DE1470507A1 - Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen - Google Patents

Description

The British Petroleum Company Limited, Britannio House, Finabury Circus, London, E.C.2 (England).

Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen

Die Erfindung bezieht sioh auf die Erzeugung von Mikroorganismen, beispielsweise Hefe, und/oder die Gewinnung von Mikroorganismen und/oder die Gewinnung von Produkten daraus» Die Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zur vollständigen oder teilweisen Entfernung von geradkettigen Kohlenwasserstoffen aus Gemischen mit anderen Kohlenwasserstoffen_e

Das Verfahren gemäß der Erfindung besteht im wesentlichen darin, daß man Mikroorganismen in Gegenwarb eines Einsatzmaterial», das eine gebundenen Kohlenstoff enthaltende Verbindung enthält, in Gegenwart eines wässrigen Nährmediume und in Gegenwart eines Gases, das freien Sauerstoff enthält, züchtet»

AIa Einsatzmaterialien, die gebundenen Kohlenstoff enthalten, kommen Wasserstoff und Sauerstoff enthaltende Materialien, z.B. Kohlehydrate, in Frage. Sin spezielles Einsatzmaterial, das verwendet werden kann, ist ein Extrakt von Lipiden, der beispielsweise bei der Reinigung von Hefe durch Lösungsmittelextraktion erhalten wird. Weitere geeignete Einsatzmaterialien sind ungesättigte Fettsäuren oder ungesättigte Fette«

ORIQWAL JNePECTED

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Vorzugsweise werden als Einsatzmaterialien gradkettige Kohlenwasserstoffe oder Gemische von Kohlenwasserstoffen, die einen geradkettigen Kohlenwasserstoff enthalten, verwendet. Vorteilhaft können Kohlenwasserstofffraktionen aua Erdöl eingesetzt werden,,

Das Verfahren gemäß der Erfindung ist von besonderem Wert für die Behandlung von G-asö If rakt ionen aus Erdöl, die geradkettige Kohlenwasserstoffe in Form von Wachsen enthalten, da durch das erfindungsgemäße Verfahren ein Gasöl von verbessertem Fließpunkt erhalten wird, während die Wachse in ein wertvolle Produkt umgewandelt werden«

Die geradkefctigen Kohlenwasserstoffe sind in den gemäß der Erfindung verwendeten Einsatzmaterialien gewöhnlioh ale Paraffine anwesende Sie können jedoch auoh als Olefine vorhanden sein« Ferner können Gemische verwendet werden, die geradkettige Paraffine und Olefine enthaltene Das Einsatzmaterial hat zweckmäßig ein mittleres Molekulargewicht, das einem Kohlenwasserstoff mit wenigstens 10 Kohlenstoffatomen im Molekül entspricht.

Es ist ein wichtiges Kennzeichen der Erfindung, dass bei der Züchtung von Hefe in Gegenwart der vorstehend beschriebenen Einsatzmaterialien unter Bedingungen, die das Wachstum der Hefe auf Kosten der geradkettigen Kohlenwasserstoffe begünstigen, die übrigen Kohlenwasserstoffe, z„B. Isoparaffine Naphthene und Aromaten,nicht aufgespalten werden oder ihr aufgespaltener Anteil bestenfalls sehr gering ist» Ferner wird im Gegensatz zu üblichen chemischen Verfahren, die dem Massenwirkungsgesetz gehorchen, die Geschwindigkeit der Entfernung von geradkettigen Kohlenwasserstoffen mit kleiner werdendem Anteil dieser Kohlenwasserstoffe im Gesamtgemisoh der Kohlenwasserstoffe nicht wesentlich geringer (ausgenommen natürlich in den letzten Phasen der Entfernung)„ So kann, fallt» gewünscht, der erreichte prozentuale Umsatz der geradkettigen Kohlenwasserstoffe bei einem Y/ert gehalten werden, der sich 100 nähert, ohne daß ein unverhältnismäßig hoher

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Aufwand an Kontaktzeit erforderlich ist, um geringe Verbesaerungen zu erzielen» Ferner kann bei einen kontinuierlichen Verfahren dieser hohe Umsatz erreicht werden, ohne die Anwendung eines langen Reaktionsweges zu Hilfe zu nehmen,

Geeignete Eineatzmaterialien für das Verfahren gemäß der Erfindung sind Leuchtpetroleum, Gasöle und Schmieröle. Diese Eineatzmaterialien können unraffiniert sein oder einer gewissen raffinierenden Behandlung unterworfen werden, jedoch müssen sie geradkettige Kohlenwasserstoffe enthalten, um für die Zwecke der Erfindung geeignet zu sein_o Zweckmäßig beträgt der Gehalt an geradkettigen Kohlenwasserstoffen in der Erdölfraktion 3-45 Gew„-#_e

Durch Anwendung dieses Verfahrens unter Bedingungen, die die Aufspaltung der geradkettigen Kohlenwasserstoffe beschränken, ist es möglich, so zu arbeiten, daß nur ein gewünschter Teil dieser Kohlenwasserstoffe entfernt wird*

Gegebenenfalls kann ein Ausgangsmaterial, das erhebliche Paraffinmengen zusammen mit anderen Kohlenwasserstoffen enthält, einer Behandlung unterworfen werden, durch die ein paraffinisches Einsatzmaterial zur Verwendung beim Verfahren gemäß der Erfindung abgetrennt wird« Geeignet sind beispielsweise aufgearbeitete Fraktionen, z_oB. Gatsch oder andere Wachsfraktionen, wie sie beispielsweise bei der Entparaffinierung von Schmierölfraktionen anfallen, sowie Paraffine, die bei Trennverfahren unter Verwendung von Molekularsieben erhalten werden,,

Im allgemeinen ist keine besondere Vorbehandlung dea paraifinischen Binsatzmaterials für die Verwendung beim Verfahren gemäß der Erfindung erforderlich. Im allgemeinen können geringwertige Fraktionen verwendet werden, die als Nebenprodukte normaler Verfahren der Raffinerie anfallen,. Falle erwünscht, kann jedoch das Einsatzmaterial einer besonderen Vorbehandlung unterworfen werden«

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Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung trennt man Erdölfraktionen durch Destillation in a) eine Leuehtpetroleumfraktion, b) eine leichte Gasölfraktion und c) eine schwere Gasölfraktion, wobei das Siedeende der leichten Gasölfraktion beim Siedeanfang der schweren Gaeölfraktion liegt, behandelt anschließend das schwere Gasöl mit einem Mikroorganismus, der auf Kosten der im schweren Gasöl enthaltenen geradkettigen Kohlenwasserstoffe wächst, und trennt anschließend das behandelte schwere Gasöl ab* Vorzugsweise wird das behandelte schwere Gasöl mit den Komponenten a) und b) gemischt. Gegebenenfalls können die Komponenten a) und b) durch Destillation als Einzelfraktionen gewonnen werden«

Falls beabsichtigt ist, die behandelte Komponente c) rück— zumischen, wird der Schnittpunkt zwischen den Komponenten b) und β) vorzugsweise in den Bereich zwischen 300 und 35O⁰O gelegt« Wenn diese Riickmisohung nicht beabsichtigt ist, sollte der 90#~Destillationepunkt der Komponente a) unter 36O⁰O liegen«,

Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Gatsch mit einem Mikroorganismus behandelt, dessen Wachstum auf der Grundlage der im Gatsch enthaltenen geradekettigen Kohlenwasserstoffe erfolgt. Anschließend wird der behandelte Gatsch abgetrenntο Vorzugsweise wird der behandelte Gatsch nach Vermischung mit einem Lösungsmittel entölte Ale Lösungsmittel eignen eich Methylethylketon oder Methylieo— butylketon. Der Gatsch kann naoh Desorption in einem Verdünnungsmittel, ZoB. einem entwachsten Gasöl, in den Gärbehälter gegeben werden. Dieses Verdünnungsmittel kann in der anschließenden Entölungestufe entfernt werden. Es ist auch möglich, den Gatsch dem Gärgefäß in einer Fora zuzuführen, bei der der in ihm enthaltenene Feststoff die Fora von feinen Teilehen hat, wie nachstehend näher beschrieben.

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Das Verfahren "besteht aus der Züchtung eines Mikroorganismus in Gegenwart eines Einsatzmaterials, das ganz oder zu einem erheblichen Teil aus geradkettigen olefinischen Verbindungen besteht» Vorzugsweise werden Kohlenwasserstoffe, insbesondere Gemische von Kohlenwasserstoffen aus Erdöl, eingesetzt. Zweckmäßig enthalten die Gemische mehr als 50 Gew.-# geradkettige olefinische Wasserstoffe. Vorteilhaft werden Fraktionen verwendet, die durch Kracken von Erdölfraktionen, Insbesondere Wachsen, erhalten werden» Die gemäß der Erfindung eingesetzte Kohlenwasserstofffraktion kann duroh Destillation aus dem gekrackten Gesamtprodukt erhalten werden» Diese Kohlenwasseretofffraktion besteht vorzugsweise überwiegend aus O^ q-CU-»-Kohlenwasserstoffen. Beispielsweise kann dieses Verfahren als integraler Teil oder als Vorstufe einer Anlage durchgeführt werden, deren Aufgabe die Herstellung von Olefinen für Waschrohstoffe ist. Gegebenenfalle können ungesättigte fettsäuren oder Fette, die olefinische Doppelbindungen enthalten, als olefinische Verbindungen eingesetzt werden,, Insbesondere können nicht genießbare Fette oder Fette von schlechter Qualität, z.Bo ranzige Fette, verwendet werden.

Nach einem weiteren Kennzeichen umfaßt die Erfindung somit ein Verfahren, bei dem Mikroorganismen in Gegenwart von Lipiden als Auegangsmaterial, in Gegenwart eines wässrigen Nährmediums und in Gegenwart eines Gases, das freien Sauerstoff enthält, gezüchtet werden. Die. lipide werden vorzugsweise durch Lösungsmittelextraktion eines Hefeoremes oder von Trockenhefe erhalten, die beide ihrerseits vorzugsweise durch Züchtung von Hefe auf Kohlenwasserstoffen erhalten werden.

Unter den hier gebrauchten Auedruck "Mikroorganismus" fallen auch Gemische von Mikroorganismen. Als Mikroorganismen, die gemäß der Erfindung gezüchtet werden, kommen Hefe, Pilze oder Bakterien in Frage.

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Bei Verwendung von Hefe gehört diese vorzugsweise zur Familie Cryptococcaccae, insbesondere zur Unterfamilie Gryptococcoidae. Gegebenenfalls können jedoch beispielsweise aacosporogene Hefen der Unterfamilie Sacoaromycelidae verwendet werden« Die bevorzugten Gattungen der Unterfamilie Cryptococcoidae sind Torulopsis (auch als Torula bekannt) und Candida« Die bevorzugten Hefestämme sind nachstehend aufgeführt. Besonders bevorzugt werden die Stämme, deren Hinterlegungsnummer in der folgenden Tabelle genannt ist« Die mit GBS gekennzeichneten Stämme sind beim Centraal Bureau vor Schimmelculture Baarn, Holland und die mit INRA gekennzeichneten Stämme beim Institut National de la Recherche Agronomique, Paris, erhältlich,,

Candida lipolytica

Candida puloherrima GBS 610

Candida utilis

Candida utilis, Variati majο CBS 841

Candida troplcalls CBS 2317

Torulopsis colliculosa OBS 133

Hansenula anomala CBS 110

Oidium laotis

Neurospora sitophila

lfcrooderma cancoillote INRA; STV 11

Von den vorstehend genannten Stämmen wird Candida lipolytica besonders bevorzugt«

Von den Pilzen kommen diejenigen der Familie Aspergillaceae in Frage. Eine geeignete Gattung ist Penioillium. Vorzugsweise wird Penicillium expansum verwendet. Als weitere verwendbare Gattung kommt Aspergillus in Frage.

Die Züchtung wird gewöhnlich in einem wässrigen Nährmedium durchgeführt. Gegebenenfalls können auch gewisse feste Nährmedien verwertet werden. In beiden Fällen muß ein Gas, das freien Sauerstoff enthält, zugeführt werden» Petiiccilium

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expansum eignet sieh, zur Züchtung ir. einem wässrigen Nährmediun:, das Kohlenwasserstoffe enthalte Penicillix-m Roqueforti, Penioillium Notatum, Aspergillus fussigatue, Aspergillus Niger und Aspergillus Versicolor kö.nnen auf einem festen Medium gezüchtet werden, das Kohlenwasserstoffe enthält„

Als Bakterien können die Ordnungen Pseudomonales, Eubacteriales und Actinomycetales verwendet werden₀ Vorzugsweise werden die Familien Bacillaceae und Pseudomonadaceae verwendet* Bevorzugte Spezies sind Bacillus megatherium, Bacillus subtilis und Pseudonomas aeruginosa«. Weitere geeignete Stämme sind:

Bacillus amylobacter

PseudomonaB natriegens

Arthrobacter sp„

MicroooccuB sp„

Corynebacterium miohiganense PseudomonaB syringae

Xanthomonas begoniae

Flavobaeterium sp_o devorans

Acetobacter sp_o ^v

Actinomyces ep,

Agrobacterium sp.

Aplanobaoter sp_e

Zum Wachstum der Mikroorganismen sind zusätzlich zum Einsatzmaterial ein wässriges Nährmedium und eine Sauerstoffquelle, vorzugsweise in Form von Luft, erforderlich«

Die Aufnahme von Sauerstoff ist für das Wachstum der Mikroorganismen wesentlich. Um die Wachstumsgeschwindigkeit hoch zu halten, muß die Luft, die den Sauerstoff liefert, durch Rühren in feine Blasen aerteilt werden. Die Luft kann durch eine Fritte eingeführt werden, jedoch kann auch das als "Wirbelbelüftung^H bekannte Syε',^m der Belüftung angewendet werden,,

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Es wurde festgestellt, daß bei Verwendung von Hefe des Stamms Candida lipolytica bei einem Verfahren gemäß der Erfindung, bei dem die Belüftung durch "Wirbelbelüftung" erfolgt, eine hohe Wachstumsgeschwindigkeit erreicht wird, wobei die Generationszeit im Bereich von 2-5 Stunden liegt und die Zellkonzentration in 2 Tagen um einen Faktor bis zu 12 erhöht wird»

Ein geeignetes Nährmittel fiir Hefe und Pilze hat folgende Zusammensetzung:

Diammoniumphosphat 2 g

Kaliumchlorid 1,15 g

Magnesiumsulfatheptahydrat 0,65 g

Zinksulfat 0,17 g

Mangansulfatmonohydrat 0,045 g

Ferrosulfatheptahydrat 0,068 g

Leitungswasser - 200 g

Hefeextrakt 0,025 g Destilliertes Wasser zur Auffüllung auf 1000 oar

Ein typisches Nährmedium für das Wachstum von Nooardia hat folgende Zusammensetzung:

Ammoniumsulfat 1 g

Magnesiumsulfat 0,20 g

Ferrosulfatheptahydrat 0,005g

Mangansulfatmonohydrat 0,002g

Monokaliumphosphat 2 g

Dinatriumphosphat 3 g

Calciumchlorid 0,1 g

Natriumcarbonat 0,1 g

Hefeextrakt 0,008g Destilliertes Wasser zur Auffüllung auf 1000 ^

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7	,2	g	g
O	,1	g	OBl
O	,5	g
2	g
1	OO cur*
O	,025
1	000

Für viele andere Bakterien eignet sich ein Nährmedium folgender Zusammensetzung:

Monokaliumphosphat Magne s iumsulfathep tahydrat Natriumchlorid

Ammoniumchlorid

Leitungswasser (Spurenelemente)

Hefeextrakt

Destilliertes Wasser zur Auffüllung auf

Einige Bakterien, z_eB<, Bacillus megatherium, können ohne Verwendung von Wachstumsfaktoren wachsen«,

Im allgemeinen, insbesondere bei Verwendung von Pseudonomas aeruginosa, wird der Pjj-Wert des Nährmediums im Bereich von 3-7,5, vorzugsweise im Bereich von 6-7, gehalten,, Als alkalische Materialien für den Zusatz zum Nährmedium eignen sich Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Dinatriumhydrogenphosphat und Ammoniak entweder in freier Form oder als wässrige Lösung.

Die optimale Temperatur des Nährmediums ist verschieden je naoh der Art der verwendeten Mikroorganismen und liegt gewöhnlich im Bereich von 25-38⁰C, Bei Verwendung von Pseudonomas aeruginosa wird ein Temperaturbereich von 30-38⁰C bevorzugt.

Es wurde festgestellt, daß bei Verwendung von Pseudonomas aeruginosa bei einem Verfahren gemäß der Erfindung, bei dem die Belüftung durch "Wirbelbelüftung" erfolgt, eine hohe Wachstumegeschwindigkeit erreicht wird, wobei die Generationszeit bei etwa 4 Stunden liegt und die Zellkonzentration in 2 Tagen um einen Faktor bis zu 15 erhöht wird.

Bei Beendigung des Wachstums erhält man eine Suspension, die Bakterien und (falls im Ausgangsmaterial vorhanden)

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2 c?

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nicht aufgespaltene Kohlenwasserstoffe in einer geschloaeenen Phase enthalte Je nach der Art der zu gewinnenden Bakterien kann diese Suspension durch Filtration und/oder Zentrifugieren getrennt werden,, Gewöhnlieh ist es vorteilhaft, Bakterien von eiförmiger Gestalt zu züchten, da die Abtrennung in diesem Fall durch Zentrifugieren erfolgen kann,, Die abgetrennten Bakterien können zur Entfernung von Kohlenwasserstoffen mit einem flüchtigen Lösungsmittel gewaschen werden.

Das Wachstum der verwendeten Mikroorganismen wird begünstigt, wenn man zum Nährmedium eine sehr geringe Menge eines Hefeextrakts (ein durch Hydrolyse von Hefe erhaltene», an Vitaminen der Gruppe B reiches industrielles Produkt) oder ganz allgemein an Vitaminen der Gruppe B und/oder Bioltin gibt. Diese Menge liegt vorzugsweise in der Größenordnung von 25 Teilen pro Million, bezogen&uf das wässrige Gärmedium. Sie kann höher oder niedriger sein je nach den für die Bebrütung gewählten Bedingungen,, Mikroorganismen, insbesondere Hefen, wachsen zuweilen nur mit Schwierigkeit, wenn sie erstmals unter Verwendung von Kohlenwasserstofffraktionen als Ausgangematerial gezüchtet werden« Zuweilen ist es erforderlich, zur Beimpfung eine Reinzüchtung eines Mikroorganismus zu verwenden, der vorher für das Wachstum auf der Kohlenwasserstofffraktion, deren Verwendung beabsichtigt iat, angepasst worden ist₀ Ferner ist es möglich, daß der Mikroorganismus trotz der Züchtung in einem wässrigen mineralischen Medium, das die geeigneten NähasLemente enthält, nur mit Schwierigkeit wächst, weil die Kohlen« Wasserstofffraktion nicht die Wachstumsfaktoren enthält, die in Kohlehydraten vorhanden sind, es sei denn, dass diese Wachstumsfaktoren zugesetzt werden.

Das Waohstum der Mikroorganismen erfolgt auf Kosten der Ausgangsfraktion unter Zwischenbildung von Körpern - haupteächlioh Fettsäuren - mit Säurefunktion, so daß der

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p-v-Wert des wässrigen mineralischen Mediums progressir sinktβ Ohne Korrektur kommt das Wachstum ziemlich schnell sum Stillstand, und die Konzentration des Mikroorganismus im Medium bezw« die Zelldichte nimmt nicht mehr zu, so daß eine eog. stationäre Phase erreicht wird₀

Das wässrige Medium wird daher vorzugsweise durch stufenweise oder kontinuierliche Zugabe eines wässrigen Mediums von hohem p„-Wert beim gewünschten p„.-Wert gehalten. Gewöhnlich wird der p^-Wert des Nährmediums bei Verwendung von Pilzen oder Hefen, insbesondere von Candida lipolytiea, im Bereich von 3-6, vorzugsweise von 4-5, gehalten, (Bakterien erfordern einen höheren p„-Wert von gewöhnlieh 6,5-8») Geeignete alkalische Materialien für den Zusatz zum Nährmedium sind Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Dinatriumhydrogenphosphat und Ammoniak in freier Form oder in wässriger Lösung.

Die optimale Temperatur des Nährmediums ist verschieden ^e nach der Art des verwendeten Mikroorganismus und liegt gewöhnlich im Bereich von 25~35°C_e Bei Verwendung von Candida lipolytiea wird ein Temperaturbereich von 28-32°C bevorzugte

Bei Chargenbetrieb wachsen die Mikroorganismen zunächst mit langsamer Zunahme der Zelldichte_β (Diese Wachstums— Periode wird nachstehend als "Trägheitsphase" bezeichnete) Danach steigt die Wachstumsgeschwindigkeit auf einen höheren Wert« Die Periode mit höherer Wachstumsgeschwindigkeit wird als "Exponent!alphase" bezeichnet. Anschließend wird die Zelldichte wieder konstant (die "stationäre Phase«). Eine gewisse Menge des Mikroorganismus für den Beginn der nächsten Charge wird vorzugsweise vor Beendigung der Exponentialphaee abgenommene Die Bebrütung wird gewöhnlich vor der stationären Phase abgebrochen.

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Zwar wurde die Erfindung bisher besonders im Zusammenhang mit der Durchführung der Wache turns stufe im Chargenbetrieb beschrieben, 3«doch werden offensichtlich bei großtechnischem Betrieb erhebliche Vorteile durch kontinuierliche Arbeitsweise erzielt. Insbesondere kann bei kontinuierlicher Arbeitsweise eine Induktionsperiode zu Beginn des Wachstums verkürzt oder ausgeschaltet werden. Die Durchführung der Wachsturnestufe unter kontinuierlichen Bedingungen fällt in den !Rahmen der Erfindung»

Nach einem weiteren Kennzeichen der Erfindung besteht das Verfahren aus einer Vorbehandlungsstufe, bei der tin Mikroorganismus in Gegenwart eines Vorbehandlungsmediums, das eine Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoff enthaltende Verbindung enthält, und der hierbei erhaltene Mikroorganismus anschließend in einer Wachstumsetufe in Gegenwart ein·» Wachstum»mediums, das einen geradkettigen Kohlenwasserstoff enthält, gezüchtet wird«, Vorzugsweise enthält das eingesetzt« Kohlenwasserstoffgemisch CL _o- oder höhere Kohlenwasserstoffe.

Wenn in dieser W^reise gearbeitet wird, wird die Trägheit·— phase, die gewöhnlich auftritt, wenn ein Mikroorganismus erstmals auf einem Kohlenwasserstoff als Auegangsmaterial gezüchtet wird, in Ihrer Wirkung abgeschwächt oder ausgeschaltet.

Sowohl bei der Vorbehandlungsstufe als auoh bei der Wachstums-•tufe let es erforderlich, in Gegenwart eines Gase«, das freien Sauerstoff enthält, und in Gegenwart eines wässrigen Haiirmediume su arbeiten« Die Zusammensetzung dieses Mediums kann In den beiden Stufen verschieden sein· Wenn Chargen*· weise gearbeitet wird, können die beiden Stufen iß. den gleichen oder verschiedenen Gärgefäßen durchgeführt werden. Bei kontinuierlicher Arbeitsweise sind getrennte Gärgefäfle oder getrennte Zonen im gleichen Gärgefäß erforderliehe

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Ale Auegangematerial In der Vorbehandlungsstufe verwendet man im allgemeinen ein Kohlehydrat, Z₀B. Melasse, Würze, Maleextrakt, Holehydrolysenzuoker oder Ablaugen au« der Papierfabrikation· Ein spezielles Auegangsmaterial für die Vorbehandlung ist ein Extrakt von Lipiden, der bei der Reinigung von Hefe durch Lösungsmittelextraktion erhalten wird ·

Nach einem weiteren Kennzeichen umfaßt die Erfindung ein Verfahren, bei dem man einen Mikroorganismus in einem Gärgefäß in Gegenwart eines Einsatzmaterials, das eine gebundenen Kohlenstoff enthaltende Verbindung enthält, in Gegenwart eines wässrigen Nährmediums und in Gegenwart eines freien Sauerstoff enthaltenden Oases ohargenweise züchtet, wobei die Waohtsumsgesohwlndlgkeit des Mikroorganismus progressiv mit der Zeit steigt, bis eine stetige Waohstumsgesohwindigkeit erreicht Is^? §as Ausgangsmaterial dem Gärgefäß kontinuierlich oder intermittierend während eines erhebliohen Teils der Wachstumsperlode zugeführt wird, die zu jedem gegebenen Zeitpunkt zugeführte Menge derart bemessen ist, daß die zu diesem Zeitpunkt im Gärgefäß ine» geeamt vorhandene Einsätzmenge das Optimum oder annähernde Optimum darstellt, um zu diesem Zeitpunkt maximale WachstumsgesohwlndigkfH t zu erzielen« Das Einsätzmaterial kann somit kontinuierlich mit ungefähr exponential steigender Menge oder intermittierend in ungefähr exponential steigenden Mengen zugeführt werden·

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren, das daduroh gekennzeichnet ist, daß man einen Mikroorganismus in Gegenwart eines gebundenen Kohlenstoff enthaltenden Einsätzmateriala, in Gegenwart eines wässrigen Nährmediums und in Gegenwart eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases ohargenweiae züchtet, wobei während einer Waohstumsperiod« die WachetumsgeBOhwindigkeit des Mikroorganismus mit der Zeit progressiv steigt und während oder nach einer Periode schnellen Wachstum· der Mikroorganismus gewonnen und zu

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einem Zeitpunkt, zu dem die Wachstumsgesohwindigkeit hoch ist, ein Teil der Gesamtmenge des Mikroorganismus abgezogen und als Inoculum zur Auslösung des Wachstums eines neuen Ansatzes des Mikroorganismus verwendet wird· Vorzugsweise wird der als Inoculum verwendete Mikroorganismus zu einem Zeitpunkt abgezogen, zu dem die Wachtsumsgesohwindigkeit «in Maximum erreicht hat· Wenn gemäß der Erfindung gearbeitet wird, wird eine "Trägheitsphaee" zu Beginn des Wachstums erheblich verkürzt oder ausgeschaltet.»

STaOh einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Mikroorganismus in einem Gärungsgefäß in Gegenwart eines kontinuierlich zugeführten frischen Ausgangsmaterials, das eine gebundenen Kohlenstoff enthaltende Verbindung «nthält> in Gegenwart eines wässrigen Hährmediuais und in Gegenwart •Ines freien Sauerstoff enthaltenden Gi see bei kontinuierlicher Abnahme des Mikroorganismus al^ Produkt züchtet, wobei man in das Gärungegefäß periodisch eine gewiss· Menge eines "verbesserten Mikroorganismus" gibt, der gesondert unter Bedingungen gezüchtet wurde, die sich für die gewünschten Eigenschaften des Mikroorganismus gut eignen, und der zum gleichen Stamm gehört, der kontinuierlich gezüchtet wird·

Während die bei der Produktionsstufe angewendeten Bedingungen sioh den Bedingungen nähern, die für die Wachstumsgesohwin— digkeit optimal sind, handelt es sich bei den für die Herstellung dies "verbesserten Mikroorganismus" angewendeten Bedingungen um solche, die für eine hohe Wachstumsgeschwin— digkeit weniger geeignet sind, oder bei denen ein anderes Einsätzmaterial verwendet wird, das sich für die Ausbildung der gevrünsonten Eigenschaften des "verbesserten Mikroorganismus" besser eignet, oder die für großtechnischen Betrieb ungeeignet sind·

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Zwar wurde die Zuführung des frischen Ausgangsmaterials vorstehend als kontinuierlich bezeichnet, jedoch kann diese Zuführung nach Belieben für die verhältnismäßig kurze Zeit, während der der "verbesserte Mikroorganismus" in das Gärungegefäß eingeführt wird, unterbrochen werden. Vorzugsweise wird der "verbesserte Mikroorganismus" aus dem Gärgefäß, in dem er gezüchtet wird, während seiner Exponentialwaohstumsperiode abgenommen,,

Nach einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren, bei dem man einen Mikroorganismus in Gegenwart eines geradkettige Kohlenwasserstoffe und andere Kohlenwasserstoffe enthaltenden Ausgangemateriale in Gegenwart eines wässrigen Nährmediume und in Gegenwart eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases züchtet, wobei die Menge einer wichtigen Komponente des Nährmediums und/oder die zugeführte Sauerstoffmenge so bemessen werden, daß nur eine gewünschte ü.enge der geradkettigen Kohlenwasserstoffe verbraucht wird· Bei ohargenweisem Betrieb wird die Gesamtmenge der wichtigen Komponente und/oder die Gesamtmenge des Sauerstoffs so eingestellt, daß der Verbrauch an geradkettigen Kohlenwasserstoffen die gewünschte Höhe erreicht. Bei kontinuierlichem Betrieb wird die Geschwindigkeit, mit der die wesentliche Komponente und/oder der Sauerstoff zugeführt werden, entsprechend eingestellt«

Wie vorstehend erwähnt, wird die eingesetzte Menge oder die Zuführungageschwittd^eit entweder des Sauerstoffe oder wenigstens einer wesentlichen Komponente, z«B₀ des Kaliumione, Magnesiumions, Phosphations oder Sulfatione unter dem optimalen Wert gehalten, um ein begrenztes Wachstum des Mikroorganismus und damit nur eine begrenzte Entfernung der geradkettigen Kohlenwasserstoffe zu erzielen, Vorzügeweise wird hierbei nicht die Zufuhr des Ammoniumions beschränkt, da im allgemeinen Ammoniak bevorzugt als Mittel zur Einstellung des p„-Werts gebraucht wird«

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Nach einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren, bei dem man einen Mikroorganismus in Gegenwart eines gebundenen Kohlenstoff enthaltenen Ausgangsmateriale, in Gegenwart eines wässrigen Nährmediums und in Gegenwart eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases züchtet, wobei der p_u-Wert durch kontinuierliche oder intermittierende

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Zugabe von Ammoniak innerhalb eines gewünschten Bereichs gehalten wird«, Vorzugsweise liegt dieser Bercioh um nicht mehr als 0,1 unter und über einem gewünschten p_H-Wert. Bei Verwendung einer Hefe oder eines Pilzes liegt der gewünschte p_H-Wert im allgemeinen im Bereich von 4-5» Bei Verwendung von Bakterien liegt der gewünsohte Wert wesentlich höher, nämlich im allgemeinen im Bereich von 6-8ο Das Ammoniak kann als Flüssigkeit, Gas oder wässrige Lösung zugegeben werden» Die Zusammensetzung des Nährmediume wird unter'Berücksichtigung der Tatsache eingestellt, daß Ammoniumionen während der Wachstumaphase zugesetzt oder gebildet werden,, Vorzugsweise wird das Ausgangsmaterial in Form von kleinen Teilchen verwendete

Nach einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung somit ein Verfahren, bei dem ein Mikroorganismus in einem Gärgefäß in Gegenwart eines gebundenen Kohlenstoff enthaltenen Ausgangsmaterials, in Gegenwart eines wässrigen Nährmediume und in Gegenwart eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases gezüchtet wird, wobei das Auegangsmaterial in Form von kleinen Flüesigkeitsteilchen im Gärgefäß vorhanden ist. Vorzugsweise haben die Teilchen einen mittleren Durchmesser von weniger als 30 u, insbesondere von weniger als 10 *u

Die kleinen Flüssigkeitsteilchen können durch Zerstäuben eines in der Flüssigphase verwendeten Ausgangsmaterial* in eine wässrige Phase oder in eine Gasphase gebildet werden. Die in der Gasphase gebildeten kleinen Flüssigkeitsteilohen müssen in ein flüssiges Medium, z.B. in eine wässrige Phase, überführt werden» Die Dispersion kleiner Teilchen in dem flü8i5igen Trägermedium kann dann in das Gärgefäß eingeführt

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werden« Es iat auch möglich, die kleinen Flüsaigkeitsteilchen im Gärgefäß durch direkte Zerstäubung in dae im Gärgefäß befindliche flüssige Material zu bilden« Daa wässrige Medium, das zur Bildung der Dispersion außerhalb des Gärgefäßea verwendet wird, kann aus wässrigem Nährmedium bestehen. Die gasförmige oder flüssige Phase, die durch den Zerstäuber geführt wird, kann gegebenenfalls ein Gemljgch der Auegangakohlenwasserstoffe mit Luft oder wässrigem Medium sein. Gegebenenfalle wird eine flüssige Phase durch den Zerstäuber geleitet, um eine Suspension feiner Flüssigkeitsteilchen in einem Gas zu bilden, worauf man das suspendierte Material auf ^ffline sich bewegende Flüssigkeitsol erfläche, z«B· aus wässrigem Nährmedium, fallen läßt.

ÜJs ist möglich, die kleinen FlÜBaigkeitateilohen zu bilden, indem man ein in der Flüssigphase vorliegendes Ausgangsmaterial unter der Einwirkung von Ultraschallwellen in eint wässrige Blase oder in eine Gasphase dispergierto Die in der Gasphase gebildeten kleinen Flüssigkeitsteilchen müssen in ein flüssiges Medium, z.B. eine wässrige Phase, überführt werden« Die Dispersion kleiner Teilchen im flüssigen Trägermedium kann dann in das Gärgefäß eingeführt werden« Es ist auch möglich, die ^r ainen Flüssigkeitsteilohan im Gärgefäß durch direkte Zerstäubung in das im Gärgefäß befindliche flüssig?? Material zu bilden. Das wässrige Medium, das zur Bildung der Diapersion außerhalb des Gärgefäßes verwendet wird, kann aus wässrigem Nährmedium bestehen»

Vorzugsweise wird durch einen Ultraschallerzeuger eine Phase geführt, die ein Gemiaoh von Ausgangskohlenwasserstoffen mit Luft oder einem wässrigen Medium darstellt. Gegebenenfalls führt man eine fließfähige Phase durch den Ultraachallorzeuger unter Bildung feiner Flüssigkeltsteilohen in einem Gaa und läßt das suspendierte Material auf eine sich bewegend· Flüssigkeitsoberfläche, z.B. aus wäsurigem Nährmedium, fallen«

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Nach einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung ein Verfahren, bei dem ein Mikroorganismus in Gegenwart eines gebundenen Kohlenstoff enthaltenden Ausgangsmaterials, in Gegenwart eines wäßrigen Nährmediums und in Gegenwart eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases gezüchtet wird, wobei das Ausgangsmaterial in Form von kleinen Feststoffteilchen anwesend ist, die vorzugsweise einen mittleren Durchmesser von weniger als J50 u haben. Hierbei ist das Einsatzmaterial ein Stoff, der bei der Temperatur, bei der das Gärgefäß gehalten wird, fest ist.

Vorzugsweise werden die kleinen Feststoffteilchen als Suspension in einem flüssigen Medium gebildet, indem das geschmolzene Ausgangsmaterial (in Gegenwart oder Abwesenheit anderer Bestandteile) in ein flüssiges Medium zerstäubt wird, das sich bei einer Temperatur unterhalb der ^.nmelzpunkts des kohlenstoffhaltigen Materials befind ν .. oourch eine plötzliche Abkühlung des letzteren statt!xndet.

Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform bildet man eine FlUssigkeit-in-Flüssigkeit-Suspension oder Lösung des Ausgangsmaterials in einem flüssigen Medium und schreckt diese Suspension oder Lösung ab, wobei eine Feststoff-in-Flüssigkeit-Suspenslon des kohlenstoffhaltigen Materials im flüssigen Medium gebildet wird. Die Flüssigkeit-in-Flüssigkeit-Suspension kann durch Zerstäuben des geschmolzenen festen kohlenstoffhaltigen Materials in ein flüssiges Medium gebildet werden, das sich bei einer Temperatur oberhalb des Schmelzpunktes des kohlenstoffhaltigen Materials befindet.

Als flüssiges Medium (gleichgültig, ob es oberhalb oder unterhalb des Schmelzpunkts des kohlenstoffhaltigen Materials verwendet wird) wird vorzugsweise eine wäßrige Phase oder eine Kohlenwasserstoffphase gebraucht. Als wäßrige Phase eignet sich das wäßrige Nährmedium. Eine geeignete Kohlenwasserstoffphase besteht aus Kohlenwasserstoffen, die durch den Mikroorganismus nicht aufgespalten werden. Im allgemeinen eignet sich beispielsweise ein entparaffiniertes Gasöl.

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Vorzugsweise werden Bedingungen angewendet, bei denen eine hohe Fallgeschwindigkeit erzielt wird, um die Bildung von Peinteilchen zu begünstigen« Bei Verwendung deu Ausgangamaterials in Form von feinen Teilchen haben diese gewöhnlich die Neigung, zu agglomerieren«, Diese Neigung kann durch Verwendung von Emulgatoren verringert werden,,

Nach einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daf3 man eine Dispersion aua einem Ausgangskohlenwasserstoff in einem flüssigen Medium bildet, die Dispersion mit einem Mikroorganismus mischt, das Gemisch in ein Gärgefäß gibt, das einen Mikroorganismus, ein wässriges Nährmedium und ein freien Sauerstoff enthaltendes Gas enthält, und einen Produktstrom abzieht, der einen im Gärgefäß gewachsenen Mikroorganismus enthält.

Nach einem weiteren Kennzeichen bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren, das darin besteht, daß man eine Dispersion einee Ausgangskohlenwasserstoffs in einem flüssigen Medium bildet, das eine Dispersion eines Mikroorganismus enthält, anschließend das Gemisch in ein Gärgefäß leitet, das einen Mikroorganismus, ein wässriges Nährmedium und ein freien Sauerstoff enthaltendes Gas enthält, und einen Produktstrom abzieht, der einen im Gärgefäß gewachsenen Mikroorganismus enthält_o

Bei den beiden vorstehend beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung können der Mikroorganismus, der in dem in das Gärgefäß eingeführten Ausgangsmaterial enthalten ist, und der Mikroorganismus, der im Gärgefäß gezüchtet wird, gleich oder verschieden sein. Durch die Anwesenheit des Mikroorganismus im dispergierten Ausgangsmaterial wird die Agglomerationsneigung der Teilchen verringert.

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Vorzugsweise ist der Mikroorganismus, der in dem zum Gärgefäß geleitet Auagangsmaterial vorhanden ist, eine Hefe_e Das Verfahren eignet sich besonders zur Züchtung von Hefe, und in diesem Fall kann ein Teil der aus dem Gärgefäß gewonnenen Hefe zur Bildung des Einsatzmaterials verwendet werden. Vorzugsweise ist das flüssige Medium, das als geschlossene Phase bei der Bildung des Einsatz— materials verwendet wird, ein wässriges Medium, Dieses wässrige Medium ist vorzugsweise eine Kreislaufstrom des wässrigen Nährmediums.

Vorzugsweise wird die aus dem Gärgefäß abgezogene gesamte Flüssigphase in eine Zentrifuge gegeben. In dieser Zentrifuge werden gewonnen: a) eine Phase, die einen größeren Teil des Mikroorganismus enthält, der in dem Produktstrom vorhanden ist. b) Eine wässrige Phase, die einen geringeren Anteil des Mikroorganismus enthält, und o) wahlweise eine Kohlenwasserstoffphase je nach der Art der Auegangskohlenwasserstoffee

Wenigstens ein Teil der wässrigen Phase, die einen Teil des Mikroorganismus enthält, kann dann als geschlossene Phase verwendet werden, in der die Ausgangskohlenwasser— etoffe dispergiert werden. Es ist möglich, daß die Menge des in der wässrigen Phase vorhandenen Mikroorganismus nicht ausreicht, um den Einsatz in Dispersion zu halten«, In diesem Fall (und immer dann, wenn gewünscht) kann die Menge des Mikroorganismus durch Zusatz weiterer Mengen eines Mikroorganismus nach der Dispergierung erhöht werden,, Zweckmäßig ist diese weitere Menge des Mikroorganismus ein Teil der durch Zentrifugieren erhaltenen Fraktion a) oder davon abgeleitet« Die größeren Agglomerate des Mikroorganismus werden von der wässrigen Phase abgetrennt, und nur die kleineren Gruppen von Mikroorganismen gehen weiter in der wässrigen Phase zur Dispergierungsstufe» Da der Vorgang der Diapergierung des Einsatzmaterials zu einer gewissen Zerstörung der Gruppen von Mikroorganismen oder sogar der

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Einzelsellen führen kann, ist es zweckmäßig, mit einem System zu arbeiten, bei dem wenigstens ein Teil des zur Stabilisierung der Dispersion verwendeten Mikroorganismus die Diapergierungsstufe umgeht. Hierbei sollte es sich um den Teil handeln, der (auf Grund der in ihm enthaltenen größeren Agglomerate) leichter einer Schädigung unterliegt·

Zur Dispergierung des Einsatamaterials in einem flüssigen Medium kann jede beliebige Methode angewendet werden. Geeignet ist beispielsweise die Verwendung von 1) Injektordüsen, 2) Kolloidmühlen, beispielsweise eines Hurrel-HomogenisatorSjOder 3) von Ultraschallwellen,,

Nach einer weiteren Ausführungsfarm der Erfindung werden Mikroorganismen gezüchtet, indem man sie mit einem kohlenstoffhaltigen Einsat£material und einem wässrigen Nährmedium über mehrere geneigte perforierte Böden nach unten im Gegenetrom zu einem Gas leitet, das freien Sauerstoff enthält und von unten naoh oben durch die Bohrungen in jedem Beden strömt. Zweckmäßig ist die Größe und/oder die Dichte der öffnungen in der oberen Hälfte wenigstens einer dieser Böden größer als in der unteren Hälfte des Bodens. Vorzugsweise weisen sämtliche Böden dieses Merkmal auf. Die Flüssigphaaff a L^d zweokmäßig kontinuierlich umgewälzt. Das Verfahren kann ohargenweise oder kontinuierlich durchgeführt werden.

Naoh einer weiteren Ausführungeform der Erfindung wird ein Gärgefäß verwendet, das mit einem Rührer versehen ist, der an einer durch eine Wand des Gärgefäßes geführten Welle befestigt ist, die im Innern des Gärgefäßes durch einen Absohluß abgedichtet ist, der frei von einer Schmierflüssigkeit ist. Die Abdichtung besteht zweckmäßig aus Polytetrafluoräthylen oder aus einer das Metall umschließenden Dichtfläche aus Graphit. Gegenenfalls kann der Abschluss als Lager für di· Auflage der Welle ausgebildet sein. Vorzugsweise ist die Welle senkrecht montiert und nach oben aus dem Gärgefäß herausgeführt.

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Unter gewissen Arbeitebedingungen kann es aweekmäßig aein, wenn im Nährmedium eine geringe Menge eines Schaumverhütungsmittels vorhanden ist. Bei Chargenbetrieb kann es vorteilhaft sein, dieses Mittel während der Wachstumeperiode nach und nach zuzugeben, da im allgemeinen hierbei insgesamt weniger Schaumverhütungsmittel erforderlich ist, als wenn das Mittel auf einmal zugegeben wird» Vorzugsweise werden Schaumverhütungsmittel auf Siliconbasis beispielsweise in einer Gesamtmenge von 0,1 Gew_e-$, bezogen auf das wässrige Medium, verwendet»

Die oben generjnten Hefen eignen sich gut für die Aufspaltung der geradkettigen Kohlenwasserstoffkomponenten von Erdölfraktionen, deren mittleres Molekulargewicht wenigstens 10 Kohlenstoffatomen im Molekül entspricht, auch wenn in den Fraktionen Nichtkohlenwasserstoffkompcnetten, z.B« Schwefelverbindungen, vorhanden sind· ¹Es erwies aich nicht als erforderlich, diese Komponenten vor der erfindungegemäßen Behandlung zu entfernen« Jedoch muß sichergestellt werden, daß bei der Raffination verwendete Fremdstoffe, die den Mikroorganismus schädigen, wenigstens bis zur Wachs— tumaperiode einschließlich abwesend sind. So ist es gewöhnlich erforderlioh, Furfurol sowie bakterlöstatisohe Mittel, wie Phenole und quarternäre Stickstoffverbindungen, aus dem Einsatzmaterial auszuschließen. Auch gewisse Metalle erweisen sich häufig als schädlich und sind vom Mikroorganismus fern zu halten. Typische Metalle dieser Art sind Kupfer, Blei und Quecksilber.

Wenn das Verfahren zur Züchtung von Hefe angewendet wird, werden die Bedingungen gewöhnlich so gewählt, dass die Wachstumsgeschwindigkeit einer bestimmten Hefe, die zu Beginn als Inoculum eingeführt werden kann, optimal ist. Die Bedingungen, die das Wachstum dieser Hefe begünstigen, können auch für das Wachstum anderer Hefen oder für das Wachstum anderer Mikroorganismen günstig sein, die somit als Verunreinigungen in der gewünschten Hefe vorhanden sind·

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Es wurde festgestellt, daß vie]e der Verunreinigungen "bevorzugt vernichtet werden können, wenr; die-; verunreinigte Hefe der nachstehend beschriebenen Art bei eineiu niedrigen Pjv-Wert gehalten wird_o

Nach einem weitermAspekt umfaßt die Erfindung ein Verfahren, bei dem man in einem Gärgefäß ejne Hefe in Gegenwart von Kohlenwasserstoffer als Ausgangsmateri&l, in Gegenwart eines wässrigen Nährmediums und in Gegenwart eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases züchtet, die liefe, die als Verunreinigung andere Mikroorganismen enthält, kontinuierlich teilweise oder int em ittierend ganz oder teilweise aus dem Gärgefäß abzieht und oic abgezogene H efe bei einem niedrigen p^-Wert hält, bis ein erheblicher Teil der Verunreinigung abgetötet ist, wähv;;rcl eir. wesentlicher Teil der Hefe lebend bleibte

Din gereinigte Hefe kann ganz oder teilweise als Produkt aue dem System abgezogen werden,, Es ist auch möglich, die gereinigte Hefe ganz oder teilweise ir. das Gärgefäß zurückzugeben „

Nach einer anderen Ausführungsfonn züchtet man die Hefe in Gegenwart der Ausgangskohlenwasserstoffe, eines wässrigen Nähnnediume und eines Gases, das freien Sauerstoff enthält_p und senkt periodisch das p„ des wässrigen Mediums auf einen niedrigen Wert, der eingehalten wird, bis ein wesentlicher Anteil der Verunreinigung abgetötet iet, während ein wesentlicher Anteil der Hefe lebend bleibt«

Unter den normalen Wachstumsbed Ingungen wird der Ρττ—Wert vorzugsweise im Bereich von 3»5-5»5 gehalten, indem bei— spielsweiee ein alkalisches Material, z«B_o wässriges Ammoniak, zugegeben wird«. Unter den Bedingungen, die zur Abtötung der Verunreinigungen angewendet werden, liegt der Pu-Wert gewöhnlich unter 3,5, vorzugsweise im Bereich von 1-3. Man kann ihn auf diesen Wert fallen lassen, indem man die Zugabe von alkalischem Material unterbricht (oder seine Menge verringert).Vorzugsweise wird der p^-V/ert durch Zusatz

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einer Säure, z.B. Salzsäure oder Phosphorsäure, eingestellt. Gewöhnlich ist es zweckmäßig, den niedrigen p^-Wert für eine Seit von 30 Minuten bis 5 Stunden einzuhalten» Die hierbei angewendeten Bedingungen und die Zeitdauer sind so ζυ wählen, daß mehr als 90 Gew_o-% der Verunreinigungen und weniger als 10 Gew„-# der Hefe abgetötet werden« Zu den Verunreinigungen, die gemäß der Erfindung abgetötet werden können, gehören die Bakterien.

Bei einem Verfahren, bei dem ein Mikroorganismus zur vollständigen oder teilweisen Entfernung von geradkettigen Kohlenwasserstoffen aus Kohlenwasserstoffgemischen verwendet wird, werden im allgemeinen Nebenprodukte,die Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoff enthalten, z,B_e Ester, gebildete Diese Nebenprodukte können in der Kohlenwasserstofffraktion bleiben, die von Mikroorganismus abgetrennt

stellen

wird, und/eine Verunreinigung dae., Wenn das Einsat zmaterial ein wachshaltiges Gasöl ist, kann das gewonnene Gasöl auf Grund der Anwesenheit dieser Nebenprodukte einen unzulässig hohen Trübungspunkt haben_o Es wurde gefunden, daß diese Nebenprodukte oder ein Teil derselben unter gewissen Bedingungen als Kohlenstoffquelle für die Mikroorganismen dienen können, wodurch die Menge der Nebenprodukte verringert werden kann,,

Nach einer Ausführungsform der Erfindung züchtet man in einer Wachsturnsstufe einen Mikroorganismus in Gegenwart eines als Kohlenstoff- und Energiequelle dienenden Materials, das aus einem Gemisch von geradkettigen Kohlenwasserstoffen mit anderen Kohlenwasserstoffen besteht, in Gegenwart eines wässrigen Nährmediums und eines Gases, das freian Sauerstoff enthält, und hält anschließend in einer "Hungerphase^M den Mikroorganismus mit den nicht verbrauchten Kohlenwasserstoffen in Kontakt, und zwar in Gegenwart eines wässrigen Nähnaediums, in Gegenwart eines Gases, das fieLen Sauerstoff enthält, jedoch ohne.Zusatz weiterer Mengen oder unter Zusatz einer verringerten Menge der als Kohlenstoff- und Energiequelle

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dienenden Kohlenwasserstoffe, wodurch die Menge der während der Wachstumsphase gebildeten Nebenprodukte in der "Hungerphase" verringert wird,, Das als Kohlenetoff- und Energiequelle dienende Material enthält vorzugsweise C-jq- oder höhere Kohlenwasserstoffe.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kultiviert man einen Mikroorganismus in der vorstehend beschriebenen Weise in Gegenwart einer Erdölfraktion, die teilweise aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen besteht und ein mittleres Molekulargewicht hat, das wenigstens 10 Kohlenstoffatomen im Molekül entspricht, und in Gegenwart eines wässrigen Mhrmediums und eines Gases, das fieien Sauerstoff enthält, und trennt von dem Gemisch einerseits den Mikroorganismus und andererseits eine Erdölfraktion ab, die einen verringerten Anteil an geradkettigen Kohlenwasserstoffen enthält oder frei von diesen geradkettigen Kohlenwasserstoffen ist«

Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung kultiviert man kontinuierlich einen Mikroorganismus in einem Gärgefäß in Gegenwart einer Erdölfraktion, die teilweise aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen besteht und ein mittleres Molekulargewicht hat, das wenigstens 10 Kohlenstoffatomen im Molekül entspricht, und in Gegenwart, eines wässrigen Näh'rmediums und eines Gases, das freien Sauerstoff enthält, und entfernt kontinuierlich aus dem Gemisch a) eine Fraktion, die aus Hefe besteht, b) eine Fraktion, die den größeren !Deil der wässrigen Phase umfaßt, und c) eine Erdölfraktion, die einen verringerten Anteil an geradkettigen Kohlenwasserstoffen enthält oder frei von diesen geradkettigen Kohlenwasserstoffen iet, und führt die Fraktion b) kontinuierlich oder chargenweise als Teil des wässrigen Nährmediums in das Gärgefäß zurück.

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Wenn gewisse Mikroorganismen, insbesondere Hefe, unter Verwendung von Kohlenwasserstoffen als Kohlenstoff- und Energiequelle gezüchtet werden, enthält das Produkt einen Anteil an Lipiden, die für gewisse Verwendungszwecke einen unerwünschten Bestandteil des Produkte darstellen

Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kultiviert man in einer Wachstumsphase einen Mikroorganismus in Gegenwert eines ganz oder teilweise aus einem geradkettigen Kohlenwasserstoff bestehenden Materials und kultiviert anschließend den auf diese Weise erhaltenen Mikroorganiemus in einer Reinigungsstufe in Gegenwart eines als Kohlenstoff- und Energiequelle dienenden Materials, das eine Verbindung des Kohlenstoffs, Wasserstoffs und Sauerstoffs enthält« Als Kohlenstoff- und Energiequelle in der Reinigungsstufe dient vorzugsweise ein Kohlehydrat, z,B_o Melasse, Würze, Malzextrakt, Holzzucker oder bei der Papierfabrikation erhaltene Ablaugen. Vorzugsweise enthalten die als Einsatzmaterial verwendeten Kohlenwasserstoffe C-_Q- oder höhere Kohlenwasserstoffe.

Bei Chargenbetrieb können die beiden Stufen im gleichen Gärgefäß oder in verschiedenen Gärgefäßen durchgeführt werden» Bei kontinuierlichem Betrieb sind getrennte Gärgefäße oder getrennte Zonen im gleichen Gärgefäß erforderlich.

Nach einer weiteren Ausführungeform der Erfindung kultiviert man in einer Wachtstumsstufe einen Mikroorganismus in Gegenwart eines als Energie- und Kohlenstoffquelle dienenden Materials, das ganz oder teilweise aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen besteht, in Gegenwart eines wässrigen Nährmediums und eines Gases, das freiene Sauerstoff enthält, trennt gegebenenfalls anschließend den Mikroorganismus von der Hauptmenge des nicht verbrauchten Kohlenwasserstoffs ab, wodurch ein Mikroorganismus erhalten wird, der nur ein· geringe Kohlenwascerstoffmenge als Verunreinigung enthält, und hält danach den Mikroorganismus in einer Reinigungsstufe

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in einem wässrigen Nährmedium und einem Gas, das freien Sauerstoff enthält, wodurch die Menge des verunreinigenden Kohlenwasserstoffs verrihgert oder dieser Kohlenwasserstoff ganz entfernt wird»

Als Alternative oder zusätzlich kann diese Reinigungsstufe angewendet werden, um Lipide, Ester, Ketone und/oder freie Fettsäuren zu entfernen oder die Menge, in der sie am Mikroorganismus, z.B. einer Hefe, anhaften, verringern«,

Als weitere Methoden zur Entfernung verunreinigender Kohlenwasserstoffe von den Mikroorganismen oder zur Verringerung der Menge der verunreinigenden Kohlenwasserstoffe kommen eine Wäsohe mit wässrigen oberflächenaktiven Mitteln und/oder eine Lösungsmittelextraktion in Frage» Die vollständige oder teilweise Entfernung der Verunreinigung wird "begünstigt, wenn man die Zellen zerreißt„ Auf diesen Aspekt der Erfindung wird später eingegangen, jedoch wird zunächst die Behandlung von Zellen beschrieben, die nicht zu diesen Zweck zerstört wurden,.

Der Mikroorganismus wird, wenn möglich, vorzugsweise durch Zentrifugieren von der Hauptmenge der Flüssigphase abgetrennt und kann als Creme oder Paste gewonnen werden,, In einigen Fällen erfolgt die Abtrennung jedoch durch Filtration oder in einem gewissen Umfange durch Dekantieren

Vorzugsweise wird zuerst der größere Teil der geschlossenen wässrigen Phase abgetrennte Dies erfolgt zweokmäßig durch Dekantieren oder Zentrifugieren. Die abgetrennte wässrige Phase enthält gewöhnlich nicht nährende Ionen in höherer Konzentration, als für den Kreislaufstrom zugelassen werden kann«, Wenn dies der Fall ist, kann nur ein Teil der abgezogenen wässrigen Phase im Kreislauf geführt werden. So iet es gewöhnlioh möglich, etwa 96 Gew„-# der im Produkt anwesenden wässrigen Phase abzutrennen, wovon - gerechnet auf der gleichen Basis — etwa 20 Gew„-# verworfen werden«, Der Kreislaufstrom wird naoh Ergänzung der erforderlichen Nährstoffe in das Gärgefäß zurückgeführt. Gegebenenfalls

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können die zur Ergänzung dienenden Nährstoffe dem Gärgefäß getrennt zugeführt werden,,

Durch Zentrifugieren des Produkts aus dem Gärgefäß (oder des Produkts, das nach dem Dekantieren eines Teile der wässrigen Phase verbleibt) können drei Fraktionen gewonnen werden, nämlich (in der Reihenfolge steigender Dichte)

I. eine Ölphase, die Hefezellen enthält,

II« eine wässrige Phase, die Spuren von öl und Hefe enthält,

III. eine aus Hefe zusammen mit wässriger Phase bestehende "Hefecreme·¹, an deren Zellen Öl haftet»

Nach der Abtrennung der Fraktion II können die verbleibenden Fraktionen I und III wieder zusammengegeben und mit einer wässrigen Lösung eines oberflächenaktiven Mittels gemischt werden«, Diese Sehandlung hat den Zweck, von den Hefezellen das Öl abzutrennen, das anscheinend duroh Absorption an den Zellen haftet. Es ist zweokmäßig, ein genießbares oberflächenaktives Mittel, z.B. einen Saooharoseester, zu verwenden, so daß das Ausmaß der anschließenden Wäsche, die zur Entfernung von nicht genießbaren oberflächenaktiven Mitteln von der Hefe erforderlich ist, verringert werden kann.

Die auf diese Weise gebildete Emulsion wird durch Zentrifugieren gebrochene Hierbei werden drei Fraktionen erhalten:

IVe eine ölphaae,

V. eine wässrige Phase, die das oberflächenaktive Mittel enthält und zur Behandlung der Fraktionen I und III im Kreislauf geführt wird, und

VI. eine "Hefecreme", bestehend aus Hefe, die noch mit öl verunreinigt ist, und einer wässrigen oberflächenaktiven Phase«,

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Um den Verbrauch an oberflächenaktivem Mittel möglichst stark einzuschränken, wird die wässrige Waschlösung, die das Mittel enthält, im Kreislauf geführt_β

Die Fraktion VI kann einer aus abwechselndem Waschen mit oberflächenaktivem Mittel und Zentrifugieren bestehenden Weiterbehandlung unterworfen werden, bis der Ölgehalt der Hefe einen gewünschten niedrigen Wert erreicht hat. Die nunmehr aus Hefe und wässrigem oberflächenaktivem Mittel bestehende Hefecreme kann mit Wasser gewaschen und erneut zentrifugiert werden» Gegebenenfalls kann diese Hefecreme zweimal oder noch häufiger gewaschen werden. Eine oder mehrere dieser Wäschen (vorzugsweise jedoch nicht die letzte) mit Wasser können mit Salzwasser (z.B. Seewasser) erfolgen» Zu letzten Wäeohe wird vorzugsweise enthärtetes Wasser verwendet» Um den Bedarf an Weichwasser im Verfahren möglichst niedrig zu ha-lten, wird das gesamte von der letzten Wäsche anfallende Wasser auegenutzt: Ein Teil dient als Ergänzungewasser für das Nährmedium, in dem die Gärung stattfindet, ein Teil - falls erforderlich - als Ergänzungewaaser für die Lösung des oberflächenaktiven Mittels, und der Rest wird dem zum Waschen verwendeten Salzwasser zugesetzt, um dessen Salzkonzentration zu verringern«,

Nach einer anderen Ausführungsform der Erfindung kultiviert man einen Mikroorganismus in Gegenwart eines ganz oder teilweise aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen bestehenden Materials, trennt vom Produkt eine Fraktion ab, die den Mikroorganismus enthält, und extrahiert diese. Fraktion mit einem Lösungsmittel, Geeignete Lösungsmittel sind Äthylalkohol, Isopropanol, leichte Kohlenwasserstoffe einschließlich Benzol und leichte Fraktionen aus einer Platforming-Anlage, Äthyläther, Aceton, chlorierte Lösungsmittel und verflüssigte Erdölgase, wie Butan und Propan.

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Die Creme oder Paste dee Mikroorganismus, die duroh Dekantieren und Zentrifugieren (oder Zentrifugieren allein) auf die beschriebene Weise abgetrennt werden kann, kann einer kontinuierlichen Lösungsmittelextraktion oder aufeinanderfolgenden Wäschen mit Lösungsmitteln und anschließender Phasentrennung unterworfen werden. Zweckmäßig verwendet man zur Extraktion ein stationäres Gefäß, das mit Paddelriihrern versehen ist, die vorzugsweise mit weniger als 10 UpM rotieren, oder in einem Gefäß, das um eine horizontale Achse rotierte Bei kontinuierlicher Lösungsmittelextraktion wird der ^bctrakt kontinuierlich abgezogen und kontinuierlich oder chargenweise bei Normaldruok oder vermindertem Druck destilliert, wobei das Lösungsmittel kontinuierlich in die Extraktionsapparatur zurückgeführt wird. Unter diesen Bedingungen kann die Hefe kontinuierlich oder chargenweise eingeführt und abgezogen werden.

Bei der Lösungsmittelextraktion wird das Lösungsmittel vorzugsweise mit periodisch wechselnder Geschwindigkeit in die Extraktionsapparatur eingeführt. Dies hat zur Folge, daß dieser Flüssigkeitsstrom pulsierte Die durch das Feststoff mate rial gehenden Flüssigkeitsstöße bewirken eine Schwingung und begrenzte Bewegung jedes ^eststoffkorns im Verhältnis zu seinem Nachbarn, und dies ist gleichwertig mit einer mechanischen Rührung des Ganzen« Aus diesem Grunde werden die Produkte insgesamt viel achneller und vollständiger extrahiert»

Zweckmäßig wird im flüssigen Einsatzstrom eine Vorrichtung angeordnet, die Flüssigkeitsstöße erzeugt, deren Amplitude und Frequenz experimentell für jeden Fall auf den günstigsten Wert eingestellt werden_e Diese Stöße werden mit einer beliebigen bekannten Vorrichtung erzeugt, vorzugsweise mit einer Kolbenpumpe, deren Ventile entfernt worden sind.« Die Zahl der Stöße liegt vorzugsweise zwischen 1 und 60 pro Minute«

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Geeignete Lösungsmittel für das Verfahren wurden bereits genannte Gegebenenfalls kann man in einer ersten Extraktionsstufe ein polares Lösungsmittel, z.B. einen Alkohol, wie Äthanol oder Isopropanol, verwenden und dann den teilweise gereinigten Mikroorganismus in einer zweiten Extraktionsstufe mit einem Kohlenwasserstoff, z_oB. Normalhexan, oder einer leichten Platformatfraktion oder Benzol, als Lösungsmittel behandeln. Vorzugsweise wird in der zweiten Stufe als Lösungsmittel ein Gemisch verwendet, das zuu größeren Teil aus Kohlenwasserstoffen und zum geringeren Teil aua einem polaren Lösungsmittel besteht<, Zweckmäßig verwendet man das azeotrope Gemisch von Hexan mit Isopropa·* nol oder Äthanol _o Gegebenenfalls können beide Extraktions— stufen kontinuierlich durchgeführt werden*

Es wird angenommen, daß bei Verwendung ei^es aus Kohlenwasserstoff und polarem Lösungsmittel bestehenden Gemisches die Punktion oder eine der Funktionen des polaren Lösungsmittels die Schwächung der Bindung des zu extrahierenden Materials (auch der Bindung von Kohlenwasserstoffen, die im polaren Lösungsmittel nicht löslioh sind) ist_e

Bei Verwendung von Alkohol in der ersten Stufe einer zweistufigen Extraktion auf die vorstehend beschriebene Weise wird der Wassergehalt der Creme oder Paste des Mikroorganismus erheblich gesenkt. Als Folge hiervon hat das in die zweite Stufe eingeführte Material, das den Mikroorganismus enthält, einen soiiiedrigen Wassergehalt, daß sichergestellt ist, daß noch vorhandene nicht-wässrige Verunreinigunge mit dem in der zweiten Stufe verwendeten Lösungsmittel mischbar sind« Jede Extraktionsstufe kann eine oder raahrere Unterstufen umfassen, die aus einer Wäsche mit dem in der Stufe verwendeten Lösungsmittel und anschließender Abtrennung bestehen«

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Wenn nur eine einzelne Wäsche in der ersten Stufe angewendet wird, beträgt die Äthanol- oder Isopropanolmenge das 1,5- bis 3-fache des Wasservolumens, das in der Creme oder Paste des Mikroorganismus vorhanden ist_e Jedoch können gegebenenfalls zwei Waschen mit Äthanol oder Isopropanol vorgenommen werden, wobei in der ersten Wäsche ein Lösungs— mittelvolumen, das dem WasBervolumen in&er Creme oder Paste entspricht, und in der zweiten Wäsche eine geringere Äthanol- oder Isopropanolmenge , beispielsweise die Hälfte der in der ersten Wäsche verwendeten Menge, verwendet wird·

Zwischen den Wäschen ;} eder Stufe oder Unterstufe läßt man die Flüssigkeit aus der Creme oder Paste ablaufen, beispielsweise durch Filtration. Ein Teil des restlichen Lösungsmittels wird dann vorzugsweise durch Vakuumfiltration entfernt ρ

In der zweiten Stufe beträgt die Menge des verwendeten Lösungsmittels in der (oder jederx^ew%hnlich das 2- bis 20—fache des Volumens des erhaltenen trocknenen Mikroorganismus β

Vorzugsweise erfolgt die Entfernung des Lösungsmittels in der letzten Stufe durch Abdampfen zweckmäßig unter vermindertem Druck und zweckmäßig in einem Inertgasstrom, z.B. Stickstoff oder überhitztem Dampf.

Durch Verwendung eines Gemisches von Kohlenwasserstoff und polarem Lösungsmittel als Lösungsmittel in der zweiten Extraktionsstufe kann die Zusammensetzung des Lösungsmittels der zweiten Stufe, das in jedem Fall polares Lösungsmittel aus der ersten Extraktionsstufe aufnimmt, stabilisiert werden« Eine Anreicherung von polarem Lösungsmittel kann durch eine Destillationsstufe vermieden werden, in der das Lösungsmittel der zweiten Stufe aufgearbeitet wird, wobei a) polares Lösungsmittel zur Rückführung in die erste Extraktions stufe und b) ein Gemisch aus Kohlenwasserstoff und polarem Lösungsmittel zur Rückführung in die zweite Stufe getrennt abgezogen werden. Zweckmäßig wird der in der zweiten

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Extraktionsstufe erhaltene Extrakt in einer zweiten Destillationsstufe destilliert, wobei a) als Kopfprodukt ein Gemisch aus Kohlenwasserstoff, polarem Lösungsmittel und Wasser zur Rückführung in die zweite Extraktionsstufe und b) als Bodenprodukt eine fraktion, die polares Lösungsmittel, Wasser und die extrahierten Stoffe enthält, abgezogen werden. Biese Fraktion wird vorzugsweise mit dem in der ersten Stufe erhaltenen Extrakt gemischt, bevor dieser in die Destillation eingesetzt wird, wodurch alle duroh die Lösungsmittelextraktion erhaltenen Verunreinigungen als Bodenfraktion in dieser Destillationsstufe entfernt werden« Als polares Lösungsmittel wird zweckmäßig Äthanol oder Isopropanol verwendet. Als Lösungsmittel für die zweite Stufe dient vorzugsweise ein azeotropes Gemisch.

Die optimale Kontaktzeit ändert sich gewöhnlich umgekehrt mit der Extraktionetemperatur. Es ist gewöhnlich unzweckmäßig, Temperaturen über 7O⁰O anzuwenden, da höhere Temperaturen au einem gewiesen Abbau des Produkts führen»

Wenn die Crem« oder Paste des Mikroorganismus vor der Lösungsmittelextraktion teilweise getrocknet wird, kommt man gewöhnlioh in der ersten Extraktionsstufe mit einer einzigen Wäsche mit einem alkoholischen Lösungsmittel und mit einer geringeren Lösungsmittelmenge aus,als sie erforderlich wäre, wenn keine Trocknung vorgenommen worden wäre· Wenn der Grad der Trocknung erheblich ist, ist eine erste Extraktionsstufe unter Verwendung eines polaren Lösungsmittels, a,B_e eines alkoholischen Lösungsmittel», nicht erforderlieb.» In diesem Fall kann die einstufige Extraktion unter Verwendung eines Lösungsmittels durchgeführt werden, das ausschließlich aus Kohlenwasserstoff oder aus einem Gemisch von Kohlenwasserstoff und polarem Lösungsmittel, β.B. einem Alkohol oder Keton oder chloriertem Kohlenwasserstoff, besteht.

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Wie bereits erwähnt, kann der Mikroorganismus oder eine Fraktion, in der er enthalten ist, einer Behandlung unterworfen werden, durch die die Zellen zerrissen werden» Vor dieser -Behandlung kann der Mikroorganismus gege-benenfalls einer der vorstehend beschriebenen Behandlungen unterworfen werden, durch die die Konzentration an Verunreinigungen verringert wird oder die Verunreinigungen entfernt werden.

Bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kultiviert man somit einen Mikroorganismus in Gegenwart eines aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen bestehenden oder diese enthaltenden Ausgangsmaterials, trennt dann, falls noch Kohlenwasserstoffe anwesend sind, eine Fraktion, die den Mikroorganismus enthält, von diesen Kohlenwasserstoffen ab und behandelt dann die den Mikroorganismus enthaltende Fraktion unter solchen Bedingungen, daß die Proteine oder Polyproteine oder Polypeptide oder Aminosäuren, die in den Mikroorganismen enthalten sind, oder deren Derivate von den Zellwänden oder dem die Zellwände bildenden Material abgetrennt werden«,

Die Abtrennung der Proteine, Polyproteine, Polypeptide oder Aminosäuren kann beispielsweise durch Autolyse, Plasmolyse oder Hydrolyse erfolgen,, Die Autolyse kann mit Hilfe der in den Mikroorganismen enthaltenen Enayme oder durch Zusatz anderer Enzyme hervorgebracht werden,,

Bei der Kultivierung von Mikroorganismen, Z₀B. von Hefe, auf Erdölkohlenwasserstoffen werden Zellen erhalten, di· nach dem Waschen und Trocknen einen besonders scharfen und ranzigen Geschmack haben. Diese Mikroorganismen, Insbesondere die Hefen, haben einen hohen Gehalt an Lipiden, deren Anwesenheit unerwünscht ist, weil sie leicht oxydieren, wodurch ein unangenehmer 'Geschmack und Geruch bedingt isto

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Jedoch haben die trockenen Mikroorganismen selbst nach der Entfernung der Lipide eine ungenügende und unterschiedliche Verdaulichkeit. Dieser Nachteil ist zumindest teilweise auf die beim Trocknen der Zellen angewendeten Bedingungen zurückzuführen, die zwangsläufig etwas scharf sind. Mikroorganismen von besserer Verdaulichkeit können erhalten werden, wenn auf die nachstehend beschriebene Weise gearbeitet wirdo

Vorzugsweise verwendet man als Fraktion, deren Zellen zerrissen oder abgebaut werden sollen, eine Creme des Mikroorganismus, die auf die beschriebene Weise erhalten wurde. Die Autolyse, die als Methode zum Abbau der Zellen bevorzugt wird, führt zu einem Produkt in Form einer Flüssigkeit, deren Viskosität von der Konzentration der Trockenmasse abhängt« Das Autolysat, das Proteine eines viel niedrigeren Molekulargewichts enthält als die Trockenhefe, ist viel verdaulicher. Da es ohne scharfes Erhitzen erhalten wird, sind die instabilen Aminosäuren und die Vitamine vollständig erhalten. Ferner ermöglicht die flüssige Form des Autolysats eine leichte Extraktion der Lipide, die es enthält, mit einem geeigneten Lösungsmittel»

Das Autolysat kann mit einem Lösungsmittel behandelt werden, um die Lipide und die möglicherweise noch in ihm enthaltenen Spuren von Kohlenwasserstoffen aus ihm zu extrahieren» Es wird dann vorzugsweise unter vermindertem Druck bei einer unter 70⁰C liegenden Temperatur konzentriert, wobei die gewünschten Bestandteile, z.B. die Aminosäuren und Vitamine, vor der Zerstörung bewahrt werden. Eine bevorzugte Arbeitsweise wird nachstehend ausführlicher beschriebene

Nach der Gärung wird eine erste Zentrifugierung vorgenommen, bei der die Hefeemulsion in drei Phasen getrennt wird, nämlich den größeren Teil der nicht aufgespaltenen Kohlenwasserstoffe, das Nährraedium, das zurückgeführt wird, und eine Tiefecreme mit etwa 10$ Trockenmasse, die noch Kohlenwasserstoffe enthält« Die Hefecreme wird mit Wasser gewanchen

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und erneut zentrifugiert« Hierbei werden als getrennte Fraktionen Kohlenwasserstoffe, Wasser und eine Hefeereme erhalten, die etwa 15$ Trockenmasse entM.lt_o Die Hefeereme mit etwa 15$ Trockenmasse wird einige "Stunden der Autolyse bei einer Temperatur zwischen 40 und 60°C unterworfen, wobei gegebenenfalls geeignete Enzyme zugesetzt werden» Durch die Autolyse werden"die Hefezellen abgebaut, worauf eine Zentr-ijHugierung vorgenommen wer-äen muss, um. die Zeil— wände vom eigentlichen Autolysat zu entfernen« Bas Autolysat . wird dann mit einer gewissen Ifenge eines Lösungsmittelsgev/asehen, das sich siur Extraktion der lipide eignet« Vorzugsweise wird das Lösungsmittel in einer Menge von 10 bis 50$ verwendet, Vorteilhaft ist Hexan*

Das Autolysat—Hexan-Gemisch wird dekantiert oder in einem Zentrifugalabscheider zentrifugiert^ der gegen Hexandämpfe beständig ist* Hierbei wird einerseits eine Lösung der lipide und der noeli in der Hefe verbliebenen Kohlenwasserstoffe im Hexan und andererseits das 'Autolysat mit etwa 15/fo Troßkenmasse erhalten.,

Die Lösung der Lipide und. Kohlenwasserstoffe im Hexan wird dann redestilliert, wobei Lipide erhalten werden, die als solche verwendet oder als Rohstoff einer Behandlung zur Abtrennung ihrer Sterole.oder ihrer sonstigen Bestandteile unterworfen werden fonnen.,, Das Autolysat wird abschließend unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unter'7O⁰C " eingeengt» Diese Einengung ermöglicht gleichzeitig die Entfernung von iiexanspurenj die im "Aatplysat verblieben sind« Man erhält auf diese Weise.ein Produkt von hohem Uährwert, das fiä von ranzigem Gesehmaek und unangenehmem Greruch ist» Die Aminosäuren und Yitamine sind unverändert, weil sämtliche Arbeitsgänge bei Tempei?atj|r«ik unter""7O⁰TO durengeführt werden, Es ist möglich, daß an dem Material,* das die'Zeil— wände enthält, eine gewisse Menge Kohlenwasserstoffe haften bleibt, die zurückgewonnen werden

._ίίΛ. BADORIGINAL

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Nach einem weitex'en Aspekt bezieht sich die Erfindung somit auf ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Mikroorganismus in Gegenwart eines Einsatzmaterials kultiviert, das aus geradlcettigen Kohlenwasserstoffen "besteht oder diese enthält, anschließend vorzugsweise - falls noch Kohlenwasserstoffe anwesend sind - eine Fraktion, die den Mikroorganismus enthält, von den Kohlenwasserstoffen abtrennt und die Fraktion Bedingungen unterwirft, unter denen die darin enthaltenen oder davon abgeleiteten Proteine oder Folyproteine oder Polypeptide oder Aminosäuren von dem Zellwandmaterial, das aus den Zellwänden besteht, und/ oder dem Material, das die Zellwände bildete, abgetrennt werden und anschließend dieses Zellwandmaterial, das mit Kohlenwasserstoffen verunreinigt ist, gegebenenfalls nach einer modifizierenden Vorbehandlung einer lösungsmittelextraktion unterwirft, durch die zumindest ein Teil der Kohlenwasserstoffe aus dem Zellwandmaterial abgetrennt wird»

Das Zellwandmaterial, das nach der Abtrennung der Proteine, Polyproteine, Polypeptide und/oder Aminosäuren erhalten wird, enthält gewöhnlich Gluclde, Lipide und einige weitere Proteine sowie die Kohlenwasserstoffe, die zu entfernen sind«, Bei der Lösungsmittelextraktion werden die lipide gewöhnlich von deu, Zellwandmaterial .entfernte Im letzteren verbleiben somit gewöhnlich die Glucoside und einige Proteine«,

Die Lösungamittelextraktion wird gewöhnlich mit einem Lösungsmittel durchgeführt, das aus einem Kohlenwasserstoff besteht oder diesen enthält«, Vorzugsweise wird ein Cj-CU-Kohlenwasserstoff verwendet ₉ insbesondere ein Paraffin und vorzugsweise ein geradkettiges Paraffin. Geeignete Lösungsmittel sind Normalpentan und ITormalhexan«, Gegebenenfalls wird vor der Extraktion des Zellwandmaterials mit einem Kohlenwasserstoff eine Extraktion mit einem Alkohol, vorzugsweise Äthanol, vorgenommen,,

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Eb ist auch möglich, die Extraktion mit einem Lösungsmittelgemisch durchzuführen, das aus einem der vorstehend genannten Kohlenwasserstoffe und einem Alkohol, z_PB. Äthanol, bestehtβ Geeignet ist beispielsweise ein Lösungsmittel, daa aus 80 Gew.—$ Hexan und 20 Gew.-^ Äthanol besteht. Die in der Extraktphase durch die Extraktion zurückgewonnenen Kohlenwasserstoffe können, wenn sie aufepaltbar sind, in die Kultivierung der Mikroorganismen zurückgeführt werden· Die bei der Lösungsmittelextraktion erhaltene Festetoffphase, die aus dem gereinigten Zellwandmaterlal besteht, kann gebundenen Stickstoff in einer Menge von etwa 4 Gew,-# enthalten und ist ein wertvolles Viehfutter»

Die Wachstumsphase wird gewöhnlich vor der stationären Phase abgebrochen«, Der Mikroorganismus wird dann gewöhnlieh von der Hauptmenge des wässrigen Nährmediumb und von der Hauptmenge der nicht verbrauchten Einsatzfraktion abgetrennt· Die Abtrennung kann durch Zentrifugieren erfolgen· Bine teilweise Abtrennung des Mikroorganismus von der Fllissigphase kann durch Filtration vorgenommen werden« Als nächste Stufe wird vorzugsweise eine Wäsche durchgeführt, in der der Mirkoorganismus abwechselnd gewaschen und zentrifugiert wird, wobei die erste Wäsche mit einer wässrigen Lösung eines oberflächenaktiven Mittels und die anschließenden Wäschen mit Wasser vorgenommen werden. Der Mikroorganismus wird vorzugsweise nach dem Waschen auf die beschriebene Weise einer Behandlung unterworfen, durch die die ±m Mikroorganismus enthaltenen Proteine, Polyproteine,Polypeptide oder Aminosäuren vom Zellwandmaterial abgetrennt werden.

Die erste Phase der Abtrennung der Proteine, Polyproteine, Polypeptide oder Aminosäuren kann aus einer Autolyse, Plasmolyse oder Hydrolyse bestehen« Die Autolyse kann mit Hilfe von Enzymen, die im Mikroorganismus enthalten sind, oder unter Verwendung zugesetzter Enzyme vorgenommen werden» Der powert wird gewöhnlich in einem Bereioh gehalten, der

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von der Art der verwendeten Enzyme abhängte

Das Autolyeat wird gewöhnlich in Form einer Flüssigkeit erhalten, deren Viskosität von der Konzentration der darin enthaltenen Trockenmasse abhängt. Da es ohne scharfes Erhitzen erhalten wird, bleiben die Ami.no säuren, die nicht sehr stabil sind, und die Vitamine gewöhnlich vollständig erhalten« Die Autolyse dauert vorzugsweise 3 Stunden, wenn das Autolyeat als Futterhefe dienen soll, und 1O-20 Stunden, wenn ein Autolysat für den menschlichen Verbrauch hergestellt werden solle

Nach einem anderen Aspekt der Erfindung werden an Stelle Ton Autolysaten Hydrolysate durch Einwirkung von Säuren oder Alkalien auf die Zellen der Mikroorganismen oder Plasmolyaate hergestellt, wobei die proteine alt:· Folge einer Änderung des osmotischen Drucks aus den Zellen diffundieren. Diese Änderung wird beispielsweise durch Zusatz von Natriumchlorid zum wässrigen Medium erreicht. Die Autolyse,Hydrolyse und Plasmolyse können in Behältern der gleichen Art durchgeführt werden. Vorzugsweise wird in Rührwerksbehältern gearbeitet.

Das durch Abbau und/oder Extraktion der Zellen erhaltene Produkt wird nun einem Trennverfahren unterworfen, wobei eine Fraktion, die die Proteine und/ocLer Polyproteine und/oder Polypeptide und/oder Aminosäuren umfaßt und auch Lipide und Kohlenwasserstoffe als Verunreinigungen enthalten kann, und eine Fraktion, die das Zellmaterial enthält, erhalten werden. D±e»e Abtrennung kann durch Zentrifugieren und/oder Filtj&tion vorgenommen werden. Die Fraktion, die das Zellwand&B'teFial und Verunreinigungen enthält, wird dann einer Behandlung evr Entfernung dieser Verunreinigungen auf die vorstehend beschriebene Weise unterworfen.

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Nach einer weiteren Aupführungsform des ei'findungsgemäßen Verfahrens kultiviert man einen Mikroorganismus in Gegenwart a) eines Einsatzmaterials, das aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen besteht oder diese enthält, b) eines wässrigen Hährmediume und c) eines Gases, das freien Sauerstoff enthält, trennt das Produkt in eine Fraktion, die den Mikroorganismus enthält, eine Fraktion, die das wässrige Nährmedium enthält und, wenn Kohlenwasserstoffe in wesentlicher Menge im Produkt vorhanden sind, eine Fraktion, die diese Kohlenwasserstoffe enthalt, behandelt anschließend eine Fraktion, die den Mikroorganismus enthält, in einer Feine abwechselnder Wasch- und Trennstufen, wobei in der ersten Waschstufe eine wässrige Lösung eines oberflächenaktiven Mittels und in der letzten Waschstufe ein wässriges Medium verwendet wird, das kein oberflächenaktives Mittel enthält, die Trennstufen so durchgeführt werden, daß der Mikroorganismus von* einer wässrigen Phase getrennt und dann zur Weiterbehandlung geleitet wird und die Wasch- und Trennstufen so durchgeführt werden, daß der bei dieser Reihe von Stufen gewonnene Mikroorganismus einen Kohlenwasseratoffgehalt von weniger als 7 Gew.—i» hat, bezogen auf das Gewicht des trockenen Mikroorganismus, und unterwirft anschließend den gewaschenen Mikroorganiemue einer Behandlung, durch die die Zellen abgebaut und/oder extrahiert werden»

Vorzugsweise werden Proteine, Polyproteine, Polypeptide oder Aminosäuren, die in den Mikroorganismen enthalten oder davon abgeleitet s-ind, vom Zellwandmaterial, das aus den Zellwänden besteht, und/oder dem Material, das die Zellwände bildete, abgetrennt«

Vorzugsweise wird das Produkt, das aus dem Mikroorganismus erhalten wurde und mit Kohlenwasserstoffen und Lipiden verunreinigt ist, gegebenenfalls nach einer modifizierenden Vorbehandlung einer Lösungsmittelextraktion unterworfen,

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r\

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durch die zumindest ein Teil der Kohlenwasserstoffe aus dem Zellwandmaterial entfernt wird» Gewöhnlich enthält das Zellwandmaterial, das nach der Abtrennung der Proteine, Polyproteine, Polypeptide und/oder Aminosäuren erhalten wird, Glucide, Lipide und einige weitere Proteine sowie die zu entfernenden Kohlenwasserstoffe« Durch die Lösungsmittelextraktion werden die Lipide gewöhnlich aus dem Zellwandmaterial entfernt. Die Glucoside und einige Proteine bleiben somit gewöhnlich im Zellwandmaterial.

Die den Mikroorganismus enthaltende Fraktion, die gewöhnlich in Form einer Paste oder Creme vorliegt und Kohlenwasserstoffe als Verunreinigungen enthält, kann mit einer wässrigen Lösung eines oberflächenaktiven Mittels gewaschen werden« Vorzugsweise wird die den Mikroorganismus enthaltende fraktion heftig mit dem oberflächenaktiven Mittel gemischt und ohne eine weitere Wachstumsperiode des Mikroorganismus einer weiteren !Trennung vorzugsweise durch Zentrifugieren unterworfen, wobei eine aus dem Mikroorganismus bestehende Fraktion gewonnen und eine auegebrauchte wässrige Phase, die die verunreinigenden Kohlenwasserstoffe enthält, vom Mikroorganismus abgetrennt wird· 'Falls erforderlich, können die Wasch- und Trennstufen einmal oder mehrmals wiederholt werden, wobei ein wässriges oberflächenaktives Mittel in der" Waschstufe verwendet wird© Nach dem Waschen mit dem oberflächenaktiven Mittel muß mit einem wässrigen Medium gewaschen werden, das frei von oberflächenaktivem Mittel ist· Vorzugsweise wird Wasser zu diesem Zweck verwendet· Auch hier kann wiederum nach Bedarf eine Reihe von Wasch- und Trennetufen durchgeführt werden_e Der Mikroorganismus wird so lange gewaschen, bis er weniger als 7# Kohlenwasserstoffe enthält, bezogen auf das Gewicht des Mikroorganismus (gerechnet als Trockenmasse)_o Vorzugsweise beträgt dieser Kohlenwasserstoffgehalt weniger als 5?£_β Im allgemeinen werden die Kohlenwasserstoffe praktisch vollständig entfernt, jedoch ist dies bei einigen Anwendungszwecken nicht erforder-

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lieh, so daß der Kohlenwasserstoffgehalt in einigen Fällen nicht auf einen Wert unter 0,1$ gesenkt werden muß»

Als oberflächenaktive Mittel zum Waschen des Mikroorganismus eignen sieh kationaktive oberflächenaktive Mittel, z.B_e Stearyldimethylammoniumehlorid, niehtionogene oberflächenaktive Mittel, z.B. die Kondensate von Oleinsäure und Äthylenoxyd, oder anionaktive oberflächenaktive Mittel, z.B. Natriumalkylsulfate«

Nach dem Waschen auf die vorstehend beschriebene Weise wird der Mi oorganismus einer Behandlung unterworfen, durch die die in ihm enthaltenen Proteine, Polyproteine, Polypeptide oder Aminosäuren aus dem Zellwandmaterial abgetrennt werden,, Die erste Phase dieser Abtrennung kann aus einer Autolyse, Plasmolyse oder Hydrolyse bestehen,» Es hat sich gezeigt, daß durch Verringerung des Kohlenwasseretoff-"»gehalts des Mikroorganismus durch die vorstehend beschriebene Wäsche die Wirksamkeit der Behandlung, durch die die Zellen abgebaut und/oder extrahiert werden, beispielsweise die Wirksamkeit der Autolyse, erhöht wird. Demzufolge kann die Verweilzeit des Mikroorganismus in dieser Stufe stark verkürzt werden, und die Einsparungen in den Anlagekosten für diese Stufe überwiegen die Kosten der Waschstufen,

Das Produkt aus der Verfahrensstufe, in der die Zellen abgebaut und/od.er extrahiert werden, wird einer Behandlung unterworfen, durch die die stickstoffhaltigen Verbindungen, z.B. Proteine und/oder Polyproteine und/oder Polypeptide und/oder Aminosäuren, vom Zellwandmaterial abgetrennt werden,, Diese Abtrennung kann durch Zentrifugieren und/oder Filtration vorgenommen werden,, Die auf diese Weise erhaltene Fraktion von stickstoffhaltigen Verbindungen enthält als Verunreinigungen Kohlenwasserstoffe und gewöhnlich auch Lipide, Diese Fraktion wird vorzugsweise einer Lösungsmittel extraktion unterworfen. Diese wird zweckmäßig mit einem Lösungsmittel durchgeführt, das aus einem Kohlenwasserstoff besteht oder diesen enthält» Vorzugsweise werden Cj-Gy-

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Kohlenwasserstoffe für diesen Zweck verwendet, insbesondere Paraffine und vorzugsweise geradkettige Paraffine„ Geeignet als Lösungsmittel sind n-Pentan und n-Hexan_o Gegebenenfalls wird vor der Extraktion der Kohlenwasserstoffe mit einem Kohlenwasserstofflöser eine Extraktion mit einem Alkohol, vorzugsweise Äthanol, vorgenommen, Ss ist auch möglich^ eine Extraktion durchzuführen, in der als Lösungsmittel ein Gemisch von Kohlenwasserstoffen der vorstehend genannten Art mit einem Alkohol, z„B_e Äthanol, verwendet wird«, Die durch die Lösungsmittelextraktion in der Extraktphase zurückgewonnenen Kohlenwasserstoffe können, wenn sie durch Mikroorganismen aufspaltbar sind, in die Kultivierunge— stufe zurückgeführt werden_e

Eine Hefe, die ganz oder teilweise von ihren Lipiden und den verunreinigenden Kohlenwasserstoffen nach einer der vorstehend beschriebenen Methoden befreit und in ihrem Geschmack verbessert worden ist, stellt ein neues industrielles Produkt von großem Wert für die menschliche Ernährung dar.

Gegebenenfalls kann ein Teil des Produkts aus der Behandlungsstufe, in der die Zellen abgebaut und/oder extrahiert werden, zur Einführung von Wachstumfaktoren in die Kulti— vierungsstufe zurückgeführt werden.

Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kultiviert man einen Mikroorganismus kontinuierlich in einem Gärgefäß in Gegenwart einer Erdölfraktion, die teilweise aus gerad·- kettigen Kohlenwasserstoffen besteht und ein mittleres Molekulargewicht hat, das wenigstens 10 Kohlenstoffatomen im Molekül entspricht, und in Gegenwart eines wässrigen Nährmedlums und eines Gases, das freien Sauerstoff enthält, und entfernt kontinuierlich von dem Gemisch a) eine Fraktion, die den Mikroorganismus enthält, b) eine Fraktion, die den größeren Teil der wässrigen Phase enthält, und c) eine Erdölfraktion, die einen verringerten Anteil an geradketti- gen Kohlenwasserstoffen enthält oder frei von diesen

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geradkettigen Kohlenwasserstoffen ist, erwärmt., einen Teil des Gesamtprodukts aus dem Gärgefäß oder eine Fraktion, die den vom Gesamtprodukt abgetrennten Mikroorganismus enthält, auf eine Temperatur, bei der der Mikroorganismus autolysiert wird, und gibt den autolysierten Mikroorganismus in das Gärgefäß,,

Wenn als Ausgangsmaterialien Erdölfraktionen verwendet werden, die gahz oder teilweise durch Mikroorganismen aufspaltbar sind, eignen sich die behandelten Erdölfraktionen je nach ihrem Siedebereich und ihren sonstigen Kennzahlen sehr gut für eine Reihe von verschiedenen Verwendungszwecken« Beispielsweise eigenen sich die Leuchtpetroleumfraktionen als Kraftstoff für Düsenflugzeuge oder Gasturbinen und die schweren Gasöle als schwere Dieselkraftstoffe· Ferner können Öle erhalten werden, die als Kälteöle oder als Transmissionsöle verwendbar sind»

Bei einem Verfahren, bei dem Mikroorganismen zur vollständigen oder teilweisen Entfernung von geradkettigen Kohlenwasserstoffen aus Kohlenwasserstoffgemisohen verwendet werden, werden Nebenprodukte, ζ_βΒ. Ester, gebildet, die Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoff enthalten. Diese Nebenprodukte können in der Kohlenwasserstofffraktion bleiben, die vom Mikroorganismus abgetrennt werden, und stellen eine Verunreinigung dar. Insbesondere ist es bei Verwendung eines wachshaltigen Gasöle als Einsatzmaterial möglich, daß das zurückgewonnene Gasöl auf Grund der Anwesenheit dieser Nebenprodukte einen unzulässig hohen Trübung3punkt hat.

Nach einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren, bei dem man in einer Wachstumsstufe einen Mikroorganismus in Gegenwart eines Gemisches von geradkettigen Kohlenwasserstoffen mit anderen Kohlenwasserstoffen, in Gegenwart eines wässrigen Nährmediume und eines Gases, das freien Sauerstoff enthält, kultiviert, anschließend den Mikroorganismus voa Kohlenwasseratoffrückstand abtrennt

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und diesen Rückstand der Hydrierung unterwirft, wodurch der Trübungspunkt dieses Rückstandes gesenkt wird«.

Als Katalysatoren eignen sich, für die Hydrierung Verbindungen des Kobalts und Molybdäns mit oder ohne Eisen, Nickelmetall, Niokel/Wolframsulfid oder beliebige andere Hydrier- oder Entschwefelungskatalysatoreno Die Hydrierung wird vorzugsweise unter folgenden Bedingungen durchgeführt:

Temperatur: 100*500°C je nach Katalysator

Druck: 10-70 kg/cm

Raumströmungsgeschwin-

digkei-b: 1-10 V/V/Std_e

Wasserstoff-•Kohlenwasserst of f-^Molverhältnis: 0,1:1 bis 5:1

Die Hydrierung kann in der Flüssigphase, Gasphase oder gemischten Paase durchgeführt werden.

Nach einer anderen AuBführungsform der Erfindung wird der Kohlenwasserstoffrückstand zur Senkung des Trübungspunktee einer Alkaliwäsohe an Stelle der vorstehend beschriebenen Hydrierung unterworfen. Diese Laugenwäsche wird vorzugsweise mit wässrige Natriumhydroxyd oder wässrigem Kaliumhydroxyd einer Konzentration von 30-50 Gew.-% bei einem ■Verhältnis von Kohlenwasserstoff zum Behandlungsmittel im Bereioh von 1:1 bis 1:5 bei einer Temperatur im Bereich von 60-100⁰C unter Rühren durchgeführte

Wie bereite beschrieben, kann durch Lösungsmittelextraktion einer Fraktion des bei diesem Verfahren gewonnenen Mikroorganismus ein Lipidextrakt erhalten werden* Der durch Abdampfen des Lösungsmittels gewonnene Lipidextrakt ist ebenfalls ein neues industrielles Produkt, das entweder ala solches verwendet oder als Rohmaterial in eine Trennstufe eingesetzt werden kann, in der die Styrole, Fett-· säuren (vor ader nach Vereeifung) oder die sonstigen Beatandteile abgetrennt werden.

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Die Mikroorganismen, die nach α^η vorstehend beschriebenen verschiedenen Ausführungsforrae- der Erfindung erhalten werden, können getrocknet werden= Im allgemeinen ist es zv/eckmäßig, eine Trocknung unter scharfen Bedingungen zu vermeiden, da dies zu einer teilweisen Zersetzung des Mikroorganismus beispielsweise durch Zerstörung von Vitaminen und Oxydation von ungesättigten Verbindungen führt» Ferner sind die Zersebzungsprodukte in dem für die Extraktion verwendeten Lösungsmittel löslich und gehen auf diese Weise aus dem Produkt verloren oder erfordern v/eitere Verfahrensstufen zur Rückgewinnung ο

Gemäß der Erfindung erfolgt die Trocknung von Hefepaste, die mit Lipiden verunreinigt ist, in Gegenwart einer Atmosphäre, die aus einem Gas besteht, das keinen molekularen Sauerstoff oder weniger molekularen Sauerstoff als luft enthält= Geeignete Gase sind Stickstoff, Kohlendioxyd, Wasserstoff, Heizgas oder Raffinerierestgas= Die Trocknung kann, in rotierenden Trommeln oder durch Sprühtrocknen vorgenommen werden»

Es hat sich gezeigt, daß der Gehalt an gewissen essentiellen Aminosäuren, insbesondere an Aminosäuren, die Schwefel, Methionin und Cystein enthalten, in der Hefe Candida lipolytica nur gering ist» Um diesen Mangel zu beheben, wurde die Zusammensetzung gewisser Mikroorganismen, die auf iirdölfraktionen kultiviert werden, hinsichtlich der Proteine untersucht. Diese Zusammensetzung ist bei den verwendeten Mikroorganismen verschieden= Es erwies sich als möglich, gev/isse Mikroorganismen zu wählen, deren ^Gehalt an essentiellen Aminosäuren so hoch ist, daß diese Mikroorganismen bei Vermischung im geeigneten Mengenverhältnis hinsichtlich der Aminosäuren eine Zusammensetzung aufweisen, die sich der optimalen Zusammensetzung nähert. Insbesondere ist es möglich, einen Mikroorganismus zu wählen, dessen Gehalt

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an schwefelhaltigen Aminosäuren (methionin + Cystein) so hoch ist, daß ein Gemisch einer entsprechenden Menge dieses Mikroorganismus mit der Hefe Cendida lipolytica Proteine enthält, deren Zusammensetzung hinsieht der essentiellen Aminosäuren der von Rose in Journal of Biological Chemistry 1955, ^eite 217, angegebenen optimalen Zusammensetzung entspricht.

Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung kultiviert man einen Mikroorganismus unter Verwendung eines kohlenwasserstoffhaltigen Einsatzmateriafe und mischt den hierbei erhaltenen Mikroorganismus oder eine daraus extrahierte oder abgeleitet*³ fraktion, die Polyproteine,Proteine und/oder Aminosäuren enthält, mit einem oder mehreren Polyproteinen, Proteinen oder Aminosäuren zu einem Produkt, das Aminosäuren iη freier oder gebundener Form im gewünschten !Mengenverhältnis enthält.

Gegebenenfalls kultiviert man getrennt zwei oder mehr verschiedene Mikroorganismen, in denen das tijengenverhältnis der Aminosäuren verschieden ist, wobei wenigstens einer dieser Mikroorganismen (vorzugsweise alle) unter Verwendung eines kohlenwasserstoffhaltigen Einsatzmater LaIs gezüchtet wird, und mischt diese Mikroorganismen oder eine davon extrahierte oder abgeleitete Fraktion, die Polyproteine und/oder Proteine und/oder Aminosäuren enthält, in den Mengen, die zur Erzielung des gewünschten Mengenverhältnisses oder Aminosäuren erforderlich sind.

Die Kultivierung des Mikroorganismus oder der Mikroorganismen kann kontinuierlich oder chargenweise erfolgen. Das durch Kultiviereil von verschiedenen Mikroorganismen erhaltene Produkt kann gemischt und das Gemisch gereinigt oder in anderer weise behandelt werden. Es ist auch möglich, die getrennten liikroorganismen zu reinigen oder in anderer Weise zu behandeln und anschließend die gereinigten bzw. behandelten Mikroorganismen zu mischen. Die Likroorganismen können getrennt BAD ORIGINAL

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oder nach Vermischung der Autolyse, Hydrolyse oder Plasmolyse unterworfen v/erden<, Die für die Mikroorganismen verwendeten Nährböden können gleich oder verschieden sein. Einer oder mehrere dieser Mährboden können gegebenenfalls gebundenen Kohlenstoff enthalten=

Die vorstehend beschriebenen verschiedenen Ausführungsfo.rmen der Erfindung können in beliebiger geeigneter Weise kombiniert werden! Die Verfahrensstufen können chargenweise durchgeführt v/erden, jedoch ist es auch möglich, eine oder mehrere der Stufen kontinuierlich durchzuführen.

In den folgenden Beispielen ist die „Zelldichte als Trockengewicht der Hefe pro Liter Kultur ausgedrückte

BeJSOJeI_-I_-

Gasöl und das Kulturmedium wurden aus zwei Behältern kit zwei Kolbenpumpen zu den beiden Leitungen eines Injektors gepumpt» Zwischen den Pumpen und dem..Injektor waren Pufferbehälter angeordnet, um den Huckdruck stetig zu halten, der auf einen Wert- im Bereich von

14-16 Kg/cm eingestellt wurde»

Der Injektor bestand aus einer Kapillare aus nichtrostendem Stahl (innendurchmesser 0,5 mm), deren freies Ende zu einer Austrittscffnung von 0,05 bis 0,C8 mm verengt war» Das andere Ende der Kapillare war gabelförmig an die beiden Eintrittsleitungen für Gasöl und Nährmedium geschweißte Die Pumpen konnten auf eine Ausströmmenge von 0,3-1 1/Std. reguliert werden.

Das aus dem Injektor kommende Gemisch...von Gasöl und Kulturmedium wurde in ein kontinuierlich arbeitendes 5 1-Gärgefäß eingeführt, das mit folgenden Einrichtungen versehen war:
Rührer

Drehzahl 1000

Verhältnis von Flügeldurchmesser zu Behälterdurch-

, _K. me s ε er 1:3 BAD ORIGfNAL

Flügel sah.!· 8

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Lufbinjekboren in Form einer Ringka.pil.lare., Elektroden zur p„-Tiegelung (eingehaltener p^-Wert = 4)-Wassermantel zur Einhaltung einer konstanten Temperatur von 30⁰C .

leitungen zur Entnahme von Flüssigkeit mit einer Kolbenpumpe.

Zur Einführung des Geraisches aus Gasöl und Kährmedium in Form einer feinen Dispersion unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Systems kann die Kapillarspitze des Injektors entweder innerhalb der Flüssigkeit (vorzugsweise unterhalb des Rührers) oder über der Flüssig--

keitsoberflache zum Boden des Gärgefäßeη zeigend angeordnet werden»

Folgende Materialien wurden gebraucht:

Hefe Candida lipolytiea

Gasöl schweres Gasöl aus Irak-Rohöl

mit 12 GeWo-% n-Paraffinen, Stcckpunkb r 1?°C

Zusammensebzung des wässrigen Nährmediums: DiammoniumphosphaJ; 2 g
Kaliumchlorid 1_?15 g

Magnesiumsulfabhepba-	0,65 g	zur Auffüllung auf
hydrab	'P,17 S · "	1000 cm3
Zinksulfab	0,045g
Mangansulfafcionohydrab	0,068g'
Ferrosulfabhepbahydrab	0,025g
Hefeexbrakb	200 g
Ieibungswasser
Desbillierbes Wasser

Luft filtriert und komprimiert

Um die Wichtigkeit der Verwendung des Muckeinspritzsysbems zu veranschaulichen, wurden folgende Versuche durchgeführb: .

1) Kulbur unter Zuführungvon Gasöl und Medium durch gebrenhbe Leibungen ohne vorherige Zerstäubung.

BAD

909001/^442

	Seine Zer stäubung
Flüs s Igke i t s~o lu men im Gärgefäß, "L	■ <-■■*■' 3
Verdünnung	• 0,0n
Luf tmenge, V/V/S i"d.	70
Flüssigkeitsmenge Lfcr./Stdo	0,21 ■
Gramm Gasöl/Lbr, Einsatz-	160

W ■ f

2. Kultur unter Zerstäubung des Gemisches von Gasöl und. Medium mit Hilfe der beschriebenen Druckeinspritzung bei eingetauchter Kapillare=

3. VLe bei 2), .jedoch mit Anordnung der Capillare oberhalb des FJ-üssigkeitsspiegels (Einspritzung an der luf b).

.Folgende Ergebnisse wurden erhalten:

Versuch 1 Versuch 2 Versuch

Zerstäu- Zerstäubung bung in . in der luf tu.er Flüssigkeit

3 . 3 . .0,10 0,11 70 70

0,3 0,33

160 160 .Zelldichte 5 . 5 5,5

ItX _ J -J —ν ^ -i. v7 vJJ» v»* i* w Va \^ J_

Gasöltröpfchen, « 100 10 6 Dauer der Zellteilung, Std. 10 "7 6,5

Verbrauch an η-Paraffinen, % 41 40 43

Es ist festzustellen, da3 durch Disper_oierung laifc liilfe der Kapillare die Zellteilungszeil· bei gleichem 3nb~ par äff inier ungsgrad erheblich verkürzt 7/ird, d.h.. die Geschwindigkeit der Bildung von Hefe und von enbparaffxniertem Gäsül wird ohne Veränderung des Grades der Entparaffinierung erhöht;'=

Beispiel 2

Dieses Beispiel -"-eranschaulicht die Verwendung eines Ausgangsmaterials, das durch Dispergierung von festem

Paraffinwachs erhalten wird»

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Das feste Substrat (Ha^ntgatsch oder festes Paraffinwachs) wurde in einem Behälter geschmolzen und an .der Luft als feine Dispersion in das im Gärgefäß enthaltene Kulturmedium gespritzt, wobei ein luftzerstauber verwendet wurde, der aus einem in einem konzentrischen Lufteintrittsrohr angeordneten Rapillarrohr.bestand» Die Einspritzung kann entweder von einem Punkt innerhalb der Flüssigkeit oder von einem Punkt oberhalb der Flüssigkeit erfolgen= Das gleiche 5 Ltr.-Gärgefäß wie in Beispiel 1 wurde verwendet»

Folgende Materialien wurden gebraucht: Hartgatsch (Schmelzpunkt 60°C)
Paraffinwachs (Schmelzpunkt 6O-7O°C).

Schweres GasöL· (Irak) (Fließpunkt + 17°C, n-Paraffine

12 Gew.-%)

Hefe: Candida lipolytica

Das gleiche wässrige Rährmedium wie in Beispiel 1 wurde verwende t.

Die folgenden Versuche wurden mit dem Ziel durchgeführt, ein feinteiliges festes Substrat, das an n-Paraffinen reich oder angereichert war, der Hefe verfügbar zu machen:

1) Kultur mit gewöhnlichem schwerem Gasöl ohne vorherige Zerstäubung«

2) Kultur mit Hartgatschdispersicn

3) Kultur mit schwerem Gasöl, das mit Paraffinwachs angereichert war,zsrstäubt.

Folgende Ergebnisse wurden erhalten:

1)Gasöl,nicht zerstäubt	Flüssigkeits volumen, Ltr.	3	2)Gatsch, zerstäubt	3)Gasöl + Wachs, zerstäubt	10
Verdünnung	0,10	3	3
Xuffcmenge, V/V/Sbd.	70	0,10	0,10
Flüssigkeitsmenge Ltr./Stdo	0,3	,.- 70	70
Gasölsubstrat, g/l Medium	180	0,3	0,3
ZelldichtB ^	4-	160	160
Größe-der Substrat teilchen	100	. 8,5.	9
80990	1/0U2	5

(öl

Verbrauch' an n-Paraffinen

im Ausgengsnaterial. Gew.-% 32 69 73

Die Verwendung einer mit einem Luftzerstäuber hergestellben feinen Dispersion von Gabsch oder Gasöl, das mib fesbem Faraffin angereicherb isb, ergibb einen deublichen Ans bieg der Zelldichbe bei gleicher Verdünnung,, Hieraus isb ersichblich, daß die Zugänglichkeib der η-Paraffine verbesser·b werden kann-» Der praktische Nubzen liegb in der erhöhben stündlichen Produktion von Hefe und enbparäffinierbem Gasöl ohne Veränderung der Qualität des letzteren- .

Beisoie_l_3

Dieses Beispiel veranschaulichb die Verwendung eines Einsabzmaberials, das durch Ulbraschallvibrabion dispergierb wird»

Das Gäsöl und das Kulburmedium wurden mib einer Kreiselpumpe zu einer Vorrichtung gepumpt, die Ultraschallvibrabionen erzeugb und als "siffleb liquide" oder "fluid whistle" (Flussigkeibsflobe) bekannt ist. Diese Vorrichbung besbehb aus einem sehr feinen Stahlblech, das vor einem abgeflachten Rohr monbiert isb, das eine flache Düse bildeb, durch das die Flüssigkeit eintritt. Diese Vorrichtung wurde in einen zylindrischen Behälter angeordnet, der eine Resonanzkammer bildete» Es wurde eine Frequenz von 20-22 kHz/Sek„ angewendete Der Austritt der "Flöte" war über einen elastischen Kunststoffschlauch von 50 cm Länge mit dem Gärgefäß verbunden» Das gleiche kontinuierlich arbeitende 5 1-Gärgefäß v/ie in Beispiel 1 wurde verwendet <,
Folgende Materialien wurden eingesetzt:

Hefe Candida lipolytica

Gasöl Schweres Gasöl (Irak) mit 12 Gew=-%

n-Paraffinen

Kulturmedium Wässriges Medium wie in Beispiel 1 Luft Filtriert und komprimierb

ORIGINAL INSPECTED

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Die Vorbeile des Ultraschallsystems ergeben sich aus folgenden Versuchen:

1) Kulbur ohne vorherige Dispergierung des Gasöls. 2"> Kultur mit Ulfcraschalldispergierung des Gasöls·,

Versuch	1	>	0,3	d.
	ohne Disper	4	Disper
	gierung	100	gierung
Flussigkeitsvolumen, Ltr„	3	3
Luftmenge, V/V/Std,	70	70
Gasölgehalt des Einsatzes,
g/l	180	160
Verdünnung	0,1	0,1
Durchflußmenge der Flüssigkeit.
1/Std ο	0,3
Zelldichte, g/l	9
Größe der Gasöltröpfchen, u	5

Verbrauch an η-Paraffin aus

dem Einsatzmater ial,Gev/*-# 32 74-

Es ist offensichtlich, daß die Zelldichte durch das Ultraschall-Dispergierungssystem bei gegebener Verdünnung erhöht wird ο Mit anderen Worten, das System verbessert die Verfügbarkeit des Gasölsubst. ats v'^:I;:· die Hefe. Es ist möglich, auf diese Weise die Hefeproduktion beiftgleicher Verdünnung zu steigern oder bei stärkerer Verdünnung die gleiche Zslldichte zu erzielen, Dies entspricht einer erheblichen Verkürzung äer Zellteilungszeit ο

Beispiel 4-

Dieses Beispiel veranschaulicht die Stabilisierung ■ von als Einsatzmaterial verwendeten Gasöldispersionen mit Hilfe von Hefen.

Die Dispergierung eines als kohlenstoffhaltiges Material verwendeten Gasöls in einem mineralischen Medium wurde in einer als "Seila-Microdisperser" bekannten Kolloidmühle durchgeführt, in der die Scherwirkung durch zwei Systeme erzeugt wurde, die auf der gleichen Drehachse montiert waren, nämlich durch ein Zahnrad und zwei konische Flächen. Der Austritt der Apparatur war mit

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ι τ / wv/

einem elastischen Schlauch mit dem Gärgefäß verbunden. Zur Stabilisierung der gebildeten Emulsion wurde eine Menge der Kulturflüsaigkeit, die etwa 5% des Volumens der Emulsion entsprach und 8-9 g Hefe/1 enthielt, am Eintritt oder am Austritt der Kolloidmühle in das flüssige Material eingespritzt» Der Rührer des Gärgefäßes, das ein Fassungsvermögen von 3 1 hatte, lief mit 1000 UpM« Das Gefäß war mit einem Abzugsystem und mit einer Pumpe versehen. Der Pjr-Wert wurde mit Elektrodenund einem automatischen Potentiometer geregelte

Folgende Materialien wurden eingesetzt:

Hefe Candida lipolytica

Gasöl Schweres Gasöl mit 12 % η-Paraf

finen, Fließpunkt + 17°C

Medium Wässriges mineralisches Bahr-

medium wie in Beispiel 1

Luft Filtriert und komprimiert

Um die Vorteile der Kolloidmühle und der Stabilisierung der Dispersion mit Hefe zu veranschaulichen, wurden folgende Versuche durchgeführt:

1) Kultivierung auf Gasöl ohne vorherige Dispergierung»

2) Kultivierung auf Gasöl mit vorheriger Dispergierung mit Hilfe der Kolloidmühle, jedoch ohne Stabilisierung mit Hefe-o

3) Kultivierung auf Gasöl mit Dispergierung und Stabilisierung durch Kreislaufführung eines Teils der Produkthefe zum Eintritt der Kolloidmühle,

Versuch Flüssigkeitsvolumen Verdünnung Zugeführte Flüssigkeit l/Sfcd.

Gasölgehalt,g/l Luftmenge, V/V/Std» Mittlere Größe der Öltröpfchen, μ

Zelldichte verbrauchte Paraffinmenge

"^% 80S901/0u!^{2 65 81}

	1	2	0	3
	3 1	3 1	0	3 l
0	,10	0,10	180	,10
0	,3	0,3	70	,3
180		180	5
70		70	10
100		10	I
4		8

Es. isb offensichtlich, daß durch Verwendung einer Kolloidmühle eine Emulsion erhalten wird, durch deren Dispergierungsgrad die Zelldichte erheblich gesteigert wird ο Durch die Anwesenheit von Hefe in der Emulsion wird der hohe Dispergierungsgrad aufrecht erhalten und das Wachstum der Hefe erheblich verstärkt -

Beispiel ^

Dieses Beispiel veranschaulicht die p_H -Regelung durch Zusatz von Ammoniak„ Versuch 1 ist ein Vergleichsversuch»
Versuch 1

In ein 1,5 1-Gärgefäß wurde 1 1 des in Beispiel 1 beschriebenen wässrigen Nährmediums gefüllt» 5 S Reinzuchthefe des Stamms Candida lipolytica, die unter den gleichen Bedingungen kultiviert worden war, wurden als Paste mit 20 GeWo-% Trockenmasse zugegeben- Die Zelldicht betrug zu Beginn etwa 1 g/l. Die Temperatur wurde auf 30 + 1°C eingestellt.

Zunächst wurden 4 g gemischter Cq-C,*g-n-Paräffinkohlenwasserstoffe zugegeben. Dann wurde die exponentielle Zugabe von Kohlenwasserstoff von dem Zeitpunkt an vorgenommen, zu dem die Kultur 2 g/l erreichte <· Folgende Mengen wurden zugegebene
Zeit in Stunden 0

4 5 6 7

Der Versuch begann in dem Augenblick, in dem das Belüftungs- und Rührsystem, das 3 Millimol Sauerstoff/l/Min, zuführte, eingeschaltet wurde. Der ρ -Wert betrug zu

1 S	g
1,4	S
1,6
2 S	S
2,8	S
3,2	g
4	S
5,6	S
6,4

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56 fe &

Beginn 7· Diesen Parameter ließ man während des Versuchs fallen, ohne neutralisierende Mittel zuzugeben, Er fiel zunächst schnell und stabilisierte sich dann bei p_H 3~ Die Zelldichte zum Schluß betrug 10 g/l, */ ■ die Zellteilungszeit 7 Stunden,
Versuch 2

Dieser Versuch wurde in der gleichen Weise wie Versuch durchgeführt mit der Ausnahme, daß der pjj-V/ert alle 2 Stunden durch Zu3atz von 10n-Ammoniak wieder auf 4 gebracht wurde. Die Zelldichte zum Schluß betrug 15 g/l» die Zellteilungszeit 7 Stunden*

Versuch 3

Dieser Versuch wurde in der gleichen Weise wie die beiden vorstehenden Versuche durchgeführt mit der Ausnahme, daß der p_H-Wert durch Zusatz von lOn-Ammoniak automatisch bei 4 ± 0,1 gehalten wurde ο Die Zelldichte zum Schluß betrug 2ü g/l, die Zellteilungszeit 3,5 Std» Die Reihe dieser Versuche zeigt, daß ein sehr niedriger ρ -W_ert die Zelldichte begrenzt, und daß seine Stabilisierung bei einem Wert von etwa 4 schnelles Wachstum begünstigt ο

Versuch 4

Ein kontinuierlicher Kultivierungsversuch wurde in einem 5 1-Gärgefäß wie folgt durchgeführt:. 3 1 der Kultur wurden in einer Menge von 500 cm^/St-d- mit einem Medium, das 10 Gew»-Teile Gasöl enthielt, das in SO Gew.-Teilen des gleichen mineralischen Mediums in Versuch 1. emulgiert war, zugeführt,- Die Temperatur wurde bei 30⁰C gehalten,und die Belüftung und Rührung wurden so vorgenommen, daß 3 inMol Sauerstoff pro 1 Medium/Min, zugeführt wurden (Sulfitmethode). Das Medium enthielt zu Beginn 2 g Diammoniumphosphat/1 entsprechend 0,42 g Stickstoff als Ammoniak pro Liter. Der Pu-Keri;.",'.' wurde durch Zusatz von 1Oii-Ammoniak automatisch bei 4 + 0,1 gehalten- Die Zelldichte stabilisierte sich nach einigen Tagen bei einem Wert von 10 τ 1 g/l. Das mineralische

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Medium aai Ausbribb enthielt pro Liter 0,42 + 0,04 g· Ammoniakstickstoffο

Durch diese Arbeitsweise wird der Stickstoffgehalt konstant bei einem gewünschten Wert gehalten, so daß auch das Kohlenstoff/Stickstoff-Verhältnis konstant bei dem Wert bleibt, der für die Zuführung der für das Wachstum erforderlichen Stickstoffmenge gebraucht wird»

BeJSOJeI_n 6

40 1 mineralisches Medium der in Beispiel 1 genannten Zusammensetzung wurden in ein Gärgefäß gefüllt, das ein Fassungsvermögen von 60 1 hatte. 20 1 eines 24 Sbunden-Inoculums von Candida lipolytica auf gemischten Cq-C^g-Kormalkoblenwasserstoffen wurden dann so zugegeben, daß die Zelidichte etwa 1 g Trockenmasse pro Liter betrug. Schweres Erdöl-Gasöl in einer.Menge von 15 g/l entsprechend einer Gesamtmenge von 1,03 1, die.ausreicht, um die Zelldichte auf 2 g/l zu bringen, wurden in das Gärgefäß einführt. Die Temperatur der Kultur wurde bei 30°C + 1°C, der p„~Werb bei 4 gehalten» Die Belüftung und Rührung wurden so vorgenommen, daß 3 Millimol Sauerstoff/1 Medium/Min, zugeführt wurden»

Durch ein automatisches Pjr-Regelsystern wurde wässriges 1On-Ammoniak eingeführt» Nachdem die Zugabe von Ammoniak 20 cm erreicht hatte, wurde mit der Zugabe von Gasöl in einer Menge begonnen, die durch den theoretischen Bedarf der Kultur und unter der Annahme einer Ausbeute

^{VOn Λ}°^% Mno ν Gebildete Hefe . \luu χ Eingesetztes Gasöl ^J

und einer Zellteilungszeib von 3 Stunden bestimmt war. Dieser Zusatz erfolgtesbündlich, bis die insgesamt zugesetzte Gasölmenge 250 g/l, d.h, insgesamt 17 1 betrug, Dieser Zusatz wurde bis zur 15,Stunde einschließlich fortgesetzt.

^: ORIGINAL INePECTED

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bar

Ausgehend von einer Zelldichbe von 2 g/l war nach 15 Stunden eine Zelldichbe von 8 g/l erreichte Diese Periode stellt die Exponential-Wachstumsphase dar»

Zwischen der 20. und 30, Stunden fiel die Wachs bumsgeschwidigkeit von einem Maximalwert auf Null. Nach der 30.Stunde, als die Zelldichte ?.0g/l betrug, begann die stationäre Phase (Wachstumsgeschv/indigkeit Null), die 45 Stunden dauerte und in der die Zelldichte abnahm „

In.einem bestimmten Augenblick dieses Versuchs wurden 9/10 der Kultur abgezogen, Das im Gärgefäß verbleibende 1/10 diente als Inoculum. Nach Zugabe von mineralischem Medium wurde eine neue Kultur auf die beschriebene Weise begonnen» Auf diese Weise wurde eine Kultur mehrmals verwendet, ohne daß es erforderlich war, ein frisches Inoculum für jeden Versuch herzustellen.

In der beschriebenen Weise wurde eine Reihe von Versuchen durchgeführt, bei denen die Kultur bei 8 g/l in in der Exponentialphase (maximale Wachstumsgeschwindigkeit) abgebrochen wurde, Die Kultur wurde immer bei der maximalen Wachs tumsgeschv/indigkei t erneut: begonnen, wodurch die Trägheitsphase und die Beschleunigungsphase praktisch ausgeschaltet wurden«

Zum Vergleich wurde eine weitere Versuchsreihe durchgeführt, bei der die Kultur nach 35 Stunden in der stationären Phase (Wachstumsgeschv/indigkeit Null) abgebrochen wurde ο Es zeigte sich, daß das Wachstum nach 5-10 Stunden erneut begann, worauf sich eine Beschleunigungsphase von 2-3 Stunden anschloß.

Beispiel 7

Die in Beispiel 6 beschriebenen Versuche wurden wiederholt, jedoch -unter Verwendung der Hefe Hansenula anomala,

AL INSPECTED

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- 59 -

die chargenweise auf schwerem Gasöl in einem Gärgefäß mit; einem Fassungsvermögen'von 60 1 kultiviei't wurde. Die Kulturen, bei denen die Beimpfung zu Beginn mit 8 g Hefe/1 vorgeno Jioen wurde, die während der Exponen-tialphase abgenommen werden war, hatten praktisch keine Trägheitsphase, während die Kulturen, die mit einem Inoculum von 20 g/l in der stationären Phase begonnen wurden, Trägheitsperioden von 10-15 Stunden hatten-

Beispiel 8

Die in den Beispielen 6 und 7 beschriebenen Versuche wurden mit den Hefen Candida lipolytica und Hansenula anomala in einem £0 1-Gärgefäß wiederholt,, Für diese Versuche wurde das Inoculum aus dem 60 1 -Gärgefäß in Form einer Paste eingeführt, die £0% Trockenmasse enthielt und durch Zentrifugieren eines Teils der Kultur

aus den Versuchen der Beispiele 6 und 7 bei 5°C erhalten worden war„

15 1 des mineralischen Mediums der in Beispiel 1 genannten Zusammensetzung wurden in das 20 1-Gärgefäß eingeführt„ Hierauf folgte die Zugabe von Hefepaste in einer Menge von 5 g/l? d.h. insgesamt 75 g entsprechend einer Anfangszelldichte von 1 g/l, und von Gasöl in einer Menge von 15 g/l₅ d.h. insgesamt 258 g., Die Temperatur der Kultur wurde bei 20 + 1°C und Ptt 4 ± 0,1 gehalten. Die Rührung und Belüftung wurden so vorgenommen, daß 3 Millimol Sauerstoff/l/Min, zugeführt wurden ο Das Gascl wurde zugegeben, nachdem 5 car⁵ lOn-Ammoniak zugegeben war, Diese Zugabe erfolgte stündlich nach dem in Beispiel 1 genannten Plan, bis pro Liter ?50 g, doh. insgesamt 4,3 1 Gasöl zugesetzt waren*

Eine Versuchsreihe wurde jeweils durch Beimpfen mit einer Hefe begonnen, die in dem 60 1 -Gärgefäß bis zu einer Zelldichte von 8 g/1 kultiviert worden war. Bei einer weiteren Versuchsreihe wurde die Beimpfung mit einer Hefe vorgenommen, die in.der stationären Phase bei einer

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-" cO -

Zelldichte von 20 g/l aus dem gleichen Gärgefäß entnommen war«

Im ersten Fall wurden Kulturen ohne Trägheitsphase sowohl bei Candida lipolytica als auch bei Hansenula anomala erhalten. Im zweiten Fall ergaben sich Trag-'·¹ heitsphasen von 5-10 Stunden bei Candida lipolytica und von 10-15 Stunden bei Hansenula anomala-

Beispiel 9

Dieses Beispiel veranschaulicht die Abstimmung der Geschwindigkeit der Nährstoffzufuhr auf die Wachstumsgeschwindigkeit der Mikroorganismen»

1 1 des mineralischen Mediums-;der in Beispiel 1 genannten Zusammensetzung wurde in ein 1,5 1-Gärgefäß gegeben. Zum Beimpfen wurden 5 g einer Kultur von Candida lipolytica, die unter den nachstehend beschriebenen gleichen Bedingungen gezüchtet worden war, in Form einer Hefepaste mit 2C% Trockenmasse verwendet. Die Anfangszelldichte betrug etwa 1 g/l (Trockenmasse/l Kultur)., Die erforderliche Menge eines Gemisches von Cq-C,»,--Normalkohlenwasser stoffen wurde zugesetzte Die Temperatur wurde auf 30 _t 1°C, der p^-Wert zu Beginn auf 4+0,1 eingestellt und während des Versuchs durch Zugabe von 1On-Ammoniak auf dieser Höhe gehalten ο

Als Versuchsbeginn wurde der Zeitpunkt gerechnet, an dem das Belüftungs- und Rührsystem eingeschaltet wurde. Mit diesem System wurden 3 Millimol Sauerstoff/1 Medium/Min» zugeführt.,

Die folgenden 3 Versuche unterscheiden sich nur in der Art, in der das Gemisch von η-Paräffinen zugegeben wurde. Die Gesamtmenge an Kohlenwasserstoff betrug in jedem Fall 32 g.

1j_Zusatz in gleichen Portionen

v/urden Je 8 g der gemischten n-Paraff ine/zu Beginn sowie nach 30, 50 und 70 Stunden zugegeben»

80990

2) Einmalige Zugabe

Die Gesamtmenge von 32 g wurde zu Beginn auf einmal zugegeben.

3)Abpestufte Zugabe

Die Kohlenwasserstoffe wurde entsprechend dem theoretischen Badarf für das Wachstum unter der Annahme einer Zellteilungszeit von 3 Stunden und einer Ausbeute von 1CO% der Paraffine zugesetzt= Zu Beginn wurden 4 g Kohlenwasserstoffe zugesetzt. Nachdem eine Zelldichte von 2g/l erreicht war, wurde die Zugabe nach dem folgenden Plan fortgesetzt:

Zeit nach Erreichen einer Zelldichte von 2 g/l, Stunden

O	1	S
1	1,4	S
2	1,6	6
3	2	S
4	2,8	S
5	3,2	S
6	4	δ
7	5,6	6
9	6,4	S

Die Zellteilungszeit betrug 5 Stunden beim Versuch 1, 4,5 Stunden beim Versuch 2 und 3 Stunden beim Versuch

Beispiel 10

40 1 des mineralischen Mediums der in Beispiel 1 genannten Zusammensetzung wurden in ein Gärgefäß mit einem Fassungsvermögen von 60 1 gefüllt. Zum Beimpfen wurden 20 1 einer 24 Stunden-Kultur von Candida lipolytica auf Normalkohlenwasserstoffen verwendet» Die Zelldichte betrug etwa "1 g/l. Dann wurden 1,3 1 schweres Gasöl entsprechend 15 g/l zugegeben. Diese Menge reichte aus, um die Zelldichte auf 2 g/l zu bringen, ^r: *:'"■·■-·- Die Kultur wurde bei 30 + 1°c und bei p_R 4 gehalten.

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- 62 -

Die Rührung und Belüftung wurden so vorgenommen, daß 3 Millimol Sauerstoff/1 Medium/Min-, zugeführt wurden, Die Zugabe von 10n-Ammoniak erfolgt durch einen automatischen ρττ-Re gier,»

Nachdem die Ammoniakzugabe £0 cm erreicht hatte, wurde mit der Zugabe von Gasöl begonnen, wobei eine Ausbeute

und eine Zel-lteilungszeit von 3 Stunden zu Grunde gelegt wurden» Diese Zugabe erfolgt jede Stunde, bis insgesamt 250 g Gasöl/1 entsprechend einer Gesamtmenge von 17 1 zugesetzt warenο

Es wurden 2 Versuche durchgeführt, die sich in der Zugabegeschwindigkeit des Gasöls unterschieden.

1) Der Kohlenwasserstoff wurde gemäß dem nachstehenden Plan entsprechend einer Zellteilungszeit von 3 Std„ und einer auf Gasöl bezogenen Ausbeute

f-lOO χ Trockenhefe \n _ _1Q% ^{1 IUJ x} zugegebenes Gasöl ^{; voa IU/O}

zugegeben„

Beginn des exponentiellen Zusatzes,Stunden g/l

0 5

1 7

2 8

3 10 4-

6 ZQ

7 28

8 32

9 40 10 55

Die dem Gärgefäß zugesetzten tatsächlichen Mengen werden durch Multiplikation der oben angebenen Zahlen mit errechnet, '

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- 65 ~

2) Der Kohlenwasserstoff wurde gemäß nachstehendem Plan entsprechend einer Zellteilungszeib von 5 Stunden und einer auf Gasöl bezogenen Ausbeute von 10% züges e t ζ t ο
Beginn des exponentieilen Zusatzes.Stunden

tunden	g/l
O	3
1	3
2	3
3	4
4	4
	5
6	6
7	6
8	7
9	8
10	10
11	12
13	12
14	14
15	16
16	24
17	24
18	26
19	52
20	16(Resfc)

Die den Gärgefäß tatsächlich zugegebenen !.!engen wurden durch Multiplikationen dieser Zahlen mit 60 erhalten.

Die Zellteilungszeit betrug 4 Stunden beim Versuch 1 und 8 Stunden beim Versuch 2. Es ist also vorteilhaft, bei der Zugabe der Kohlenstoffquelle eine kurze Zellteilungszeit; zu Grunde zu legen,

3) Der Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch der Kohlenwasserstoff in einer Geschwindigkeit zugegeben wurde, die stündlich nach dam theoretischen Bedarf auf der Grundlage der tatsächlichen Y/achstumsgeschwindigkeit im Augenblick der Zugabe bestimmt.wurde ο Die Zellteilungszeib Lei diesem Versuch betrug 10 Stunden,

BAOOBtQINAL

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ein Zeichen, daß der Zugabe der Kohlenstoffquelle eine Zellteilungszeit von 3 Stunden zugiunde gelegt v/erden sollte..

! 2JL

Bei dem nachstehend "beschriebenen Versuch wurde die Kultur mit einen auf Heiasse kultivierten Inoculum begonnen»
Ver such_ _1_

40 1 des mineralischen Mediums der in Beispiel 1 genannten Zusammensetzung wurden in ein Gärgefäß mit einem Fassungsvermögen von 60 1 gegebene 20 1 eines Inoculums aus einer 24 Stunden-Kultur von Candida lipolytica auf n-?araffinen (in der stationären Wachstumsphase, Zelldichte 5 g/l) wurden dann in das Gärgefäß gegeben, wobei eine Zelldichte von 1 g/l im Gärgefäß erhalten wurdec Dann wurde 1.03 1 schweres Gasöl entsprechend 15 g/l in das Gärgefäß gegeben- Diese Menge reichte aus_s um die Zelldichte auf 2 g/l zu bringen= Die Temperatur der Kultur wurde auf 30 + 1⁰O und der p_H-\iert auf 4 eingestellte Die Belüftung und Eührung wurden so vorgenommen, daß 3 Π111.ίπο1^;Sauerstoff/l Meddum/Minute zugeführt wurden. Durch einen automatischen Pjj-Kegler wurde TOn-Ammoniak nach Bedarf zugegeben»

Nachdem die zugegebene Ammoniakmenge 20 cm erreicht hatte., wurde mit der Zugabe von Gasöl nach dem theoretischen Bedarf der Kultur begonnen, wobei eine Ausbeute , ■ . ■ . , . /_{inn v} Trockenhefe _{w ΛηΑ} ⁽¹⁰° ^x errorderliches Gasöl^{)von 10}^

und eine Zellteilung3seit von 3 Stunden zugrunde gelegt wurden« Diese Zugabe wurde stündlich vorgenommen,bis insgesamt 250 g Gasöl/l entsprechend einer Gesamtmenge von .17..-1 zugesetzt wareiioPür diese Zugabe waren 15 Std„ erforderliche Nach einer Zelldichte von 1 g/l au Beginn

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folgte eine Trägheitsperiode von 5 Stunden, dann eine Beschleunigungsphase von 3 Stunden und abschließend eine Phase exponentiellen Wachstums bis zu einer Zelldichte von 18 g/l nach 22 Stunden,,

Der gleiche Versuch wurde wiederholt; wobei jedoch zum Beinpfen 20 1 einer 24 Stunden-Kultur von Candida lipolytica auf Melasse verwendet wurden (Zelldichte 6 g/l in der stationären Vfachstuiasphace) „ Das Inoculum war unter Verwendung von 30 g Rübenmelasse/l hergestellt worden, die unter anderen Wachstunsfaktoren pro Kilogramm 0,04 mg Biotin, 50 mgPantothensäure und 5 ag Inosit enthielt» Diese 3 Paktoren sind besonders wertvoll für das Wachstum von Hefe,, Bei Verwendung dieses Inoculun3 nit schweren Gasöl trat keine Trägheitsphase ein, vielmehr begann die Kultur sofort in der Phase maximalen Wachstuns (Zellteilungszeit 3 Stunden)»

Dieses Beispiel veranschaulicht ein Verfahren, bei dem die Hefe nit einen Saccharidester gewaschen wird»

Eine Kulturflüssigkeit au3 der kontinuierlichen Gärung mit 6 g Hefc/l und 150 g nicht aufgespaltenem Gasöl/l wurde durch Dekantieren in 2 Schichten getrennt. Die obere Schicht bestand aus Hefecrene» Sie machte 40$ des Gesamtvolumens aus und enthielt das gesamte Gaaöl und die gesamte Hefe mit etwa 10$ des ursprünglichen Kasservolumens. Die untere Schicht bestand aus ausgebrauchten Kulturmedium, das praktisch frei von Hefe und Gasöl war„

100 g der durch Dekantieren abgetrennten Creme wurden in einen 1 1-Behälter gegeben, der mit einen Paddelrühror versehen war. Enthärtete» Wasser wurde in. einer Menge von 60 Vol.-Teilen pro 40 VoIc-Teile Creme zuge-

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setzt ο Außerdem wurde", dem Genisch 1 VoI„-0 einer 10$igen wässrigen Lösung eines oberflächenaktiven Saccharidesters zugesetzt»

Nach einer Rührzeit von 10 Hinuten bei Rauntenperatur wurde der Inhalt des Behälters in den zylindrischen Behälter einer Zentrifuge überführt, Nach einer Zentrifugierzeit von 10 Minuten bei 3500 UpM v/urden drei Phasen erhalten, die nachstehend in der Reihenfolge abnehmender Dichte aufgeführt sind:

Feste Hefefraktion (Hefepaste) Wässrige Phace

Gasöl

Das Gasöl und dann da.3 Wasser v/urden durch Abhebern abgetrenntDie Hefepaste wurde mit einen Viasserstrahl gespült und hatte dann folgende gewichtsmäßige Zusammensetzung:

Gasöl 8-10$

Wasser 65-70$

Hefe 27-30$

Die Hefepaste wurde durch Rühren im zehnfachen Wasoervolunen dispergierto Dann wurde 1$ der wässrigen Lösung des Saccharidesters zugegeben und die Flüssigkeit nach einer Rührzeit von 10 Minuten zentrifugiert. Die erhaltene Hefefraktion wurde erneut in den zehnfachen Wasscrvolunen dispergiert und 10 Hinuten ohne ober.·* . flächenaktives Kittel gerührte Hiernach wurde die Flüssigkeit zentrifugiert, wobei eine praktisch gasölfreie Hefepa3te abgetrennt wurde« Diese Hefepaste hatte folgende gewichtsnäßige Zusammensetzung:

In Benzol lösliche Bestandteile 0,8$· Hefe 29,2$

Wasser 70,0$ '

r.

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VV

- 67 -

Nach den Trocknen, v/urden hieraua erhalten: Troclzenhefe 97 _:, 5?°

In. Benzol lösliche
Bestandteile 2,lf->

Die in Benzol löslichen Substanzen hatten folgende Zusammensetzung:

Gasöl

Nicht verseifbares Zellnaterial Verseifbares Zellnaterial

Dieses Beispiel veranschaulicht ein Verfahren, bei dem Hefe durch "Aushungern" gereinigt wird*

In ein 60 1-Gärgefäß v/urden 60 1 des mineralischen Mediums der in Beispiel 1 genannten Zusammensetzung gefüllte Dann wurde mit 20 1 einer 24 Stunden-Kultur von Candida lipolytica auf genischten Cq-C₁ g-IIornalparaffinen beimpft, wobei eine Zelldichte you Ί g/l erhalten wurde₀ Hierauf wurde 1,035 1 schweres Gasöl entsprechend 15 g/l zugesetzt ο Diese Menge reichte aus₅ um die Zelldichto auf 2 g/l zu bringen., Die T_emperatur der Kultur .wurde bei 50 _+ 1⁰C und p_H 4 gehalten* Die Belüftung und Rührung wurden so vorgenommen, daß 3 Hillimol Sauerstoff/l Medium/Minute zugeführt v/urden. Durch einen automatischen p_H-Regler wurde 10n-Aamoniak zugeführt ο ...--..

Nachdem die zugeführte Ammoniakmenge 20 cm^ erreicht hatte, wurde mit dem Zusatz von Gasöl begonnen,■wobei eine auf Gasöl bezogene Ausbeute von

( 100 ν bildete. Irpckenhef^ ν _in ^{K 1ÜO x} zugeaetztee Gasöl ^}-¹⁰

und eine Zellteilungssoit von 3 Stunden zugrunde gelegt wurden Diese Zugabe wurde stündlich vorgenommen., bis

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- 68 _

200 g/l. d.h. insgesar.it 13.8 1 zugesetzt waren,

Ausgehend von einer Zelldichte von 2 g/l-wurde an Ende der Exponentialwachstumsphase nacli 25 Stunden eine Dichte von 15 g/l erhalten. Dieser Wert blieb während der stationären Phace zwischen der 25α und 40_o Stunde konstant.. Während dieser Periode fehlte der Hefe die Kohlenstoffquelle, während andere Elenente in Überschuß vorhanden waren. Diese Periode wird als "Kungerphace" bezeichnet.

Die Hefe wurde durch Zentrifugieren und Waschen nach der 25ο und nach der 40cStunde abgetrennt« ITach der Gefriertrocknung wurde sie analysiert, Ihr Gesantgehalt an Lipiöen. (in Hexan löbliche Fraktion) betrug 185» nach der 25cStunde und 3$ nach der 4OoStunde.

3eispiel_ λ 4,

Ein ähnlicher Versuch wie der in Beispiel 13 beschriebene wurde durchgeführt, wobei die Hefe nach der 25»Stunde au3 der Kulturflüc3igkeit geerntet und dann in gleichen Gärgefäß in 60 1 des frischen nineralischen Mediuns ohne Kohlenwasserstoff eingesetzt wurde. Das Genisch wurde dann 10 Stunden unter den gleichen Kultivierungsb3dingungen gerührt (Temperatur 50⁰C, P_H 4, 3 Millinol Sauerstoff/l/Stunde), Die Zelldichte betrug zu-Beginn etwa 15 g/l und blieb während des gesanten Pronecces konstante Obwohl die Hefe in Augenblick der Einführung in das frische Mediun 20 Gew_o-# Gesantlipide (auf Trockenbasis) enthielt,«., betrug ihr Lipidgehalt nach der Behandlung nicht mehr als

Ein ähnlicher Veisuch wie der in den Beispielen 13 und 14 beschriebene wurde nit Hefen aus der kontinuierlichen Gärung durchgeführt, jedoch mußte in diesen Pall ait

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gewaschener Hefe in einen frischen Kediun gearbeitet werden_s da es bein kontinuierlichen Verfahren nicht möglich ist, eine Kulturflüooigkeit abzuziehen; die vollständig frei von aufspaltbaren Kohlenstoffsubstat ist.

Die Kultur in 60 1-Gärgefäß wurde bei stündlich 0,1 mineralisches Mediun plus Gasöl pro Liter Kultur im Gärgefäß stabilisiert* Nach Einstellung der Kulturbedingungen (insbesondere 30⁰C und p_H 4) wurde die Hefe aus einen Teil der Kultur durch Zentrifugieren bei + 5⁰C abgetrennte Nach den Waschen wurde sie in ein 20 1-Gärgefüß gegeben, dao 15 1 nineralisches Mediun der in Beispiel 1 genannten Zusammensetzung enthielt, wobei eine Zelldichte von 20 g/l erhalten wurde ο Der Pjj-Uert wurde automatisch bei 4, die Temperatur bei 30⁰C gehalten« Die Luftnenge und die Rührung wurden so eingestellt, daß 3 Millinol Sauerstoff/l Kultur/Hinute zugeführt wurden. Die Behandlungsdauer betrug 10 Stunden. Die Zelldichte blieb während des gesamten Versuchs konstant bei 20 g/l. Die Hefe wurde su Beginn und an Schluß des Versuchs auf ihren Fettgehalt analysiert. Ein deutlicher Abfall deo Fettgehalte .von 15 auf 5#, besoßen auf Trockenmasse, wurde festgestellt. ·

Dieaee Beispiel veranschaulicht die Erniedrigung des Trübungspunktes deo als" Produkt erhaltenen Gasöls durch Hydrierung.

40 1 des oineralisehen-Mediuns der in Beispiel 1 genannten Zusammensetzung wurden in ein Gärgefäß mit eine« Paoeungeveraögen von 60 1 gefüllt. Dieseo Medium wurde oit 20 1 einer 24 Stunden-Kultur von Candida lipolytiea auf genischten O₉-C ₁₆-llornalpar äff inen

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• - 70 -

so "beimpft, daß die Zelldichte etwa 1 g/l betrug» .Dann v/urden 1,03 1 schweres Gasöl (15 g/l Gärgefäß) einge- · führte Diese Menge genügte, uii die Zelldichte auf 2 g/l zu "bringen-,

Die Temperatur der Kultur wurde bei 30jr1°C, der Py-Vert bei 4 gehalten» Die Rührung und Belüftung wurden so vorgenommen, daß 3 Ilillinol Sauer st of f/l Kediun/llinute zugeführt wurden,, Hit Hilfe eines automatischen Ρτ,-Reglers wurde lOn-Amiioniak eingeführte

Nachdem die zugesetzte Ammoniakmenge 20 cn erreicht hatte, wurde mit der intermittierenden Zugabe von Gasöl in einer Menge begonnen, der der theoretische Bedarf der Kultur unter der Annahme einer Ausbeute von

/_1f)n Trockengewicht der gebildeten Hefe> ^{uuu x} erforderliches" Gasöl**" '"" '""" ^;

von 10$ und einer Zellteilungszeit von 3 Stunden zugrunde lag- Dieser Zusatz wurde stündlich vorgenommen, bis insgesamt 250 g/l Ga3öl, d.ho insgesamt 17 1 zügesetzt waren.

Ausgehend von einer Zelldichte von 2g/l war nach 25 Stdo (zum Schluss der Exponentialwachstunsphase) eine Zelldichte von 18 g/l erreicht« Das verwendete Gasöl hatte folgende Kennzahlen:

Dichte bei 15°C/4°C 0,876

Flammpunkt gemäß Afnor, ⁰C 120

Trübungspunkt,°C 4-20

Fließpunkt, ⁰C +18

Gewp-Jo n-Paraffine · .10

Saybolt-Dectillation: ⁰O

Siedeanfang 221

55» 228

50Ji 363

95^5 ₄₀₂ '

Siedeende 405 ■

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Rückstand, VoI--£ 11

Verlust, Vol.-# 0

Nach 25 Stunden wurde ein Teil der Kultur aus den Gürgefäß entnommen., Aus diesen Teil wurden 300 cn nicht aufgespaltenes Gasöl durch Zentrifugieren bei + 5⁰C erhalten» Dieses restliche Gasöl hatte folgende

Keimzahlen:	0,890
Dichte 15°C/4°C	,0C 120
Plannpunkt genäß Afnor	. +5
Trübungspunkt.0C	-13
Fließpunkt, 0C	2,1
n-Paraffihe, Gew.-fS	0C
Saybolt-Destillation:	248
Siedeanfang	300
%	368
j \Jt'O	381
7O7S	395
20fo	402
35$	405
Siedeende	1
Rückstand, VoIc-fo	0
Verlust, VoIo-^

Das gewonnene Gasöl wurde mit Wasser gewaschen und mit Phosphorpentoxyd getrocknete Es wurde dann in einer Menge von 400 cn /Stunde bei 39O⁰C und einen Druck von 70 kg nit Wasserstoff in einer Menge von 100 cnVstunde über 100 cn⁵ eines üblichen Co/Mo-Hydrierkatalysators geleitet, flach dieser Behandlung zeigte das Gaoöl einen Trübungspunkt von -10⁰Co

Beisj)iel_j2

Der in Beispiel 16 beschriebene Versuch wurde mit einen Gasöl aus der kontinuierlichen Kultivierung von Candida lipolytica wiederholte'

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Die Kultur wurde kontinuierlich in einer Menge von 300 cn³/ Stunde nit einen Hediuii, das 10 Gew.-^ schweres Gasöl enthielt, das in S0# eines mineralischen Mediums der in Beispiel 1 genannten Zusammensetzung enulgiert war, in ein 5 1-Gärgefäß eingeführt, das 3 1 der Kultur enthielt. Das verwendete Gasöl hatte folgende Kennzahlen:

Dichte bei 15°/4°C 0,875

Fließpunkt.⁰G +17

Trübungspunkt;°C +20

Schwefel, Gew,-ff» 1,6

n-Faraffine, Gew.,-# 12

Flammpunkt gemäß Afnor, C 135

Saybolt-Dectillation: ⁰C

Siedeanfang .-139

5$ 304

50$ 362

95./° 398

Siedeende " " 400

Rückstand,

Verlust, V0I.-5S 0

Der p„-Uert wurde durch automatischen Zusatz von 1On-Arcr.oniak nit einer geeigneten Apparatur bei 4 + Q_;1 gehalten» Die Temperatur wurde bei 3O⁰C gehalten» Die Rührung und Belüftung wurden so vorgenommen, daß 3 Hillinol Sauerstoff/l Mediun/Hinute zugeführt wurden.

Die Zelldichte wurde nach einigen Tagen mit einem Wert von 10 + 1 g Trockenmasse/l konstante Dann wurde eine solche Kulturnenge abgezogen, daß durch Zentrifugleren bei + 5⁰C 500 cn⁵ nicht gespaltenes Gasöl erhalten wurden» Das restliche Gacöl hatte folgende Kennzahlen: Dichte bei 15°/4°C 0,888

Fließpunkt,⁰C _5

Trübungspunkt,°C +21 ·

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.·... ,. , •,Gesar.itschv/efeljGev/,-^ 1,95 η-Paraffine, Ge\i«-$ 2,1 Flammpunkt gemäß Afnor

Saybolt-Deatillation: ⁰G

Siedeanfang 265

556 310

5056 365

95$ 398

Siedeende 400

Rückstand, VoI„-fo 1

Verlust, VoIo-# 0

Dieses nicht aufgespaltene Gasöl wurde auf die in Beispiel 16 beschriebene Vfeise behandelt» Hierdurch wurde der Trübungspunkt von +21 auf O⁰G erniedrigt.

Beispiel. J 8

Dieses Beispiel veranschaulicht die Erniedrigung des Trübungspunktes des als Produkt erhaltenen Gasöls durch Behandlung mit Kalilauge»

40 1 deo in Beispiel 1 beschriebenen mineralischen Mediums wurden in ein 60 1-Gärgefäß gefüllt» Dieses Medium wurde mit 20 1 einer 24 Stunden-Kultur von Candida lipolytica auf gemischten Cg-C-jg-Kormalparaffinen beimpft» Hierbei wurde eine Zelldichte von etwa 1g/l erhalten» Dann wurden 1,03 1 schweres Gasöl entsprechend 15 g/l zugesetzte Diese Kenge genügte, um die Zelldichte auf 2 g/l zu bringen«.

Dio Temperatur wurde bei 30 +; 1⁰C, der p_H~Wert bei 4 gehalten. Die Belüftung und Rührung wurden so vorgenommen, daß 3 Killicol Sauerstoff/l/Stuhdo.''zugeführt wurden.Hit einen automatischen p_H-r.egler wurde 1On-Ammoniak zugesetzt«

Nachden 20 cn⁵ Ammoniak zugesetzt waren, wurde Gasöl entoprcchend den theoretischen Bedarf der Kultur zugesetzt,

w: W-Cy ^;*O;ft»o:imit ■ ■■ ■

470507

wobei eine Ausbeute von

_Mm gebildete, Trpckenhef e, )_ _1Orf UOOx erforderliches Gasöl ^J~ ^lU/

und eine Zellteilungszeit von 3 Stunde zugrunde gelegt wurden. Dieser Zusatz wurde stündlich vorgenommen,bis. 17 1 G-asöl entsprechend 250 g/l zugesetzt waren_o

Ausgehend von einer Zelldichtc von 2 g/l wurde an Schluß der Exponentialwachstunsphase nach 25 Stunden eine Zelldichte von 18 g/l erhaltene

Das zugeführte Gasöl hatte folgende Kennzahlen:

Dichte bei 15 /4 G	0,876	0G
Flammpunkt gemäß Afnor	120	221
Trübungspunkt, 0O	+20	228
Fließpunkt, 0G	+18	363
n-?araffine, Gev;,-^	10	402
Destillation:	405
Siedeanfang	1
% . -	O
50/O
Siedeende
dj VoIo —$>
Voio-5o

Rückstand;
'Verlust,

Nach 25 Stunden wurde ein Teil der Kultur aus dem Gefäß abgezogen. Von diesen Teil wurde 300 cly^ nicht aufgespaltenes Gasöl durch Zentrifugieren bei + 50⁰O erhaltene Das restliche Gasöl hatte folgende Keimzahlen: Dichte bei 15°A°G 0_?8939

Plannpunkt gemäß Afnor,⁰G 120 Triibungspunkt ,⁰C 0

Fließpunkt,⁰C ■ -16.

n-Paraffine, Ge\i_a-?> 1,8 ,

809901/0441 - -

- 73 -

^Saybplt-Ie st illation . _°(3

Siedeanfang 245

5i° 296

50$ 365

95$ 402

Siedeende 405

Rückstand, Vol.-5$ "I

Verlust, " O

3CO enr des nicht aufgespaltenen Gacöls und 300 cm alkoholische Kalilauge einer Konzentration von 20 Gew.-$ wurden in einen mit Rückflußkühler versehenen 1000 cm -Eundkolben gegeben und 2 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Das behandelte Gaoöl wurde durch Dekantieren abgenommen. Sein 'frübungspunkt war von 0° auf -16⁰C erniedrigt worden.

Der in leispiel 18 beschriebene Versuch wurde mit einen Gasöl aus einer kontinuierlichen Kultur von Candida lipolytica durchgeführt.

Einer kontinuierlich durchgeführten Kultur von 3 1 in einem 5 1-Gärgefäß wurden stündlich 300 crr eineo Mediums zugeführt, das 10$ schweres Gasöl enthielt, das in 90$ eines mineralischen Mediums der in Versuch 1 angegebenen Zusammensetzung emulgiert war. Das Gasöl hatte folgende Kennzahlen: ■'"■".■

Dichte	0,875	Siedeende
Fließpunkt, 0C	+17	400
5rübungspunkt, 0C	+20	ol.-$
Schwefelgehalt, Gew.-$	1,6
Gehalt an n-Paraffinen	, Gew.$ 12
Flammpunkt nach Afnor,	0C 135
Saybolt-!estimation, °c
Siedeanfam; 5j§	5p£' J5$
139 304	362 398
Rückstand; 1 Vol.-$,	Verlust: 0 V

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14705Q7

jjer p_TT-Y/ert wurde durch automatischen Zusatz von 1On-Ammoniak bei 4 + 0,1 gehalten» Die Temperatur wurde bei 30⁰U gehalten» Die Belüftung und Rührung wurden so eingestellt, daß 3 Millimol Sauerstoff/l/Minute zugeführt wurden,

Mach wenigen Tagen stabilisierte sich die Zelldichte bei 10 + 1 g/l» Dann wurde eine solche Menge der Kulturflüssiglceit abgenommen, daß durch Zentrifugieren bei 5 C 300 cm restliches Gasöl erhalten wurde= Das nicht aufgespaltene Gasöl hatte folgende Kennzahlen:

lichte bei 15⁰A⁰O 0,891

Fließpunkt, ⁰O -8

Trübungspunkt, ⁰C +20

Schwefelgehalt', Gew.-^ 1,86

Gehalt an n-Paraffinen, G evr.-^ 1,6

Flammpunkt nach Afnor, ⁰C ' 147

£ 5#_ · J50$ 95% i>iedeeride 260 3C6 364 398 4CO ⁰G

Rückstand: 1 Vol.-^; Verlust: 0$

Dieses nicht aufgespaltene Gasöl wurde auf die in Beispiel 18 beschriebene Yieise behandelt. Sein Trübungspunkt wurde von +20° auf -6⁰C erniedrigt.

Ej? i_s£ie 1_ 20

Durch Zentrifugieren eines Kulturprodukts, das auf die in Beispiel 6 beschriebene Yieise erhalten worden war, wurde eine Hefepaste erhalten. 8,4 kg dieser Paste enthielten 2 kg Trockenmasse (ausschließlich zurückbehaltener Kohlenwasserstoffe) , 1 kg nicht aufgespaltene Kohlenwasserstoffe und 1 kg Proteine. Zu dieser Paste wurden 14,5 1 Wasser gegeben, das 180 g Natriumchlorid enthielt. Das Gemisch "wurde 10 Stunden unter ständiger leichter Bewegung ohne ρ,τ-Regelung bei 50 G gehalten. las auf diese Weise erhaltene Produkt enthielt etwa 600 g Protein und 1200 g

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löslich gemachte Trockenmasse. Dieses Produkt wurde in zwei Stufen in einer Sharples-Zentrifuge bei 11.QOO G zentrifugiert. Hierbei wurden erhalten: eine Ölphase, die das Zellwandmatorial enthielt, ein·' trübes flüssiges Autolysat (das 500 g Protein enthielt) und ein Rückstand, der mit Kohlenwasserstoffen leicht durchtränktes Zellwandmaterial enthielt.

Das als Rückstand erhaltene Zellwandmaterial wurde teilweise getrocknet, Hach dem Trocknen auf einen YTassergehalt von 20 Gew»-$ wurde dieses Produkt entölt, indem es bei 55⁰C Diit einem azeotropen Gemisch von η-Hexan und Iso-■propanol bei einem Verhältnis von 5 1 lösungsmittel pro kg Trockenmasse im behandelten Produkt extrahiert wurde. Das entölte Material kann als Viehfutter verwendet werden.

Bei dem in Eeispiel 1 beschriebenen Versuch wurde die sugeführte luft mit Watte gefiltert« Gegebenenfalls kann auch Filterpapier verwendet werden= Der Luftdruck am Eintritt des Gärgefäßes betrug 100 - 200 g'cm , jedoch ist dieser Druck verschiedenen je nach dem Druckabfall im luftverteiler, der (im Falle des in Eeispiel 1 beschriebenen Versuchs) aus 16 Kapillarrohren aus nichtrostendem Stehl von 1/10 mm Innendurchmesser bestand, die symme- ·. ·- trisch an einem Ring von 15 cm Durchmesser am Boden des Gärgefäßes angeordnet waren.

TJm die Temperatur im Gärgefäß konstant bei 30⁰C zu halten, wurde Wasser in einem Ringraum zwischen zwei konzentrischen Zylindern umgewälzt, wobei der kleinere Zylinder das eigentliche Gärgefäß bildete. Im Falle des 5 1-Gär- · gefäßes bestanden die beiden Zylinder aus Glas, im Falle des 60 1-Gärgefäßes aus nichtrostendem Stahl.

■-:■ ■■■' CV

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Claims (32)

Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen in Gegenwart eines gebundenen Kohlenstoff enthaltenden Materials und in Gegenwart eines wäßrigen NHhrmediums und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases, gekennzeichnet durch eines oder mehrere der folgenden Merkmale:

1. Als Material, das gebundenen Kohlenstoff enthält, werden geradkettige Kohlenwasserstoffe oder Kohlenwasserstoffgemische, die einen geradkettigen Kohlenwasserstoff enthalten, verwendet.

2. Es werden kohlenstoffhaltige Materialien verwendet, deren mittleres Molekulargewicht einem Kohlenwasserstoff mit wenigstens 10 Kohlenstoffatomen im Molekül entspricht.

J. Als kohlenstoffhaltige Materialien werden Erdölfraktionen verwendet.

4. Als gebundenen Kohlenstoff enthaltende Materialien werden Leuchtpetroleum, Gasöle oder Schmieröle verwendet.

5· Man verwendet als gebundenen Kohlenstoff enthaltende Materialien Gemische, die teilweise aus geradkettigen paraffinischen Kohlenwasserstoffen bestehen, und gewinnt einerseits einen Mikroorganismus und andererseits eine Erdölfraktion mit verringertem Anteil an geradkettigen Kohlenwasserstoffen. _

6. Man verwendet als kohlenstoffhaltiges Material ein Gasöl aus Erdöl und gewinnt ein Gasöl mit verringertem Wachsgehalt.

7· Man kultiviert als Mikroorganismus Hefe, insbesondere Hefe aus der Familie Cryptocoecoidae, zweckmäßig aus der Gattung Candida und vorzugsweise den Stamm Candida lipolytica.

8. Man kultiviert als Mikroorganismen Bakterien, insbesondere solche der Ordnungen Pseudomonales oder Eucobacteriales oder Actinomycetales, vorzugsweise den Stamm Eacillus megatherium oder Bacillus subtilis oder Pseudomonas

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aerugincsa.

9. Man trennt eine Erdölfraktion destillativ in a) eine Leuchtpetroleumfraktion, b) eine leichte Ga.sölfraktion und c) eine schwere Gasölfraktion, wobei die leichte Gasölfrakticn bis zum Siedeanfang der schweren Gasölfraktion siedet, behandelt anschließend die schwere Gasölfraktion mit einem Mikroorganismus, wodurch diener Mikroorganismus unter Ausnutzung der im schweren Gasöl enthaltenen geradkettigen Kohlenwasserstoffe als Kohlenstoff quelle wächst, und trennt dann das behandelte schvrere Gasöl ab.

10. Man behandelt einen Gatsch mit einen Mikroorganismus, wodurch der Mikroorganismus unter Ausnutzung der im Gatsch enthaltenen geradkettigen Kohlenwasserstoffe als Kohlenstoffquelle wächst,und trennt anschließend den behandelten Gatsch ab.

11. Man kultiviert in einer Vorbehandlungsstufe einen Mikroorganismus in Gegenwart einer Verbindung, die Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoff enthält, und kultiviert anschließend in einer Wachsturr.sstufe den aus der Vorbehandlungsstufe erhaltenen Mikroorganismus in Gegenwart einer Kohlenstoffquelle, die einen geradkettigen Kohlenwasserstoff enthält.

12. Man kultiviert einen Mikroorganismus in einem Gärgefäß in Gegenwart eines gebundenen Kohlenstoff enthaltenden Materials, in Gegenwart eines wäßrigen Nährrr.ediums und einen freien Sauerstoff enthaltenden Materials, wobei man chargenweise arbeitet und die Wachsturr.sgeschwindigkeit des Mikroorganismus mit der Zeit allmählich steigt, bis eine stetige Wachstumsgeschwindigkeit erreicht ist, und wobei man das kohlenstoffhaltige Material kontinuierlich oder intermittierend während eines wesentlichen Teils der Wachstumsperiode, in daß Gärgefäß einführt und die zu jedem Zeitpunkt zugegebene Menge so bemißt, daß die zu diesem Zeitpunkt im Gärgefäß insgesamt·vorhandene Menge an gebundenen Kohlenstoff 'enthaltendem Material »

_{7 0 u} £ _;. λ -, _{(i t}, ,:,, BAD

• dem Optimum oder ungefähren Optimum für die Erzielung der maximalen Wachsturr.sgeschwindigkeit zu diesem Zeitpunkt entspricht.

13.. Man kultiviert einen Mikroorganismus in Gegenwart eines gebundenen Kohlenstoff enthaltenden Materials als Kohlenstoff quelle »und in Gegenwart eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases, wobei man chargenvreise arbeitet und die Wachsturr.sgeschviindigkeit des Mikroorganismus während einer Wachsturr.speriode allmählich steigt, und gewinnt den Mikroorganismus während oder nach einer Periode schnellen Wachstums, wobei man zu einem Zeitpunkt, zu dem die Wachstumsgeschwindigkeit hoch ist, einen Teil der Gesamtmenge des Mikroorganismus abzieht und als Inoculum zur Auslösung des Wachstums einer weiteren Charge des Mikroorganismus verwendet.

lh. Man kultiviert einen Mikroorganismus in einem Gärgefäß in Gegenwart einer kontinuierlich zugeführten frischen Kohlenstoffquelle in Form einer gebundenen Kohlenstoff enthaltenden Verbindung, in Gegenwart eines wäßrigen Nährmediums und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases bei kontinuierlicher Entnahme des Mikroorganismus als Produkt und führt periodisch ''.'·. in das Gärgefäß eine Menge eines "verbesserten Mikroorganismus" ein, der zum gleichen Stamm gehört, der kontinuierlich eingeführt wird, und der getrennt unter Eedingungen kultiviert worden ist, die sich zur Ausbildung der gewünschten Eigenschaften im Mikroorganismus gut eignen.

15· Man kultiviert einen Mikroorganismus in Cegenwart eines geradkettig© und andere Kohlenwasserstoffe enthaltenden Kohlenwasserstoffgemisches, in Cegenwart eines wäßrigen Nährrr.ediurr.s und eines freien Sauerstoff enthaltenden Ga-es, wobei m?.n die nv.ceführto Menge sincr Wc^eublienen .Komponente des Nährmediums und/oder die zugeführte Sauerstoff menge so bemißt, daß nur eine gewünschte Menge der geradkettigen Kohlenwasserstoffe verbraucht wird.

BAD ORIGINAL

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16. Man kultiviert einen Mikroorganismus in Gegenwart eines gebundenen Kohlenstoff enthaltenden Materials, in Gegenwart eines-wäßrigen Nährrr.ediuirs und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases, wofcei man den p_H~v:ert durch kontinuierliche oder intermittierende Zugabe von Ammoniak innerhalb eines.gewünschten Eereichs hält.

17. Man kultiviert einen Mikroorganismus in einem Gärgefäß in Gegenwart eines gebundenen Kohlenstoff enthaltenden Materials, in Gegenwart eines wäßrigen Nährmediums und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases, wobei die Kohlenstoffquelle in Form kleiner Flüssigkeitsteilchen im Gärgefäß vorliegt.

18. Die Kohlenstoffquelle liegt im Gärgefäß in Form von Teilchen eines mittleren Durchmessers von weniger als 30 71 vor.

19· Man bildet eine Dispersion eines als Kohlenstoffquelle dienenden Kohlenvrasserstoffs in einem flüssigen Medium, mischt die Dispersion mit einem Mikroorganismus, führt das Gemisch in ein Gärgefäß ein, das einen Mikroorganismus, ein wäßriges Nährmedium und ein freien Sauerstoff enthaltendes Gas enthält, und zieht einen Produktstrom ab, der einen im Gärgefäß gewachsenen Mikroorganis „ enthält.

20. Man bildet eine Dispersion eines als Kohlenstoffquelle dienenden Kohlenwasserstoffs in einem flüssigen Medium, das eine Dispersion eines Mikroorganismus.enthält, führt anschließend das Gemisch in ein Gärgefäß ein, das einen Mikroorganismus, ein wäßriges Nährmedium und ein freien Sauerstoff enthaltendes Gas enthält, und zieht einen Produkt strom., ab, der einen im Gärgefäß gewachsenen Mikroorganismus enthält.

21. Man leitet den Mikroorganismus mit einem^kohlenstoffhaltigen Material und einem wäßrigen Nährmedium von oben nach unten über mehrere geneigte Siebböden im Gegenstrom zu einem '; ' /.. von unten nach oben durch die Öffnungen in ^eöem Siebboden strömenden, freien Sauerstoff enthal-

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tenden Gas.

22. Kan kultiviert in einem Gärgefäß eine Hefe in Gegenwart von als Kohlenstoffquelle dienenden Kohlenwasserstoffen, in Gegenwart eines wäßrigen Nährmediums und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gaceo, zieht aus dem Gärgefäß kontinuierlich einen Teil oder intermittierend die gesamte oder einen Teil der Hefe ab, die als Verunreinigung andere Mikroorganismen enthält, und hält die abgezogene Hefe bei einem niedrigen p_H-V<ert, bis ein erheblicher Teil der Verunreinigung abgetötet ist, während ein erheblicher Anteil der Hefe lebend erhalten wird.

23· Man kultiviert in einem Gärgefäß eine Hefe in Gegenwart von als Kohlenstoffquelle dienenden Kohlenwasserstoffen, in Gegenwart eines wäßrigen Nährir.ediums und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases und senkt das p_H des wäßrigen Mediums periodisch auf einen tiefen Kert und hält diesen tiefen Wert ein, bis ein erheblicher Anteil der genannten Verunreinigung abgetübet ist, während ein erheblicher Anteil der Hefe lebend gehalten wird.

24. Man kultiviert in einer Wachstumsstufe einen Mikroorganismus in Gegenwart von als Kohlenstoffquelle dienenden Gemischen vcn geradkettigen Kohlenwasserstoffen mit anderen Kohlenwasserstoffen, in Gegenwart eines wäßrigen Nährir.ediums und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases und hält anschließend in einer Hungerphase den Mikroorganismus mit den nicht verbrauchten Kohlenwasserstoffen in Gegenwart eines wäßrigen Nährmediums und in Gegenwart eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases in Eerührung, jedoch ohne Einführung weiterer Mengen der als Kohlenstoffquelle dienenden Kohlenwasserstoffe oder unter Einführung einer verringerten Menge dieser Kohlenwasserstoffe, wodurch die Menge des während der Wachstumsphase gebildeten Nebenprodukts während der Hungerphase verringert wird. . ,

25. Man kultiviert einen Mikroorganismus in einer Wachsturnsphase in Gegenwart eines als Kohlenstoffquelle dienenden

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Kohlenwasserstoffs, der aus einem geradkettigen Kohlenwasserstoff besteht oder diesen enthält, und kultiviert anschließend in einer Reinigungsphase den auf diese Weise erhaltenen Mikroorganismus in Gegenwart einer Verbindung des Kohlenstoffs, Wasserstoffs und Sauerstoffs als Kohlenstoffquelle.

26. Man kultiviert einen Mikroorganismus in einer Wachsturcsphase in Gegenwart eines ganz oder teilweise aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen bestehenden Kohlenwasserstoff gemisches -als Kohlenstoffquelle, in Gegenwart eines wäßrigen Nährmediums und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases, trennt anschließend gegebenenfalls den Mikroorganismus von der Hauptmenge des nicht verbrauchten Kohlenwasserstoffs ab, wobei ein Mikroorganismus erhalten wird, der als Verunreinigung nur eine geringe Kohlenwasserstoffmenge enthält, und hält den Mikroorganismus anschließend in einer Reinigungsphase mit einem wäßrigen Nährmedium und einem freien Sauerstoff enthaltenden Gas in Eeriihrung, wodurch die Menge des den Mikroorganismus verunreinigenden Kohlenwasserstoffs verringert oder dieser¹ Kohlenwasserstoff entfernt wird.

27. Man kultiviert einen Mikroorganismus in Gegenwart einer ganz oder teilweise aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen bestehenden Kohlenstoffquelle, trennt vom Produkt eine Fraktion ab, die den Mikroorganismus enthält, und extrahiert diese Fraktion mit einem Lösungsmittel.

28. Man extrahiert den Mikroorganismus in einer ersten Extraktionsstufe mit einem polaren Lösungsmittel und den hierbei erhaltenen, teilweise gereinigten Mikroorganismus in einer zweiten Extraktionsstufe mit einem Kohlenwasserstoff als Lösungsmittel.

29. Man kultiviert" einen Mikroorganismus in Gegenwart einer aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen bestehenden oder diene enthaltenden Kohlenstoffquelle, trennt dann vorzugsweise -wenn noch Kohlenwasserstoffe vorhanden sind - eine Fraktion, die den Mikroorganismus enthält,

_Λ , , _{Λ f} . ., ,_{; ;} , BAD ORJQiNAL

80990

_ 84 -

von den Kohlenwasserstoffen ab und behandelt dann die den Mikroorganismus enthaltende Fraktion unter solchen Bedingungen, daß die im Mikroorganismus enthaltenen Proteine, Polyproteine oder Polypeptide oder Aminosäuren oder deren Derivate von den Zellwänden oder dem die Zellwände bildenden Material abgetrennt vrerden.

30. Die Proteine, Polyproteine, Polypeptide oder Aminosäuren werden durch Autolyse, Plasmolyse oder Hydrolyse vom Mikroorganismus abgetrennt.

31. Man kultiviert einen Mikroorganismus in Gegenwart eines aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen bestehenden oder diese enthaltenden Materials, trennt vorzugsweise anschließend - wenn noch Kohlenwasserstoffe anwesend sind - eine den Mikroorganismus enthaltende Fraktion von den Kohlenwasserstoffen ab, unterwirft die den Mikroorganismus enthaltende Fraktion solchen Bedingungen, daß die im Mikroorganismus enthaltenen oder davon abgeleiteten.Proteine,_:Polyproteine, Polypeptide oder Aminosäuren von dem aus Zellwänden bestehenden Zellwandmaterial und/oder dem Material, das die Zellwände bildete, abgetrennt werden, und untervirft anschließend das mit Kohlenwasserstoffen verunreinigte Zellwandmaterial mit oder ohne vorherige modifizierende Eehandlung einer Lösungsmittelextraktion, durch die wenigstens ein Teil der Kohlenwasserstoffe aus dem Zellwandmaterial zurückgewonnen wird.

32. Man kultiviert einen Mikroorganismus in Gegenwart

a) einer aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen bestehenden oder diese enthaltenden Kohlenstoffquelle, b) eines wäßrigen Nährmediums und c) eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases, trennt das Produkt in eine Fraktion, die den Mikroorganismus enthält, eine Fraktion, die das wäßrige Nährrcedium enthält und, falls noch'Kohlenwasserstoffe in erheblicher Menge im Produkt enthalten sind, in eine Fraktion, die diese Kohlenwasserstoffe enthält, unterwirft anschließend eine Fraktion, die den 'Mikro-

80990 1 /0U2 - ^J-

Organismus enthalt, einer Reihe abwechselnder Wasch- und Trennbehandlungen, wobei man in der ersten Waschstufe eine wäßrige Lösung eines oberflächenaktiven Mittels und in der letzten Waschstufe ein von oberflächenaktiven Mitteln freies wäßriges Kedium verwendet, die Trennstufen so durchführt, daß der Mikroorganismus von einer wäßrigen Phase abgetrennt wird, worauf er zur weiteren Eehandlung geführt wird, und die Wasch- und Trennstufen so durchführt, daß der aus dieser Reihe von Stufen gewonnene Mikroorganismus einen Kohlenwasserstoffgehalt von weniger als 7% aufweistj bezogen auf das Gewicht des trockenen Mikroorganismus, und unterwirft anschließend den gewaschenen Mikroorganismus solchen Eedingungen, daß Abbau und/oder Extraktion der Zellen stattfindet. 33· Man kultiviert einen Mikroorganismus in einer Wachstumsstufe in Gegenwart eines Gemisches vcn geradkettigen Kohlenwasserstoffen mit anderen Kohlenwasserstoffen, in Gegenwart eines wäßrigen Nährmediums und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases, trennt den Mikroorganismus vom Kohlenwasserstoffrückstand ab und unterwirft diesen Rückstand der Hydrierung zwecks Senkung seines Trübungspunktes.

y\. Man kultiviert einen Mikroorganismus in einer Wachstums-• stufe in Gegenwart eines Gemisches von geradkettigen Kohlenwasserstoffen mit anderen Kohlenwasserstoffen, in Gegenwart eines wäßrigen Nährmediums und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases, trennt den Mikroorganismus vom Kohlenwasserstoffrückstand ab und unterwirft diesen Rückstand einer Laugenwäsche zwecks Senkung seines Trübungspunktes.

35· Man trocknet eine mit Lipiden verunreinigte Hefepaste in Gegenwart einer Atmosphäre, die frei vcn molekularem Sauerstoff ist oder einen geringeren Anteil an molekularem Sauerstoff als Luft enthält.

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I47Ü5Ü7

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3β. Kan kultiviert einen Mikroorganismus in einem kohlenwasserstoffhaltigen Nähriredium und mischt den auf diese V'eise erhaltenen Mikroorganismus oder eine daraus extrahierte oder abgeleitete Fraktion, die Polyproteine und/cder Proteine und/oder Aminosäuren enthält, mit einem oder mehreren Polyproteinen, Proteinen oder einer oder mehreren Aminosäuren in einem solchen Kengenverhältnis, daß das Produkt Aminosäuren in freier oder gebundener Form in der gewünschten mengenmäßigen Abstimmung enthält.

37· fön führt eine oder mehrere Stufen der Vorbehandlung und/oder Kultivierung des Mikroorganismus und/oder der Prcduktgewinnung und/cder Produktreinigung kontinuierlich durch.

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