EP1658360A1 - Biotechnologische prozessoptimierung bei der lgewinnung - Google Patents

Biotechnologische prozessoptimierung bei der lgewinnung

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Publication number
EP1658360A1
EP1658360A1 EP04764483A EP04764483A EP1658360A1 EP 1658360 A1 EP1658360 A1 EP 1658360A1 EP 04764483 A EP04764483 A EP 04764483A EP 04764483 A EP04764483 A EP 04764483A EP 1658360 A1 EP1658360 A1 EP 1658360A1
Authority
EP
European Patent Office
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enzyme
activity
oil
olive
enzyme mixture
Prior art date
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EP04764483A
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English (en)
French (fr)
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EP1658360B1 (de
Inventor
Björn-Oliver JACKISCH
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sued Chemie AG
Original Assignee
Sued Chemie AG
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Filing date
Publication date
Application filed by Sued Chemie AG filed Critical Sued Chemie AG
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Application granted granted Critical
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B1/00—Production of fats or fatty oils from raw materials
    • C11B1/02—Pretreatment
    • C11B1/025—Pretreatment by enzymes or microorganisms, living or dead

Definitions

  • the present invention relates to a process for the recovery of oil from olives and / or olive components by using an enzyme or an enzyme mixture.
  • Olive oil is obtained from the fruits of the olive tree (class: Dicotyle- doneae, order: Oleales, family: Oleaceae, type: Olea europaea).
  • the olive fruit (olive) has a rounded, oval cross-section and is a fleshy pome fruit with a bitter taste.
  • the physical and chemical properties of olive fruits depend on many factors, such as variety, degree of ripeness, time of harvest, geographical location or growing conditions. Structurally, the olive fruit can be divided into two essential components, these are the Pericarp and
  • the pericarp includes the epicarp (fruit skin) and the mesocarp (pulp), which enclose the endocarp (wooden core), in which the seed is embedded.
  • the technology used and the type of process control determine, among other things. the yield of olive oil.
  • the olives are, for example, first crushed, e.g. by millstones or hammer mills, followed by a step in which the olive paste is incubated for a certain time (typically 30-90 minutes) with horizontal stirring, optionally with the addition of water, for further comminution and maceration. Oil is then obtained from the suspension obtained, typically by pressure (pressure) and / or by centrifugal force.
  • the first isolation step described above ie in the step into which chopped olives go directly, depending on the method, typically between 50 and 85% of the total oil contained is isolated.
  • the olive mass (olive pulp) obtained after the first isolation step thus still has a significant residual oil content, the reduction of which by or Repetition of the first process step can be carried out several times, possibly by changing certain process parameters such as temperature, applied centrifugal force, water addition etc.
  • the oil isolation can be carried out economically with mechanical-physical methods only up to a certain residual oil content.
  • chemical extractive processes are used. For this purpose, the olive pulp is dried, if necessary extruded and extracted with a solvent such as hexane.
  • the oil is obtained from the extract by removing the solvent, for example by evaporation.
  • the quality of the olive oil is also influenced by the type of process and the process control. It makes economic sense to select such processes that deliver high-quality oil, since the quality is positively correlated with the price to be achieved.
  • the mechanical-physical methods are particularly suitable for this. From environmental and safety aspects too, efforts are being made to avoid chemical-extractive processes as much as possible in favor of mechanical-physical processes.
  • enzymes are functional polypeptides that are able to catalyze the cleavage of defined substrates or the synthesis of certain products. With regard to the process of olive oil production, those enzymes or enzyme mixtures which are capable of degrading certain cellular structures of the olive fruit have been described in the past.
  • endogenous or exogenous enzymes is also from the prior art such as polygalacturonases (EC 3.2.1.15 (endo-) or EC 3.2.1.67 (exo-)), pectin esterases (EC 3.1.1.11), pepsin (EC 3.4.23.1), papain (EC 3.4.22.2), cellulases (EC 3.2 .1.4), ⁇ -amylase (EC 3.2.1.1), proteases (EC 3.4.2x.yz), ß-glucosidases (EC 3.2.1.21), ß-galactosidases (EC 3.2.1.23), arabinosidases (EC 3.2.
  • polygalacturonases EC 3.2.1.15 (endo-) or EC 3.2.1.67 (exo-)
  • pectin esterases EC 3.1.1.11
  • pepsin EC 3.4.23.1
  • papain EC 3.4.22.2
  • cellulases EC 3.2 .1.4
  • ⁇ -amylase EC
  • ⁇ -mannosidases EC 3.2.1.24
  • ß-xylosidases EC 3.2.1.37
  • ß-N-acetylglucoaminidase EC 3.2.1.52
  • -D-galactosidase EC 3.3.1.22
  • pectin lyase EC 4.2.2.10
  • pectate lyase EC 4.2.2.2
  • EP 0 616 024 AI describes a specific process for the production of olive oil from pitted olive fruits using a cellulase.
  • the object of the invention was therefore to provide an improved process for oil production using an enzyme or an enzyme mixture, with the aid of which the yield in the olive oil production process can be significantly increased and the process of oil separation can also be facilitated.
  • a composition or mass of olives or olive components is provided. Any mass of olives or olive constituents familiar to the person skilled in the art can be used here, which will generally be a mass of pre-shredded olives or olive constituents. In principle, various components of the olive fruit can be present in any proportion. Practical oil extraction will usually involve an olive mass or olive pulp that contains the pericarp parts of the olive fruit, ie the epicarp and the mesocarp. It is preferably a mass in which the olives or olive components have already been comminuted by mechanical processes such as grinding.
  • the method according to the invention is particularly well and efficiently suitable for obtaining oil from the mass from olives or olive components in which the kernels have not been removed or separated. Endocarpane parts are also included. This enables a simplified process, whereby a very good oil yield and quality can be achieved.
  • the mass is an already de-oiled mass, i.e. at least the first oil extraction step has already taken place.
  • a stored, pre-oiled olive pulp (sometimes also called "orrujo") is used which has not been subjected to a further separation step in which the seeds and pulp are separated, but which is directly subjected to a further deoiling step.
  • the above mass of olives and / or olive components becomes an enzyme or an enzyme mixture containing at least one Pectin esterase added.
  • the addition can be in any liquid or solid form.
  • an enzyme solution ie a liquid enzyme mixture
  • a concentrated stock solution of the enzyme mixture can be assumed, which is pre-diluted shortly before the addition to the mass.
  • the enzyme can be added at any time, but preferably before or during a step for mixing and / or crushing the mass of olives or olive components.
  • a particularly preferred addition is made in the mixing containers with vertical or horizontal stirring rods.
  • the enzyme (s) and olive mass can be mixed with all the usual means known to those skilled in the art (e.g. stirring), and at the same time (further) comminution of the olives (components) can take place, e.g. in a mill.
  • the optimum enzyme incubation time and temperature in the individual case can easily be determined by the person skilled in the art on the basis of routine tests. As a rule, temperatures between 20 and 60 ° C., preferably 25-55 ° C., in particular 30-50 ° C. and preferably incubation times between 5 to 120 minutes, preferably 10-100 minutes, in particular 30-90 minutes, will lead to good results , However, significantly shorter or longer times can also be useful. A separate incubation phase can also be omitted if necessary.
  • the oil must be separated from the mixture.
  • the oil can be obtained by separating off the oil phase in any manner known to the person skilled in the art, reference also being made to the methods mentioned in the introduction to the description by way of example. It is preferably a mechanical physical process, ie in contrast to the chemical-extractive processes, no solvent such as hexane is added or used to extract the oil.
  • the mass introduced, e.g. the oleaginous olive pulp (in one work step) into a liquid oil phase, an aqueous phase (sometimes called “papilla”) and a partially de-oiled and partially dewatered (solid) suspension (sometimes called “alperujo").
  • a liquid oil phase sometimes called “papilla”
  • a partially de-oiled and partially dewatered (solid) suspension sometimes called “alperujo”
  • the malaxer can particularly preferably be omitted in the process.
  • an improvement in coalescence is brought about solely by the enzymes.
  • the process economy can be significantly increased by the possibility of omitting the malaxers.
  • the advantages of the method for oil production described here are particularly great when the enzyme mixture has a certain composition.
  • a ratio of the activity of the pectin esterase (s) to the activity of the en o-polygalacturonase (s) of at least 0.13 particularly advantageous properties are obtained when extracting oil.
  • a ratio of the activity of the pectin esterase (s) to the activity of the exo-polygalacturonase (s) of at least 0.3 is particularly favorable.
  • a pectin esterase is understood to mean an enzyme from the classification group EC 3.1.1.11.
  • the activity can in principle be determined using standard methods familiar to the person skilled in the art. A method used according to the invention is given in the method part below.
  • the enzyme mixture used according to the invention thus contains at least one PEase (activity).
  • an endo-polygalacturonase means an enzyme from the classification group EC 3.2.1.15.
  • the activity of this enzyme can in principle be determined using standard methods familiar to the person skilled in the art.
  • the method used according to the invention is specified in the method part below (pectic acid (PGA) as substrate).
  • the enzyme mixture used according to the invention thus contains at least one endo-PGase (activity).
  • the ratio of the pectin esterase (PEase) to the activity of the endo-polygalacturonase is at least 0.15, preferably at least 0.16.
  • the enzyme mixture used according to the invention further contains at least one exo-polygalacturonase (exo-PGase, exo-pectinase), the ratio of the activity of the pectin esterase (s) to the activity of the exo-polygalacturonase (s) being at least 0.3.
  • An activity ratio of at least 0.33 is particularly preferred.
  • an exo-PGase is understood to be an enzyme from the classification group EC 3.2.1.67.
  • the activity of this enzyme can in principle be determined using standard methods familiar to the person skilled in the art. A method used according to the invention is given in the method part below.
  • pectin esterase particularly in the simultaneous presence of endo- and exo-PGase (s)
  • digestion is particularly efficient of high molecular weight polysaccharide structures in which the oil to be recovered is "trapped".
  • pectin esterase improves the accessibility of substrates of the endo- and exo-PGase as well as other polysaccharide-cleaving enzymes. Hence, this can also accelerate the degradation of high molecular structures with which the oil to be extracted is associated.
  • exo-PGase catalyzes the release of D-galacturonate monomers from 1, -alpha-D-galacturonide polymers by cleavage of terminal ones
  • pectin is used as a substrate, as with endo-PGase, it is necessary that any methyl acid ester of polygalacturonic acid is first converted into the free acid or its salt so that it is available to the exo-PGase as a substrate.
  • the setting of the (minimum) ratio according to the invention between pectin esterase and exo-PGase is apparently particularly advantageous in this context.
  • the cleavage of the acid esters by the pectin esterase along the polysaccharide chain probably occurs statistically.
  • the chain is made accessible to the endo-PGase as substrate, which then breaks the chain into oligosaccharides.
  • the exo-PGase already performs a final cleavage here, but only until it again finds a methyl acid ester on the chain. A further terminal degradation of the chain could only take place if this methyl acid ester is converted into the acid.
  • the minimum ratio according to the invention between PEase and endo-PGase can ensure that the statistical cleavage of the methyl acid esters by the PEase is coordinated with the exo-PGase activity in such a way that it can work with particularly high performance without restricting the sales due to blocking methyl esters. Further favorable interactions between the above enzyme activities are also conceivable.
  • the ratio of the activity of the pectin esterase to the activity of the endo-polygalacturonase is particularly preferably not greater than about 1, in particular about 0.5, and the ratio of the activity of the pectin esterase to the activity of exo-polygalacturonase is not greater than about 1, in particular about 0.6.
  • the enzyme mixture used also contains at least one laminarinase ( ⁇ -1,3-glucanase).
  • this is understood to mean an enzyme from the classification group EC 3.2.1.39.
  • the activity of this enzyme can in principle be determined using standard methods familiar to the person skilled in the art. A method used according to the invention is given in the method part below.
  • the ratio of the activity of the pectin esterase to the activity of the laminarinase is preferably at least 20, preferably at least 30.
  • the enzyme mixture used also contains at least one cellulase, in particular a Cl cellulase.
  • the activity of this enzyme can in principle be determined using standard methods familiar to the person skilled in the art. A method used according to the invention is given in the method part below.
  • the ratio of the activity of the PEase to the activity of the Cl cellulase is particularly preferably at least 75, preferably at least 100.
  • the enzyme mixture used thus comprises at least six different individual activities, the preferred ratios of the individual activities having a surprisingly positive effect on the oil yield obtained and phase separability.
  • the preferred enzyme activities are listed again below: exo-polygalacturonase (EC 3.2.1.67) endo-polygalacturonase (EC 3.2.1.15) pectin lyase (EC 4.2.2.10) pectin esterase (EC 3.1.1.11) Cl-cellulase (EC 3.2.1.91) laminarinase (EC 3.2.1.39)
  • further components can also be contained in the enzyme mixture according to the invention.
  • the enzymatic components of the enzyme mixture for example further cells or.
  • Degrading enzymes may be present in cell wall structures, such as, but not limited to, xylanase (s) (EC 3.2.1.8) or proteolytic enzymes (see introduction to the description and list of enzymes before the method part; according to an embodiment of the invention not contained in the enzyme mixture).
  • Further components in the mixture of the olive mixture and the enzyme mixture are also not excluded.
  • additives are known to the person skilled in the art and include, for example, salts, cofactors, inhibitors or activators for enzymes, stabilizers such as glycerol, etc.
  • the enzyme mixture used according to the invention is particularly advantageous for increasing the yield in the extraction of olive oil from olive fruits or their components, particularly in mechanical-physical extraction processes.
  • the following enzyme activities are particularly preferred and can be determined as indicated in the method part below: a. Pectin esterase: more than 300 U / ml, especially more than 320 U / ml b. exo-polygalacturonase: less than 1000 U / ml c. endo-polygalacturonase: between 1500 and 2500 U / ml, i.e. Laminarinase: less than 15 U / ml, especially less than 12 U / ml e. Cl cellulase: less than 3.3 U / ml f. Pectin lyase: between about 25,000 and 150,000 U / ml
  • the individual enzymes are commercially available (e.g. Sig-a-Aldrich Chemie GmbH, Kunststoff, DE). Exemplary enzyme sources are given below before the method part. However, enzymes from other sources can of course also be used as long as they have the corresponding activity indicated above. According to a preferred embodiment, the enzymes are obtained from cultures or the culture supernatant from microorganisms, in particular from bacteria and fungi, including yeasts. A preferred source are cultures of Aspergillus, in particular Aspergillus niger strains, which have several or even all of the enzyme activities contained in the enzyme mixture according to the invention.
  • At least 50 ml, in particular between approximately 50 and 400 ml, preferably between 100 and 300 ml, particularly preferably between 125 and 250 ml of the above-mentioned enzyme mixture per ton of mass are particularly preferably used according to the invention.
  • preferably between 100 and 175 ml, in particular between 125 and 150 ml, of the above enzyme mixture per ton of mass are advantageous.
  • the expression enzyme mixture is also to be used in the present description in the case of using only one enzyme (PEase).
  • the protein or enzyme concentration in the enzyme mixture used is preferably between about 2 and 20 mg / 1, preferably 2 and 12 mg / ml, in particular 3 and 10 mg / 1.
  • the protein con- concentration can be determined photometrically using standard methods. From this, the preferred absolute total activities of the individual enzymes contained per ton of the mass of olives or olive components can easily be calculated.
  • the present invention relates to the use of an enzyme mixture as defined above for the treatment of masses from olives or olive components, in particular from pre-de-oiled masses in the production of oil.
  • the use in physical or mechanical-physical oil production has surprisingly been found to be particularly advantageous. As stated at the outset, higher-quality oils can be obtained with these processes, so that the oil yield increased according to the present invention is particularly worthwhile.
  • pectin can also be used as the substrate instead of pectic acid (PGA). In this way, an overall activity of the pectin-degrading enzymes can be determined.
  • PGA pectic acid
  • the present invention therefore also relates to a composition
  • a composition comprising a mass of olives or olive constituents and an enzyme mixture, in which the ratio of the PEase to the total activity of the pectin-degrading enzymes in the enzyme mixture, as determined above, in the enzyme mixture is at least 0.035, preferably at least 0.04 , in particular 0.05.
  • the total activity of the pectin-degrading enzymes is preferably less than 8000 U / ml, in particular less than 7000 U / ml.
  • the activity values of the other enzymes are preferably as indicated above.
  • the activity ratios of PEase to exo-PGase, from PEase to laminarinase and from PEase to Cl-cellulase are also preferably as stated above.
  • the same amounts of enzyme mixture as described above can be used.
  • Another aspect of the invention relates to the use of an enzyme mixture as set out above in one of the methods described here for treating masses from olives or olive constituents or in a method for extracting oil.
  • the solid / liquid separation in oil production can be improved.
  • a preferred use here relates to the deoiling of a pre-deoiled mass from olives or olive components.
  • the solid / liquid separation is carried out exclusively with the aid of at least one three-phase decanter.
  • the oil yield in the solid / liquid separation is increased, the oil content of the aqueous outlet from the three-phase decanter is reduced, the amount of water removed in the aqueous outlet is increased and / or the oil and / or water content is reduced with the aid of of the solid phase obtained from the three-phase decanter.
  • a parameter that defines the quality of an oil is e.g. B. the acidity.
  • the oil manufacturers strive to keep this as low as possible. It can also be observed that - as described above - the oil yield is increased by sharp centrifugation, but in this way undesirable by-products also enter the oil. These by-products slowly settle out as sediment. It can be stated that the oil manufacturers endeavor to keep the volume of this sediment as small as possible, the texture as uniform as possible and the color as neutral as possible.
  • the parameters mentioned are positively influenced with the aid of the present invention.
  • the present invention thus relates to the use of an enzyme mixture as defined herein in the process according to the invention described here for improving the quality of the oil obtained, in particular the reduction in the acid content, the reduction in the concentration of conjugated dienes or trienes, the reduction in peroxidic Substances, the reduction of sterols or waxes and / or the reduction of the free fatty acid content in the oil obtained.
  • a further preferred use is characterized in that the treatment with the enzyme composition according to the invention does not adversely affect the cholesterol content, Brassicasterol, 'Stigmasterol, ⁇ -Stigmasterol and Trilinolein takes place.
  • niger EC 3.2.1.1 amylase e.g. from Sigma-Aldrich, catalog no. A6211, from A. oryzae EC 3 4.2x.yz proteases, eg pepsin and papain, so EC 3 2.1.21 ß-glucosidase, eg Sigma-Aldrich, catalog no. G6906, recombinant EC 3.2.1.22 ⁇ -galactosidase, e.g. from Sigma-Aldrich, catalog no. G4408, from A. niger EC 3.2.1.23 ⁇ -galactosidase, e.g. from Sigma-Aldrich, catalog no. G3522, from A.
  • exo-polygalacturonase activity Measurement of the reducing sugars
  • exo-polygalacturonase cleaves galacturonic acid units from saponified citrus pectin, which can be detected photometrically due to the reducing aldehyde groups after reaction with 3,5-dinitrosalicylic acid (DNSS).
  • DNSS 3,5-dinitrosalicylic acid
  • This test can also be used to measure mono-, di-, oligo- and polysaccharides as well as methyl pentoses and O-methyl saccharides.
  • Solution A Weigh 38.55 g K-Na-tartrate in a 200 ml beaker and in 125 ml dist. Dissolve water, 2.425 g NaOH (cookies) are dissolved in the solution.
  • Solution B 1.325 g 3, 5-dinitrosalicylic acid (C 7 H 4 N 2 ⁇ 7 ; 2-hydroxy-3, 5-dinitrobenzoic acid) in a brown screw-top bottle in 125 ml dist. Dissolve water.
  • Solution C 1.05 g phenol in 12.5 ml dist. Dissolve water. Add 0.25 g NaOH (cookies) and 1.05 g Na 2 S0 4 in succession and dissolve with stirring.
  • Solution A and solution C are poured (without rinsing) into solution B and homogenized for 10 min. Allow the solution to stand for at least one night before use and always keep it in the dark.
  • Substrate Solution
  • a 250 ml bottle is set in a water bath at 35 ° C and stirrer with a stirrer motor fastened in it.
  • 2.2 g of more than 80% esterified citrus pectin (from Herbstreith and Fox KG, Pectin Classic CF 201, 00302026 from 30.04.03) are wetted with 4 ml of pure alcohol with slow stirring. With a strong stirring movement, 50 ml of dist. Pour water into the middle of the stirring suction and stir for another 20 minutes. Make sure that a smooth, viscous solution without lumps is created. Then 20 ml of 0.5 N sodium hydroxide solution are rapidly added dropwise over a period of 5 minutes, taking the time for saponification.
  • the contents of the beaker are then transferred to a 100 ml measuring cylinder while rinsing with buffer solution. After the solution has cooled to 20 ° C., the volume is made up to 100 ml with citrate buffer pH 4.4. Before use, the finished pectic acid solution is filtered over glass wool.
  • a specific endo-PGase unit corresponds to the reciprocal of the amount of enzyme in g multiplied by 100 ml, which in 30 min lowers the viscosity (water value) of 1 liter of a 2.2% pectic acid solution *) by 3/5; (to rel. viscosity 0.40), at 30 ° C and at an optimum pH of 4.4.
  • Apparatus a) Ostwald viscometer 30 ml; Water value approx. 40 seconds in a water bath at 30 ° C. b) Ultra thermostat with water bath and hanging device for test tubes c) Water bath with hanging immersion thermostat d) Stirrer motor with paddle stirrer e) Beakers 600 and 800 ml f) volumetric flasks 100 and 500 ml g) calibrated full pipette, 3, 20 and 30 ml h) test tubes 18 x 180 mm i) feeding bottle, glass frit with rubber sleeve and glass wool, measuring cylinder 100 and 250 ml j) stopwatches , Division 0.1 sec. K) pH device and glass electrode and 1) magnetic stirrer with sticks
  • Base solution 21.01 g citric acid monohydrate in a 1 liter volumetric flask in approx. 100 ml dist. Dissolve water. Pipette in 200 ml of 1N sodium hydroxide solution and mix well, fill up to the calibration mark.
  • Ready-to-use-solution About 350 ml of the basic release ring are placed in an 800 ml beaker and a glass electrode with a connected pH device is immersed. With stirring (magnetic Stirrer) is now slowly added 0.1 N hydrochloric acid until the pH of 4.4 is reached.
  • each of the freshly prepared pectic acid solution are pipetted from full pipettes into test tubes and heated to 30 ° C for about 5 minutes before fermentation in an ultra-thermostat for test tubes.
  • the ferment addition of 3 ml (blow out the full pipette) to the 30 ml tempered pectic acid solution is carried out by pressing a stopwatch.
  • the corresponding enzyme solutions are added every 4 minutes. After a fermentation time of less than 30 minutes at 30 ° C, the reaction sample is removed from the water bath and filled into the Ostwald viscometer, which is also heated to 30 ° C.
  • the solution in the viscometer is immediately sucked up in such a way that it passes the upper mark exactly 30 minutes after the start of fermentation in the outlet.
  • the throughput time between the calibration marks is stopped with a second stopwatch and registered as the final viscosity. In the case of several ferment samples, the interval of 4 min between each measurement must also be strictly observed.
  • the initial viscosity is determined in the same viscometer by measuring the throughput time of 30 ml pectic acid solution at 30 ° C, but now adding 3 ml citrate buffer solution pH 4.4 instead of ferment solution.
  • the initial viscosity should be determined immediately before the final viscosity. If a whole series of enzyme samples is examined, the initial viscosity is determined immediately before and after the measurement series and the average value is taken. Evaluation:
  • the relative viscosity of the fermented solution corresponds to the ratio of final viscosity (water value) to initial viscosity (water value)
  • the value of the relative viscosity should be between 0.36 - 0.45. If this is not the case, the measurement must be repeated with a correspondingly changed amount of enzyme.
  • the activity can be estimated using the "calibration curve over a wide range" and the units calculated with it can be used as a guideline.
  • the viscosity test is carried out with different concentrations of a standard enzyme (Panzym Combi 285/12, Boehringer Ingelheim).
  • the enzyme concentration which leads to a relative viscosity of 0.40, is equated with the curve value of 1.100.
  • apple pectin (Sigma, catalog no. P8471) was used in the above regulation instead of pectic acid (PGA). This enables a parallel viscosimetric activity determination of the following enzyme activities: pectin esterase, pectin lyase, endo- and exo-polygalacturonase.
  • apple pectin B (citrus pectin from Herbstreith & Fox KG no.
  • the increase in absorbance should be between 0.005 and 0.05 per minute at the beginning of the rection, otherwise the measurement must be repeated with more or less diluted enzyme solution.
  • the lyase activity results from the measured extinction increase values per minute ( ⁇ Ext.) At the start of the reaction:
  • V F dilution factor
  • a specific pectin esterase unit corresponds to the amount of enzyme in g, which cleaves one micro equivalent of methyl ester groups in a pectin solution containing 550 mg of highly-esterified citrus pectin at 30 ° C and the pH optimum of 4.4 in one minute , Principle:
  • Apparatus pH device with glass electrode and titrator, water bath with immersion thermostat, stirrer motor with paddle stirrer, 2 micro burettes, 10 ml, automatic volumetric flask, 100 ml, 1 liter full pipette, 10 ml, 100 ml beakers, 200 ml, 1 liter stopwatch, 1 liter suction bottle; Glass frit with rubber sleeve glass wool or Microlith glass filter fleece type OR 80 N (Glastechnik Schuller, Westheim)
  • the finished pectin solution is filtered over glass wool.
  • a beaker (200 ml) is attached so that half of it is immersed in it. 20 ml of the pectin solution are added to the beaker and the temperature is controlled for exactly 15 minutes.
  • a glass electrode connected to a pH meter with a titrator is attached in such a way that it is immersed in the beaker in the pectin solution.
  • a paddle stirrer and the two leads of the car burettes with 0.1 N and 0.01 N NaOH were installed.
  • the amount of 0.01 N NaOH used should be between 1.6 and 4 ml. If this is not the case, the measurement must be repeated with a correspondingly changed amount of enzyme or dilution.
  • M molarity of the titration solution [ ⁇ mol / ml]
  • DNSS 3, 5-dinitrosalicylic acid
  • DNSS phenol reagent Solution A: Weigh 38.55 g K-Na-tartrate in a 200 ml beaker and in 125 ml dist. Dissolve water. 2.425 g of NaOH (cookies) are then dissolved in the solution.
  • Working solution Solution A and solution C are poured into solution B without rinsing and homogenized for 10 min. Allow the solution to stand for at least one night before use and always keep it in the dark.
  • Buffer 0.1 M Na citrate buffer, pH 4.5
  • Calibration lines c (glucose) standard solution. least. Water in g / 1 in ⁇ l in ⁇ l 0.1 100 1900 0.125 120 1880 0.16 160 1840 0.22 220 1780 0.24 240 1760 0.28 280 1720 0.3 300 1700
  • Laminarinase cleaves the ⁇ -1,3 bond between the glucose units within the laminarin.
  • the glucose released is detected photometrically with 3, 5-dinitrosalicylic acid (DNSS).
  • DNSS 3, 5-dinitrosalicylic acid
  • 3-amino-5-nitrosalicylic acid is formed (Eq. 1).
  • a nitro group is reduced to the amino group, while the aldehyde group of the monosaccharide oxidizes to the carboxyl group (Kalac and Vejdelek, 1974).
  • DNSS phenol reagent Solution A: Weigh 38.55 g K-Na-tartrate in a 200 ml beaker and in 125 ml dist. Dissolve water. 2.425 g of NaOH (cookies) are then dissolved in the solution.
  • Solution B 1.325 g 3, 5-dinitrosalicylic acid (C 7 H 4 N 2 0; 2-hydroxy-3, 5-nitrobenzoic acid) in a brown screw-top bottle in 125 ml dist. Dissolve water.
  • Solution C 1.05 g phenol in 12.5 ml dist. Dissolve water. Add 0.25 g NaOH (cookies) and 1.05 g Na2S04 in succession and add Loosen stirring.
  • Working solution Solution A and solution C are poured into solution B without rinsing and homogenized for 10 min. Allow the solution to stand for at least one night before use and always keep it in the dark.
  • Buffer 0.1 M Na citrate buffer, pH 4.5
  • Standard solution 2.0 g / 1 glucose (glucose) in dist. Water.
  • Xylanase cleaves the ⁇ -1,4 bond between the xylose units within a xylan molecule.
  • the released xylos is detected photometrically with 3, 5-dinitrosalicylic acid (DNSS).
  • DNSS 3, 5-dinitrosalicylic acid
  • Eq. 1 3-amino-5-nitrosalicylic acid is formed (Eq. 1).
  • a nitro group is reduced to the amino group, while the aldehyde group of the monosaccharide oxidizes to the caboxyl group (Ka tanninc and Vejdelek, 1974).
  • DNSS phenol reagent Solution A: Weigh 38.55 g K-Na-tartrate in a 200 ml beaker and in 125 ml dist. Dissolve water. 2.425 g of NaOH (cookies) are then dissolved in the solution.
  • Solution B 1.325 g 3, 5-dinitrosalicylic acid (C 7 H 4 N 2 0 7 ; 2-hydroxy-3, 5-nitrobenzoic acid) in a brown screw-top bottle in 125 ml dist. Dissolve water.
  • Solution C 1.05 g phenol .in 12.5 ml dist. Dissolve water. Successively Add 0.25 g NaOH (cookies) and 1.05 g Na 2 S0 4 and dissolve with stirring.
  • Working solution Solution A and solution C are poured into solution B without rinsing and homogenized for 10 min. Allow the solution to stand for at least one night before use and always keep it in the dark.
  • Buffer 0.1 M Na citrate buffer, pH 4.5
  • Lipase activity is determined using the pH-Stat method. Triolein is used as the substrate.
  • a substrate solution (30 ml) consisting of 2% w / v gum arabic, 5% v / v substrate in water is prepared and emulsified with a homogenizer. 1 ml of enzyme solution is added. The acid released in the reaction is back-titrated with 0.01 M sodium hydroxide solution in order to keep the pH constant. The amount of acid released and consequently the activity of the enzyme are calculated from the amount of NaOH.
  • the enzyme solution is then replaced by distilled water. The measurements are carried out three times at 37 ° C and pH 7.5. The activity values obtained in U / ml are converted to the total composition of olives or olive components and enzyme mixture (ie the activity in the enzyme mixture already used for oil production).
  • the phospholipase C activity is carried out using p-nitrophenylphosphorylcholine as the test substance.
  • 50 ⁇ l of enzyme solution are added to 50 ⁇ l of a p-nitrophenylphosphorylcholine solution (100 mM in 50 mM Borax-HCl, pH 7.5).
  • the p-nitrophenol resulting from the hydrolysis of p-nitrophenylphosphorylcholine is measured at 410 nm on a photometer.
  • the enzyme solution is replaced by distilled water.
  • a calibration curve can be created by preparing suitable dilutions and measuring these solutions at 410 nm in the photometer. Each measurement is carried out three times. The activity values obtained in U / ml are converted to the enzyme mixture. If p-nitrophenyl-phosphorylcholine is not cleaved by the enzyme solutions, there is no phospholipase C activity.
  • the yield was 1.11% (w / w) or 270% of the comparison sample, with the addition of 50 ⁇ l of the enzyme mixture according to the invention the yield was 1.14% (w / w) or 278% of the comparison sample, with the addition of 100 ⁇ l of the enzyme mixture according to the invention was 1.26% (w / w) or 307% of the comparison sample and when 200 ⁇ l of the enzyme mixture according to the invention was added the yield was 1.45% (w / w) or 354% of the comparison sample.
  • Example 2 laboratory test, for explanation
  • the relative oil yield without enzyme addition was 2.5 ⁇ 0.1% (w / w), with the addition of 150 ⁇ l of the enzyme mixture according to the invention (see above) the relative yield was 4.0 ⁇ 0.2% ( w / w) or 163.6 ⁇ 4.2% (w / w) of the comparison sample, with the addition of 250 ⁇ l of the enzyme mixture according to the invention, the relative yield was 4.3 + 0.2% (w / w) or 177, 3 ⁇ 3.9% (w / w) of the comparison sample, with the addition of 350 ⁇ l of the enzyme mixture according to the invention, the relative yield was 4.8 + 0.1% (w / w) or 195.5 + 2.0% ( w / w) of the comparison sample and with the addition of 450 ⁇ l of the enzyme mixture according to the invention, the relative yield was 4.9 ⁇ 0.1% (w / w) or 200.0 ⁇ 2.0% (w / w) of the comparison sample.
  • Example 3 (industrial test, pilot plant, for explanation)
  • the residual oil content was determined by Soxhlet extraction (Spanish standard UNE 55030), the moisture content was determined by drying at 110 ° C to constant weight.
  • the relative oil yield from the second pressing results from the calculation of the difference between the residual oil content in the raw mass after the first step and the equivalent residual oil content after the second step, divided by the residual oil content from the first step.
  • Example 4 (industrial test, industrial plant, "stored”, for explanation)
  • the oil was separated by solid / liquid in a horizontal two-phase decanter (model SPI7 Pieralisi, mass flow 2500-2725 kg / h) and liquid / liquid separation in a centrifuge (model P2000 Pieralisi) with the addition of 300 1 / h water with a Temperature of 38 ° C isolated.
  • the oil isolated in the parallel batches was then stored and the yield was determined by reading a level indicator in the storage containers, 1 cm level difference corresponding to an oil quantity of 95.26 kg.
  • PEase PEase: PEase:
  • Example 6 Reduction of the oil content of the aqueous decanter effluent as a function of the process temperature; Increase in oil yield
  • Pre-deoiled olive pulp was continuously fed from a storage basin to a mixing container with a vertical stirring rod.
  • the performance of this mixing container was 25 mt / h with an average residence time of 60 min.
  • the pulp was heated to a temperature of 45 ° C.
  • the olive pulp was conveyed from this mixing container into a mixing container with a horizontal stirring rod (type Pieralisi Kneader 900 4 basins). With a medium The retention time of 40 minutes was the throughput of this process unit 11 t / h.
  • the olive pulp was conveyed from this horizontal mixing bath to two three-phase decanters of the Pieralisi Giant 2 type. These decanters had a nominal throughput of about 7 mt of olive pulp per hour, but were adjusted to the mass flows specified by the process.
  • the results described below come from the analysis of samples that were taken from the aqueous outlet (papilla) of both decanters.
  • Results for the following parameters were determined when analyzing the samples: water content papilla and oil content papilla.
  • the results for the addition of 80, 160 and 240 ml / mt of the enzyme mixture according to the invention are summarized in Tables 1, 2 and 3 below.
  • the addition of 160 ml of the enzyme mixture according to the invention per ton of olive pulp has a particularly advantageous effect in relation to the water and oil content of the papilla and the oil yield.
  • a positive effect based on the parameters mentioned is also achieved by adding 80 ml of the enzyme mixture according to the invention, but here a temperature increase of 8 ° C. was carried out in parallel in comparison with the tests with 160 ml / t.
  • Pre-deoiled olive pulp was continuously fed from a storage basin to a mixing container with a vertical stirring rod.
  • the performance of this mixing container was 25 mt / h with an average residence time of 60 min.
  • the olive pulp was conveyed directly to three-phase decanters (Pieralisi, type Giant 2) without the interposition of a mixing container with a horizontal stirring rod.
  • These decanters had a nominal throughput of about 7 mt of olive pulp per hour, but were adjusted to the mass flows specified by the process.
  • the results described below come from the Analysis of samples taken directly from any decanter of your choice.
  • the temperature of the olive pulp in the process was 32 ° C.
  • the addition of 160 ml of the enzyme mixture according to the invention per ton of olive pulp has a particularly advantageous effect in relation to the economy of the overall process.
  • a positive effect based on the overall process economy is also achieved by adding 240 ml of the enzyme mixture according to the invention, although not as pronounced as when adding 160 ml.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Gewinnung von Öl aus Massen aus Oliven und/oder Olivenbestandteilen, umfassend die folgenden Schritte: Bereitstellen einer Masse aus 0liven oder Olivenbestandteilen, ohne Entfernung der Olivenkerne; Zugabe eines Enzyms oder einer Enzymmischung enthaltend mindestens eine Pektinesterase in flüssiger oder fester Form; Vermischen der Masse und der Enzymmischung; Abtrennen der Ölphase von der Masse mit Hilfe eines Dreiphasen-Dekanters. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die vorteilhafte Verwendung einer entsprechenden Enzymmischung in einem solchen Verfahren zur Ölgewinnung.

Description

Patentanmeldung
Bio echnologische Pro zes soptimierung bei der Öl- ge innung
Die vorliegende Erfindung betriff ein Verfahren zur Gewinnung von Öl aus Massen aus Oliven und/oder Olivenbestandteilen unter Verwendung eines Enzymes oder einer Enzymmischung.
Olivenöl wird aus den Früchten des Olivenbaums (Klasse: Dicotyle- doneae, Ordnung: Oleales, Familie: Oleaceae, Art: Olea europaea) gewonnen. Die Olivenfrucht (Olive) hat eine rundliche, im Querschnitt ovale Form und ist eine fleischige Kernfrucht mit bitterem Geschmack. Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Olivenfrüchte hängen von vielen Faktoren, wie z.B. Sorte, Reifegrad, Erntezeitpunkt, geographische Lage oder Wachstumsbedingungen ab. Strukturell kann die Olivenfrucht in zwei wesentliche Bestandteile gegliedert werden, diese sind das Pericarp und
das Endocarp. Das Pericarp umfasst das Epicarp (Fruchthaut) und das Mesocarp (Pulpe) , die das Endocarp (hölzerner Kern) umschließen, in welches wiederum der Samen eingebettet ist.
Die Gewinnung von Öl aus den Olivenfrüchten ist von großer wirtschaftlicher Bedeutung. Nach Angaben des internationalen Olivenölrates (International Olive Oil Council, IOOC) wird für das Produktionsjähr 2003/2004 eine weltweite Gesamtmenge von mehr als 2,8 Millionen Tonnen Olivenöl erwartet. Diese Menge wird mit den unterschiedlichsten technologischen Methoden dargestellt und beinhaltet verschiedene Qualitäten. Eine Unterteilung der Gewinnungsmethoden in zwei Prinzipien ist möglich, nämlich zu einem in die mechanisch-physikalische Technologie wie z.B. Pressung, Per- kolation sowie Zwei- oder Drei-Phasen-Verfahren und zum anderen in Lösungsmittel-basierte Verfahren als chemisch-extraktive Technologie.
Die verwendete Technologie und die Art der Prozessführung bestimmt u.a. die Ausbeute an Olivenöl. Zur Verarbeitung in mechanisch-physikalischen Verfahren werden die Oliven beispielsweise zunächst zerkleinert, z.B. durch Mühlsteine oder Hammermühlen, gefolgt von einem Schritt, in dem die Olivenpaste für eine gewisse Zeit (typischerweise 30-90 Minuten) unter horizontalem Rühren, ggf. unter Zusatz von Wasser, zur weiteren Zerkleinerung und Mazerierung inkubiert wird. Anschließend erfolgt eine Gewinnung von Öl aus der erhaltenen Suspension, typischerweise durch Druck (Pressung) und/oder durch Zentrifugalkraft.
Im vorstehend beschriebenen ersten Isolierungsschritt, d.h. bei dem Schritt, in den zerkleinerte Oliven direkt eingehen, werden je nach Verfahren typischerweise zwischen 50 und 85% des gesamten enthaltenen Öls isoliert. Die nach dem ersten Isolierungsschritt erhaltene Olivenmasse (Olivenpulpe) weist somit noch einen signifikanten Rest-Ölgehalt auf, dessen Reduktion durch ein- oder mehrfache Wiederholung des ersten Prozessschrittes herbeigeführt werden kann, ggf. unter Veränderung bestimmter Prozessparameter wie z.B. Temperatur, angelegte Zentrifugalkraft, Wasserzusatz etc.. Jedoch kann die Ölisolierung mit mechanisch-physikalischen Methoden ökonomisch sinnvoll nur bis zu einem bestimmten Restöl- gehalt durchgeführt werden. Um den Restölgehalt weiter zu senken und somit die Ölausbeute zu erhöhen, wird daher auf chemischextraktive Verfahren zurückgegriffen. Hierzu wird die Olivenpulpe getrocknet, ggf. extrudiert und mit einem Lösungsmittel wie z.B. Hexan extrahiert. Das Öl wird aus dem Extrakt durch Entfernen des Lösungsmittels, z.B. durch Verdampfen gewonnen. Neben der Ausbeute wird außerdem die Qualität des Olivenöls von der Art des Verfahrens und der Prozessführung beeinflusst. Ökonomisch sinnvoll ist die Auswahl solcher Verfahren, die qualitativ hochwertiges Öl liefern, da die Qualität positiv mit dem zu erzielenden Preis korreliert ist. Besonders sind hierzu die mechanischphysikalischen Verfahren geeignet. Auch aus Umwelt- und Sicherheitsaspekten ist man bestrebt, zu Gunsten der mechanischphysikalischen Verfahren auf chemisch-extraktive Verfahren so weit wie möglich zu verzichten.
Aus der Literatur ist auch die Anwendung von Enzymen bekannt. Enzyme sind funktionelle Polypeptide, die in der Lage sind, die Spaltung definierter Substrate oder die Synthese bestimmter Produkte zu katalysieren. Bezugnehmend auf den Prozess der Olivenölgewinnung wurden in der Vergangenheit bevorzugt solche Enzyme o- der Enzymmischungen beschrieben, die in der Lage sind, degradierend auf bestimmte zelluläre Strukturen der Olivenfrucht zu wirken.
Der Einsatz zellwanddegradierender Enzyme in der Olivenölgewinnung wurde bereits 1954 von de Soroa y Pineda (de Soroa y Pineda, J. M. (1954) Oleagineux 9, 865-868. Emploi des enzymes dans l'extraction de l'huile d' olive.) beschrieben. Aus dem Stand der Technik ist weiterhin der Einsatz endogener oder exogener Enzyme wie Polygalacturonasen (EC 3.2.1.15 (endo-) oder EC 3.2.1.67 (exo-)), Pektinesterasen (EC 3.1.1.11), Pepsin (EC 3.4.23.1), Papain (EC 3.4.22.2), Cellulasen (EC 3.2.1.4), α-Amylase (EC 3.2.1.1), Proteasen (EC 3.4.2x.yz) , ß-Glucosidasen (EC 3.2.1.21) , ß-Galactosidasen (EC 3.2.1.23), -Arabinosidasen (EC 3.2.1.55), α-Mannosidasen (EC 3.2.1.24) , ß-Xylosidasen (EC 3.2.1.37) 'ß-N- Acetylglucoaminidase (EC 3.2.1.52), -D-Galactosidase (EC 3.3.1.22), Pektin-Lyase (EC 4.2.2.10) und Pektat-Lyase (EC 4.2.2.2) bekannt. Die angegebenen EC-Nummern beziehen sich auf die Enzymnomenklatur gemäß der Recommendations of the Nomen- clature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the Nomenclature and Classification of En- zyme-Catalysed Reactions (www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/ enzyme) . Die EP 0 616 024 AI beschreibt ein spezifisches Verfahren zur Gewinnung von Olivenöl aus entkernten Olivenfrüchten unter Verwendung einer Cellulase.
Jedoch sind die in der Literatur beschriebenen Systeme insofern nicht optimal, da sie die Ölausbeute bei der Gewinnung von Olivenöl nur verhältnismäßig geringfügig erhöhen. Weiterhin fehlt eine biotechnologische Prozessoptimierung des Ölgewinnungsverfah- rens, insbesondere im Hinblick auf vorentölte Olivenmassen.
Aufgabe der Erfindung war es daher, ein verbessertes Verfahren zur Ölgewinnung unter Verendung eines Enzyms bzw. einer Enzymmischung bereitzustellen mit dessen Hilfe die Ausbeute im Prozess der Olivenölgewinnung signifikant erhöht und der Prozess der Öl- abtrennung zudem erleichtert werden kann.
Beschreibung der Erfindung
Diese Aufgabe wird durch das Verfahren gemäß Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen angegeben . Bereitgestellt wird zunächst eine Zusammensetzung bzw. Masse aus Oliven oder Olivenbestandteilen. Dabei kann jede dem Fachmann geläufige Masse aus Oliven oder Olivenbestandteilen verwendet werden, wobei es sich in der Regel um eine Masse aus vorzerkleinerten Oliven oder Olivenbestandteilen handeln wird. Prinzipiell können darin verschiedene Bestandteile der Olivenfrucht in beliebigen Anteilen vorhanden sein. Bei der praktischen Ölgewinnung wird es sich in der Regel um eine Olivenmasse bzw. Olivenpulpe handeln, die die Pericarpanteile der Olivenfrucht, d.h. das Epi- carp und das Mesocarp enthält. Vorzugsweise handelt es sich um eine Masse, in der die Oliven bzw. Olivenbestandteile bereits durch mechanische Verfahren wie Vermählen zerkleinert sind. Überraschend wurde gefunden, dass sich das erfindungsgemäße Verfahren besonders gut und effizient zur Gewinnung von Öl aus Masse aus Oliven oder Olivenbestandteilen eignet, bei denen die Kerne nicht entfernt bzw. abgetrennt wurden. Es sind also auch Endocarpantei- le enthalten. Dies ermöglicht ein vereinfachtes Verfahren, wobei eine sehr gute Ölausbeute und -qualität erzielt werden kann.
Weiterhin kann es sich um eine Masse vor oder nach der ersten Entölung (Ölgewinnung) handeln. Es hat sich jedoch überraschend gezeigt, dass besonders gute Ergebnisse im Rahmen der vorliegenden Erfindung erhalten werden, wenn es sich bei der Masse um eine bereits vorentölte Masse handelt, d.h. zumindest der erste Ölge- winnungsschritt bereits erfolgt ist. Nach einer besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird dabei eine gelagerte, vorentölte Olivenpulpe (manchmal auch "Orujo" genannt) eingesetzt, die nicht einem weiteren Trennschritt unterzogen wurde, bei dem Kerne und Pulpe getrennt werden, sondern die direkt einem weiteren Entölungsschritt unterzogen wird.
Der vorstehenden Masse aus Oliven und/oder Olivenbestandteilen wird ein Enzym oder eine Enzymmischung enthaltend mindestens eine Pektinesterase zugesetzt. Die Zugabe kann in beliebiger flüssiger oder fester Form erfolgen. Aus Gründen der Dosierbarkeit wird sich jedoch die Herstellung einer Enzymlösung, d.h. einer flüssigen Enzymmischung vor der Zugabe zu der Masse aus Oliven oder Olivenbestandteilen empfehlen. Dabei kann z.B. von einer konzentrierten Stammlösung der Enzymmischung ausgegangen- werden, die kurz vor der Zugabe zur Masse vorverdünnt wird. Die Enzymzugabe kann zu einem beliebigen Zeitpunkt erfolgen, vorzugsweise jedoch vor oder während einem Schritt zur Durchmischung und/oder Zerkleinerung der Masse aus Oliven bzw. Olivenbestandteilen. Eine besonders bevorzugte Zugabe erfolgt in den Mischbehältern mit vertikalem oder horizontalem Rührgestänge.
Allgemein kann das Vermischen von Enzym(en) und Olivenmasse mit allen üblichen und dem Fachmann geläufigen Mitteln (z.B. Rühren) erfolgen, wobei auch gleichzeitig eine (weitere) Zerkleinerung der Oliven (bestandteile) erfolgen kann, z.B. in einer Mühle.
Die im Einzelfall optimale Enzyminkubationszeit und -temperatur kann vom Fachmann einfach anhand routinemäßiger Versuche bestimmt werden. In der Regel werden Temperaturen zwischen 20 und 60°C, vorzugsweise von 25-55°C, insbesondere 30-50°C und vorzugsweise Inkubationszeiten zwischen 5 bis 120 min, vorzugsweise 10-100 min, insbesondere 30-90 min zu guten Ergebnissen führen. Es können jedoch auch wesentlich kürzere oder längere Zeiten sinnvoll sein. Auch kann ggf. auf eine eigene Inkubationsphase ganz verzichtet werden.
Anschließend muss, wie bereits oben ausgeführt, das Öl aus der Mischung abgetrennt werden. Die Gewinnung des Öls unter Abtrennung der Ölphase kann auf jede beliebige, dem Fachmann geläufigen Weise geschehen, wobei auch auf die in der Beschreibungseinleitung angeführten Verfahren beispielhaft verwiesen wird. Vorzugsweise handelt es sich um ein mechanisch- physikalisches Verfahren, d.h. es wird im Gegensatz zu den chemisch-extraktiven Verfahren kein Lösungsmittel wie z.B. Hexan zugesetzt bzw. zur Extraktion des Öls verwendet.
Im Rahmen der Erfindung wurde nun überraschend gefunden, dass durch den erfindungsgemäßen Einsatz des Enzyms bzw. der Enzymmischung enthaltend mindestens eine Pektinesterase eine besonders effiziente Ölgewinnung unter Verwendung eines Dreiphasen- Dekanters ermöglicht wird.
Beim sogenannten Dreiphasen-Verfahren wird durch den Einsatz von mindestens einem Dreiphasen-Dekanter die eingebrachte Masse, z.B. die ölhaltige Olivenpulpe (in einem Arbeitsschritt) in eine flüssige Ölphase, eine wässrige Phase (manchmal auch "Papilla" genannt) und eine teilentölte und teilentwässerte (Feststoff) - Suspension (manchmal auch „alperujo" genannt) getrennt. Aufgrund der begrenzten Trennleistung der Dreiphasen-Dekanter befindet, sich jedoch herkömmlich eine signifikante Menge Öl in der Papilla. Dieses Öl wird üblicherweise in einem weiteren Prozessschritt aus der Papilla isoliert. Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird nun unerwartet die Trennleistung der Dreiphasen-Dekanter signifikant erhöht, wobei insbesondere die Ölausbeute steigt und der Olanteil in der Papilla erheblich gesenkt werden kann. In den meisten Fällen ist es mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens überraschend möglich, ggf. nachfolgende Prozessschritte zur Isolierung des Öls aus der Papilla überflüssig zu machen. Dreiphasen-Dekanter als solche sind dabei dem Fachmann bekannt, es können beliebige Modelle verwendet werden.
Nach einen anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass nicht nur im vorstehen beschriebenen Dreiphasen- Verfahren, sondern auch bei Verwendung anderer physikalischer bzw. mechanisch-physikalischer Verfahren, insbesondere des sogen- nannten Zweiphasen-Verfahren, d.h. wobei durch den Einsatz von Zweiphasen-Dekantern die Olivenpulpe in eine stark feststoffhal- tige Suspension (manchmal auch "Alperujo" genannt) und eine Öl/Wasser Emulsion aufgetrennt und das Öl wird aus dieser Emulsion durch Zentrifugation gewonnen wird, durch den erfindungsgemäßen Enzymeinsatz die Zwischenschaltung von Malaxern, d.h. dem Fachmann geläufigen Rührbecken mit horizontalem Rührgestänge, und/oder von dem Fachmann ebenfalls geläufigen Rührbecken mit vertikalem Rührgestänge überflüssig gemacht werden kann. Besonders bevorzugt kann erfindungsgemäß der Malaxer im Verfahren weggelassen werden. Offenbar wird hier, ohne dass die Erfindung auf die Richtigkeit dieser Annahme beschränkt wäre, eine Verbesserung der Koaleszenz allein durch die Enzyme bewirkt. Durch die Möglichkeit der Weglassung der Malaxer lässt sich die Prozessökonomie erheblich steigern.
Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass die hierin beschriebenen Vorteile des Verfahrens zur Ölgewinnung besonders groß sind, wenn die Enzymmischung eine bestimmte Zusammensetzung aufweist. So wurde überraschenderweise gefunden wurde, dass bei einem Verhältnis der Aktivität der Pektinesterase (n) zur Aktivität der en o-Polygalacturonase (n) von mindestens 0,13 besonders vorteilhafte Eigenschaften bei der Ölgewinnung erhalten werden. Weiterhin wurde unerwartet gefunden, dass ein Verhältnis der Aktivität der Pektinesterase (n) zur Aktivität der exo-Polygalacturonase (n) von mindestens 0,3 besonders günstig ist. Bei Einhaltung jeweils dieser Verhältnisse sind die positiven Effekte auf die Freisetzung des Öls aus der Masse aus Oliven oder Olivenbestandteilen, und auf die Freisetzung und Abtrennung des wässrigen Anteils (der wässrigen Phase) in dem Ölgewinnungsprozeß besonders ausgeprägt. Insgesamt lässt sich die Ölausbeute überraschend steigern.
Unter einer Pektinesterase (PEase) wird erfindungsgemäß ein Enzym der Klassifizierungsgruppe EC 3.1.1.11 verstanden. Die Aktivität dieses Enzyms kann prinzipiell anhand von dem Fachmann geläufigen Standardmethoden bestimmt werden. Eine erfindungsgemäß verwendete Methode ist im nachstehenden Methodenteil angegeben. Die erfindungsgemäß eingesetzte Enzymmischung enthält somit mindestens eine PEase (-aktivität) .
Unter einer endo-Polygalacturonase (endo-PGase, endo-Pektinase) wird erfindungsgemäß ein Enzym der Klassifizierungsgruppe EC 3.2.1.15 verstanden. Die Aktivität dieses Enzyms kann prinzipiell anhand von dem Fachmann geläufigen Standardmethoden bestimmt werden. Die erfindungsgemäß verwendete Methode ist im nachstehenden Methodenteil (Pektinsäure (PGA) als Substrat) angegeben. Die erfindungsgemäß eingesetzte Enzymmischung enthält somit mindestens eine endo-PGase (-aktivität) .
Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt das Verhältnis der Pektinesterase (PEase) zur Aktivität der endo-Poly- galacturonase mindestens 0,15, vorzugsweise mindestens 0,16.
Die erfindungsgemäß eingesetzte Enzymmischung enthält weiterhin mindestens eine exo-Polygalacturonase (exo-PGase, exo-Pektinase) , wobei das Verhältnis der Aktivität der Pektinesterase (n) zur Aktivität der exo-Polygalacturonase (n) mindestens 0,3 beträgt. Besonders bevorzugt ist ein Aktivitätsverhältnis von mindestens 0,33. Erfindungsgemäß wird unter einer exo-PGase ein Enzym der Klassifizierungsgruppe EC 3.2.1.67 verstanden. Die Aktivität dieses Enzyms kann prinzipiell anhand von dem Fachmann geläufigen Standardmethoden bestimmt werden. Eine erfindungsgemäß verwendete Methode ist im nachstehenden Methodenteil angegeben.
Es wird angenommen, ohne dass die Erfindung auf diesen theoretischen Mechanismus beschränkt wäre, dass durch den relativ hohen Pektinesteraseanteil, insbesondere bei gleichzeitiger Anwesenheit von endo- und exo-PGase (n) ein besonders effizienter Aufschluss der hochmolekularen Polysaccharidstrukturen erzielt wird, in denen das zu gewinnende Öl "eingeschlossen" ist. Es wird weiterhin angenommen, dass durch die Pektinesterase die Zugänglichkeit von Substraten der endo- und der exo-PGase sowie anderer polysaccha- ridspaltender Enzyme verbessert wird. Dadurch kann offenbar auch der Abbau von hochmolekularen Strukturen, mit denen das zu gewinnende Öl assoziiert ist, beschleunigt- werden. Per definitionem katalysiert exo-PGase die Freisetzung von D-Galacturonat- Monomeren aus 1, -alpha-D-Galacturonid-Polymeren durch Spaltung von endständigen
O-glycosidischen Bindungen. Wird Pektin als Substrat eingesetzt, ist es wie auch bei der endo-PGase notwendig, dass das etwaige Methylsäureester der Polygalacturonsäure zunächst in die freie Säure bzw. in deren Salz umgewandelt werden, damit sie der exo- PGase als Substrat zur Verfügung steht. Die Einstellung des erfindungsgemäßen (Mindest-) Verhältnisses zwischen Pektinesterase und exo-PGase ist in diesem Zusammenhang offenbar besonders vorteilhaft. Die Spaltung der Säureester durch die Pektinesterase entlang der Polysaccarid-Kette erfolgt wohl statistisch. So wird die Kette im ersten Schritt der endo-PGase als Substrat zugänglich gemacht, die die Kette anschließend in Oligosaccharide zerteilt. Es ist möglich, dass die exo-PGase hier bereits eine endständige Abspaltung durchführt, jedoch nur solange, bis sie auf der Kette wiederum einen Methylsäureester vorfindet. Ein weiterer endständiger Abbau der Kette könnte dann nur erfolgen, wenn dieser Methylsäureester in die Säure umgewandelt wird. Das erfindungsgemäße Mindestverhältnis zwischen PEase und endo-PGase kann dafür sorgen, dass die statistische Spaltung der Methylsäureester durch die PEase so mit der exo-PGase-Aktivität abgestimmt ist, dass diese mit besonders hoher Leistungsfähigkeit ohne eine Einschränkung der Umsätze durch blockierende Methylester arbeiten kann. Auch sind weitere günstige Interaktionen zwischen den vorstehenden Enzymaktivitäten denkbar. Besonders bevorzugt ist das Verhältnis der Aktivität der Pektinesterase zur Aktivität der endo-Polygalacturonase nicht größer als etwa 1, insbesondere als etwa 0,5, und das Verhältnis der Aktivität der Pektinesterase zur Aktivität der exo-Polygalacturonase nicht größer als etwa 1, insbesondere als etwa 0,6.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die verwendete Enzymmischung weiterhin mindestens eine Laminarinase (ß- 1, 3-Glucanase) . Erfindungsgemäß wird hierunter ein Enzym der Klassifizierungsgruppe EC 3.2.1.39 verstanden. Die Aktivität dieses Enzyms kann prinzipiell anhand von dem Fachmann geläufigen Standardmethoden bestimmt werden. Eine erfindungsgemäß verwendete Methode ist im nachstehenden Methodenteil angegeben. Vorzugsweise beträgt das Verhältnis der Aktivität der Pektinesterase zur Aktivität der Laminarinase mindestens 20, vorzugsweise mindestens 30.
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform enthält die verwendete Enzymmischung weiterhin mindestens eine Cellulase, insbesondere eine Cl-Cellulase. Hierunter wird erfindungsgemäß ein Enzym der Klassifizierungsgruppe EC 3.2.1.91 verstanden. Die Aktivität dieses Enzyms kann prinzipiell anhand von dem Fachmann geläufigen Standardmethoden bestimmt werden. Eine erfindungsgemäß verwendete Methode ist im nachstehenden Methodenteil angegeben. Besonders bevorzugt beträgt das Verhältnis der Aktivität der PEase zur Aktivität der Cl-Cellulase mindestens 75, vorzugsweise mindestens 100.
Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die verwendete Enzymmischung somit mindestens sechs verschiedene Einzelaktivitäten, wobei die bevorzugten Verhältnisse der Einzelaktivitäten sich überraschend positiv auf die erhaltene Ölausbeute und Phasentrennbarkeit auswirken. Die bevorzugt enthaltenen Enzymaktivitäten sind nachstehend nochmals aufgelistet: exo-Polygalacturonase (EC 3.2.1.67) endo-Polygalacturonase (EC 3.2.1.15) Pektinlyase (EC 4.2.2.10) Pektinesterase (EC 3.1.1.11) Cl-Cellulase (EC 3.2.1.91) Laminarinase (EC 3.2.1.39)
Es können jedoch auch weitere Komponenten in der erfindungsgemäßen Enzymmischung enthalten sein. In Bezug auf die enzymatischen Komponenten der Enzymmischung können beispielsweise weitere Zellbzw. Zellwandstrukturen degradierende Enzyme enthalten sein, wie beispielsweise, jedoch nicht beschränkend, Xylanase(n) (EC 3.2.1.8) oder auch proteolytische Enzyme (vgl. Beschreibungseinleitung und Enzymauflistung vor dem Methodenteil; nach einer erfindungsgemäßen Ausführungsform nicht in der Enzymmischung enthalten) . Auch sind weitere Bestandteile in der Mischung aus der Olivenmasse und der Enzymmischung nicht ausgeschlossen. Solche Zusätze sind dem einschlägigen Fachmann geläufig und umfassen beispielsweise Salze, Cofaktoren, Inhibitoren oder Aktivatoren für Enzyme, Stabilisatoren wie Glycerin, etc..
Wie bereits erwähnt, eignet sich die erfindungsgemäß verwendete Enzymmischung besonders vorteilhaft zur Erhöhung der Ausbeute in der Gewinnung von Olivenöl aus Olivenfrüchten oder deren Bestandteilen, besonders in mechanisch-physikalischen Gewinnungsprozessen.
Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäß die folgenden Enzymaktivitäten, die wie im nachstehenden Methodenteil angegeben bestimmt werden können: a. Pektinesterase: mehr als 300 U/ml, insbesondere mehr als 320 U/ml b. exo-Polygalacturonase: weniger als 1000 U/ml c. endo-Polygalacturonase: zwischen 1500 und 2500 U/ml, d. Laminarinase: weniger als 15 U/ml, insbesondere weniger als 12 U/ml e. Cl-Cellulase: weniger als 3,3 U/ml f. Pektinlyase: zwischen etwa 25.000 und 150.000 U/ml
Die einzelnen Enzyme sind kommerziell erhältlich (z.B. Firma Sig- a-Aldrich Chemie GmbH, München, DE) . Beispielhafte Enzymquellen sind nachstehend vor dem Methodenteil angegeben. Es können jedoch selbstverständlich auch Enzyme aus anderen Quellen verwendet werden, solange sie die entsprechende vorstehend angegebene Aktivität aufweisen. Nach einer bevorzugten Ausführungsform werden die Enzyme aus Kulturen bzw. dem Kulturüberstand von Mikrooganismen, insbesondere von Bakterien und Pilzen, einschließlich Hefen gewonnen. Eine bevorzugte Quelle sind Kulturen von Aspergillus, insbesondere von Aspergillus niger Stämmen, die mehrere oder sogar alle der in der erfindungsgemäßen Enzymmischung enthaltenen Enzymaktivitäten aufweisen.
Bezogen auf die Masse aus Oliven bzw. Olivenbestandteilen werden erfindungsgemäß besonders bevorzugt mindestens 50 ml, insbesondere zwischen etwa 50 und 400 ml, vorzugsweise zwischen 100 und 300 ml, besonders bevorzugt zwischen 125 und 250 ml der vorstehend bestehenden Enzymmischung pro Tonne Masse eingesetzt. In vielen Fällen sind vorzugsweise zwischen 100 und 175 ml, insbesondere zwischen 125 und 150 ml der vorstehend bestehenden Enzymmischung pro Tonne Masse vorteilhaft. Der Ausdruck Enzymmischung soll in der vorliegenden Beschreibung auch für den Fall der Verwendung nur eines Enzyms (PEase) verwendet werden.
Bevorzugt liegt dabei die Protein- bzw. Enzymkonzentration in der eingesetzten Enzymmischung zwischen etwa 2 und 20 mg/1, vorzugsweise 2 und 12 mg/ml, insbesondere 3 und 10 mg/1. Die Proteinkon- zentration kann anhand von Standardverfahren z.B. photometrisch bestimmt werden. Hieraus lassen sich einfach die bevorzugten absoluten Gesamtaktivitäten der einzelnen enthaltenen Enzyme pro Tonne der Masse aus Oliven bzw. Olivenbestandteilen errechnen.
Nach einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Enzymmischung wie vorstehend definiert zur Behandlung von Massen aus Oliven oder Olivenbestandteilen, insbesondere von vorentölten Massen bei der Ölgewinnung. Als besonders vorteilhaft hat sich überraschend die Verwendung bei der physikalischen bzw. mechanisch-physikalischen Ölgewinnung herausgestellt. Wie eingangs ausgeführt, können bei diesen Verfahren hochwertigere Öle erhalten werden, so dass sich die gemäß der vorliegenden Erfindung gesteigerte Ölausbeute als besonders lohnend darstellt.
Bei der nachstehenden Methode zur Bestimmung der Aktivität der endo-PGase kann als Substrat auch anstelle von Pektinsäure (PGA) Pektin eingesetzt werden. Auf diese Weise lässt sich eine Gesamtaktivität der Pektin-degradierenden Enzyme ermitteln. Im Rahmen einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat sich dabei gezeigt, dass sich besonders vorteilhafte Eigenschaften bei der Ölgewinnung zeigen, wenn in der eingesetzten Enzymmischung das Verhältnis der PEase zur wie vorstehend bestimmten Gesamtaktivität der Pektin-degradierenden Enzyme in der Enzymmischung mindestens 0,035, vorzugsweise mindestens 0,04, insbesondere 0,05 beträgt. Nach einer alternativen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung daher auch eine Zusammensetzung, enthaltend eine Masse aus Oliven oder Olivenbestandteilen und eine Enzymmischung, worin das Verhältnis der PEase zur wie vorstehend bestimmten Gesamtaktivität der Pektin-degradierenden Enzyme in der Enzymmischung mindestens 0,035, vorzugsweise mindestens 0,04, insbesondere 0,05 beträgt. Die Gesamtaktivität der Pektin-degradierenden Enzyme liegt dabei vorzugsweise bei weniger als 8000 U/ml, insbesondere weniger als 7000 U/ml. Die Aktivitätswerte der anderen Enzyme sind vorzugsweise wie vorstehend angegeben. Auch die Aktivitätsverhältnisse von PEase zu exo-PGase, von PEase zu Laminarinase und von PEase zu Cl-Cellulase sind vorzugsweise wie vorstehend angegeben. Es können die gleichen Mengen an Enzymgemisch wie vorstehend beschrieben eingesetzt werden.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt betrifft die Verwendung einer Enzymmischung wie vorstehend ausgeführt in einem der hierin beschriebenen Verfahren zur Behandlung von Massen aus Oliven oder Olivenbestandteilen bzw. in einem Verfahren zur Ölgewinnung. Dabei kann nach einer Ausführungsform der Erfindung die Fest-/Flüssigtrennung bei der Ölgewinnung verbessert werden. Eine bevorzugte Verwendung betrifft hier die EntÖlung einer vorentölten Masse aus Oliven bzw. Olivenbestandteilen.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird die Fest-/Flüssig- trennung ausschliesslich mit Hilfe mindestens eines Dreipha- sen-Dekanters erfolgen.
Nach einem weiteren Verwendungsaspekt der vorliegenden Erfindung wird die Ölausbeute bei der Fest-/Flüssigtrennung erhöht, der Ölgehalt des wässrigen Ablaufs aus dem Dreiphasen-Dekanter gesenkt, die abgetrennte Wassermenge im wässrigen Ablauf erhöht und/oder der Öl- und/oder Wassergehalt der mit Hilfe des Dreiphasen-Dekanters gewonnenen Festphase reduziert.
Nach einem weiteren Verwendungsaspekt der vorliegenden Erfindung wird ermöglicht, die Prozesstemperatur bei der Ölgewinnung bei zumindest gleichbleibender Ölausbeute absenken zu können. Im Prozess der Gewinnung von Olivenöl ist man auch bestrebt, möglichst große Mengen hochwertigen Öls zu produzieren, um auf diese Weise einen möglichst hohen Marktpreis erzielen zu können. In dem eingesetzten Produktionssystem besteht in erster Näherung eine Korrelation zwischen Ölmenge und Qualität: wird eine Anlage mit möglichst hoher Trenneffizienz gefahren, d.h. auf Ölmenge optimiert, so nimmt die Qualität ab und vice versa. Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Enzymmischung kann überraschend ein hochqualitatives Öl bei gleichzeitig hoher Ausbeute erzielt werden.
Ein Parameter, der die Qualität eines Öles definiert ist z. B. der Säuregehalt. Die Ölhersteller sind bestrebt, diesen möglichst niedrig zu halten. Weiterhin ist zu beobachten, dass - wie oben beschrieben - durch scharfe Zentrifugation zwar die Ölausbeute erhöht wird, jedoch auf die Weise auch unerwünschte Nebenprodukte in das Öl eingehen. Diese Nebenprodukte setzen sich langsam als Sediment ab. Es kann festgehalten werden, dass die Ölhersteller bestrebt sind, dieses Sediment volumenmäßig möglichst gering, die Textur möglichst einheitlich und die Farbe möglichst neutral zu halten. Die genannten Parameter werden mit Hilfe der vorliegenden Erfindung positiv beeinflusst.
Nach einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung somit die Verwendung einer Enzymmischung wie hierin definiert in dem hierin beschriebnen erfindungsgemäßen Verfahren zur Verbesserung der Qualität des erhaltenen Öls, insbesondere die Reduktion des Säuregehaltes, die Reduktion der Konzentration von konjugierten Dienen oder Trienen, die Reduktion von peroxidischen Substanzen, die Reduktion von Sterolen oder Wachsen und/oder die Reduktion des Gehaltes an freien Fettsäuren in dem erhaltenen Öl. Eine weitere bevorzugte Verwendung ist dadurch gekennzeichnet, dass durch die Behandlung mit der erfindungsgemäßen Enzymzusammensetzung keine negative Beeinflussung des Gehalts an Cholesterol, Brassicasterol, ' Stigmasterol, Δ-Stigmasterol und Trilinolein erfolgt.
Quellen für Enzyme:
EC 3.2.1.15 endo-PGase, z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. P4716, aus A. niger b. EC 3.2.1.67 exo-PGase (Kobayashi, T., Higaki, N., Yaji- ma, N., Suzumatsu, A., Hagihara, H., Kawai, H., und Ito, S. (2001) Biosci . Biotechnol . Biochem . 65, S. 842-848) oder von ASA Spe- zialenzyme GmbH, Wolfenbüttel, DE in Form von exo-PGase-haltigen Enzymlösungen EC 3.1.1.11 Pektinesterasen, z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. P5400, aus Orangenschale d EC 3.4.23.1 Pepsin, z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog- Nr. P7012, aus Schweinemagenschleimhaut EC 3.4.22.2 Papain, z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog- Nr. P4762, aus Papaya EC 3.2.1.4 Cellulase, z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. C1184, aus A. niger EC 3.2.1.1 -Amylase, z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. A6211, aus A. oryzae EC 3 4.2x.yz Proteasen, z.B. Pepsin und Papain, s.o. EC 3 2.1.21 ß-Glucosidase, z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. G6906, rekombinant EC 3.2.1.22 α-Galactosidase, z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. G4408, aus A. niger EC 3.2.1.23 ß-Galactosidase, z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. G3522, aus A. niger EC 3.2.1.55 α-Arabinosidase m. EC 3.2.1.24 -Mannosidase, z.B. Firma Sigma, Katalog- Nr. M7257, aus Bohnen n. EC 3.2.1.37 ß-Xylosidase, z.B. Firma Sigma, Katalog-Nr. X3501, aus A. niger o. EC 3.2.1.52 ß-N-Acetylglucosaminidase, z.B. Firma Sigma, Katalog-Nr. A2264, aus Bohnen p. EC 4.2.2.10 Pektin-Lyase, z.B. Firma Sigma, Katalog-Nr. PP7052, aus A. niger q. EC 3.2.1.6 Laminarinase, z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. L5272, aus Trichoderma spec. r. EC 3.2.1.8 Xylanase, z.B. Firma Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. X3876, aus Trichoderma veride
Methodenteil: Bestimmung der Enzymaktivitäten (gemäß Methoden der Firma ASA Spezialenzyme GmbH, Wolfenbüttel, DE)
Soweit nicht anders angegeben, werden die Enzymaktivitäten im Rahmen der Erfindung nach den im folgenden Methodenteil angegebenen Verfahren bestimmt.
1. Bestimmung der exo-Polygalacturonase- (exo-PGase) Aktivität (Messung der reduzierenden Zucker)
Testprinzip: exo-Polygalacturonase (exo-PGase) spaltet aus verseiftem Citruspektin Galacturonsäure-Einheiten ab, die aufgrund der reduzierenden Aldehydgruppen nach Reaktion mit 3, 5-Dinitrosalicyl- säure (DNSS) photometrisch nachgewiesen werden können.
Beim Erwärmen von 3, 5-Dinitrosalicylsäure (DNSS) mit reduzierenden Zuckern in alkalischem Medium entsteht 3-Amino-5-nitrosali- cylsäure (Gl. 1). Dabei wird eine Nitrogruppe zur Aminogruppe reduziert, während die Aldehydgruppe des Monosaccharids zur Carbo- xylgruppe oxidiert (Kakäc und Vejdelek, 1974) . 3, 5-Dinitrosa icylsäure 3-Analno-5-nitrosalicylsäure (Gl. 1)
Verschiedene Zucker ergeben unterschiedliche Färbungen, deren Ab- sorptionsmaximum zwischen 500 und 550 nm liegt. So können mit diesem Test ebenfalls Mono-, Di-, Oligo- und Polysaccharide sowie Methylpentosen und O-Methylsaccharide erfasst werden.
Reagenzien: DNSS-Phenol-Reagenz :
Lösung A: 38,55 g K-Na-tartrat in ein 200 ml Becherglas einwiegen und in 125 ml dest. Wasser lösen, in der Lösung werden 2,425 g NaOH (Plätzchen) gelöst.
Lösung B: 1,325 g 3, 5-Dinitrosalicylsäure (C7H4N2θ7; 2-Hydroxy-3, 5- dinitrobenzoesäure) in einer braunen Schraubflasche in 125 ml dest. Wasser lösen.
Lösung C: 1,05 g Phenol in 12,5 ml dest. Wasser lösen. Nacheinander 0,25 g NaOH (Plätzchen) und 1,05 g Na2S04 zugeben und unter Rühren lösen.
Gebrauchslösung: Lösung A und Lösung C werden (ohne nachspülen) in Lösung B gegossen und 10 min homogenisiert. Die Lösung vor Gebrauch mindestens eine Nacht stehen lassen und stets im Dunkeln aufbewahren. Substratlösung:
2,2% verseifte Citruspektinlösung in 0,1 M Na-Citrat, pH 4,4;
Verseifungsmethode: Vorschrift nach Boehringer Ingelheim, S.3
Standardlösung:
12,0 g/1 Galacturonsäure (GA) in dest. Wasser.
Durchführung:
Proben:
0,9 ml Substratlösung mit 0,1 ml Enzymlösung mischen, bei 30 °C für 30 min inkubieren, danach sofort ins Eisbad stellen. 2,0 ml
DNSS-Phenol-Reagenz dazugeben und 5 min kochen. Gemisch für ca.
5 min im Eisbad abkühlen und die Extinktion bei Raumtemperatur und 492 nm messen.
Blindwerte:
0,9 ml Substratlösung mit 0,1 ml Wasser mischen, 2,0 ml DNSS- Phenol-Reagenz dazugeben und 5 min kochen. Gemisch für ca. 5 min im Eisbad abkühlen und die Extinktion bei Raumtemperatur und 492 nm messen.
Standard:
1,0 ml verdünnte Standardlösung mit 2,0 ml DNSS-Phenol-Reagenz mischen und 5 min kochen. Gemisch für ca. 5 min im Eisbad abkühlen und die Extinktion bei Raumtemperatur und 492 nm messen.
Kalibrierung:
Verdünnungen der Standardlösung zur Erstellung der Kalibriergeraden: c (GA) Standardlsg. dest. Wasser in g/1 in μl in μl 0 , 6 50 950 1 , 2 100 900 1 , 8 150 850 3 , 0 250 750 4 , 5 375 625 6, 0 500 500
Auswertung :
Δc(GA) vf R aktiσnslsg. exo-PGase-Aktivi tat [U/ml] = •Verd. M(GA) ''Enzym, t-Jeafetion
M (GA) = 194 g/mol tReaktion = 30 min
Herstellung der verseiften Pektinlösung 2,2' (Pektinsäurelösung)
Eine 250 ml Flasche wird in einem Wasserbad auf 35 °C eingestellt und Rührer mit Rührmotor darin befestigt. 2,2 g über 80% ve- restertes Citruspektin (v. Herbstreith und Fox KG , Pektin Clas- sic CF 201, 00302026 v. 30.04.03) werden darin mit 4 ml reinem Alkohol unter langsamen Rühren benetzt. Bei stärkerer Rührbewegung werden daraufhin 50 ml dest. Wasser in die Mitte des Rührsoges eingegossen und 20 min nachgerührt. Es ist darauf zu achten, das dabei eine glatte viskose Lösung ohne Klümpchen entsteht. Danach werden unter Zeitnahme zur Verseifung aus einem Tropftrichter 20 ml 0,5 N Natronlauge innerhalb von 5 min rasch zugetropft. Nach einer gesamten Verseifungszeit von genau 60 min bei 35 °C un- ter stetem Rühren wird die Reaktion abgestoppt durch Zugabe von 10%-iger Zitronensäure aus einer Stabpipette. Durch Zugabe von 3 ml Zitronensäurelösung wird der pH-Wert auf 4,4 eingestellt. Der pH-Wert darf nicht nachträglich mit Lauge korrigiert werden.
Anschließend wird der Inhalt des Becherglases unter Nachspülen mit Pufferlösung in einen 100 ml-Messzylinder überführt. Nachdem die Lösung auf 20°C abgekühlt ist, wird das Volumen mit Citrat- puffer pH 4,4 auf 100 ml aufgefüllt. Vor dem Gebrauch wird die fertige Pektinsäurelösung über Glaswolle filtriert.
2. Bestimmung der endo-Polygalacturonase-Aktivität (endo-PGase)
Definition:
Einer spezifischen endo-PGase-Einheit entspricht der mit 100 ml multiplizierte reziproke Wert der Enzymmenge in g, die in 30 min die Viskosität (-Wasserwert) von 1 Liter einer 2,2%-igen Pektinsäurelösung*) um 3/5 erniedrigt; (auf rel. Viskosität 0,40), bei 30°C und beim pH-Optimum von 4,4.
*) Pektinsäure purum
Fluka AG, Chemische Fabrik, CH-9470 Buchs SG
Prinzip:
Messung des Viskositätsabbaues der fermentierten Fluka-Pektin- säurelösung im Ostwald-Viskosimeter.
Apparatur: a) Viskosimeter nach Ostwald 30 ml; Wasserwert ca. 40 sec. im Wasserbad bei 30°C. b) Ultra-Thermostat mit Wasserbad und Einhängevorrichtung für Reagenzgläser c) Wasserbad mit Einhängethermostat d) Rührmotor mit Flügelrührer e) Bechergläser 600 und 800 ml f) Messkolben 100 und 500 ml g) geeichte Vollpipette, 3, 20 und 30 ml h) Reagenzgläser 18 x 180 mm i) Saugflasche, Glasfritte mit Gummimanschette und Glaswolle, Messzylinder 100 und 250 ml j) Stoppuhren, Teilung 0,1 sec. k) pH-Gerät und Glaselektrode sowie 1) Magnetrührer mit Stäbchen
Reagenzien: Pektinsäure purum (Fluka AG, Chem. Fabrik, Buchs, SG) Zitronensäuremonohydrat, DAB 6 - Natronlauge I , 0,5 N, 0,1 N Salzsäure 0,1 N - Alkohol, absolut p.A.
Lösungen: a) Citratpufferlösung pH 4,4 (0,1 molar)
Basislösung: 21,01 g Zitronensäuremonohydrat in einem 1 Liter Messkolben in ca. 100 ml dest. Wasser lösen. 200 ml 1 N-Natronlauge dazu pipettieren und gut mischen, bis zur Eichmarke auffüllen.
Gebrauchslösung : Von der Basislösring werden ungefähr 350 ml in einem 800 ml Becherglas vorgelegt und eine Glaselektrode mit angeschlossenem pH-Gerät eingetaucht. Unter Rühren (Magnet- rührer) wird nun langsam 0,1 N Salzsäure hinzugegeben, bis der pH von 4,4 erreicht wird.
Pektinsäurelösung (2,2%-ig)
11 g Pektinsäure werden in einem 600 ml Becherglas (Flachform) vorgelegt und mit 20 ml Alkohol (Ethanol p.A.) versetzt. 30 Minuten quellen lassen. Anschließend wird das Becherglas in einem Wasserbad mit Einhängethermostat - eingestellt auf 35 °C - fixiert und ein Rührmotor mit Flügelrührer derartig darüber angebracht, dass der Flügelrührer möglichst dicht über dem Boden des Becherglases hängt.
Bei starker Rührbewegung werden 240 ml dest. Wasser in das Becherglas eingegossen und anschließend bei konstanter, starker Rührgeschwindigkeit genau 20 Minuten nachgerührt .
Es ist darauf zu achten, dass eine glatte viskose Lösung ohne Klümpchen entsteht. Danach wird der pH-Wert der Lösung mit Natronlauge (zuerst 0,5 N dann 0,1 N) auf exakt pH 4,4 eingestellt (pH-Meter). Nicht übertitrieren, da bei pH-Werten über pH 4,4 Klümpchen durch Gelbildung entstehen! Nach der pH-Einstellung wird der Inhalt des Becherglases unter gutem Nachspülen mit der Citrat-Puf- ferlösung pH 4,4 in einen 500 ml Messkolben überführt und nach Abkühlen auf 20 °C mit Citratpuffer zur Marke aufgefüllt .
Vor dem Gebrauch wird die fertige Pektinsäurelösung über Glaswolle filtriert. Durchführung der Bestimmung:
Von der frisch hergestellten Pektinsäurelösung werden, entsprechend der Anzahl der Enzymproben, aus Vollpipetten je 30 ml in Reagenzgläser pipettiert und vor der Fermentierung im Ultrathermostat für Reagenzgläser - eingestellt auf 30 °C - etwa 5 min auf 30 °C erwärmt. Der Fermentzusatz von je 3 ml (Vollpipette ausblasen) zu den 30 ml temperierter Pektinsäurelösung erfolgt unter Zeitnahme durch Drücken einer Stoppuhr. Bei mehreren Enzymproben werden die entsprechenden Enzymlösun- gen im Abstand von jeweils 4 min zugesetzt. Nach einer Fermen- tierungszeit von nicht ganz 30 min bei 30 °C wird die Reaktionsprobe dem Wasserbad entnommen und in das ebenfalls auf 30 °C temperierte Ostwald-Viskosimeter gefüllt. Die Lösung im Visko- simeter wird sogleich hochgesaugt, und zwar so, dass sie im Auslauf die obere Marke genau 30 min nach Beginn der Fermentierung passiert. Die Durchlaufzeit zwischen den Eichmarken wird mit einer zweiten Stoppuhr gestoppt und als Endviskosität registriert. Bei mehreren Fermentproben ist auch hier der Abstand von jeweils 4 min zwischen jeder Messung genau einzuhalten.
Die Ausgangsviskosität wird im gleichen Viskosimeter bestimmt, indem man die Durchlaufzeit von 30 ml Pektinsäurelösung bei 30 °C misst, nun aber anstelle von Fermentlösung 3 ml Citrat- pufferlösung pH 4,4 zufügt. Die Ausgangsviskosität soll unmittelbar vor der Endviskosität bestimmt werden. Wird eine ganze Serie von Enzymproben untersucht, so wird die Ausgangsviskosität unmittelbar vor und nach der Messreihe bestimmt und der Durchschnittswert genommen. Auswertung:
Messung im gleichen Viskosimeter
Wasserwert Durchlaufzeit von destilliertem Wasser -> W
Ausgangsviskosität Durchlaufzeit der Pektinsäurelösung - A + 3 ml Puffer pH 4,4
Endviskosität Durchlaufzeit der fermentierten Lösung -> E
Die relative Viskosität der fermentierten Lösung entspricht dem Verhältnis von Endviskosität ( Wasserwert) zu Ausgangsviskosität (-Wasserwert)
E - W relative Viskosität = A - W
Der Wert der relativen Viskosität soll zwischen 0,36 - 0,45 liegen. Ist dies nicht der Fall, so ist die Messung mit einer entsprechend veränderten Enzym-Einsatzmenge zu wiederholen. Zur Bestimmung der neuen Einwaage kann eine Abschätzung der Aktivität mit Hilfe der "Eichkurve über weiten Bereich" vorgenommen und die damit berechneten Einheiten als Richtwert eingesetzt werden.
Berechnung der Aktivität: k x Vτ x VF endo-Polygalacturonase-Aktivität [U/ml] = VE k = 1.100; Kurvenwert der Eichkurve bei einer relativen Viskosität von 0,40 (erstellt mit einem Standardenzym) Vτ = Testvolumen VF = Verdünnungsfaktor VE = Volumen Enzymlösung [ml]
Erstellung der Eichkurve:
Der Viskositätstest wird mit verschiedenen Konzentrationen eines Standardenzyms (Panzym Combi 285/12, Boehringer Ingelheim) durchgeführt. Die Enzymkonzentration, die zu einer relativen Viskosität von 0,40 führt, wird mit dem Kurvenwert von 1.100 gleichgesetzt.
Nach der alternativen Ausführungsform der Erfindung wurde in der vorstehenden Vorschrift anstelle von Pektinsäure (PGA) Apfelpektin (Sigma, Katalog-Nr. P8471) eingesetzt. Dies ermöglicht eine parallele viskosimetrische Aktivitätsbestimmung folgender Enzymaktivitäten: Pektinesterase, Pektinlyase, endo- und exo-Polygalacturonase.
3. Bestimmung der Pektinlyaseaktivität
Testprinzip:
Bei der Pektinspaltung durch Pektinlyase entsteht eine Doppelbindung zwischen C-Atom 4 und C-Atom 5 des neu entstehenden nichtreduzierenden Kettenendes. Die Doppelbindung führt zur Lichtabsorption bei 235 nm. Die Geschwindigkeit, mit der die Extinktion zunimmt, dient als Maß für die Lyaseaktivität .
Substratlösung:
0,41 g Apfelpektin B (Citruspektin v. Herbstreith & Fox KG Nr.
00302026 v. 30.04.03) werden mit 0,1 n Citratpuffer von pH 5,0 auf 100 ml gelöst und (z.B. durch ein Glasfilter G2) filtriert.
Durchführung der Messung:
In der Küvette mit 1 cm Schichtdicke werden 2,9 ml (auf 30°C temperierte) Substratlösung und 0,1 ml Enzymverdünnung pipet- tiert und gemischt. Bei 30 °C und 235 nm wird die Extinktionszunahme über die Zeit im Vergleich zu einer Nullprobe aus 2,9 ml Substrat und 0,1 ml zuvor hitzeinaktivierter Enzymverdünnung gemessen.
Die Extinktionszunahme soll zu Beginn der Rektion im Bereich zwischen 0,005 und 0,05 pro Minute liegen, andernfalls ist die Messung mit mehr oder weniger stark verdünnter Enzymlösung zu wiederholen.
Berechnung der Aktivität:
Die Lyaseaktivität ergibt sich aus den gemessenen Extinktionszunahmewerten pro Minute (ΔExt.) bei Reaktionsbeginn:
ΔExt. x 1000 x 30 x VF Pektinlyaseaktivität in U/ml = 5,5
VF = Verdünnungsfaktor
4. Bestimmung der Pektinesterase- (PEase) -Aktivität
Definition:
Einer spezifischen Pektinesterase-Einheit (PEase-E) entspricht die Enzymmenge in g, die in einer Minute ein Mikroäquivalent Methylestergruppen in einer Pektinlösung, die 550 mg hochve- restertes Citruspektin enthält, bei 30 °C und dem pH-Optimum von 4,4 spaltet. Prinzip :
Alkalimetrische Titration der Pektinlösung während des Enzy- mierungsvorganges bei 30 °C und bei konstant gehaltenem pH-Wert von 4,4 mit 0,02 N Natronlauge. Die ersten 5 min nach der Enzymzugabe zur Pektinlösung dienen zur Einstellung des Soll-pH- Wertes. Die eigentliche Titration von genau 20 min Dauer beginnt nach dieser Zeit.
Apparatur: pH-Gerät mit Glaselektrode und Titrator Wasserbad mit Einhängethermostat Rührmotor mit Flügelrührer 2 Mikrobüretten 10 ml automatisch Messkolben 100 ml, 1 Liter Vollpipetten 10 ml, 100 ml Bechergläser 200 ml, 1 Liter Stoppuhr Saugflasche 1 Liter; Glasfritte mit Gummimanschette Glaswolle oder Microlith-Glasfiltervlies Typ OR 80 N (Glaswerk Schuller, Westheim)
Reagenzien: Citrustrockenpektin ca. 74% verestert (Pemosin, Frankfurt/M) Natronlauge 0,1 N Titrisol
Lösungen: a) 0,01 N Natronlauge 2 x 100 ml 0,1 N Natronlauge werden in einen 1 Liter Messkolben pipettiert und mit dest. Wasser zur Marke aufgefüllt. b) Pektinlösung (0,55%-ig) Ein 100 ml Becherglas wird in einem Wasserbad mit Einhän- gethermostat - eingestellt auf 30 °C - fixiert und ein Rührmotor mit Flügelrührer derartig darüber angebracht, dass der Flügelrührer möglichst dicht über dem Boden des Becherglases hängt.
Es werden ca. 700 ml dest. Wasser (H20 dest.) in dem Becherglas vorgelegt und anschließend 5,5 g des hochver- esterten Citrustrockenpektins unter starkem Rühren in ca. 2 min in der Mitte des Rührsoges eingetragen. Danach wird die Rührgeschwindigkeit verringert und bei für alle weiteren Versuche konstanter Umdrehungszahl dann genau 30 min lang nachgerührt.
Es ist darauf zu achten, dass dabei eine glatte viskose Lösung ohne Klümpchen entsteht.
Der Inhalt des Becherglases wird unter Nachspülen mit einer kleinen Menge dest. Wasser in einen 1 Liter Messkolben überführt und bei 20 °C bis zur Marke aufgefüllt
Vor Gebrauch wird die fertige Pektinlösung über Glaswolle filtriert .
Durchführung der Bestimmung:
In einem Wasserbad mit Einhängethermostat - eingestellt auf 30°C - wird ein Becherglas (200 ml) so befestigt, dass es zur Hälfte darin eintaucht. 20 ml der Pektinlösung werden in das Becherglas gegeben und genau 15 min temperiert.
Innerhalb dieser Zeit wird eine Glaselektrode, angeschlossen an ein pH-Meter mit Titrator, derart befestigt, dass sie in dem Becherglas in die Pektinlösung eintaucht. Ebenso werden ein Flügelrührer und die zwei Zuleitungen der Autobüretten mit 0,1 N und 0,01 N NaOH installiert.
Nach Ablauf der 15 min werden 2 ml Enzymlösung in die Pektinlösung pipettiert und unter ständigem Rühren gehalten.
Nun wird zu der Autobürette mit 0,01 N NaOH gewechselt, gleichzeitig die Stoppuhr gedrückt und weiterhin der pH-Wert durch tropfenweise Zugabe der 0,01 N NaOH auf pH 4,4 gehalten. Exakt 10 min nach der Zeitnahme wird die verbrauchte Menge 0,01 N NaOH abgelesen.
Die verbrauchte Menge 0,01 N NaOH soll zwischen 1,6 und 4 ml liegen. Ist dies nicht der Fall, so ist die Messung mit einer entsprechend veränderten Enzymeinsatzmenge bzw. Verdünnung zu wiederholen.
Auswertung: A x M x VF Pektinesteraseaktivität [U/ml] = VE x t
A = Verbrauch 0,01 N NaOH [ml]
M = Molarität der Titrierlösung [μmol/ml]
VF = Verdünnungsfaktor
VE = Volumen Enzymlösung [ml] t = Reaktionszeit [min]
5. Bestimmung der Cl-Cellulase-Aktivität mit Avicel (Messung der reduzierenden Zucker) Testprinzip:
Cellulase spaltet die ß-1, 4-Bindung zwischen den Glucose- einheiten innerhalb eines Stärkemoleküls. Die dabei freigesetzte Glucose wird mit 3, 5-Dinitrosalicylsäure (DNSS) photometrisch nachgewiesen.
Beim Erwärmen von 3, 5-Dinitrosalicylsäure (DNSS) mit reduzierenden Zuckern in alkalischem Medium entsteht 3-Amino- 5-nitrosalicylsäure (Gl. 1). Dabei wird eine Nitrogruppe zur Aminogruppe reduziert, während die Aldehydgruppe des Monosac- charids zur Carboxylgruppe oxidiert (Kakäc und Vejdelek, 1974) .
3,5-Dinitros licylsäure 3-Amino-5-nitrosallcylsäure (G1 . X)
Verschiedene Zucker ergeben unterschiedliche Färbungen, deren Absorptionsmaximum zwischen 500 und 550 nm liegt. So können mit diesem Test ebenfalls Mono-, Di-, Oligo- und Polysacchari- de sowie Methylpentosen und O-Methylsaccharide erfasst werden.
Reagenzien: DNSS-Phenol-Reagenz : Lösung A: 38,55 g K-Na-tartrat in ein 200 ml Becherglas einwiegen und in 125 ml dest. Wasser lösen. In der Lösung werden dann 2,425 g NaOH (Plätzchen) gelöst.
- Lösung B: 1 , 325 g 3 , 5-Dinitrosalicylsäure ( C7H4N2θ ; 2-Hydroxy-3 , 5- dinitrobenzoesäure) in einer braunen Schraubflasche in 125 ml dest. Wasser lösen.
- Lösung C: 1,05 g Phenol in 12,5 ml dest. Wasser lösen. Nacheinander 0,25 g NaOH (Plätzchen) und 1,05 g Na2S04 zugeben und unter Rühren lösen.
Gebrauchslösung: Lösung A und Lösung C werden ohne Nachspülen in Lösung B gegossen und 10 min homogenisiert. Die Lösung vor Gebrauch mindestens eine Nacht stehen lassen und stets im Dunkeln aufbewahren.
Substrat: 2,0 g Avicel in 90 ml Puffer
Puffer: 0,1 M Na-Citrat-Puffer, pH 4,5
Standardlösung: 2,0 g/1 Glucose (Traubenzucker) in dest. Wasser
Durchführung:
1,5 ml Substratlösung (unter Rühren entnehmen!) 10 min. bei 50°C inkubieren, danach 0,5 ml flüssiges Enzympräparat (für den Blindwert 0,5 ml Puffer) zusetzen. Nach genau 20 min Reaktionszeit wird das Gemisch im Eisbad abgekühlt, und 20 min bei 4200 rpm zentrifugiert . 1,0 ml Überstand werden mit 2,0 ml DNSS-Phenol-Reagenz versetzt und 5 min im siedenden Wasserbad gekocht. Gemisch für ca. 5 min im Eisbad abkühlen und die Extinktion bei Raumtemperatur und 546 nm messen. Kalibrierung :
Statt Substrat- und Enzymlösung werden 2 ml Standard im Test eingesetzt. Verdünnungen der Standardlösung zur Erstellung der
Kalibriergeraden: c (Glucose) Standardlsg. dest. Wasser in g/1 in μl in μl 0,1 100 1900 0,125 120 1880 0,16 160 1840 0,22 220 1780 0,24 240 1760 0,28 280 1720 0,3 300 1700
Auswertung: c (Glucose) VpeaktioΩslsg. Cl-Cellulase-Aktivität [U/ml] •Verd. M (Glucose) v EEnzym. tpeaktion
M (Glucose) = 180 g/mol t Reaktion = 20 min
6. Bestimmung der Laminarinase- (ß-1 , 3-Glucanase) -Aktivität (Messung der reduzierenden Zucker)
Testprinzip:
Laminarinase spaltet die ß-1, 3-Bindung zwischen den Glucose- einheiten innerhalb des Laminarins . Die dabei freigesetzte Glucose wird mit 3, 5-Dinitrosalicylsäure (DNSS) photometrisch nachgewiesen. Beim Erwärmen von 3, 5-Dinitrosalicylsäure (DNSS) mit reduzierenden Zuckern in alkalischem Medium entsteht 3-Amino-5- nitrosalicylsäure (Gl. 1). Dabei wird eine Nitrogruppe zur A- minogruppe reduziert, während die Aldehydgruppe des Monosac- charids zur Carboxylgruppe oxidiert (Kakäc und Vejdelek, 1974) .
3,5-Dinitrosalicylsäure 3-A ino-5-nitrosallcylsäure ( G1 > ^
Verschiedene Zucker ergeben unterschiedliche Färbungen, deren Absorptionsmaximum zwischen 500 und 550 nm liegt. So können mit diesem Test ebenfalls Mono-, Di-, Oligo- und Polysacchari- de sowie Methylpentosen und O-Methylsaccharide erfasst werden.
Reagenzien: DNSS-Phenol-Reagenz : Lösung A: 38,55 g K-Na-tartrat in ein 200 ml Becherglas einwiegen und in 125 ml dest. Wasser lösen. In der Lösung werden dann 2,425 g NaOH (Plätzchen) gelöst.
Lösung B: 1,325 g 3, 5-Dinitrosalicylsäure (C7H4N20 ; 2-Hydroxy-3, 5-di- nitrobenzoesäure) in einer braunen Schraubflasche in 125 ml dest. Wasser lösen.
Lösung C: 1,05 g Phenol in 12,5 ml dest. Wasser lösen. Nacheinander 0,25 g NaOH (Plätzchen) und 1,05 g Na2S04 zugeben und unter Rühren lösen.
Gebrauchslösung: Lösung A und Lösung C werden ohne Nachspülen in Lösung B gegossen und 10 min homogenisiert. Die Lösung vor Gebrauch mindestens eine Nacht stehen lassen und stets im Dunkeln aufbewahren.
Substrat:
0,5 % Laminarin in 0,1 M Na-Citrat-Puffer, pH 4,5 ; Puffer auf ca. 40°C erhitzen, Laminarin unter Rühren zugeben.
Puffer: 0,1 M Na-Citrat-Puffer, pH 4,5
Standardlösung: 2,0 g/1 Glucose (Traubenzucker) in dest. Wasser.
Durchführung: Proben:
0,9 ml Substratlösung mit 0,1 ml Enzymlösung mischen; bei 40°C für 15 min inkubieren, danach sofort in Eisbad stellen. 2,0 ml DNSS-Phenol-Reagenz dazugeben und 5 min im siedenden Wasserbad kochen. Gemisch für ca. 5 min im Eisbad abkühlen und die Extinktion bei Raumtemperatur und 546 nm messen.
Blindwerte:
0,9 ml Substratlösung mit 0,1 ml Wasser mischen. 2,0 ml DNSS- Phenol-Reagenz dazugeben und 5 min im siedenden Wasserbad kochen. Gemisch für ca. 5 min im Eisbad abkühlen und die Extinktion bei Raumtemperatur und 546 nm messen.
Standard:
1,0 ml verdünnte Standardlösung mit 2,0 ml DNSS-Phenol-Reagenz mischen und 5 min kochen. Gemisch für ca. 5 min im Eisbad ab- kühlen und die Extinktion bei Raumtemperatur und 546 nm messen.
Kalibrierung:
Verdünnungen der Standardlösung zur Erstellung der Kalibriergeraden: c (Glucose) Standardlsg. dest. Wasser in g/1 in μl in μl 0,092 50 950 0,110 60 940 0,147 80 920 0,221 120 880 0,258 140 860 0,294 160 840
Auswertung: c (Glucose) vReaktionslsg. Laminarinase-Aktivität [U/ml] • Verd. M (Glucose) V E*nzym. tp aktion
M (Glucose) = 180 g/mol tRe tion = 20 min
7. Bestimmung der Xylanase-Aktivität (Messung der reduzierenden Zucker)
Testprinzip:
Xylanase spaltet die ß-1, 4-Bindung zwischen den Xyloseeinhei- ten innerhalb eines Xylanmoleküls. Die dabei freigesetzte Xy- lose wird mit 3, 5-Dinitrosalicylsäure (DNSS) photometrisch nachgewiesen. Beim Erwärmen von 3, 5-Dinitrosalicylsäure (DNSS) mit reduzierenden Zuckern in alkalischem Medium entsteht 3-Amino-5-nitro- salicylsäure (Gl. 1). Dabei wird eine Nitrogruppe' zur Ami- nogruppe reduziert, während die Aldehydgruppe des Monosaccha- rids zur Caboxylgruppe oxidiert (Kakäc und Vejdelek, 1974) .
3 , 5-Dinitrosalicylsäure 3-A lno-5-ιιitrosalicylsäure (Gl . 1)
Verschiedene Zucker ergeben unterschiedliche Färbungen, deren Absorptionsmaximum zwischen 500 und 550 nm liegt. So können mit diesem Test ebenfalls Mono-, Di-, Oligo- und Polysaccharide sowie Methylpentosen und O-Methylsaccharide erfasst werden.
Reagenzien: DNSS-Phenol-Reagenz : Lösung A: 38,55 g K-Na-tartrat in ein 200 ml Becherglas einwiegen und in 125 ml dest. Wasser lösen. In der Lösung werden dann 2,425 g NaOH (Plätzchen) gelöst.
Lösung B: 1,325 g 3, 5-Dinitrosalicylsäure (C7H4N207; 2-Hydroxy-3, 5-di- nitrobenzoesäure) in einer braunen Schraubflasche in 125 ml dest. Wasser lösen.
Lösung C: 1,05 g Phenol .in- 12,5 ml dest. Wasser lösen. Nacheinander 0,25 g NaOH (Plätzchen) und 1,05 g Na2S04 zugeben und unter Rühren lösen.
Gebrauchslösung : Lösung A und Lösung C werden ohne Nachspülen in Lösung B gegossen und 10 min homogenisiert. Die Lösung vor Gebrauch mindestens eine Nacht stehen lassen und stets im Dunkeln aufbewahren.
Substrat: 2,0 g Xylan in 90 ml Puffer
Puffer: 0,1 M Na-Citrat-Puffer, pH 4,5
Standardlösung: 2,0 g/1 Xylose in dest. Wasser
Durchführung:
1,5 ml Substratlösung (unter Rühren entnehmen!) 10 min bei 50°C inkubieren, danach 0,5 ml flüssiges Enzympräparat (für den Blindwert 0,5 ml Puffer) zusetzen. Nach genau 20 min Reaktionszeit wird das Gemisch im Eisbad abgekühlt, und 20 min bei 4200 rpm zentrifugiert . 1,0 ml Oberstand werden mit 2,0 ml DNSS-Phenol-Reagenz versetzt und 5 min im siedenden Wasserbad gekocht. Gemisch für ca. 5 min im Eisbad abkühlen und die Extinktion bei Raumtemperatur und 546 nm messen.
Kalibrierung:
Statt Substrat- und Enzymlösung werden 2 ml Standard im Test eingesetzt. Verdünnungen der Standardlösung zur Erstellung der Kalibriergeraden: c (Xylose) Standardlsg. dest. Wasser in g/1 in μl in μl 0,1 100 1900 0,125 120 1880 0,16 160 1840 0,22 220 1780 0,24 240 1760 0,28 280 1720 0,3 300 1700
Auswertung: c (Xylose) vpeaktionslsg. Xylanase-Aktivi tat [U/ml] • Verd. M (Xylose) ''Enzym, ßgak ion
M (Xylose) = 150 g/mol tReaktion = 20 min
8. Bestimmung der Lipase- und Phospholipase-Aktivität
Die Lipase-Aktivität wird mit der pH-Stat-Methode bestimmt. Als Substrat wird Triolein verwandt. Es wird eine Substratlösung (30 ml) bestehend aus 2 % w/v Gummi Arabicum, 5 % v/v Substrat in Wasser hergestellt und mit einen Homogenisator e- mulgiert. Dazu wird 1 ml Enzymlösung gegeben. Die in der Reaktion freigesetzte Säure wird mit 0,01 M Natronlauge zurücktitriert, um den pH-Wert konstant zu halten. Aus der Menge an NaOH berechnet man die Menge der freigesetzten Säure und folglich die Aktivität des Enzyms. Zur Bestimmung der Autohydroly- se wird die Enzymlösung durch destilliertes Wasser ersetzt. Die Messungen werden bei 37 °C und pH 7,5 jeweils dreimal durchgeführt. Die erhaltenen Aktivitätswerte in U/ml werden auf die GesamtZusammensetzung aus Oliven bzw. Olivenbestandteilen und Enzymmischung (d.h. die Aktivität in der bereits zur Ölgewinnung eingesetzten Enzymmischung) umgerechnet.
Die Phospholipase C-Aktivität wird mit p-Nitrophenyl- phosphorylcholin als Testsubstanz durchgeführt. Zu 50 μl einer p-Nitrophenylphosphorylcholin-Lösung (100 mM in 50 mM Borax- HCl, pH 7,5) werden 50 μl Enzymlösung gegeben. Das durch die Hydrolyse von p-Nitrophenylphosphorylcholin entstehende p- Nitrophenol wird bei 410 nm am Photometer gemessen. Als Negativkontrolle wird die Enzymlösung durch destilliertes Wasser ersetzt. Zur Kalibrierung (Eichung) wird eine p- Nitrophenollösung (100 mM in 50 mM-Borax-HCl, pH=7,5) frisch angesetzt. Durch Herstellung geeigneter Verdünnungen und Vermessung dieser Lösungen bei 410 nm im Photometer ist die Erstellung einer Eichkurve möglich. Jede Messung wird jeweils dreimal durchgeführt. Die erhaltenen Aktivitätswerte in U/ml werden auf die Enzymmischung umgerechnet. Soweit p- Nitrophenyl-phosphorylcholin durch die Enzymlösungen nicht gespalten wird liegt keine Phospholipase C-Aktivität vor.
Die Erfindung wird nun anhand der nachstehenden nicht beschränkenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1 (Laborversuch, zur Erläuterung)
Etwa 900 g vorentölte Olivenmasse (Olea europaea hojiblanca cv., zweite Reifestufe) wurden eingewogen, mit 50 ml Wasser bzw. wäss- riger Enzymlösung versetzt und für 60 min bei 40°C in einem 2000ml Becherglas unter Rühren mit einem Wendelrührer (150 rpm) inkubiert. Danach wurde eine Fest-Flüssigtrennung durch Zentrifu- gation in 500 ml Edelstahlbechern in einer Heraus Zentrifuge vom Typ KS IV (2000 g, 20 °C) durchgeführt. Die Flüssig-Flüssig- Trennung erfolgte in einem Scheidetrichter bei Raumtemperatur über Nacht. Die wässrige Phase wurde abgelassen, der Auslauf trocken gewischt und die Menge des verbleibenden Öls gravimetrisch bestimmt. Die relative Ölausbeute bei alleinigem Zusatz von Wasser ohne Enzymmischung (Vergleichsprobe) betrug 0,41% (w/w), bei einem Zusatz von 10 μl einer erfindungsgemäßen Enzymmischung (Enzymquellen wie vorstehend angegeben) : exo-PGase : 900 U/ml Pektinlyase : 61 . 400U/ml endo-PGase : 5 . 500 U/ml (Viskositätstest; Substrat : Pektin) endo-PGase : 2 . 060 U/ml (Viskositätstest; Substrat : PGA) Pektinesterase 340 U/ml Cl-Cellulase : 2 , 8 U/ml (Avicelase) Laminarinase : 9 , 3 U/ml Xylanase : 1 . 820 U/ml
betrug die Ausbeute 1,11% (w/w) oder 270% der Vergleichsprobe, bei einem Zusatz von 50 μl der erfindungsgemäßen Enzymmischung betrug die Ausbeute 1,14% (w/w) oder 278% der Vergleichsprobe, bei einem Zusatz von 100 μl der erfindungsgemäßen Enzymmischung betrug die Ausbeute 1,26% (w/w) oder 307% der Vergleichsprobe und bei einem Zusatz von 200 μl der erfindungsgemäßen Enzymmischung betrug die Ausbeute 1,45% (w/w) oder 354% der Vergleichsprobe. Beispiel 2 (Laborversuch, zur Erläuterung)
Etwa 600 g vorentölte Olivenmasse (Olea europaea hojiblanca cv. , dritte Reifestufe) wurden eingewogen und ohne bzw. mit wässriger Enzymlösung für 60 min bei 35°C in einem Edelstahlgefäß unter Rühren mit einem Wendelrührer (150 rpm) inkubiert. Die Fest- Flüssigtrennung erfolgte durch Zentrifugation bei 3.500 g für 60s. Die Ölausbeute wurde nach einstündiger Phasentrennung in einem Standzylinder volumetrisch bestimmt.
Die relative Ölausbeute ohne Enzymzusatz (Vergleichsprobe) betrug 2,5 ± 0,1% (w/w), bei einem Zusatz von 150 μl der erfindungsgemäßen Enzymmischung (vgl. oben) betrug die relative Ausbeute 4,0 ± 0,2% (w/w) oder 163,6 ± 4,2% (w/w) der Vergleichsprobe, bei einem Zusatz von 250 μl der erfindungsgemäßen Enzymmischung betrug die relative Ausbeute 4,3 + 0,2% (w/w) oder 177,3 ± 3,9% (w/w) der Vergleichsprobe, bei einem Zusatz von 350 μl der erfindungsgemäßen Enzymmischung betrug die relative Ausbeute 4,8 + 0,1% (w/w) oder 195,5 + 2,0% (w/w) der Vergleichsprobe und bei einem Zusatz von 450 μl der erfindungsgemäßen Enzymmischung betrug die relative Ausbeute 4,9 ± 0,1% (w/w) oder 200,0 ± 2,0% (w/w) der Vergleichsprobe.
Beispiel 3 (Industrieller Versuch, Technikum, zur Erläuterung)
1.500 kg Oliven der Sorte Olea europaea hojiblanca cv. , 2. Reifephase, wurden eingewogen, zerkleinert (Hammermühle) und mit 1,5% (w/w) Talk (22.2 kg) für 68 min bei 28-30 °C im horizontalen Rührbad (Pieralsi) inkubiert. Der Massenstrom war Q = 1100 kg/h. Das Öl wurde durch Fest-/Flüssigtrennung in einem horizontalen Zwei- Phasendekanter (Modell M-2 Pieralisi) und Flüssig-/Flüssigtren- nung in einer Zentrifuge isoliert (jeweils kontinuierlich) . Rest- ölgehalt und Feuchtigkeit der entölten Olivenmasse wurden bestimmt (Versuche 3F0498 und 3F0502) . Anschließend wurden 1.250 kg der entölten Olivenmasse aus dem ersten Prozessschritt eingewogen. Die Masse wurde ohne Enzymzusatz (Referenzprobe) bzw. mit einem Zusatz von 150 ml erfindungsgemäßer Enzymmischung (vgl. o- ben) pro Tonne, jedoch in beiden Fällen ohne weiteren Zusatz von Talk, für 50 min bei 37-40°C (Referenzprobe) bzw. 39-40°C (enzymbehandelte Probe) im horizontalen Rührbad inkubiert. Das Öl wurde durch Fest-/Flüssigtrennung in einem horizontalen Zwei- Phasendekanter (Modell M-2 Pieralisi) und Flüssig-/Flüssigtren- nung in einer Zentrifuge isoliert (jeweils kontinuierlich) . Der Massenfluss betrug wiederum Q = 1.100 kg/h. Restölgehalt und Feuchtigkeit in Referenzprobe (Versuch 3F0500) und behandelter Probe (3F0504) wurden bestimmt. Zweiphasen, siehe Beschreibung.
Die Bestimmung des Restölgehaltes wurde durch Soxhlet-Extraktion (Spanische Einheitsnorm UNE 55030) vorgenommen, die Bestimmung des Feuchtigkeitsgehaltes durch Trocknen bei 110 °C bis zur Gewichtskonstanz .
Versuch 3F0498 (Olivenpulpe nach erster Pressung Referenzprobe)
TM Trockenmasse Versuch 3F0500 (Olivenpulpe nach zweiter Pressung Referenzprobe)
Versuch 3F0502 (Olivenpulpe nach erster Pressung behandelte Probe)
Versuch 3F0504 (Olivenpulpe nach zweiter Pressung behandelte Pro- be)
Die relative Ölausbeute aus der zweiten Pressung ergibt sich durch die Berechnung der Differenz zwischen Restölgehalt in der Rohmasse nach dem ersten Schritt und dem äquivalenten Restölgehalt nach dem zweiten Schritt, geteilt durch den Restölgehalt aus dem ersten Schritt.
Für die Referenzprobe 3F0500 bedeutet dieses, dass im Verhältnis zur Probe 3F0498 eine relative Ölausbeute von 1,50% ± 0,04% : 3,62% ± 0,03%, entsprechend 41,44% + 1,42% bezogen auf Rohmasse erreicht wurde. Bezogen auf Trockenmasse ergibt sich eine relative Ölausbeute von 2,73% + 0,08% : 7,75% ± 0,04%, entsprechend 35,22% ± 1,21%.
Für die mit der erfindungsgemäßen Enzymmischung behandelten Probe 3F0504 bedeutet dieses, dass im Verhältnis zur Probe 3F0502 eine relative Ölausbeute von 1,70% ± 0,04% : 3,64% ± 0,04%, entsprechend 46,70% ± 1,21% bezogen auf Rohmasse erreicht wurde. Bezogen auf Trockenmasse ergibt sich eine relative Ölausbeute von 3,26% ± 0,09 % : 7,88 % + 0,09%, entsprechend 41,37% ± 1,62%. Bei einer Zugabe von 150 ml erfindungsgemäßer Enzymmischung pro Tonne vorentölter Olivenmasse konnte in diesem Versuch eine mittlere Mehrausbeute von 17,5% bezogen auf Trockenmasse erzielt werden kann.
Beispiel 4 (Industrieller Versuch, Industrieanlage, "gelagert", zur Erläuterung)
Insgesamt 31.000 kg vorentölte Olivenmasse, gewonnen aus der Sorte Olea europaea picual cv. , die für 24 Tage unter Luftabschluss gekühlt gelagert worden war wurden als Ausgangsmaterial für den nachfolgend beschriebenen Versuch eingesetzt. In einem semiparallelen Ansatz wurden zunächst jeweils 15.500 kg dieser Olivenmasse ohne bzw. mit Zusatz der erfindungsgemäßen Enzymmischung (insgesamt 250 g/t, aufgenommen in 1,5 1 Wasser) für 60 min bei 33-35°C in horizontalen Rührbädern mit zwei Ebenen (Pieralisi) inkubiert. Das Öl wurde durch Fest-/Flüssigtrennung in einem horizontalen Zwei-Phasendekanter (Modell SPI7 Pieralisi, Massenstrom 2500-2725 kg/h) und Flüssig- /Flüssigtrennung in einer Zentrifuge (Modell P2000 Pieralisi) unter Zugabe von 300 1/h Wasser mit einer Temperatur von 38 °C isoliert. Das in den parallelen Ansätzen isolierte Öl wurde anschließend gelagert und die Ausbeute über Ablesen einer Niveauanzeige in den Lagerungsbehältern bestimmt, wobei 1 cm Niveauunterschied einer Ölmenge von 95,26 kg entsprach.
Spezifikationen:
Feuchtigkeit (Rest-) 01 (Rest-) 01 (w/w) in TM (w/w) in Rohmasse (w/w)
Ausgangsmasse 73,58% 12,54% ό f JL'ö für Referenz
Masse nach Pro74,62% 4,69% 1,19% zess Referenz
Ausgangsmasse 73,14% 12,99% 3,49% für Behandlung
Masse nach Prozess mit Enzym75,33% 0,50% 0,12% behandlung
Niveau- Ölmenge Rel. Ausbeute Unterschied
Referenz (ohne erf.-gem. 3,5 cm 333,41 kg 2,15% Enzymmischung)
Behandelte Probe (mit 5,5 cm 523,93 kg 3 , 38-s erf.-gem- Enzymmischung)
Bei einer Zugabe von 250 g erfindungsgemäßer Enzymmischung pro Tonne vorentölter Olivenmasse unter den gegebenen Bedingungen konnte in diesem Versuch bezogen auf die bestimmten Trockenmassen (TM) eine Mehrausbeute von 63% im Vergleich zur unbehandelten Referenzprobe erzielt werden. Der minimale Restölgehalt in der behandelten Olivenmasse macht eine Weiterverarbeitung in einem chemisch-extraktiven Verfahren überflüssig. Beispiel 5: Verfizierung der idealen Enzymverhältnisse (zur Erläuterung)
In die Untersuchungen wurde das kommerziell erhältliche Produkte Olivex® der Firma Novozymes A/S, DK, einbezogen (nachstehend als KPl bezeichnet) . Für die nachfolgend beschriebenen Experimente wurden alle Enzymaktivitäten gemäß den im vorstehenden Methodenteil aufgeführten Verfahren bestimmt. Dabei konnten die in der nachfolgenden Tabelle aufgeführten Einzelaktivitäten bestimmt werden:
Enzymaktivität KPl (U/ml) exo-PGase 1.710 endo-PGase* 2.720 Pektinesterase 270 Cl-Cellulase 4 Laminarinase 21
* bestimmt gemäß Methodenteil mit PGA (Pektinsäure) als Substrat
Für die Vergleichsmessungen wurden jeweils 600 g vorentölte Olivenmasse (Olea europaea hojiblanca cv., dritte Reifestufe) eingewogen und ohne bzw. mit wäßriger Enzymlösung (150 μl des Vergleichsprodukts, ggf. plus Zugabe von Pektinesterase) für 60 min bei 35 °C in einem Edelstahlgefäß unter Rühren mit einem Wendelrührer (150 rp ) inkubiert. Die Fest-Flüssigtrennung erfolgte durch Zentrifugation bei 3.500 g für 60 s. Die Ölausbeute wurde nach einstündiger Phasentrennung in einem Standzylinder volumetrisch bestimmt.
Unterschiedliche Verhältnisse zwischen Pektinesterase und den anderen Enzymen wurden in den Versuchen durch Zugabe von definierten Mengen einer Pektinesterase aus Orangenschale (Sig- ma/Aldrich, Katalognummer P5400) eingestellt. Dafür wurde das lyophilisierte Enzym in einem Puffer (3,2 M (NH4)2S04 und 0,1 M NaCl, pH=7,0) aufgenommen und auf eine Aktivität von 75 U/ml eingestellt. Die Zugabe wurde in Inkrementen von jeweils 7,5 U durchgeführt, es erfolgte eine Doppelbestimmung. Die Versuchsergebnisse sind in nachfolgender Tabelle zusammengestellt. Die Ölausbeute ohne jegliche Enzymzugabe betrug 14,7 + 0,6 ml, die Ölausbeute bei Zugabe von 150 μl der erfindungsgemäßen Enzymmischung betrug 24,5 + 0,4 ml.
Eine grafische Auswertung beider Analysen ist in Fig. 1 zu finden. Es wird deutlich, dass die Veränderung der Verhältnisse der Enzymaktivitäten durch Zugabe von Pektinesterase zum Produkt KPl zu einer deutlichen Verbesserung der Ölausbeute führt.
Die aus der Zugabe von Pektinesterase resultierenden Veränderungen der Aktivitätsverhältnisse sind in den nachfolgenden Tabellen dargestellt, Volumeneffekte wurden dabei nicht berücksichtigt. Aus den Tabellen geht hervor, dass die Einstellung der Verhältnisse der Enzymaktivitäten in die erfindungs- gemäßen Bereiche mit einer starken Erhöhung der Ölausbeute bei KPl korreliert ist.
Einstellung Enzymaktivitäten KPl
Zugabe Aktivität PEase PEase: PEase:
PEase [U] [U] exo-PGase encfo-PGase 0,0 40,5 0,158 0,099 7,5 48,0 0,187 0,118 15,0 55,5 0,216 0,136 22,5 63,0 0,246 0,154 30,0 70,5 0,275 0,173 37,5 78,0 0,304 0,191 45,0 85,5 0,333 0,210 52,5 93,0 0,363 0,228 60,0 100,5 0,392 0,246 67,5 108,0 0,421 0,265 75,0 115,5 0,450 0,283 82,5 123,0 0,480 0,301 90,0 130,5 0,509 0,320
Die nachstehenden Beispiele 6 und 7 wurden zum Nachweis der biotechnologischen Prozessoptimierung bei der Ölgewinnung unter Verwendung der erfindungsgemäßen Enzymmischung durchgeführt .
Beispiel 6: Reduktion des Ölgehaltes des wässrigen Dekanter- ausstroms in Abhängigkeit von der Prozesstemperatur; Erhöhung der Ölausbeute
Vorentölte Olivenpulpe wurde einem Mischbehälter mit vertikalem Rührgestänge kontinuierlich aus einem Vorratsbecken zugeführt. Die Leistung dieses Mischbehälters betrug 25 mt/h bei einer mittleren Verweilzeit von 60 min. Die Pulpe wurde dabei auf eine Temperatur von 45 °C aufgeheizt. Von diesem Mischbehälter wurde die Olivenpulpe in einen Mischbehälter mit horizontalem Rührgestänge (Typ Pieralisi Kneader 900 4 basins) gefördert. Bei einer mittle- ren Verweilzeit von 40 Minuten betrug der Durchsatz dieser Prozesseinheit 11 t/h. Die Olivenpulpe wurde von diesem horizontalen Mischbad zu zwei Dreiphasen-Dekantern vom Typ Pieralisi Giant 2 gefördert. Diese Dekanter hatten einen nominalen Durchsatz von etwa 7 mt Olivenpulpe pro Stunde, waren jedoch auf die durch den Prozess vorgegebenen Massenströme eingestellt. Die nachfolgend beschriebenen Ergebnisse stammen aus der Analyse von Proben, die aus dem wässrigen Auslauf { Papilla) beider Dekanter entnommen worden sind.
Zur Untersuchung der Wirkung der erfindungsgemäßen Enzymmischung gemäß Beispiel 1 wurden der dem horizontalen Mischbehälter zugeführten Olivenpulpe direkt an der Einlassöffnung über einen Zeitraum von 12 Stunden 80, 160 bzw. 240 ml/mt der erfindungsgemäßen Enzymmischung gemäß Beispiel 1 mittels einer Pumpe zugesetzt. Die Badtemperatur betrug 45°C bzw. 37°C bzw. 41°C. Die jeweiligen Proben zur Analyse der Wirkungsweise der erfindungsgemäßen Enzymkomposition wurden 6 h nach Beginn der Enzymzugabe aus der Papilla direkt an den Dekantern entnommen. 6 Stunden nach Beendigung der Enzymzugabe wurde an den gleichen Entnahmenstellen Vergleichsproben entnommen. Auf diese Weise war ein direkter Vergleich zwischen den Prozessergebnissen bei Zugabe bzw. ohne Zugabe der erfindungsgemäßen Enzymmischung möglich.
Ergebnisse für folgende Parameter wurden bei der Analyse der Proben ermittelt: Wassergehalt Papilla und Ölgehalt Papilla. Die Ergebnisse für die Zugabe von 80, 160 bzw. 240 ml/mt der erfindungsgemäßen Enzymmischung sind in den nachfolgenden Tabellen 1, 2 und 3 zusammengestellt. Tabelle 1: Versuchsergebnisse bei Zugabe von 80 ml/mt der erfindungsgemäßen Enzymmischung (T=45°C)
Tabelle 2: Versuchsergebnisse bei Zugabe von 160 ml/mt der erfindungsgemäßen Enzyinmischung (37°C)
Die weitere Auswertung dieser Analysendaten brachte folgende Ergebnisse:
1. Die Zugabe von 80 ml der erfindungsgemäßen Enzymmischung pro Tonne Olivenpulpe unter den gegebenen Prozessbedingungen (T=45°C) führt im Vergleich zur unbehandelten Olivenpulpe zu einer Erhöhung des Wassergehaltes in der Papilla von bis zu 2,61% und zu einer Erniedrigung des Öl- gehaltes in der Papilla von bis zu 28,44%. Die Ölausbeute in diesem Prozessschritt stieg um bis zu 38,26%.
Die Zugabe von 160 ml der erfindungsgemäßen Enzymmischung pro Tonne Olivenpulpe unter den gegebenen Prozessbedingungen (T=37°C) führt im Vergleich zur unbehandelten Oli- venpulpe zu einer Erhöhung des Wassergehaltes in der Papilla von bis zu 2,78% und zu einer Erniedrigung des Öl- gehaltes in der Papilla von bis zu 38,30%. Die Ölausbeute in diesem Prozessschritt stieg um bis zu 29,03%.
Unter den gegebenen Bedingungen zeigt die Zugabe von 160 ml der erfindungsgemäßen Enzymmischung pro Tonne Olivenpulpe besonders vorteilhafte Wirkung in Bezug auf die Wasser- und Ölgehalt der Papilla sowie Ölausbeute. Eine positive Wirkung bezogen auf die genannten Parameter wird auch durch die Zugabe von 80 ml der erfindungsgemäßen Enzymmischung erreicht, allerdings ist wurde hier parallel eine Temperaturerhöhung um 8°C im Vergleich zu den Versuchen mit 160 ml/t durchgeführt.
Es kann also festgehalten werden, dass sich die Zugabe von 160 ml der erfindungsgemäßen Enzymmischung pro Tonne Olivenpulpe bei einer Temperatur von ~37°C besonders vorteilhaft auf die Trennleistung sowie auf die Ölausbeute im betrachteten Prozess auswirkt, jedoch ergibt auch die Analyse der anderen Ergebnisse, dass bei anderen Temperaturen und anderen Enzymkonzentrationen vorteilhafte Effekte beobachtet werden können.
Beispiel 7: Ökonomie des Gesamtprozesses
Vorentölte Olivenpulpe wurde einem Mischbehälter mit vertikalem Rührgestänge kontinuierlich aus einem Vorratsbecken zugeführt. Die Leistung dieses Mischbehälters betrug 25 mt/h bei einer mittleren Verweilzeit von 60 min. Von diesem Mischbehälter wurde die Olivenpulpe direkt, d.h. ohne Zwischenschaltung eines Mischbehälters mit horizontalem Rührgestänge, zu Dreiphasen-Dekantern (Pieralisi, Typ Giant 2) gefördert. Diese Dekanter hatten einen nominalen Durchsatz von etwa 7 mt Olivenpulpe pro Stunde, waren jedoch auf die durch den Prozess vorgegebenen Massenströme eingestellt. Die nachfolgend beschriebenen Ergebnisse stammen aus der Analyse von Proben, die direkt an einem beliebig gewählten Dekanter entnommen worden sind. Die Temperatur der Olivenpulpe im Prozess war 32°C.
Zur Untersuchung der Wirkung der erfindungsgemäßen Enzymmischung gemäß Beispiel 1 wurden der dem vertikalen Mischbehälter zugeführten Olivenpulpe direkt an der Einlassöffnung über einen Zeitraum von 12 Stunden 160 bzw. 240 ml/mt der erfindungsgemäßen Enzymmischung mittels einer Pumpe zugesetzt. Die jeweiligen Proben zur Analyse der Wirkungsweise der erfindungsgemäßen Enzymkomposition aus den Prozessströmen des Dekanters (prozessierte Olivenpulpe {Alperujo) , wässrige Phase (Papilla) ) wurden 6 h nach Beginn der Enzymzugabe entnommen. Die produzierte Ölmenge wurde kontinuierlich durch die anlagenseitig vorhandene Messtechnik bestimmt. Nach 12 h wurde die Enzymzugabe gestoppt. 6 Stunden nach Beendigung der Enzymzugabe wurde an den gleichen Entnahmenstellen Vergleichsproben entnommen. Auf diese Weise war ein direkter Vergleich zwischen den Prozessergebnissen bei Zugabe bzw. ohne Zugabe der erfindungsgemäßen Enzymmischung möglich.
Ergebnisse für folgende Parameter wurden bei der Analyse der Proben ermittelt: Wassergehalt Alperujo, Ölgehalt Alperujo, Wassergehalt Papilla und Ölgehalt Papilla. Außerdem wurde die Prozesseffizienz, bezogen auf die Ölausbeute, zum Zeitpunkt der jeweiligen Probennahme bestimmt. Die Ergebnisse für die Zugabe von 160 bzw. 240 ml/mt der erfindungsgemäßen Enzymmischung sind in den nachfolgenden Tabellen 3 und 4 zusammengestellt. Tabelle 3: Versuchsergebnisse bei Zugabe von 160 ml/mt der erfindungsgemäßen Enzymmischung
Tabelle 4: Versuchsergebnisse bei Zugabe von 240 ml/mt der erfindungsgemäßen Enzymmischung
Die weitere Auswertung dieser Analysendaten brachte folgende Ergebnisse:
1. Die Zugabe von 240 ml der erfindungsgemäßen Enzymmischung pro Tonne Olivenpulpe unter den gegebenen Prozessbedingungen führt im Vergleich zur unbehandelten Olivenpulpe zu einer Erhöhung des Wassergehaltes im Alperujo von 4,24%, zu einer Erniedrigung des Ölgehaltes im Alperujo von 12,42%, zu einer Erhöhung des Wassergehaltes in der Papilla von 1,07% und zu einer Erniedrigung des Ölgehaltes in der Papilla von 8,73%. Die Ölausbeute in diesem Prozessschritt sank um 2,22%. 2. Die Zugabe von 160 ml der erfindungsgemäßen Enzymmischung pro Tonne Olivenpulpe unter den gegebenen Prozessbedingungen führt im Vergleich zur unbehandelten Olivenpulpe zu einer Erniedrigung des Wassergehaltes im Alperujo von 13,85%, zu einer Erniedrigung des Ölgehaltes im Alperujo von 13,25%, zu einer Erhöhung des Wassergehaltes in der Papilla von 0,13% und zu einer Erniedrigung des Ölgehaltes in der Papilla von 3,94%. Die Ölausbeute in diesem Prozessschritt stieg um 4,94%.
Unter den gegebenen Bedingungen zeigt die Zugabe von 160 ml der erfindungsgemäßen Enzymmischung pro Tonne Olivenpulpe besonders vorteilhafte Wirkung in Bezug auf die Ökonomie des Gesamtprozesses. Eine positive Wirkung bezogen auf die Gesamtprozessökonomie wird auch durch die Zugabe von 240 ml der erfindungsgemäßen Enzymmischung erreicht, wenn auch nicht so stark ausgeprägt, wie bei der Zugabe von 160 ml.
Von besonderer Bedeutung ist, dass diese Experimente bei einer Prozesstemperatur von 32 °C durchgeführt wurden. Auch bei dieser vergleichsweise niedrigen Temperatur hat der Einsatz der erfindungsgemäßen Enzymmischung einen stark positiven Effekt auf die Prozessökonomie .

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Gewinnung von Öl aus Massen aus Oliven und/oder Olivenbestandteilen, umfassend die folgenden Schritte: a. Bereitstellen einer Masse aus Oliven und/oder Olivenbestandteilen, ohne Entfernung der Olivenkerne; b. Zugabe eines Enzyms oder einer Enzymmischung enthaltend mindestens eine Pektinesterase in flüssiger oder fester Form; c. Vermischen der Masse und der Enzymmischung; d. Abtrennen der Ölphase von der Masse mit Hilfe eines Drei- phasen-Dekanters .
2. Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend den folgenden Schritt: Inkubation der Mischung aus Anspruch 1 c, insbesondere bei einer Temperatur zwischen 20 und 60 °C, und insbesondere über 5 bis 120 min.
3. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei als Masse aus Oliven und/oder Olivenbestandteilen eine vorentölte Masse eingesetzt wird.
4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei in mindestens einem Schritt vorentölte Olivenpulpe ohne Zwischenschaltung eines Mischbehälters mit horizontalem Rührgestänge (Malaxer) und/oder eines Mischbehälters mit vertikalem Rührgestänge einem Dreiphasen-Dekanter zugeführt wird.
5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Enzymmischung mindestens eine Pektinesterase, mindestens eine endo-Polygalacturonase und mindestens eine exo- Polygalacturonase enthält, und worin vorzugsweise das Verhält- nis der Aktivität der Pektinesterase zur Aktivität der endo- Polygalacturonase mindestens 0,13 beträgt, und vorzugsweise das Verhältnis der Aktivität der Pektinesterase zur Aktivität der exo-Polygalacturonase mindestens 0,3 beträgt.
6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis der Aktivität der Pektinesterase zur Aktivität der endo-Polygalacturonase mindestens 0,15, vorzugsweise mindestens 0,16 beträgt.
7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis der Aktivität der Pektinesterase zur Aktivität der exo-Polygalacturonase mindestens 0,33 beträgt.
8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in der Enzymmischung zusätzlich mindestens eine Laminarinase enthalten ist und das Verhältnis der Aktivität der Pektinesterase zur Aktivität der Laminarinase mindestens 20, vorzugsweise mindestens 30 beträgt.
9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in der Enzymmischung zusätzlich mindestens eine Cl-Cellulase enthalten ist und das Verhältnis der Aktivität der Pektinesterase zur Aktivität der Cl-Cellulase mindestens 75, vorzugsweise mindestens 100 beträgt.
10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in der Enzymmischung folgende Enzymaktivitäten enthalten sind: a. Pektinesterase: mehr als 300 U/ml, insbesondere mehr als 320 U/ml b. exo-Polygalacturonase: weniger als 1000 U/ml c. endo-Polygalacturonase: zwischen 1500 und 2500 U/ml, d. Laminarinase: weniger als 15 U/ml, insbesondere weniger als 12 U/ml e. Cl-Cellulase: weniger als 3,3 U/ml f. Pektinlyase: zwischen etwa 25.000 und 150.000 U/ml
11. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass darin mindestens 50 ml, insbesondere zwischen 50 und 400 ml, vorzugsweise zwischen 100 und 300 ml, besonders bevorzugt zwischen 125 und 250 ml der Enzymmischung pro Tonne Masse enthalten sind.
12. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in der Enzymmischung die Proteinkonzentration zwischen 2 und 20 mg/ml, vorzugsweise 2 und 12 mg/ml, insbesondere 3 und 10 mg/ml liegt.
13. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Verfahren zur Gewinnung von Öl aus vorentölten Massen aus Oliven und/oder Olivenbestandteilen handelt.
14. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein physikalisches oder mechanisch-physikalisches Ölgewinnungsverfahren handelt.
15. Verwendung einer Enzymmischung wie in einem der vorstehenden Ansprüche definiert in einem Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche zur Verbesserung der Fest- /Flüssigtrennung bei der Ölgewinnung, insbesondere bei der Entölung einer vorentölten Masse aus Oliven bzw. Olivenbestandteilen.
16. Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Fest-/Flüssigtrennung ausschließlich mit Hilfe mindestens eines Dreiphasen-Dekanters erfolgt.
17. Verwendung nach einem der Ansprüche 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Ölausbeute bei der Fest- /Flüssigtrennung erhöht wird.
18. Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Ölgehalt des wässrigen Ablaufs aus dem Dreiphasen-Dekanter gesenkt und/oder die abgetrennte Wassermenge im wässrigen Ablauf erhöht wird.
19. Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Öl- und/oder Wassergehalt der mit Hilfe des Dreiphasen-Dekanters gewonnenen Festphase reduziert wird.
20. Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 19, um die Prozesstemperatur bei zumindest gleichbleibender Ölausbeute absenken zu können.
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