Zitronensäurelösung wird
der pH-Wert auf 4,4 eingestellt. Der pH-Wert darf nicht nachträglich mit
Lauge korrigiert werden.
Anschließend wird
der Inhalt des Becherglases unter Nachspülen mit Pufferlösung in
einen 100 ml-Messzylinder überführt. Nachdem
die Lösung
auf 20°C
abgekühlt
ist, wird das Volumen mit Citratpuffer pH 4,4 auf 100 ml aufgefüllt. Vor
dem Gebrauch wird die fertige Pektinsäurelösung über Glaswolle filtriert.
2. Bestimmung der endo-Polygakturonase-Aktivität (endo-PG)
Definition:
Einer
spezifischen endo PG-Einheit entspricht der mit 100 ml multiplizierte
reziproke Wert der Enzymmenge in g, die in 30 min die Viskosität (-Wasserwert)
von 1 Liter einer 2,2%-igen Pektinsäurelösung um 3/5 erniedrigt;
(auf rel. Viskosität
0,40), bei 30°C
und beim pH-Optimum von 4,4.
Prinzip:
Messung des Viskositätsabbaues
der fermentierten Fluka-Pektinsäurelösung im
Ostwald-Viskosimeter.
Apparatur:
- a) Viskosimeter nach Ostwald 30 ml; Wasserwert
ca. 40 sec. im Wasserbad bei 30°C.
- b) Ultra-Thermostat mit Wasserbad und Einhängevorrichtung für Reagenzgläser
- c) Wasserbad mit Einhängethermostat
- d) Rührmotor
mit Flügelrührer
- e) Bechergläser
600 und 800 ml
- f) Messkolben 100 und 500 ml
- g) geeichte Vollpipette, 3, 20 und 30 ml
- h) Reagenzgläser
18 × 180
mm
- i) Saugflasche, Glasfritte mit Gummimanschette und Glaswolle,
Messzylinder 100 und 250 ml
- j) Stoppuhren, Teilung 0,1 sec.
- k) pH-Gerät
und Glaselektrode sowie
- l) Magnetrührer
mit Stäbchen
Reagenzien:
- – Pektinsäure purum
(Fluka AG, Chem. Fabrik, Buchs, SG)
- – Zitronensäuremonohydrat,
DAB 6
- - Natronlauge 1 N, 0,5 N, 0,1 N Titrisol
- – Salzsäure 0,1
N Titrisol
- – Alkohol,
absolut p.A.
Lösungen:
a) Citratpufferlösung pH
4,4 (0,1 molar)
Basislösung:
21,01
g Zitronensäuremonohydrat
in einem 1 Liter Messkolben in ca. 100 ml dest. Wasser lösen.
200
ml 1 N-Natronlauge dazu pipettieren und gut mischen, bis zur Eichmarke
auffüllen.
Gebrauchslösung:
Von
der Basislösring
werden ungefähr
350 ml in einem 800 ml Becherglas vorgelegt und eine Glaselektrode
mit angeschlossenem pH-Gerät
eingetaucht. Unter Rühren
(Magnetrührer)
wird nun langsam 0,1 N Salzsäure
hinzugegeben, bis der pH von 4,4 erreicht wird.
b) Pektinsäurelösung (2,2%-ig)
11
g Pektinsäure
werden in einem 600 ml Becherglas (Flachform) vorgelegt und mit
20 ml Alkohol (Ethanol p.A.) versetzt. 30 Minuten quellen lassen.
Anschließend
wird das Becherglas in einem Wasserbad mit Einhängethermostat – eingestellt
auf 35°C – fixiert
und ein Rührmotor
mit Flügelrührer derartig
darüber
angebracht, dass der Flügelrührer möglichst
dicht über
dem Boden des Becherglases hängt.
Bei
starker Rührbewegung
werden 240 ml dest. Wasser in das Becherglas eingegossen und anschließend bei
konstanter, starker Rührgeschwindigkeit
genau 20 Minuten nachgerührt.
Es
ist darauf zu achten, dass eine glatte viskose Lösung ohne Klümpchen entsteht.
Danach wird der pH-Wert der Lösung
mit Natronlauge (zuerst 0,5 N dann 0,1 N) auf exakt pH 4,4 eingestellt
(pH-Meter). Nicht übertitrieren,
da bei pH-Werten über
pH 4,4 Klümpchen
durch Gelbildung entstehen! Nach der pH-Einstellung wird der Inhalt
des Becherglases unter gutem Nachspülen mit der Citrat-Pufferlösung pH
4,4 in einen 500 ml Messkolben überführt und
nach Abkühlen
auf 20°C
mit Citratpuffer zur Marke aufgefüllt.
Vor
dem Gebrauch wird die fertige Pektinsäurelösung über Glaswolle filtriert.
Durchführung der Bestimmung:
Von
der frisch hergestellten Pektinsäurelösung werden,
entsprechend der Anzahl der Enzymproben, aus Vollpipetten je 30
ml in Reagenzgläser
pipettiert und vor der Fermentierung im Ultrathermostat für Reagenzgläser – eingestellt
auf 30°C – et wa 5
min auf 30°C
erwärmt.
Der Fermentzusatz von je 3 ml (Vollpipette ausblasen) zu den 30
ml temperierter Pektinsäurelösung erfolgt
unter Zeitnahme durch Drücken
einer Stoppuhr. Bei mehreren Enzymproben werden die entsprechenden
Enzymlösungen
im Abstand von jeweils 4 min zugesetzt. Nach einer Fermentierungszeit
von nicht ganz 30 min bei 30°C
wird die Reaktionsprobe dem Wasserbad entnommen und in das ebenfalls
auf 30°C
temperierte Ostwald-Viskosimeter gefüllt. Die Lösung im Viskosimeter wird sogleich
hochgesaugt, und zwar so, dass sie im Auslauf die obere Marke genau
30 min nach Beginn der Fermentierung passiert. Die Durchlaufzeit
zwischen den Eichmarken wird mit einer zweiten Stoppuhr gestoppt
und als Endviskosität
registriert. Bei mehreren Fermentproben ist auch hier der Abstand
von jeweils 4 min zwischen jeder Messung genau einzuhalten.
Die
Ausgangsviskosität
wird im gleichen Viskosimeter bestimmt, indem man die Durchlaufzeit
von 30 ml Pektinsäurelösung bei
30°C misst,
nun aber anstelle von Fermentlösung
3 ml Citratpufferlösung
pH 4,4 zufügt.
Die Ausgangsviskosität
soll unmittelbar vor der Endviskosität bestimmt werden. Wird eine
ganze Serie von Enzymproben untersucht, so wird die Ausgangsviskosität unmittelbar
vor und nach der Messreihe bestimmt und der Durchschnittswert genommen.
Auswertung:
Messung im gleichen Viskosimeter
Wasserwert
- Durchlaufzeit von destilliertem Wasser → W
Ausgangsviskosität
- Durchlaufzeit der Pektinsäurelösung → A + 3 ml Puffer pH 4,4
Endviskosität
- Durchlaufzeit der fermentierten Lösung → E
Die
relative Viskosität
der fermentierten Lösung
entspricht dem Verhältnis
von Endviskosität
( Wasserwert) zu Ausgangsviskosität (-Wasserwert)
Der
Wert der relativen Viskosität
soll zwischen 0,36–0,45
liegen. Ist dies nicht der Fall, so ist die Messung mit einer entsprechend
veränderten
Enzym-Einsatzmenge zu wiederholen. Zur Bestimmung der neuen Einwaage
kann eine Abschätzung
der Aktivität
mit Hilfe der "Eichkurve über weiten
Bereich" vorgenommen und
die damit berechneten Einheiten als Richtwert eingesetzt werden.
Berechnung
der Aktivität:
- k
- = 1.100; Kurvenwert
der Eichkurve bei einer relativen Vis kosität von 0,40 (erstellt mit einem
Standardenzym)
- VT
- = Testvolumen
- VF
- = Verdünnungsfaktor
- VE
- = Volumen Enzymlösung [ml]
Erstellung der Eichkurve:
Der
Viskositätstest
wird mit verschiedenen Konzentrationen eines Standardenzyms (Panzym
Combi 285/12, Boehringer Ingelheim) durchgeführt. Die Enzymkonzentration,
die zu einer relativen Viskosität
von 0,40 führt,
wird mit dem Kurvenwert von 1.100 gleichgesetzt.
Nach
der alternativen Ausführungsform
der Erfindung wurde in der vorstehenden Vorschrift anstelle von
Pektinsäure
(PGA) Apfelpektin (Sigma, Katalog-Nr. P8471) eingesetzt. Dies ermöglicht eine
parallele viskosimetrische Aktivitätsbestimmung folgender Enzymaktivitäten: Pektinesterase,
Pektinlyase, Endo- und Exo-Polygalakturonase.
3. Bestimmung
der Pektinlyaseaktivität
Testprinzip:
Bei
der Pektinspaltung durch Pektinlyase entsteht eine Doppelbindung
zwischen C-Atom 4 und C-Atom 5 des neu entstehenden nichtreduzierenden
Kettenendes. Die Doppelbindung führt
zur Lichtabsorption bei 235 nm. Die Geschwindigkeit, mit der die
Extinktion zunimmt, dient als Maß für die Lyaseaktivität.
Substratlösung:
0,41
g Apfelpektin B (Citruspektin v. Herbstreith & Fox KG Nr. 00302026 v. 30.04.03)
werden mit 0,1 n Citratpuffer von pH 5,0 auf 100 ml gelöst und (z.B.
durch ein Glasfilter G2) filtriert.
Durchführung der Messung:
In
der Küvette
mit 1 cm Schichtdicke werden 2,9 ml (auf 30°C temperierte) Substratlösung und
0,1 ml Enzymverdünnung
pipet tiert und gemischt. Bei 30°C
und 235 nm wird die Extinktionszunahme über die Zeit im Vergleich zu
einer Nullprobe aus 2,9 ml Substrat und 0,1 ml zuvor hitzeinaktivierter
Enzymverdünnung
gemessen.
Die
Extinktionszunahme soll zu Beginn der Rektion im Bereich zwischen
0,005 und 0,05 pro Minute liegen, andernfalls ist die Messung mit
mehr oder weniger stark verdünnter
Enzymlösung
zu wiederholen.
Berechnung der Aktivität:
Die
Lyaseaktivität
ergibt sich aus den gemessenen Extinktionszunahmewerten pro Minute
(ΔExt.)
bei Reaktionsbeginn:
V
F = Verdünnungsfaktor
4. Bestimmung der Pektinesterase-(PE)-Aktivität
Definition:
Einer
spezifischen Pektinesterase-Einheit (PE-E) entspricht die Enzymmenge
in g, die in einer Minute ein Mikroäquivalent Methylestergruppen
in einer Pektinlösung,
die 550 mg hochverestertes Citruspektin enthält, bei 30°C und dem pH-Optimum von 4,4
spaltet.
Prinzip:
Alkalimetrische
Titration der Pektinlösung
während
des Enzymierungsvorganges bei 30°C
und bei konstant gehaltenem pH-Wert von 4,4 mit 0,02 N Natronlauge.
Die ersten 5 min nach der En zymzugabe zur Pektinlösung dienen
zur Einstellung des Soll-pH-Wertes.
Die eigentliche Titration von genau 20 min Dauer beginnt nach dieser
Zeit.
Apparatur:
- a) pH-Gerät
mit Glaselektrode und Titrator
- b) Wasserbad mit Einhängethermostat
- c) Rührmotor
mit Flügelrührer
- d) 2 Mikrobüretten
10 ml automatisch
- e) Messkolben 100 ml, 1 Liter
- f) Vollpipetten 10 ml, 100 ml
- g) Bechergläser
200 ml, 1 Liter
- h) Stoppuhr
- i) Saugflasche 1 Liter; Glasfritte mit Gummimanschette
- j) Glaswolle oder Microlith-Glasfiltervlies Typ OR 80 N (Glaswerk
Schuller, Westheim)
Reagenzien:
- – Citrustrockenpektin
ca. 74% verestert (Pemosin, Frank furt/M)
- – Natronlauge
0,1 N Titrisol
Lösungen:
a) 0,01 N Natronlauge
2 × 100 ml
0,1 N Natronlauge werden in einen 1 Liter Messkolben pipettiert
und mit dest. Wasser zur Marke aufgefüllt.
b) Pektinlösung (0,55%-ig)
Ein
100 ml Becherglas wird in einem Wasserbad mit Einhängethermostat – eingestellt
auf 30°C – fixiert und
ein Rührmotor
mit Flügelrührer derartig
darüber
angebracht, dass der Flügelrührer möglichst
dicht über dem
Boden des Becherglases hängt.
Es
werden ca. 700 ml dest. Wasser (H2O dest.)
in dem Becherglas vorgelegt und anschließend 5,5 g des hochveresterten
Citrustrockenpektins unter starkem Rühren in ca. 2 min in der Mitte
des Rührsoges
eingetragen. Danach wird die Rührgeschwindigkeit
verringert und bei für
alle weiteren Versuche konstanter Umdrehungszahl dann genau 30 min
lang nachgerührt.
Es
ist darauf zu achten, dass dabei eine glatte viskose Lösung ohne
Klümpchen
entsteht.
Der
Inhalt des Becherglases wird unter Nachspülen mit einer kleinen Menge
dest. Wasser in einen 1 Liter Messkolben überführt und bei 20°C bis zur
Marke aufgefüllt
Vor
Gebrauch wird die fertige Pektinlösung über Glaswollefiltriert.
Durchführung der Bestimmung:
In
einem Wasserbad mit Einhängethermostat – eingestellt
auf 30°C – wird ein
Becherglas (200 ml) so befestigt, dass es zur Hälfte darin eintaucht. 20 ml
der Pektinlösung
werden in das Becherglas gegeben und genau 15 min temperiert.
Innerhalb
dieser Zeit wird eine Glaselektrode, angeschlossen an ein pH-Meter
mit Titrator, derart befestigt, dass sie in dem Becherglas in die
Pektinlösung
eintaucht. Ebenso werden ein Flügelrührer und
die zwei Zuleitungen der Autobüretten
mit 0,1 N und 0,01 N NaOH installiert.
Nach
Ablauf der 15 min werden 2 ml Enzymlösung in die Pektinlösung pipettiert
und unter ständigem Rühren gehalten.
Nun
wird zu der Autobürette
mit 0,01 N NaOH gewechselt, gleichzeitig die Stoppuhr gedrückt und
weiterhin der pH-Wert durch tropfenweise Zugabe der 0,01 N NaOH
auf pH 4,4 gehalten. Exakt 10 min nach der Zeitnahme wird die verbrauchte
Menge 0,01 N NaOH abgelesen.
Die
verbrauchte Menge 0,01 N NaOH soll zwischen 1,6 und 4 ml liegen.
Ist dies nicht der Fall, so ist die Messung mit einer entsprechend
veränderten
Enzymeinsatzmenge bzw. Verdünnung
zu wiederholen.
- A
- = Verbrauch 0,01 N
NaOH [ml]
- M
- = Molarität der Titrierlösung [μmol/ml]
- VF
- = Verdünnungsfaktor
- VE
- = Volumen Enzymlösung [ml]
- t
- = Reaktionszeit [min]
5. Bestimmung der C1-Cellulase-Aktivität mit Avicel
(Messung der reduzierenden Zucker)
Testprinzip:
Cellulase
spaltet die β-1,4-Bindung
zwischen den Glucoseeinheiten innerhalb eines Stärkemoleküls. Die dabei freigesetzte
Glucose wird mit 3,5-Dinitrosalicylsäure (DNSS) photometrisch nachgewiesen.
Beim
Erwärmen
von 3,5-Dinitrosalicylsäure
(DNSS) mit reduzierenden Zuckern in alkalischem Medium entsteht
3-Amino-5-nitrosalicylsäure (Gl.
1). Dabei wird eine Nitrogruppe zur Aminogruppe reduziert, während die
Aldehydgruppe des Monosaccharids zur Carboxylgruppe oxidiert (Kakác und
Vejdelek, 1974).
Verschiedene
Zucker ergeben unterschiedliche Färbungen, deren Absorptionsmaximum
zwischen 500 und 550 nm liegt. So können mit diesem Test ebenfalls
Mono-, Di-, Oligo- und Polysaccharide sowie Methylpentosen und O-Methylsaccharide
erfasst werden.
Reagenzien:
DNSS-Phenol-Reagenz:
- – Lösung A:
38,55
g K-Na-tartrat in ein 200 ml Becherglas einwiegen und in 125 ml
dest. Wasser lösen.
In der Lösung werden
dann 2,425 g NaOH (Plätzchen)
gelöst.
- – Lösung B:
1,325
g 3,5-Dinitrosalicylsäure
(C7H4N2O7; 2-Hydroxy-3,5-dinitrobenzoesäure) in einer braunen Schraubflasche
in 125 ml dest. Wasser lösen.
- – Lösung C:
1,05
g Phenol in 12,5 ml dest. Wasser lösen. Nacheinander 0,25 g NaOH
(Plätzchen)
und 1,05 g Na2SO4 zugeben
und unter Rühren
lösen.
- Gebrauchslösung:
Lösung A und
Lösung
C werden ohne Nachspülen
in Lösung
B gegossen und 10 min homogenisiert. Die Lösung vor Gebrauch mindestens
eine Nacht stehen lassen und stets im Dunkeln aufbewahren.
Substrat: |
2,0
g Avicel in 90 ml Puffer |
Puffer: |
0,1
M Na-Citrat-Puffer, pH 4,5 |
Standardlösung: |
2,0
g/l Glucose (Traubenzucker) in dest. Wasser |
Durchführung:
1,5
ml Substratlösung
(unter Rühren
entnehmen!) 10 min. bei 50°C
inkubieren, danach 0,5 ml flüssiges
Enzympräparat
(für den
Blindwert 0,5 ml Puffer) zusetzen. Nach genau 20 min Reaktionszeit
wird das Gemisch im Eisbad abgekühlt,
und 20 min bei 4200 rpm zentrifugiert. 1,0 ml Überstand werden mit 2,0 ml DNSS-Phenol-Reagenz
versetzt und 5 min im siedenden Wasserbad gekocht. Gemisch für ca. 5
min im Eisbad abkühlen
und die Extinktion bei Raumtemperatur und 546 nm messen.
Kalibrierung:
Statt
Substrat- und Enzymlösung
werden 2 ml Standard im Test eingesetzt. Verdünnungen der Standardlösung zur
Erstellung der Kalibriergeraden:
- M(Glucose) = 180 g/mol
- tReaktion = 20 min
6. Bestimmung der Laminarinase-(β-1,3-Glucanase)-Aktivität (Messung
der reduzierenden Zucker)
Testprinzip:
Laminarinase
spaltet die β-1,3-Bindung
zwischen den Glucoseeinheiten innerhalb des Laminarins. Die dabei
freigesetzte Glucose wird mit 3,5-Dinitrosalicylsäure (DNSS)
photometrisch nachgewiesen.
Beim
Erwärmen
von 3,5-Dinitrosalicylsäure
(DNSS) mit reduzierenden Zuckern in alkalischem Medium entsteht
3-Amino-5-nitrosalicylsäure (Gl.
1). Dabei wird eine Nitrogruppe zur Aminogruppe reduziert, während die
Aldehydgruppe des Monosaccharids zur Carboxylgruppe oxidiert (Kakác und
Vejdelek, 1974).
Verschiedene
Zucker ergeben unterschiedliche Färbungen, deren Absorptionsmaximum
zwischen 500 und 550 nm liegt. So können mit diesem Test ebenfalls
Mono-, Di-, Oligo- und Polysaccharide sowie Methylpentosen und O-Methylsaccharide
erfasst werden.
Reagenzien:
DNSS-Phenol-Reagenz:
- Lösung
A:
38,55 g K-Na-tartrat in ein 200 ml Becherglas einwiegen
und in 125 ml dest. Wasser lösen.
In der Lösung werden
dann 2,425 g NaOH (Plätzchen)
gelöst.
- Lösung
B:
1,325 g 3,5-Dinitrosalicylsäure (C7H4N2O7;
2-Hydroxy-3,5-dinitrobenzoesäure)
in einer braunen Schraubflasche in 125 ml dest. Wasser lösen.
- Lösung
C:
1,05 g Phenol in 12,5 ml dest. Wasser lösen. Nacheinander 0,25 g NaOH
(Plätzchen)
und 1,05 g Na2SO4 zugeben
und unter Rühren
lösen.
- Gebrauchslösung:
Lösung A und
Lösung
C werden ohne Nachspülen
in Lösung
B gegossen und 10 min homogenisiert. Die Lösung vor Gebrauch mindestens
eine Nacht stehen lassen und stets im Dunkeln aufbewahren.
Substrat: |
0,5
% Laminarin in 0,1 M Na-Citrat-Puffer, pH 4,5; Puffer auf ca. 40°C erhitzen,
Laminarin unter Rühren zugeben. |
Puffer: |
0,1
M Na-Citrat-Puffer, pH 4,5 |
Standardlösung: |
2,0
g/l Glucose (Traubenzucker) in dest. Wasser. |
Durchführung:
Proben:
0,9
ml Substratlösung
mit 0,1 ml Enzymlösung
mischen; bei 40°C
für 15
min inkubieren, danach sofort in Eisbad stellen. 2,0 ml DNSS-Phenol-Reagenz
dazugeben und 5 min im siedenden Wasserbad kochen. Gemisch für ca. 5
min im Eisbad abkühlen
und die Extinktion bei Raumtemperatur und 546 nm messen.
Blindwerte:
0,9
ml Substratlösung
mit 0,1 ml Wasser mischen. 2,0 ml DNSS-Phenol-Reagenz dazugeben und 5 min im
siedenden Wasserbad kochen. Gemisch für ca. 5 min im Eisbad abkühlen und
die Extinktion bei Raumtemperatur und 546 nm messen.
Standard:
1,0
ml verdünnte
Standardlösung
mit 2,0 ml DNSS-Phenol-Reagenz mischen und 5 min kochen. Gemisch
für ca.
5 min im Eisbad abkühlen
und die Extinktion bei Raumtemperatur und 546 nm messen.
Kalibrierung:
Verdünnungen
der Standardlösung
zur Erstellung der Kalibriergeraden:
- M(Glucose) = 180 g/mol
- tReaktion = 20 min
7. Bestimmung der Xylanase-Aktivität (Messung
der reduzierenden Zucker)
Testprinzip:
Xylanase
spaltet die β-1,4-Bindung
zwischen den Xyloseeinheiten innerhalb eines Xylanmoleküls. Die dabei
freigesetzte Xylose wird mit 3,5-Dinitrosalicylsäure (DNSS) photometrisch nachgewiesen.
Beim
Erwärmen
von 3,5-Dinitrosalicylsäure
(DNSS) mit reduzierenden Zuckern in alkalischem Medium entsteht
3-Amino-5-nitrosalicylsäure (Gl.
1). Dabei wird eine Nitrogruppe zur salicylsäure (Gl. 1). Dabei wird eine
Nitrogruppe zur Aminogruppe reduziert, während die Aldehydgruppe des
Monosaccharids zur Caboxylgruppe oxidiert (Kakác und Vejdelek, 1974).
Verschiedene
Zucker ergeben unterschiedliche Färbungen, deren Absorptionsmaximum
zwischen 500 und 550 nm liegt. So können mit diesem Test ebenfalls
Mono-, Di-, Oligo- und Polysaccharide sowie Methylpentosen und O-Methylsaccharide
erfasst werden.
Reagenzien:
DNSS-Phenol-Reagenz:
- Lösung
A:
38,55 g K-Na-tartrat in ein 200 ml Becherglas einwiegen
und in 125 ml dest. Wasser lösen.
In der Lösung werden
dann 2,425 g NaOH (Plätzchen)
gelöst.
- Lösung
B:
1,325 g 3,5-Dinitrosalicylsäure (C7H4N2O7;
2-Hydroxy-3,5-dinitrobenzoesäure)
in einer braunen Schraubflasche in 125 ml dest. Wasser lösen.
- Lösung
C:
1,05 g Phenol in 12,5 ml dest. Wasser lösen. Nacheinander 0,25 g NaOH
(Plätzchen)
und 1,05 g Na2SO4 zugeben
und unter Rühren
lösen.
- Gebrauchslösung:
Lösung A und
Lösung
C werden ohne Nachspülen
in Lösung
B gegossen und 10 min homogenisiert. Die Lösung vor Gebrauch mindestens
eine Nacht stehen lassen und stets im Dunkeln aufbewahren.
Substrat: |
2,0
g Xylan in 90 ml Puffer |
Puffer: |
0,1
M Na-Citrat-Puffer, pH 4,5 |
Standardlösung: |
2,0
g/l Xylose in dest. Wasser |
Durchführung:
1,5
ml Substratlösung
(unter Rühren
entnehmen!) 10 min bei 50°C
inkubieren, danach 0,5 ml flüssiges Enzympräparat (für den Blindwert
0,5 ml Puffer) zusetzen. Nach genau 20 min Reaktionszeit wird das
Gemisch im Eisbad abgekühlt,
und 20 min bei 4200 rpm zentrifugiert. 1,0 ml Oberstand werden mit
2,0 ml DNSS-Phenol-Reagenz versetzt und 5 min im siedenden Wasserbad
gekocht. Gemisch für
ca. 5 min im Eisbad abkühlen und
die Extinktion bei Raumtemperatur und 546 nm messen.
Kalibrierung:
Statt
Substrat- und Enzymlösung
werden 2 ml Standard im Test eingesetzt. Verdünnungen der Standardlösung zur
Erstellung der Kalibriergeraden:
- M(Xylose) = 150 g/mol
- tReaktion = 20 min