DE1470507C3 - Kultivieren von Mikroorganismen - Google Patents
Kultivieren von MikroorganismenInfo
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Description
Die Erfindung''bezieht sich auf die Erzeugung von
Mikroorganismen, beispielsweise Hefe.
Die Erfindung geht aus von einem Verfahren gemäß
dem Oberbegriff des Patentanspruchs.
Die geradkettigen Kohlenwasserstoffe sind in der gemäß der Ei-fiiidung verwendeten K-ohlenstoffquelle
gewöhnlich' ab Paraffine anwesend. Sie können jedoch
auch als Olefine! vorhanden sein. Ferner können Gemische verwendet werden, die gerädkettige Paraffine
und Olefine enthalten. Des mittlere Molekulargewicht entspricht zweckmäßig einem Kohlenwasserstoff
mit wenigstens 10 Kohlenstoffatomen im Molekül.
Geeignete Kohlenstoffquellen für das Verfahren gemJlß der Erfindi'nc sind Leuchtpetroleum, Gasöle und
Schmieröle.; Diese ilincatematerialien können unraffinif.re.i
cm oder einer gewissen raffinierenden Behand-1ϊηΐ£
unterworfer· werden, jedoch müssen sie geradkcttigc,
kohl^awa;serstcffc enthalten, um für die Zwecke
■'. dc^firfindiuiEiXit^Iguritzusrivi.
::C:ecebcilr:nfalls .itaiin ■ ein Ausgangsmaterial, das
erhebliche v Paräffinmengen zusammen mit anderen
Kohlemvassei stoffen enthält, einer Behandlung unterworfen
v/erden, durch die ein paraffinisches Einsatzmaterial zur Verwendung beim Verfahren gemäß der
Erfindung ab/retrennt wird. Geeignet sind beispielsweise,
aufgearbeitete tjahtioncii, z.B. Gatsch oder andere
Wechriiraktionen, wie sie beispielsweise bei der
Entparaffinierung von Schmierölfräktionen anfallen, sowie Paraffine, die bei Trennverfahren unter Verwendung
von Molekularsieben erhalten werden.
Das Einsatzmr.tcri?.l kann auch ganz oder zu einsm
erheblichen Teil ενζ geradkettigen olefinischen Verbindungen
bestehe;!. So können Gemische von Kohlenwasserstoffen aus Erdöl eingesetzt werden. Zweckmäßig
enthalten die Gemische dabei mehr als 50 Gew.-°/o
gerädkettige olefinische Wasserstoffe. Es können ferner
Fraktionen verwendet werden, die durch Kracken von Erdölfraktionen, insbesondere V/achsen, erhalten worden
sind. Die gemäß der Erfindung eingesetzte Kohlenwasserstofffraktion kann durch Destillation aus
dem gekrackten Gesamtprodukt erhalten werden. Diese Kohlenwasserstofffraktion besteht am besten
überwiegend aus C10 — C30-Kohlenwasserstoffen. Es sind
jedoch die im Oberbegriff des Patentanspruchs genannten Bedingungen hinsichtlich der Kohlenstoffquelle
einzuhalten.
Unter den hier gebrauchten Ausdruck »Mikroorganismus« fallen selbstverständlich auch Gemische von
Mikroorganismen. Als Mikroorganismen, die gemäß der Erfindung gezüchtet werden, kommen Hefen, Pilze oder
Bakterien in Frage.
Bei Verwendung von Hefe gehört diese am besten zur Familie Cryptococceccae, insbesondere zur Unterfamilie
Cryptococcoidae. Gegebenenfalls können jedoch beispielsweise ascosporogene Hefen der Unterfamilie
Saccaromycelidae verwendet werden. Gut verwendbare Gattungen der Unterfamilie Cryptococcoidae sind
Torulopcis (auch als Torula bekannt) und Candida. Günstige Hefearten sind beispielsweise Candida Üpolytica,
Candida' pulcherrima, Cr.udida utilis, Candida
utilis-Variati majo, Candida tropicalis, Torulopsis colliculosa, Hansenula anomala, Oidium lactis, Neurospora
sitophila, Mycoderma cancoillote.
Von den vorstehend genannten Arten ist Candida
lipolytica besonders gut einsetzbar.
Zum Wachstum der Mikroorganismen sind zusätzlich zur Kohlenstoffquelle ein wäßriges·Nährmedium und
ein freien Sauerstoff enthaltendes Gas, am besten Luft,*,
erforderlich.
Die Aufnahme von Sauerstoff ist für das Wachstum
der Mikroorganismen wesentlich. Um die Wachstumsgeschwindigkeit hoch zu halten, muß die Luft, die den
Sauerstoff liefert, durch Rühren in feine Blasen zerteilt werden. Die Luft kann durch eine Fritte eingeführt
werden, jedoch kann auch das als Wirbelbelüftung bekannte System angewendet werden.
Es wurde festgestellt, daß bei Verwendung von
Candida lipolytica und der Wirbelbelüftung eine hohe Wachstumsgeschwindigkeit erreicht wird.
Ein geeignetes Nährmittel für Hefen und Pilze hat folgende Zusammensetzung:
Diamrnoniumphosphat 2 g
Ka!iu:.vcii!orid 1,15 g
Magnesiuinculfatheptahydrat 0,65 g
Zinksulfat 0,17 g
Mangansulfatmonohydrat 0,045 g
Ferrosulfatlicptahydrat 0,068 g
Leitungswasser 200 g
Hefeexirakt 0,025 g
Destilliertes Wasser,
zur Auffüllung auf 1000 cm3
zur Auffüllung auf 1000 cm3
Für viele "Fjrhterieri eignet sich ein Nährmedium
folgender Zug-Lirhcnsetzuhg:
Monelcnliumphosphat 7 g
Mr^nssiumsuifatheptahydrat 0,2 g
N?.f-iumchlorid 0,1 g
Ammoniumchlorid 2,5 g
Leitungswasser (Spurenelemente) 100 cm3
Hefeextrakt · * 0,025 g
Destilliertes Wasser,
Destilliertes Wasser,
zur Auffüllung Euii 1000 enV
Im allgemeinen wiidder pH-Wert des Nährmediums
im Bereich von ^ - - 7,5 gehalten. Als alkalische Materialien für den Zusatz zum Nährmedium eignen
sich Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Dinatriumhydrogenphosphat und Ammoniak entweder in freier
Form oder als wäßrige Lösung.
Die optimale Temperatur des Nährmediums liegt gewöhnlich im Bei eich von 25 - 38° C.
Das Wachstum der Mikroorganismen erfolgt auf Kosten der Ausgangsfraktion unter Zv/ischenbildung
von Körpern — hauptsächlich Fettsäuren — mit
Säurefunktion, so daß derv pH-Wert des -wäßrigen mineralischen Mediums progressiv sinkt. Ohne dauernde
Korrektur des pH-Wertes kommt das Wachstum ziemlich schnell zum Stillstand, undcdie Konzentration
des Mikroorganismus im: Medium bzw. die Zelldichte nimmt nicht mehr zu, so daß eine sog. stationäre Phase
erreicht wird. s ; ' ■
Das wäßrige Medium wirddaher durch stufenweise oder kontinuierliche Zugabe eines wäßrigen Mediums
von hohem pH-Wert beim gewünschten pH-Wert
'gehalten.' -v>····?-^^^,··. '^.'V-^λ--·.λ ;- "'^ }'■.. . .
Gewöhnlich wird der pH-Wert des Nährmediums bei Verwendung von flHefen, insbesondere von Candida
lipolytica, im Bereich von 3—6, am besten von 4 — 5, gehalten. Bakterien erfordern einen höheren pH-Wert
von gewöhnHch 6,5^-8. ί
Die optimale Temperatur des Nährmediums ist verschieden': je nach der Art des : verwendeten
Mikroorganismus und liegt gewöhnlich im Bereich von 25—380G. Bei Verwendung von Candida lipolytica ist
ein Temperaturbereich von 28 - 32° C sehr günstig.
Der pH-Wert kann durch; kontinuierliche oder intermittierende Zugabe von Ammoniak innerhalb eines
gewünschten Bereichs gehalten werden. Dieser Bereich
liegt am besten um nicht mehr als 0,1 unter und über einem gewünschten pH-Wert. Das Ammoniak kann als
Flüssigkeit, Gas oder wäßrige Lösung zugegeben werden. Die Zusammensetzung des Nährmediums wird
unter Berücksichtigung der Tatsache eingestellt, daß
Ammoniumionen während der Wachstumsphäse zugesetzt
oder gebildet werdeno J ; ,; -
Unter gewissen Arbeitsbedingungen kann es selbstverständlich
zweckmäßig sein, daß im Nährmedium eine geringe Menge eines Schaumverhütungsmittels vorhanden
ist. Am besten werden hierzu Schaumverhütungsmittel auf Siliconbasis beispielsweise in einer Gesamtmenge
von 0,1 Gew;-%, bezogen auf das wäßrige Medium; verwendet. \
Wenn das Verfahren zur Züchtung: von Hefe
angewendet wird, werden die Bedingungen gewöhnlich so gewählt, daß die Wachstumsgeschwjndigkeit für die
Hefe, die gezüchtet werden soll, optimal ist. Die Bedingungen, die das Wachstum dieser Hefe begünstigen,
können auch für das Wachstum anderer Hefen oder für das Wachstum anderer Mikroorganismen günstig
sein, die als Verunreinigungen in der zu züchtenden Hefe vorhanden sein können. Es wurde festgestellt, daß
viele dieser Verunreinigungen vernichtet werden können, wenn die verunreinigte Hefe bei einem
niedrigen pH-Wert gehalten wird. v ·■·:? '-.,i,
Dabei liegt der pH-Wert dann gewöhnlich unter 3,5,
am besten im Bereich von 1 —3. Man kann ihn auf diesen Wert fallen lasseh, indem ' man die 'Zugabe von
alkalischem Material unterbricht (oder seine Menge verringert). Am besten wird dieser pH-Wert durch
Zusatz einer Säure, z. B. Salzsäure oder Phosphorsäure, eingestellt.
Die Erfindung geht von der Aufgabe aus, die als Ernteprodukt gewonnenen Mikroorganismen durch
eine anschließende Reinigungsstufe von verunreinigenden Kohlenwasserstoffen und/oder anderen unerwünschten
Verbindungen ganz oder teilweise zu befreien. Diese Reinigungsstufe soll dabei unter den
gleichen Verfahrensbedingungen wie dias Züchtungsverfahren
durchgeführt werden können und dementsprechend
in der praktischen Verfahrensausgestaltung besonders einfach sein,, ■■'■.'"<■■
Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zum Kultivieren eines Mikroorganismus in
einer Wachstumsstufe in Gegenwart von als.Kohlenstoffquelle dienenden geradkettigen Kohlenwässerstof-
fen oder Gemischen solcherKohlenwasserstoffe·mit anderen Kohlenwasserstoffen in Gegenw'ärt .eines
wäßrigen Nährmediums und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases, das dadurch gekennzeichriet ist,
daß man anschließend den MikrQorganismys&mit den
ίο nicht verbrauchten Kohlenwasserstoffen in Gegenwart
eines wäßrigen Nährmediums und; in Gegenwart {eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases ohne Einführung
weiterer Mengen der als k6hienstQJffqueU^-.^'ienehden
Kohlenwasserstoffe in Berührung hält. Y ΐ ^|f|jC:/ .
Im erfindungsgemäßen Verfahren kultiviert Jfeth also'
zunächst in einer Wächsturrisstufein üblicherweise
einen Mikroorganismus in Gegenwart des ganz oder teilweise aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen bestehenden
Ausgangsmaterials und in Gegenwart eines wäßrigen Nährmediums sowie eines freien Sauerstoff
enthaltenden Gases. Der dabei anfallende Mikroorganismus wird dann in gleicher Weise in einer Reinigungsstufe
dadurch von verunreinigenden kohlenwasserstoffen, vollständig oder teilweise befreit, daß die Züchtung
des Mikroorganismus gewissermaßen fortgesetzt wird, jedoch auf die Einführung weiterer Mengen der als
Kohlenstoffqüelle dienenden Kohlenwasserstoffe verzichtet wird. Bei dieser Reinigung kann zusätzlich zur
Entfernung anhaftender Kohlenwasserstoffe auch der Gehalt an Lipiden, Estern, Ketonen und/oder freien
Fettsäuren, die dem Mikroorganismus anhaften, verringert oder entfernt werden.
Zweckmäßig wird vor der Reinigungsstufe der größere Teil der geschlossenen wäßrigen Phase
abgetrennt/Dies erfolgt am besten durch Dekantieren oder Zentrifugieren. %
-Die Creme oder Paste des Mikroorganismus, die
durch" Dekantieren und Zentrifugieren (oder Zentrifugieren
allein) auf die beschriebene Weise abgetrennt werden kann, kann dann der Reinigungsstufe zur
. Verringerung des Kohlenwasserstoffgehalts unterworfen werden. - ,
In den folgenden Beispielen ist die Zelldichte als Trockengewicht der Hefe pro Liter Kultur ausgedrückt.
40 Liter eines wäßrigen mineralischen Nährmediums der nachstehend genannten Zusammensetzung werden
in einen Fermenter aus nichtrostendem Stahl gefüllt, der ein Fassungsvermögen von 60 Liter hat. Um die
Temperatur, im Fermenter konstant bei 30° C, zu halten,
wurde Wasser in einem Ringraum umgewälzt, der durch den Raum zwischen zwei konzentrischen Zylindern
gebildet wurde, von denen der kleinere den Fermenter selbst darstellte. Das wäßrige Nähr-medium hatte
folgende Zusammensetzung:
Diammoniumphosphat
. Kaliumchlorat'
. Kaliumchlorat'
Magnesiumsulfatheptahydrat
Zinksulfat
Mangansulfatmonohydrat
Eisen(II)-sulfatheptahydrat
Hefeextrakt
Hefeextrakt
Leitungswasser
Destilliertes Wasser,
zur Auffüllung auf
2g
1,15g
0,65 g
0,17 g
0,045 g
0,068 g
0,025 g
200 g
1,15g
0,65 g
0,17 g
0,045 g
0,068 g
0,025 g
200 g
1000 ml
201 eines Impfmaterials aus einer 24-Stunden-Kultur
von Candida lipolytica auf einem Gemisch von Cg- Cie-Normalparaffinen wurden darin so zugesetzt,
daß die Zelldichte etwa 1 g/l betrug. In den Fermenter wurden dann 1,031 schweres Gasöl (15 g/l des
Fermenters) eingeführt. Diese Menge genügte, um die Zelldichte auf 2 g/l zu bringen. Die Temperatur der
Kultur wurde bei 30 ± Γ C, der pH-Wert bei 4 gehalten.
Die Belüftung und Bewegung wurden so vorgenommen, daß 3 mMol Sauerstoff/l Medium/Min, zugeführt
wurden.
Durch ein automatisches pH-Regelsystem wurde v wäßriges 10 η-Ammoniak eingeführt. Nachdem die
Zugabe von Ammoniak 20 ml erreicht hatte, wurde mit der Zugabe von Gasöl in einer Menge begonnen; die -'
durch die Annahme einer Ausbeute von
Trockengewicht der gebildeten Hefe
Erforderliches Gasöl
Erforderliches Gasöl
= 10%
(bezogen auf Gasöl) und einer Zellteilungszeit von 3 Std. bestimmt war. Diese Zugabe erfolgte stündlich, bis die *
zugesetzte Menge 200 g/l, d. h. insgesamt 13,8 1 betrug.
Ausgehend von einer Zelldichte von 2 g/l war nach 25 Stunden (am Ende der Exponential-Wachstumsphase)
eine Zelldichte von 15 g/l erreicht. Dieser Wert blieb während der stationären Phase von der 25. bis zur 40.
Stunde konstant. Während dieser Zeit fehlte der Hefe ' die Kohlenstoffquelle, während andere Elemente im ;
Überschuß vorhanden waren. Dies wirkte sich als Mangelphase aus.
Die Hefe wurde nach der 25. Stunde und der 40. Stunde durch Zentrifugieren und Waschen bei 5° C
gewonnen. Sie wurde der Gefriertrocknung unterworfen und analysiert. Der Gesamtgehalt an Lipiden (in
Hexan lösliche Fraktion) betrug 18% bei Gewinnung nach 25 Stunden und 3% bei' Gewinnung nach 40
Stunden. '<■
Ein ähnlicher Versuch wie der in Beispiel 1 beschriebene wurde durchgeführt, wobei die Hefe nach
40 der 25. Stunde aus der Kulturflüssigkeit geerntet und dann im gleichen Gärgefäß in 601 des frischen
mineralischen Mediums ohne Kohlenwasserstoff eingesetzt wurde. Das Gemisch wurde dann 10 Stunden unter
den gleichen Kultivierungsbedingungen gerührt (Temperatur 3O0Q pH 4, 3 mMol Sauerstoff/l/Stunde). Die
Zelldichte betrug zu Beginn etwa 15 g/l und blieb während des gesamten Prozesses konstant. Obwohl die
Hefe im Augenblick der Einführung in das frische Medium 20 Gew.-% Gesamtlipide (auf Trockenbasis)
enthielt, betrug ihr Lipidgehalt nach der.Behandlung
nicht mehr als 8%. ' ■
Beispiels >; Γ V
- Ein ähnlicher Versuch wie der in den Beispielen 1 und
2 beschriebene wurde mit Hefen aus der kontinuierlichen Gärung durchgeführt, jedoch mußte in diesem Fall
mit gewaschener Hefe in einem frischen Medium gearbeitet werden, da es beim kontinuierlichen Verfahren
nicht möglich ist, eine Kulturflüssigkeit abzuziehen, die vollständig frei von aufspaltbarem Kohlenstoffsubstratist. ' ·: · ■ ■ . ■'. · ;f ■-:) ";·<:.." ■·';.■ . ■ ■/■' ' ·
Die Kultur im 60-1-Gärgefäß wurde bei stündlich 0,1 I
mineralisches Medium plus Gasöl pro Liter Kultur im Gärgefäß stabilisiert. Nach Einstellung der Külturbedingungen
(insbesondere 30° C und pH 4) wurde die Hefe aus einem Teil der Kultur durch Zentrifugieren bei
+5° C abgetrennt. Nach dem Waschen wurde sie in ein 20-1-Gärgefäß gegeben, das 151 mineralisches Medium
der in Beispiel 1 genannten Zusammensetzung enthielt, wobei eine Zelldichte von 20 g/l erhalten wurde. Der
pH-Wert wurde automatisch bei 4, die Temperatur bei
300C gehalten. Die Luftmenge und die Rührung wurden
so eingestellt, daß 3 mMol Sauerstoff/Liter Kultur/Minute zugeführt wurden. Die Behandlungsdaüer betrug
10 Stunden. Die Zelldichte blieb während des gesamten Versuchs konstant bei 20 g/l. Die Hefe wurde zu Beginn
und am Schluß des Versychs auf ihren Fettgehalt
analysiert. Ein deutlicher Abfall des Fettgehalts von 15 auf 5%, bezogen auf Trockenmasse, wurde festgestellt.
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zum Kultivieren eines Mikroorganismus in einer Wachrüimsstufe in Gegenwart von als Kohlenstoffquellc dienenden geradkettigen Kohlenwasserstoffen oder Gemischen solcher Kohlenwas-. serstoffe mit anderen Kohlenwasserstoffen in Gegenwart eines wäßrigen Nährmediums und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gasrs, dadurch gekennzeichnet, daß man anschließend den Mikroorganismusden nicht verbrauchtenKohlenwasserstoffen in Gegenwart eines wäßrigen Hähruiediums und in Gegenwart eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases ohne Einführung weiterer Mengen der als Kohlenstoffquelle dienenden Kohlenwasserstoffe in Berührung hält.
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| GB49055/62A GB1059884A (en) | 1962-12-31 | 1962-12-31 | Process for the removal, wholly or in part, of straight chain hydrocarbons from hydrocarbon mixtures |
| GB49056/62A GB1059885A (en) | 1962-12-31 | 1962-12-31 | Process for the removal, wholly or in part, of straight chain hydrocarbons from hydrocarbon mixtures |
| GB4906662 | 1962-12-31 | ||
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| GB2080363 | 1963-05-24 |
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|---|---|
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ID=27585214
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Families Citing this family (1)
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|---|---|---|---|---|
| WO1996038536A1 (fr) * | 1995-05-29 | 1996-12-05 | Nauchno-Issledovatelsky Institut Vychislitelnykh Komplexov | Procede de culture d'une biomasse de micro-organismes |
-
1963
- 1963-12-30 DE DE1963B0074851 patent/DE1470507C3/de not_active Expired
- 1963-12-30 DE DE1963B0085070 patent/DE1442067A1/de active Pending
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