-
Verfahren zur Herstellung von proteinhaltigem Material (Trennanmeldung
i) (Auscheidung aus Patent .................(Patentanmeldung 3 74 851 IVa@a # Die
Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur herstellung von proteinhaltigem material
sowie auf ein Verfahren zur vollständigen oder teilweisen Entfernung von geradkettigen
Kohlenwasserstorfqen von Gemischen dieser Kohlenwasserstoffe mit anderen Kohlenwasserstoffen.
-
NaCh einem Aspekt ist die Erfindung auf ein Verfahren gerichtet, des
dadurch gekennzeichnet ist, daß men einen Mikroorganismus in Geenwart eines Einsatzmatrials
züchtet, da. aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen besteht oder idese enthält und
anschlieszend eine Fraktion, die der Mikroorganismus enthält, Bedingungen unterwirft,
unter denen eine Fraktion gewonnen wird, die aus Proteinen oder polyproteinen oder
Polypeptiden oder Aminesäuren, die 1. Mikresorganismus enthalten sind oder davon
abgeleitet sind, besteht oder diese Protolne, Polyproteine, Polypeptlde oder Aminesäuren
enthält. Die den Mikroorganismua enthaltende Fraktien wird verzugswiese der Autelyse,
Plasmolyse oder Hydrolyse unterwefen. Die Autolyse kann mit Hilfe der im Mikroorganismus
enthaltenen Enzyme oder durch Zusata anderer Enzyme vorgenommen
werden.
-
Durch Züchtung der Mikroorganin, s. B. Hefen, auf Erdölkohlenwasseratoffen
werden Zellen gebildet, die nachdem Waschen und Trocknen einen besonders scharfen
und ranzigen Geschmack haben.
-
Fliege Mikroorganismen, insbesondere hefen, haben einen hoben Gehalt
an Lipiden. deren Anwessen eitwegen ihrer leichten Oxyde. tion, die zu einem unangenehemn
Geschmack und Geruch führt, unerwünscht ist. Jedoch ist die Aufspaltung und Resorption,
d.h. die Verdaulichkeit, dea trockenen Hikroorganimus selbst nach Entfernung der
Lipide ungenügend und unregelmässig. Dieser Nach. toll ist zu-mindest tollw w auf
die zwangeläufig etwas scharfen Bedingungen des Trocknens der Zellen zurückzuführen.
Durch das nachstehend beschriebene Verfahren wird der Mikroorganismu in ein verdaulcheres
material überführt.
-
Die Autolysse, die bevorzugte Methode zum Abbau der Zellen, führt
zu eine. Produkt in Form einer Flüssiglosit, deren Viskosität von der Konzentration
des Trocknestoffz abhängty. Das Autolysat, das Proteine eines viel niedrigeren Molekulargewichts
als die Trockenhefe enthält, ist viel verdaulicher. Da es ohne acharfes Erhitzen
erhalten wird, bleiben die instabilen Aminosäuren und die Vitamine vollständig oder
im wesentlichen vollständig erhalten. Ferner ermöglicht die flüssige Form des Autolysats
ein. leichte Extraktion der darin enthaltenen Lipide unter Verwendung geeigneter
Lösungsmittel.
-
Das Autolysat kann also mit einem geeigneten Lösungsmittel behandelt
werden, um die Lipide und die möglicherweise noeh darin enthaltenen Spuren von Kohlenwasserstoffen
zu extrahieren. Es wird dann vorzugsweise unter Vakuum bei einer Temperatur unter
70°C eingeengt, wobei die gewünschten Bestandteile, z.B. di.
-
Aminosäuren und Vitamine, gegen Zerstörung geschützt werden. ich einem
anderen Aspekt ist die Erfindung auf ein Verfahren gerichtet, das durch gekennzcihnet
ist, dase Man einen Mikroorgani@@us in Gegenwart eines Einsatzmaterials kultiviert,
das
aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen besteht oder diese enthält,
das Produkt in eine den Mikrooganismus enthaltende Fraktion, eine das wäzsrige Mährmedium
emnthaltende Fraktion, und, falls Kohlenwasseratoffe in wesentlicher Menge ii Produkt
enthalten sind, eine diese Kohlenwasserstoffe enthaltende Fraktion trennt, an. schliesend
eine den Mikroorganiamus enthaltende Fraktion einer @eihr abwechalnder Wasch- und
Trennstufen unterwirft, in denen die Abtrennung des anschlieseend zur weiteren Aufarbeitung
geführten Mikroorganismus von einer wässrigen Phase erfolgt, wobei in der ersten
Waschatufe eine wäszrige Lösung eines oberfläcenaktiven Mittels und in der letzten
Waschstufe ein von oberflächenmaktiven Mitteln freies wäriges Medium verwendet wird
und die Wasch- und Trenzufen so durchgeführt werden, das der aus die mer Reibe von
Stufen gewonnene Mikroorganismus einen Kohlenwasserstoffgehlat von weniger als 7
Gew-% hat, bezogen auf das Gewicht des Trockenen Mikroorganismus, und enschliessend
den gewaschenne Mikroorganismue Bedingungen unterwirft, bei denen Bruch oder Kxtraktion
der Zellen stattfindet.
-
Vorzugzweise werden Proteine oder Polyproteine oder Polypeptide oder
Aminosäuren, die ii Mikroorganismus enthalten sind oder davon stammen, Ton Zellwandmaterial
abgetrennt, das aus den Zell. wänden und/oder de. die Zellwände bildenden Material
besteht.
-
Mach einer anderen Auaführungsform ist das Verfahren gemäss der Erfndung
dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorgania. auz in Gegenwart eines Einsatzmaterials
züchtet, das aus geradlosttigen Kohlenwasserstoffen besteht oder diese enthält,
vorzugsweise anschliessend, wenn noch Kohlenwasserstoffe anwesend sind, ein' Fraktion,
die den Mikroorganismus enthält, von den Kohlenwasserstoffen abtrennt und anschliessond
die den Mikroorganismus @nthaltende Frktion Bedingen unterwirft0 bei denen Proteine,
Polyperoteine @Polyeptide oder Aminosäuren, die ja Mikroorganismjs enthalten sind
oder davon stamen, vonm Zellwandmaterial abgestrent werden, das aus den Zellwänden
und/oder dei die Zellwände
bildenden Material besteht, und anschliessend
das mit Kohlenwasserstoffen verunreinigte Zellwandmaterial gegebenen. falls nach
vorheriger modifizierender Behandlung der Lösungsmittelextraktion unterwirft, wodurch
die Kohlenwasserstoffe wenigstens teilweise vom Zellwandmaterial gewonnen werden.
-
Das Zellwandmaterial, das nach der Abtrennung der Proteine, Polyproteine,
Polypeptide und/oder Aminosäuren enrhalten wird. enthält gewöhnlich Glucoside' Lipide
und einige weitere Protoine sowie die zu entfernenden Kohlenwasserstoffe. Boi der
Lösungsmittelextraktion werden die Lipide gewöhnlich vom Zellwandmaterial entfernt.
Beim Zellwand:aterial verbleiben somit ge. wöhnlich die Glucoaide und einige Proteine.
-
Die Lösungsmittelextraktion des Zellwwandmaterials wird vorzugsweise
mit eine Lösungsmittel durchgeführt, das aus Kohlenwasserstoffen besteht odor diese
enthält. Vorzugsweise werden C4-C7-Kohlenwasserstoffe verwendet. Bevorzugt werden
paraffiniache Kohlenwasserstoffe, insbesondere geradkettige Paraffine. Geiignet
sind Normalpentan und Normalhexan. Gegebenenfalls wird vor der Extraktion des Zelwandmaterials
mit einem Kohlenwassermtofflöser eine Extraktion mit einom Alkohol, vorzugsweise
Xthanol, vorgenommen. Geeignot ist ein Lösungsmittel, das aus 80 Gew.-% Hexan und
20 Gew.-% Äthanol besteht. Wenn die XohIen. wasserstoffe, die durch die Lösungsmittelextraktion
In der Extrsktphase gewonnen worden, durch den Mikroorganismus abbau. fähig atnd,
können sie in dio Kultivierungsstufe zurUckgeftihrt werden. Die feste Phase, die
bei der Lösungsmittelextraktion erhalten wird und aus den gereinigten Zellwandmaterial
besteht, kann etwa 4 Gew.-% gebundenen Stickstoff enthalten und ist ein wertvolles
Viehfutter.
-
Die bevorzugte Methode der Kultivierung und anschliessenden Behandlung
des Mikroorganismus wird nachstchand ausführlicher be. schrieben.
-
Als Einsstzmaterial dient vorzugsweise ein geradkettiger Kohlen. wasserstoff
oder ein Gemisch von Kohlenwasserztoffen, das einen
geradkttigen
Kohlenwasserstoff enthält. Vorzugsweise wird ein C10- oder höherer Kohlenwassersotff
verwendet. Zweckmässig werden aus Erdöl stammende Kohlenwasserstoffraktionen eingesetzt.
-
Es ist bekannt, dass gewises Erdölfraktionen, insbesondere Gasöle,
geradkettige Kohlenwasserstoffe enthalten, und zwar haupt. zächlich Paraffine, die
Wachse darstellen und sich nachteilig auf don Stäckpunkt der Fraktion auswirkon.
Mit anderen Worten, wenn diese Kohlenwasserstoffe ganz oder teilweise entfernt werdon,
wird der Stockpunkt der Fraktion erniedrigt. das Wachs wird gewöhnlich durch Ausfällung
mit HilS von Lösungsmitteln entfernt, und zwar wird das ursprünglich in der Fraktion
enthaltene wachs als solches, d.h. ohne Umwandlung in wertvollere Produlcte gewonnen.
-
Die unter den Gasölen siedenden Erdölfrkationen, z.B. schwere Nphthene
und Kerosine, enthalten ebenfalls geradkettige Kohlenwasserstoffe, die potentiell
wertvoll itlr die Umwandlung in andere Produkte sind. Biaher war Jedoch die Ausnutzung
dieser Kohlenwasseratoffe erschwert durch die Notwendigkeit, sie von den Erdölfrkationen,
in denen sie enthalten sind, abzutrennen, bevor sie b andere Produkte umgewandelt
werden können.
-
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kultiviert man
einen Mikroorganismus in der vorstehend beschriebenen Weise in Gegenwart einer Erdölfraktion,
die teilweise aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen besteht und ein mSttlerea Molekulargewicht
hat, das wenigstens 10 C-Atomen im Molekül entspricht, sowie in Gegenwart eines
wässrigen Nährmediums und in Gegenwart eines Gases, des freien Sauerstoff enthält,
und trennt vom Gemisch einerseite den Mikroorganimus und andererseits eine Erdölfraktion
ab, die einon verringerten Anteil an geradkettigen Kohlenwasserstoffen hat oder
frei von diesen geradkettigen Kohlenwasserstoffen ist s Das Verfahren gemäss der
Erfindung ist von besonderem Wort für die Aufarbeitung von aus Erdöl erhaltenen
Gasölfraktionen, die geradkettige Kohlenwasserstoffe in Form von Wechzen enthalten,
da
durch das Vorfahren gemäss der Erfindung ein Gasöl mit erniedrigten Stockpunkt erholten
wird, während die Wachse in ein wertvolleres Produkt umgewandelt worden.
-
Die geradkettigen Kohlenwasserstoffe sind in den gemäss der Erfindung
verwendeten Einsatzmaterialien gewähnlich als Paraffine vorhanden. Sie können Jedoch
auch als Olefine vorliegen0 Ferner können Gemische verwendet werden, die geradkettige
Paraffine und Olefine enthalten.
-
Es ist ein wichtiges Kennzeichen der Erfindung, da33 bel der Züchtung
von Hefe in Gegenwart der vorstehend beschriebenen Einsatzmaterialien unter Bedingungen,
die des Wechstum der hefe auf Kosten der geradkettigen Kohlenwasserstoffe begünstigen,
die Ubrigen Kohlenwasserstoffe, z,B, Isoparaffine, Naphthcne und Aromaten, nicht
aufgespalten werden oder ihr aufgespaltener Anteil bestenfalls sehr gering ist.
Ferner wird im Gegensatz zu üblichen chemischen Verfahren, die dem massenwirkungsgesetz
gehorchen, die Geschwindigkeit der Entfernung Von geradkettigen Kohlenwasserstoffen
nit kleiner werdendem Anteil dieser Kohlenwasserstoffe im Gesmtgemisch der Kohlenwasserstoffe
nicht weseitlich geringer (ausgenommen natürlich in den letzten Phasen der Entfernung).
So kann, falls gewünscht, der erreichte pro. zentuale U@satz der geradkettigen Kohlenwasserstoffe
bei einem Wert gehalten werden, der sich 100% nähort, ohne dass ein unverhältnismässig
hoher Aufwand an Kontaktzeit erforderlich ist, um geringe Verbesserungen zu erzielen.
Ferner kann bei einem kontinuierlichen Verfahren dieser hobe Umsatz erreicht werden,
ohne die Anwendung eines langen Reaktionsweges zu Hilfe zu Dehmen.
-
Durch Anwendung dieses Verfahrens unter Bedingungen, die -die Aufspaltung
der geradkettigen Kohlenwasserstoffe beschränken, ist es möglich, so zu arbeiten,
dass nur ein gewünschter Teil dieser Kohlenwasserstoffe entfernt wird.
-
Gseignete Einsatzmaterialien für das Verfahren gemäse der Erfindung
sind Leuchtpetroleum, Gasöle und Schmieröle, Diese Einsatzmaterielien können unraffiniert
sein oder einer gewisen raffinierenden
Behandlung unterworfen werden,
jedoch müssen sie 9-wöhnlich einen gewissen Anteil an geradkettigen Kohlenwasseratoffen
enthalten, um fur die Zwecke der Erfindung geeignet zu sein, Zweckmässig beträgt
der Gehalt an geradkettigen Kohlenwasserstoffen in der Erdölfraktion 3 bis 45 Gew.%.
-
Als Mikroorganismen, die gemäss der Erfindung kultiviert werden,
kommen Hefe, Pilze oder Bakterien infrage. Bei Verwendung von Hefe gehört diese
vorzugsweise zur Familie Cryptococcaccae, insbesondere zur Unterfamilie Cryptococpoccoidae.
Gegebenenfalls können jedoch beispielsw@@@ ascosporogene Hefen der Unterfaillis
Saocharomyceloidae verwendet werden. die bevorzugten Gettungen der Unterfamilie
Cryoto@@occoidae sind Torulopsis (auch als Torula bekannt) und Candia. Die bevorzugten
Hefestäme@ sind nachztehend aufgeführt. Besonders bevorzugt werden die Stä@@@, deren
Hinterlegunznummer in der folgenden @abelle genannt ist. Diese Hinterlegunganumern
beziehen sich auf Stämme, die bei. Central bau vor Schimmelculture, Baarn, Holland,
hinterlegt Sind.
-
Candida lipolytice Candida pulcherrime CBS 610 Candida utilis Candida
utilis, Variati major CBS 841 Candida tropicalie CBS 2317 Torulopsis colliculose
CBS 133 Han@@nuls anomale CBS 110 Oidium lactis Meurospora sitophila Von den vorstebend
genannten Stämmen wird Candida lipolytion bes@@der@ bevorzugt.
-
Von den Pilzen kommen die jenigen der Fomilie Aspergillaces infrage.
Eine gesignete Gattung ist Perbillium. Vorzugzwise wire Penieillium expenzum verwendet.
Als weitere verwendbare Gattung kommt Aspergillus infrage.
-
Als Bakterien können die Ordnungen Paeudomonales, Eubascteriales
und Actinomycetales verwendet werden. Vorzugsweise werden die
Familien
Bacillsocae und Pseudomonadaceae verwendet. Bevorzugte Spezics sind Becillus megatherium,
Becillus subtilis und Pseudomonas aeruginosa. Weitere geeignete Stämme sind: Bacillus
amylobacter Pseudomonas natriegens Arthrobater sp.
-
Hlerococcus sp.
-
Corynebacterium michiganense Pseudomonas syringae Xanthomonas begonies
Flavobacteriutn sp. devorans Acetobacter sp.
-
Aotinomyces sp.
-
Agrobacterium sp.
-
Aplanobacter sp.
-
Die Züchtung wird gewöhnlich in Gegenwart eines wäserigen Nährmedium@
durchgeführt. Gegebenenfalls können gewisse feste Nährmedien verwendet wurden. in
Jedem Fall muse ein Gas, das freien Sauerstoff enthält, zugeführt werden.
-
Penicillium expansum eist sich zur Z2chtung in einem wässrigen Nährmedium,
das Kohlenwasserstoffe enthält.
-
Penicillium Roqueforti, Penicillium Notatum, Aspergillus fussigatus,
Aspergillus Niger und Aupergillus Versicolor können auf eine. festen Nährmedium
gezüchtet werden, das Kohlenwasserstoffe enthält.
-
Zum Wachstum der Mikroorganismen sind zusätzlich zum Einsatzmaterial
ein wäsariges Nährmedium und eine Sauerstoffquelle, vorzugsweise in Porn: von Luft,
erforderlich.
-
Ein typisches Nährmedium für das Wachztum von Nocardim hat folgende
Zusammensetzung:
Ammoniumsulfat Ig Magne siumsulfat 0,20 g Eisen(II)-sulfathsptahydrat
0,005 g Mangansulfatmonohydrat 0,002 g Monokaliumphosphat 2g Dinstriumphosphat 3
g Calciumchlorid 0,1 g Natriumcarbonat 0,3 g Hefeextrakt 0,008 g destiliiertes Wasser
(zur Auffüllung auf 1000 ml0.
-
Pur andere Bakterien ist folgende Zusammensetzung des Nährmediums
geeignet: Monkal t iumphosphat Magn@@iumsulfatheptahydrat 0,2 g Natiumchlordi 0,1
g amoniumchlorid 2,5 g g Leitungswasser (Spurenelemente) 100 ml Hefeextrakt 0,025
g destilliertes Wasser (zur Auffüllung auf 1000 ml).
-
Ein geeignetes Nährmedium für Hefen(und Pilze) hat folgende Zusammensetzung:
Diammoniumphosphat 2g Keliumchlorid 1,15 g Magne siumsulfatheptahydrat t 0,65 g
Zinksulfat 0,17 g Mangansulfatmonohydrat 0,045 g Eisen(II)-sulfatheptahydrat 0,068
g Le ittmgswasser 200 g Hefeextrakt 0,025 g destilliertes Wasser (zur Auffüllung
auf 1000 ml).
-
Miloroorganismen, insbesondere Hefe, wachsen zuweilen nur mit Schiwerigkeit,
wenn sie erstmals unter Verwerdung von Kohlonwaserstofffraktionen als Ausgangsmaterial
gezücktet t werden.
-
Manchmal ist es erforderlich, zum Beimpfen einen Mikroorganismus
zu
verwenden, der vorher zum Wachstum auf der zu verwendenden Kohlenwasserstofffraktion
angepasst worden ist. Ferner ist es möglich, das die Mikroorganismen trotz der Züchtung
in Gegenwart eines wässrigen mineralischen Mediums, das die geeigneten Nährstoffe
enthält, nur mit Schwierigkeit wachsen, weil die Kohlenwasserstoffratkion nicht
die Wachstumsfktoren enthält, dio in Ausgangsmterialien auf der Basis von Kohlehydraten
vorhanden sind, es sei denn, diese Wachstumsfaktoren werden zugeetzt.
-
Das Wachstum der verwendeten Mikroorganismen wird begünstigt, wenn
man zum Nährmedium eine sehr geringe Mange eines Hefeextrakts (cin durch Hydrolyse
von Hofe erhaltenes, an Vitarainen der Gruppe B reiches industrielles produkt) oder
ganz allgemein an Vitaminen der Gruppe B und/oder Biotin gibt. Die Menge liegt vorzugsweise
in der Grössenordnung von 25 Teilen pro Million, bezogen auf das wässrige Gärmedium.
Sie kann höher oder niedriger sein Je nach den für die Bebrütung gewählten Bedingungen.
-
Das Wachstum des Mikroorganismus erfolgt auf Kosten der Einsatzfraktion
unter Zwischenbildung von Körpern - hauptsächlich Fettsäuren - mit Säure funktion,
so dass dor pH-Wert des wässrigen mineralischen Mediums allmählich sinkt. Ohne Korrektur
kommt das Wachstum ziemlich schnell zum Stillstand, und die Konzentration des Mikroorganismus
im Medium bzw. die Zelldichte nimmt nicht mehr zu, so dass eine sogenannte stationäre
Phase ericht wird.
-
Das wäsarige Nährmedium wird daher vorzugsweise durch stufenweise
oder kontinuierliche Zugabe eines wässrigen mediumms von hohe pH-Wrt beim gewUnsehten
pH-Wert gehalten. Geähpnlich wird der pH-Wert des Nährmediums bei Verwendung von
Pilzen oder Befen, insbesondere bei Verwendung von Candida lipolytion, im Bereich
von 3 bis 6, vorzugsweise von X bis 5, gehalten. (Bakterien ertordern einen höheren
pH-Wert von gewöhnlic 6,5 bis 8.) Als alkalische Stoffe für den Zusatz zur WUrm
eignen sich Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Dinatriumhydrogenphosphat und Ammoniak
in freier Fore oder in Waasriger Lösung.
-
@ie @@@@@@@@@ Temperatur des Zuchtmediums ist verschieden Je nach
der Art des verwendeten Mikroorganismus und liegt gewöhnlich im Bereich von 25 bis
35°C. Bei Verwendung von Candida lipolytica wird ein Temperaturbereich von 28 bis
32°C bevor-@@gt.
-
Die Aufnahme von Sauerstoff ist für das Wachstum der hefe wesentlich.
Der Sauerstoff wird gewöhnlich als Luft zugeführt. Um die Wachstumsgeschwindigkeit
h@ch zu halten, muß die Luft, die den Sauerstoff liefert, durch Rühren in feine
Blasen zerteilt werden. Die Luft kann durch eine Fritte eingefUhrt werden, Jedoch
kann auch das als "Wirbelbelüftung" bekannte System der Belüftung angewendet werden.
es wurde festgestellt, daß bei Verwendung von Hefe des Stammes Candida lipolytica
bei einem Verfahren gemäß der Erfindung, bei dem die Belöftung durch "Wirbelbelüftung'
erfolgt, eine hohe Wachstumsgeschwindigkeit erreicht wird, wobei die Generationszeit
im Bereich von 2 bis 5 Stunden liegt.
-
Bei Chargenbetrieb wachsen die Mikroorgansimen zunächst mit. langsamer
Zunahme der ZelldlchtRe. (Diese Wachstumsperiode wird nachstehdn als "Trägheitsphase"
bezeichnet). Danach steigt die Wachstumsgeschwindigkeit auf einen höheren Wert.
Die Periode mit höherer Wachstumsgeschwidndigkiet wird als "Exponentialphase' bezeichnet.
Anschließend wird die Zelldichte wieder konstant, (die stationäre Phase). Eine gewisse
Menge des Mikroorganismus fUr den Beginn der sechsten Charge wird vorzugsweise vor
Beendlgung der Exponentialphase abgenommen. Die Fermentation wird gewöhnlich vor
der stationären Phase abgebrochen. In dieser Phase wird der Mikroorganismus gewöhnlich
von der Hauptmasse des wMBrigen Nährmediums und von der Hauptmasse der nicht verbrauchten
Einsatz fraktion abgetrennt.
-
Gegebenenfallo kann der Mikroorganismus vor der weiteren Reinigung
des Produkts der Autolyse unterworfen werden.
-
Nach einer der Aufarbeitungsmethoden des Produkts wtrd zuerst der
grössere Tebl der geschlossenen wässrigen Phase abgetrennt.
-
Vorzugsweise erfolgt dies durch Zentrifugieren oder Dekantieren.
-
Die abgetrennte wässrige Phase enthält gewöhnlich eine höhere Konzentration
an Ionen, die keine Nährstoffe sind, als im Kreislaufstrom toleriert worden kann.
Wenn dies der Fall ist, kann nur ein Teil der zurückgewonnenen wässrigen Phase im
Kreislauf geführt werden. Beispielsweise ist es gewöhnlich möglich, etwa 96 Gew.%
der im Produkt vorhandenen wässrigen Phase abzutrennen. wovon etwa 20 Gew.% verworfen
werden. Dem Kreislaufstrom werden ergänzende Mengen der notwendigen Nährstoffe zugeführt,
worauf er in den Fermenter zurückgeführt wird. Gegebenenfalls können die ergänzenden
Nährztoffe dem Formonter getrennt zugesetzt werden.
-
Bei Anwendung zur Kultivierung von Hefe kann das Verfahren die folgenden
Produktabtrennungsetufen umfassen. In gewissen Fällen können ausser hefen auch andere
Mikroorganismen in dieser Weise abgetrennt werden0 Durch Zentrif@gieren des Produkts
aus dem Fermenter werden dreiFraktionen gewonnen, und zwar in der Reinhenfolge zunehmender
Dichte: I. eine Ölphase, die Hefezellen enthält, II. eine wäsarige Phase, die Bpuren
von 01 und Hefe enthält und III. eine "Hefecreme". die aus Hefe, an deren Zellen
eine gewisse Ölemgne gebunden ist, zusammen niit wässriger Phase be steht.
-
N;'ch der Gewinnung der Fraktion II wird die Fraktion III oder ein
Gemisch der Fraktionen I und III mit einer wässrigen Lösung eines oberflächenaktiven
Mittels gemischt. Diese Behandlung hat den Zweck, das Öl. das offensichtlich durch
Adsorption an den Zellen festgehalten wird, von den Hefezellen abzutrennen.
-
Vorzugsweise wird die den Mikroorganismus enthaltende Fraktion kräftig
mit dem wässrigen oberflächenaktiven Mittel gemischt und ohne eine weitere Wachstumsperiode
des Mikroorganiw:us e iner weiteren Trennung vorzugsweise durch Zentrifugieren unter
worfen, wobei eine Mikroorganismusfraktion und eine ausgebrauchte wässrige Phase,
die die vom Mikroorganismus abgetrennten verunreinigenden Kohlenwasserstoffe enthält,
erhalten werden. Gegebenenfalls können die ilasch-und Trennstufen einmal oder mehrmals
unter Verwendung eines wässrigen oberflächenaktiven Mittles in der Waschstufe wiederholt
werden. Nach dem Waschen mit dem oberflächenaktiven Mittel muss eine Wäsche mit
eine. wässrigen Medium vorgenommen werden, das kein oberflächenaktives Mittel enthält.
-
Vorzugsweise wird Wasser als dieses Medium verwendet. Auch hier kann
eine Reihe von Wasch- und Trennstufen angewendet werden.
-
Insgesamt werden die Waschatufen durchUhrt, bis der Kohlenwasserstoffgehalt
des Mikroorganismus geringer ist als 7%, bezogen auf das Gewicht des Mikroorganismus
(als Trockenmases gerechnet).
-
Vorzugsweise liegt dieser Gehalt an Kohlenwasserstoffen unter5%.
-
Gewhn1ich werden die Kohlenwasserstoffe praktisch entfernt, Jedoch
ist dies für gewisse Anwendungen nicht erforderlch, so dass es in einigen Fällen
nicht notwendig ist, diesen Gehalt aut ein Wert unter û, 1 zu senken.
-
Als oberflächenaktive Mittel eignen sich zum Waschen kationaktive
Substanzen, z.B. Steryltrimothylammoniumchlorid, nichtionogene oberflächenaktive
Mittel, z.B. die Kondensate von Oleinsäure und Äthylenoxyd, oder Anionaktive Substanzen,
z.B. Natriumalkylsulfate.
-
D¢r Mikroorganismus wird nach den Waschen in der beschriebenen weise
vorzugsweise als Creme gewonnen, die vorzugsweise 10 bis 20 Gew.%, z.B. 15 Gew.-%
Trockensubstanz enthält. Der Mikroorganismus wird vorzugsweise in der Form dieser
Creme einer Behandlung unterworfen, durch die @@ darin enthaltenden Proteine , Polyproteine,
Polypeptide oder Aminosäuren vom Zellwandmaterial abgetrenntwerden. Die Anfangsphase
der Abtrennung der Proteine, Polyproteine, Polypoptide oder Aminosäuren Lcann durch
Autolyse,
Plasmolyse oder Hydrolyse durchgeführt werden. Die Autolyse
kann mit hilfe von Enzymen, die tin Mikroorganismus enthalten sind, oder unter Verwendung
zugesetzter Enzyme erfolgen. Gewöhnlich wird hierbei ein pH-Wert eingehalten, der
durch die Art der verwendeten Enzyme bestimmt ist. Die Autolyse wird worzugsweise
bei Temperaturen im Bereich von 43 bis 55°C. vorzugsweise bei 360C durchgeführt.
-
Das Autolysat wird gewöhnlich in Forin einor Plüssigkeit erhalten,
deren Viskosität von der Konzentration der darin enthaltenen Trockensubstanzen abhängt.
Da es ohne starkes Erhitzen erhalten wird, bleiben die nicht sehr beständigen Aminosäuren
und die Vitamine gewöhnlich volständig erhalten.
-
Bei der Herstellung eines als Viehfutter vorgesehenen Autolysats wird
eine Hefe drei Stunden autolysiert. Vorzugsweise enthält die Autolysat 40 bis 50
Gew.-% Trockensubstanz. Wenn ein Autolysat für die menschliche Ernährung vorgesehen
ist, wird die Hefe vorzugsweise 10 bis 20 Stunden autolysiert. Dieses Autoly-Set
enthält vorzugsweise 33 bis 65 Gew.-%, insbesondere 60 Xw.
-
Trockensubstanz.
-
Nach einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden anstelle von
Autolysaten Hydrolysate hergestellt, die durch Einwirkung von Säuren oder Alkalien
auf die Zellen der Mikroorganismen oder Plasmolysate erhalten werden, wobei die.Proteine
als Folge einer Änderung des osmotischen Drucks aus den zellen heraus diffundieren.
Diese Änderung wird beispielsweise durch Z@satz von Natriumchlorid zum wässrigen
medium errecht. Die Arbeitsgänge der Autolyse, Hydrolyse und Plasmolyse können in
der gleichen Apparatur durchgeführt werden. Vorzugsweise wird hierzu ein werksbehälter
verwendet.
-
Es wurde festgestellt, dass durch Senkung das Kohlenwasserstoffgehalts
des Mikroorgani us durch Waschen in der beschriebenen Weise die Arbeitsgeschwindigkeit
bei der Behandlung, die dom Zerreissen oder der Extraktion der Zellwände beispielsweise
durch
Autolyse dient, erhöht wird0 Demzufolge werden die Kosten
der Waschstufe durch die Verweilzeit des Mikroorganismus in dieser Phase wieder
wettgemacht, Das Produkt dieser Stufe, in der die Zellwände abgebaut wurden, wird
nummehr einer Behandlung unterworfen, durch die die stickstoffhaltigen Stoffe, z.B.
Proteine und/oder Polyproteine und/ oder Polypeptide und/oder Aminosäuren, vom Zellwandmaterial
abgetrennt werden. Diese Abtrennung kann durch Zentrifugieren und/oder Plitration
erfolgen. Die so erhaltene stickstoffhaltige Fraktion enthält als Verunreinigungen
Kohlenwasserstoffe und gewöhnlich auch Lipide. Diese Fraktion wird vorzugsweise
der Lözungzmittelextraktion unterworfen. Gegebenenfalls kann Jedoch die Lösungsmittelextraktion
vor der Abtrennung des Zellwandmaterials oder ohne diese Abtrennung durchgefUhrt
werden.
-
Die Lösungsmittelextraktion wird vorzugsweise mit einem Lösungsmittel
durchgefUhrt, das aus einem Kohlenwasserstoff besteht oder diesen enthält. Bevorzugt
werden C4-C7- Kohlenwasserstoffe, insbesondere Paraffine und hier wiederum vorzugsweise
geradkettige Paraffine. Normalpentan und Normalhexan stellen geeignete Lösungsmittel
dar. Gegebenenfalls kann vor der Extraktion dor Kohlenwasserstoffe alt einem Kohlenwwaserstofflöser
eine Extraktion mit einen Alkohol, vorzugsweise Xthanol, vorgenommen werden. Gcgebenenfalle
kann eine Extraktion angewendet werden, bei der als Lösungsmittel ein Gemisch eines
Kolenwassersotffs, beispielsweise der vorstehend genannten Art mit einem Alkohol,
z.B. Xthanol, verwendetbwird. Gegeignet ist beispielsweise ein Lösungsmittel, des
aus 80 Gew.-% hexan und 20 Gew.4 Xthanol besteht.
-
Die Lösung von Kohlenwaserstoffen und Lipiden im Lösungsmittel kann
destilliert werden, um die Kohlenwasserstoffe und die Lipid de getrennt zu gewinnen.
Wenn die zurückgewonnenen Kohlenwasserstoffe aufspaltbar sind, können sie in die
Fermentationsstufe zurückgeführt werden. Die Lipide kannen einer Aufarbeitung zur
Gewinndung von Sterolen unterworfen werden.
-
Das als Raffinat gewonnene Autolysat kann in der beschriebenen
Weise
vorzugsweise bei einer Temperatur unter 70°C getrocknet werden. Während der Trocknung
werden Lösungsmittel spuren von Autolysat entfernt. Die von der Extraktphase gewonnenen
Kohlenwasserstoffe können, wann sio aufspaltbar sind, in die Fermentationsstufe
zurückgeführt werden. Die das Zellwandmaterial enthaltende Fraktion, die die Verunreinigungen
enthält, wird dann einer Behandlung unterworfen, durch die diese Verunreinigungen
in der beschriebenen Weise entfernt werden.
-
Beispiel. 1 40 Liter eines wässrigen mineralischen Nähreediums der
nachstehenden zusammensetzung wurden in einen Fermenter aus nicht rostenden Stahl
eingeführt. der ein Fassungsvermögen von 60 Litern hatte.
-
Das wässrige Nährmedium hatte folgende Zusammensetzung: Diammoniumphosphat
2g Kaliumchlorid 1,15 g Magnesiumsulfathepathydrat 0,65 g Zinksulfat 0,17 g Mangansul
fatmonohydrat 0,045 g Eisen(II)-sulfatheptahydrat 0,068 g Hefextrakt 0,025 g leitungswasser
200 g destilliertes Wassen zur AuffUllung auf 1000 ml.
-
Dann wärden 20 Liter eines 24 Stunden-Impfmaterials von Candida lipolytice
auf gemischten C9-C10-Normalkohlenwasserstoffen ao zugesetzt, daß die Zelldichte
etwa 1 g Trockensubstanz/Liter betrug. Pro Liter wurden 15 g schweres Gasöl aus
Erdöl in den Fermenter gegeben. Diese Menge entspricht 1 03 Liter und reicht aus,
um die Zelldichte auf 2 g/Liter zu bringen.
-
Das Nährmedium wurde bei einer Temperatur von 30 t 1 0C und bei einem
pH-Wert von 4 gehalten. Die Belüftung und Bewegung wurden 80 vorgenomm-en, dass
3 mMol O2/Liter Medium/Minute zugeführt wurden. Durch ein automatisches pH-Reglesystem
wurde wässriges 10n-Ammoniak eingeführt. Nachdem der Zufluss des Ammoniaks 20 ml
erreicht hatte, wurde mit der Zugabe des Gasöls in einer Menge begonnen, die durch
den theoretischen Bedarf der Kultur
bestimmt war unter der Annah@@
einer Ausbeute von #100 x gebildete Hefe # von 10% und einer Zellteilungszeit Gasöleinsatz
von 3 Stunden. Dieser Zusatz erfolgte Jede Stunde, bis die insgesamt zugesetzte
Gasölmenge 250 g/Liter, d.h. 17 Liter erreich. te. Diese Zugabe wurde bis zur 15.
Stunde einschliesslich tortgesetzt. Hach der 15. Stunde betrug die Zelldichte 8
g/Liter.
-
Das so erhaltene Züchtungsprodukt wurde zentrifungiert # wobei eine
Hefepaste erhalten wurde. 8,4 kg dieser Paste enthielten 2 kg Trock@enmasse (ausschliesslich
der festgehaltenen Kohlenwasserstorre), 1 kg nicht aufspaltbare Kohlenwasserstoffe
und l kg Proteine. Zu dieser Paste wurden 14,5 Liter Wasser gegeben, das 180 g Natriumochlorid
enthielt. Das Gemisch wurde 10 Stunden unter ständigem langsamen Rühren bei 50°C
gehalten, ohne den pH-Wert zu regeln. Das so erhaltene Produkt enthielt etwa 600
g Protein und 1200 g löslich gemachte Trockenmasse. Dieses Produkt wurde in zwei
Stufen in einer Sharples-Zentrifuge bei 11000 0 zentrifugiert, wobei eine Olphaae,
die das Zellwandmaterial entnielt, ein durchsichtiges flUssiges autolysat (das 500
g Protein enthielt) und ein Rückstand, der mit Kohlenwaserstoffen leicht durchtränktes
Zellwandmaterial enthielt, erhalten wurden.
-
Das als RUckatand erhaltene Zellwandmaterial wurde teilweise getrocknet.Nach
Trocknung auf einen Wassergehalt von 20 Gew.-% wurde dieses Produkt entölt, indem
es bei 55°C mit einem azeotropen Gemisch von Normalhexan und isopropanol in einer
Menge von 5 Liter Lösungzmittel Je kg Trockenmasse in dem behandelten Produkt extrahiert
wurde. Das entölte Material kann als Viehfutter verwendet werden.
-
Beispiel 2 40 Liter eines waßrigen mineralischen Nährmediums der
nachstehend angegebenen Zusammensetzung wurden in einen Fermenter aus nichtrostendem
Stahl eingeführt. der ein Fassungsvermögen von 60 1 hatte.
-
Zusammensetzung des nährmediums: Diammoniumhydrogenphosphat 2 g Kalijmmchloird
1,15 g Magnesiumsulfathepahydrat 0,65 g Zinksulfat 0,17 g Mangansulfattetrahydrat
0,068 g Eisen(III)-sulfathepthaydrat 0,124 g hefeextrakt 0,030 g Leitungswasser
200 g Destilliertes Wasser: zur Auffüllung auf 1000 ml Dann wurden 20 1 einer 24-Stundenimpfkultur
von Candida lipolytica auf einem Gemisch von C10 0-C20-Normalkohlenwasserstoffen
so zugesetzt, daß die Zelldichte etwa 1 ß Trockensubstanz pro Liter betrug. Die
Temperatur der Kultur wurde mit Hilfe von Wasser, das in einem Ringraum umgewälzt
wurde, der durch den Raum zwischen zwei lconzentrischen Zylindern gebildet wurde,
von denen der kleinere den Fermenter selbst bildets, bei 30#1°C gehalten. Die Belüftung
und Bewegung wurden so eingestellt, daß 3 mMol 02J1 Medium/Minute zugeführt wurden.
-
Der pH-Wert wurde durch Zusatz von Ammoniaklösung, die durch ein automatisches
pH-Regelaystem zugeführt wurde, bei 4 gehalten. Nachdem 20 ml Ammoniak zugesetzt
waren, wurden mit der Zugabe von Gasöl begonnen, das folgende Kennzahlen hatte:
Spezifisches
Gewicht 0,87 Stockpunkt +15°C Siedebereich 300 - 3900C Die Zugebemenge wurde durch
den theoretischen Bedarf der Kultur unter der Annahme einer auf Gasöl bezogenen
usbeute bildete Trockenhefe von 10 Gew.-% und einer Zell-(eingesetztes Gasöl) teilungszeit
von 3 Stunden bestimmt. Diese Zugabe erfolgte stündlich, bis die Geszamtmenge des
Gasöls 200 g/l, d.h. 13.81 erreichte.
-
Ausgehend von einer Zelldichte von 2 gil betrug die Zelldichte nach
2, Stunden (Ende der exponentiellen Waschstumsphase) 15 g/l. Der Fermenter wurde
darm kontinuierlich bei einer Verdünnungsrate von 0,2 V/V/Std. betrieben. Die Zolldichte
blieb während des gesamten Versuchs konstant bei 15 g/l.
-
Die au Austritt des Fermenters abgezogene Brühe wurde der Schichtentrennung
überlassen. Eine wäßrige Phase, die 65 Gew.-% der Brühe ausmachte, wurde als ausgebrauchtes
Medium abgezogen und durch 65% Leitungswasser ersetzt. Zum letztgenannten Gemisch
wurde ein nichtionogenes Detergens (Produkt der Kondensation eines Gewmisches von
Laurin- und Myristinalkohol mit Äthylenoxyd, Handelsbezeichtung "NI 29") in einer
Menge von 0,5 g/l Gemisch gegeben. Dieses Gemisch wurde gut gerührt und in einer
Shaprles-Superzentrifuge zentrifugiert, wobei die folgenden Produkte getrennt erhalten
wurden eine Hefepaste, eine wäßrige Phase, eine Gasölphase.
-
Die Hefepaste wurde mit Leitungswasser bei einem Verhältnis von t
Teil Trockensubstanz tut @@Teile Wesser gespUlt und erneut mit der Shaprles-Superznetrifuge
zentrifugiert.
-
8,4 kg der geaptilten Hefepaste enthielten 2 ks Trooken-Substanz (auschließlcih
der zurückgehaltenen Kohlenwasserstoffe
), 1 kg nich abgebauten
Kohlenwasserstoff und 1 kg Proteine. Zu dieser Paste wurden 14,5 1 wasser gegeben,
das 180 g Natriumchlorid enthielt. Das Gemisch wurd 10 Stunden ohne pH-Regelung
in ständiger Bewegung gehalten. Das so erhaltene Produkt enthielt etwa 600 g Protein
und 1200 g löslich gemachte Trockensubstanz.
-
Dieses Produkt wurde in zwei Stufen in einer Sharples-Superzentrifuge
bei 11000 g. zentrifugiert, wobei eine Ölphase, die Zellwandmaterial enthielt, ein
klares flüssiges Autolysat (das 500 g Protein enthielt) und ein Rückstand, der leicht
mit Kohlenwasserstoffen getränktes Zellwandmaterial enthielt, erhalten wurden.
-
Das als Rückstand gewonnene Zellwandmaterial wurde teilweise getrocknet.
Nach dem Trocknen auf ein Produkt, das 30 Gew..% Wasser enthielt, wurde dieses Produkt
durch Extraktion bei 80°C mit einem azeotropen Gemisch von n-Hexan und Isopropylalkohol
bei einem Verhältnis von 8 Teilen Lösungsmittel pro kg Trockensubstanz im behandelten
Produkt entdlt. Diese Lösungsmittelwäsche wurde wiederholt. Dann wurde eine abschließende
Extraktion vorgenommen, die aus einer Wäsche mit Isopropanol bei einem Verhältnis
von 4 Teilen Löaungsmittel pro Teil Trockenhefe (Gewichtsbasis) bestand. Das entölte
Material kann als Viehfutter verwendet werden0