DE1642586A1

DE1642586A1 - Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen

Info

Publication number: DE1642586A1
Application number: DE19671642586
Authority: DE
Inventors: Filosa Jean Antoine
Original assignee: BP PLC
Current assignee: BP PLC
Priority date: 1966-05-13
Filing date: 1967-05-12
Publication date: 1971-05-06
Also published as: GB1168834A; BE698395A; US3522147A; NL6706581A

Description

PATEN ΓΑΝνν^ΙΤΕ |64258ρ

DR.-ING. VON KREISLcR DR.-INo. SCHÖNWALD DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DlPL-CHEM. ALEK VON KREISLER DiPL-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLDPSCH

KÖLN 1, DEICHMANNHAUS

Köln, den 26. Mai 1970 Kl/En

P 16 42 $86,8

The British Petroleum Company Li.nited,

Britannic House, Moor Lane, London E.C.2 (England) ä

Verfahren zur Kultivierung von_Mikroorganismen

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Erzeugung von Mikroorganismen, z.B. Hefe. Sie betrifft ferner die vollständige oder teilweise Entfernung von geradkettigen Kohlenwasserstoffen aus Gemischen mit anderen Kohlenwasserstoffen.

Bei einem Verfahren, bei dem ein Mikroorganismus in Gegenwart eines Kohlenwasserstoffs gezüchtet wird, wurde festgestellt, i daß der Mikroorganismus durch sorbierte Kohlenwasserstoffe verunreinigt sein kann. Zuweilen können auch andere beim Fermentationsprozeß gebildete Stoffe anwesend sein. Beispielsweise können Hefen mit Lipiden verunreinigt sein«

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren, das die folgenden Stufen umfaßt:

1. Man züchtet in einer Wachstumsstufe einen Mikroorganismus in Gegenwart eines Kohlenwasserstoff-Einsatzmaterials, das ganz oder teilweise aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen besteht, in Gegenwart eines wäiSrigen Nährmediums und in Gegenwart eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases.

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2. Man hält anschließend in einer Reinigungsstufe den Mikroorganismus in einem wäßrigen Nährmedium und einem freien Sauerstoff enthaltenden Gas, wodurch die Menge des den Mikroorganismus verunreinigenden Kohlenwasserstoffs verringert wird.

3. Man unterwirft danach die den Mikroorganismus enthaltende Fraktion einer Trennungsbehandlung.

4. Anschließend wird der Wasseranteil in der den Mikroorganismus enthaltenden Fraktion verringert und

5. die den Mikroorganismus enthaltende Fraktion der Lösungsmittelextraktion unterworfen.

Die Trennung in der Stufe (3) kann durch Dekantieren und zusätzlich oder als Alternative durch Zentrifugieren erfolgen.

Als Lösungsmittel eignen sich für die Zwecke der Erfindung beispielsweise Äthylalkohol, Isopropanol, leichte Kohlenwasserstoffe einschließlich Benzol und leichter Fraktionen aus Platforming-Anlagen, Äthyläther, Aceton, chlorierte Lösungsmittel und verflüssigte Erdölgase, z.B. Butan und Propan. Das Kohlenwasserstoff-Einsatzmaterial enthält vorzugsweise Kohlenwasserstoffe einer C-Zahl von 10 oder darüber. Zweckmäßig wird eine aus Erdöl erhaltene Kohlenwasserstofffraktion verwendet.

Gewisse Erdölfraktionen, insbesondere Gasöle, enthalten bekanntlich geradkettige Kohlenwasserstoffe, hauptsächlich Paraffine, die Wachse sind und sich nachteilig auf den Stockpunkt der Fraktion auswirken«, Wenn also diese Kohlenwasserstoffe ganz oder teilweise entfernt werden, wird der Stockpunkt der Fraktion erniedrigt. Gewöhnlich wird das Wachs durch Ausfällung mit Hilfe von Lösungsmitteln entfernt. Hierbei wird das ursprünglich in der Fraktion vorhandene Wachs als solches, d.ho ohne Umwandlung in wertvollere Produkte gewonnen.

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Die unterhalb der Gasöle siedenden Erdölfraktionen, z.B. Schwerbenzine und Leuchtpetroleum, enthalten ebenfalls geradkettige Kohlenwasserstoffe, die potentiell wertvoll für die Umwandlung in andere Produkte sind, jedoch war bisher die Ausnutzung dieser Kohlenwasserstoffe im allgemeinen durch die Notwendigkeit erschwert, diese Kohlenwasserstoffe aus den Erdölfraktionen, in denen sie enthalten sind, abzutrennen, bevor sie in andere Produkte umgewandelt werden können.

Gemäß einem bevorzugten Kennzeichen ist die Erfindung auf ein Verfahren gerichtet, bei dem man einen Mikroorganismus auf ™ die vorstehend beschriebene Weise in Gegenwart einer teilweise aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen bestehenden Erdölfraktion, die ein mittleres Molekulargewicht hat, das wenigstens 10 C-Atomen pro Molekül entspricht, und in Gegenwart eines wäßrigen Nährmediums und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases züchtet und aus dem Gemisch einerseits den Mikroorganismus und andererseits eine Erdölfraktion abtrennt, die einen verringerten Anteil an geradkettigen Kohlenwasserstoffen hat oder frei von diesen geradkettigen Kohlenwasserstoffen ist.

Das Verfahren gemäß der Erfindung ist von besonderem Wert für | die Behandlung von Gasölfraktionen aus Erdöl, die geradkettige Kohlenwasserstoffe in Form von Wachsen enthalten, da beim Verfahren gemäß der Erfindung ein Gasöl von verbessertem Stockpunkt erhalten wird, während die Wachse in ein wertvolles Produkt umgewandelt werden.

Die geradket.tigen Kohlenwasserstoffe sind in den erfindungsgemäß verwendeten Einsatzmaterialien gewöhnlich als Paraffine vorhanden. Sie können jedoch auch als Olefine vorliegen. Ferner können Gemische verwendet werden, die geradkettige Paraffine und Olefine enthalten.

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Es ist ein wichtiges Merkmal der Erfindung, daß bei der Züchtung von Hefen in Gegenwart der vorstehend beschriebenen Ein-. satzmaterialien unter Bedingungen, die das Wachstum der Hefe auf Kosten der geradkettigen Kohlenwasserstoffe begünstigen, die anderen Kohlenwasserstoffe, z.B. Isoparaffine, Naphthene und Aromaten, nicht abgebaut werden oder der abgebaute Anteil bestenfalls sehr gering ist. Ferner wird im Gegensatz zu üblichen chemischen Verfahren, die dem Massenwirkungsgesetz gehorchen, die Geschwindigkeit, mit der die geradkettigen Kohlenwasserstoffe entfernt werden, mit abnehmendem Anteil dieser Kohlenwasserstoffe im Gesamtgemisch der Kohlenwasserstoffe nicht wesentlich geringer (ausgenommen natürlich in den letzten Phasen der Entfernung). Falls gewünscht, kann somit die erreichte prozentuale Umwandlung der geradkettigen Kohlerwasserstoffe bei einem Wert gehalten werden, der sich 100 nähert, ohne daß ein unverhältnismäßig hoher Aufwand an Kontaktzeit zur Erzielung geringer Verbesserungen notwendig ist. Ferner kann beim kontinuierlichen Verfahren diese' hohe prozentuale Umwandlung erreicht werden, ohne zur Anwendung eines langen Reaktionsweges Zuflucht zu nehmen.

Durch Anwendung dieses Verfahrens unter Bedingungen, die den Abbau der geradkettigen Kohlenwasserstoffe begrenzen," ist es .möglich, unter Entfernung nur eines gewünschten Anteils dieser Kohlenwasserstoffe zu arbeiten.

Zu den für das Verfahren gemäß der Erfindung geeigneten Einsatzmaterialien eignen sich Leuchtpetroleum, Gasöle und Schmieröle. Diese Einsatzmaterialien können unraffiniert oder einer gewissen raffinierenden Behandlung unterworfen worden sein, jedoch müssen sie gewöhnlich einen Anteil an geradkettigen Kohlenwasserstoffen enthalten, um für die Zwecke der Erfindung geeignet zu sein. Zweckmäßig enthält die Erdölfraktion 3 bis 45 GeWo-# geradkettige Kohlenwasserstoffe.

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Als Mikroorganismen, die auf die hier beschriebene Weise gezüchtet werden, kommen Hefen, Pilze oder Bakterien in Frage.

Bei Verwendung einer Hefe gehört diese vorzugsweise zur Familie Cryptococcaceae, insbesondere zur Unterfamilie Cryptococcoideae. Gegebenenfalls können jedoch auch ascosporogene Hefen der Unterfamilie Saccharomycoideae verwendet werden. Die bevorzugten Gattungen der Unterfamilie Cryptococcoideae sind Torulopsis (auch als Torula bekannt) und Candida. Bevorzugte Hefespezies werden nachstehend genannt. Besonders bevorzugt wird die Verwendung der nachstehend zusammen mit den Hinterlegungsnummern genannten Stämme. Die mit CBS gekennzeichneten Stämme sind beim Centraal Bureau voor Schimmelculture, Baarn, Holland,, und die mit INRA gekennzeichneten Stämme beim Institut National de la Recherche Agronomique, Paris, Frankreich, hinterlegt.

Bevorzugter Stamm Candida lipQlytica

Candida puleherrime CBS 610

Candida utilis

Candida utilis, Bariati major CBS 841

Candida tropicalis CBS 23I7

•Torulopsis colliculosa CBS 133

Hansenula anomala CBS 110

Oidium lactis
Neurospora sitophila
Mycoderma Cancoillote INRA: STV 11

Von den vorstehend genannten Stämmen wird Candida lipolytica besonders bevorzugt.

Als Mikroorganismen können in einem wäßrigen Nährmedium, das Kohlenwasserstoffe enthält, auch Pilze gezüchtet werden. Ein geeigneter Stamm ist Penicillium expansum. Auf einem festen

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Nährboden, der Kohlenwasserstoffe als Einsatzmaterial enthält, können Penicillium roquefortii, Penicillium notatum, Aspergillus fussigatus, Aspergillus niger und Aspergillus versicolor gezüchtet werden.

Die erfindungsgemäß gezüchteten Bakterien gehören zweckmäßig zu den Ordnungen Pseudomonadales, Eubacteriales und Actinomycetales. Vorzugsweise werden Bakterien der Familie Bacillaceae und Pseudomonadaceae verwendet. Bevorzugte Spezies sind Bacillus megaterium, Bacillus subtills und Pseudomonas aeruginosa. Weitere geeignete Spezies sind:

Bacillus amylobacter
Pseudomonas natriegens
Arthrobacter sp.
Micrococcus sp.
Corynebacterium sp.
Pseudomonas syringae
Xanthomonas begoniae
Plavobacterium devorans
Acetobacter sp.
Actinomyces sp.

Für das Wachstum des Mikroorganismus ist außer dem Kohlenwasserstoff-Einsatzmaterial ein wäßriges Nährmedium und die Zufuhr von Sauerstoff vorzugsweise in Form von Luft erforderlich. Ein typisches Nährmedium für die Züchtung von Nocardia, eine Gattung von Actinomycetales, hat folgende Zusammensetzung:

Ammoniumsulfat 1 g

Magnesiumsulfat 0,20 g

Eisen(ll)-sulfatheptahydrat 0,005 g

Mangansulfatmonohydrat 0,002 g

Monokaliumphosphat 2 g

Dinatriumphosphat * 3 ß

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ORIGiWAL fNSPECTED

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Calciumchlorid 0,1 g

Natriumcarbonat 0,1 g

Hefeextrakt 0,008 g

destilliertes Wasser (zur Auffüllung auf lOOO ml)

Ein Nährmedium, das sich für andere Bakterien eignet, hat die folgende Zusammensetzung:

Monokaliumpho sphat

Magne s iumsulfatheptahydrat Natriumchlorid

Ammoniumchlorid

Leitungswasser (Spurenelemente)

Hefeextrakt 0,025 g

destilliertes Wasser (zur Auffüllung auf 1000 ml)

Ein geeignetes Nährmedium für Hefen (und Pilze) hat folgende Zusammensetzung:

7	2	g
0,	1	g
0,	5	g
2,	100	g
	ml

Diammoniumpho sphat	2	g
Kaiiumchlorid	1,15	g
Magne s iumsulfatheptahydrat	0,65	g
Zinksulfat	0,17	g
Mangansulfatmonohydrat	0,0^5	g
Eisen(II)-sulfatheptahydrat	0,068	ε
Leitungswasser	200
Hefeextrakt	0,025	g

destilliertes Wasser (zur Auffüllung auf 1000 ml)

Mikroorganismen, insbesondere Hefen, wachsen zuweilen mit Schwierigkeit, wenn sie erstmals unter Verwendung von Kohlenwasserstofffraktionen als Einsatzmaterial gezüchtet werden. Zuweilen muß als Impfmaterial ein Mikroorganismus verwendet werden, der vorher zur Züchtung auf der Kohlenwasserstofffraktion, deren Verwendung beabsichtigt ist, angepaßt oder adaptiert worden ist. Ferner 1st es möglich, daß der Mikroorganis-

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tnus trotz seiner Züchtung in Gegenwart eines wäßrigen mineralischen Mediums, das die geeigneten Nährelemente enthält, nur mit Schwierigkeit wächst, weil die Kohlenwasserstofffraktion nicht die V/uchsfaktoren enthält, die in Nährmedien auf Basis von Kohlehydraten vorhanden sind, es sei denn, diese V/uchsfaktoren werden zugesetzt.

Das Wachstum der Mikroorganismen wird begünstigt, wenn man zum Kulturmedium eine sehr geringe Menge eines Hefeextrak'ses (ein durch Hydrolyse von Hefe erhaltenes, an Vitaminen der Gruppe B reiches industrielles Produkt) oder allgemein an Vitaminen der Gruppe B und/oder Biotin zusetzt. Diese Menge liegt vorzugsweise in der Größenordnung von 25 Teilen pro Million, bezogen auf das wäßrige Fermentationsmedium. Sie kann je nach den für die Züchtung gewählten Bedingungen höher oder niedriger liegen.

Das Wachstum der Mikroorganismen erfolgt auf Kosten der Ausgangsfraktipn unter Zwischenbildung von Körpern mit Säurefunktion, hauptsächlich Fettsäuren, so daß der pH-Wert des wäßrigen mineralischen Mediums progressiv sinkt. Ohne Korrektur kommt das Wachstum ziemlich schnell zum Stillstand, und die Konzentration des Mikroorganismus im Medium bzw. die Zelldichte nimmt nicht mehr zu, so daß eine sogenannte stationäre Phase erreicht wird.

Das wäßrige Nährmedium wird daher vorzugsweise durch stufenweise oder kontinuierliche Zugabe eines wäßrigen Mediums von ! hohem pH-Wert beim gewünschten pH-Wert gehalten. Gewöhnlich j wird der pH-Wert des Nährmediums bei Verwendung von Pilzen j oder Hefen, insbesondere von Candida lipolytica, im Bereich j von J bis 6, vorzugsweise von 4 bis 5* gehalten. (Bakterien erfordern einen höheren pH-Wert von gewöhnlich 6,5 bis 8). j Geeignete alkalische Materialien für den Zusatz zum Nährme- : dium sind Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Diratriumhydrogen- ^;

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phosphat und Ammoniak in freier Form oder in wäßriger Lösung.

Die optimale Temperatur des Nährmediums ist verschieden je nach der Art des verwendeten Mikroorganismus und liegt gewöhnlich im Bereich von 25 bis 55°C. Bei Verwendung von Candida lipolytica wird ein Temperaturbereich von 28 bis 32°C bevorzugt.

Die Aufnahme von Sauerstoff ist für das Wachstum der Mikroorganismen wesentlich. Der Sauerstoff wird gewöhnlich als Luft zugeführt. Damit die Wachstumsgeschwindigkeit hoch bleibt, muß die für die Einführung von Sauerstoff verwendete Luft durch Rühren in feine Bläschen zerteilt werden. Die Luft kann durch eine Fritte eingeführt werden, jedoch kann auch das als "Wirbelbelüftung" bekannte System der intensiven Belüftung zur Anwendung kommen.

Es wurde gefunden, daß bei Verwendung von Hefe des Stammes Candida lipolytica beim Verfahren gemäß der Erfindung, wobei die Belüftung durch "Wirbelbelüftung" erfolgt, eine hohe Wachstumsgeschwindigkeit erreicht wird, wobei die Generationszeit im Bereich von 2 bis 5 Stunden liegt und die Zellkonzentration in 2 Tagen um einen Paktor bis zu 1000 gesteigert wird.

Bei Chargenbetrieb wachsen die Mikroorganismen gewöhnlich zunächst mit langsamer Zunahme der Zelldichte. (Diese Wachstumsperiode wird nachstehend als "Trägheitsphase" bezelehnet.) Danach steigt die Wachstumsgeschwindigkeit auf einen höheren Wert# Die Periode mit höherer Wachstumsgeschwindigkeit wird als "Exponentlalphase" bezeichnet. Anschließend wird die Zelldichte wieder konstant.'(."stationäre Phase"}·

Eine gewisse Menge des Mikroorganismus für den Beginn der nächsten Charge wird vorzugsweise vor Beendigung der Exponentialphase abgenommen. Die Züchtung oder Bebrtitung wird gewöhn«

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lieh vor der stationären Phase abgebrochen. In dieser Stufe wird der Mikroorganismus gewöhnlich von der Hauptmenge der nicht gebrauchten Einsatzfraktion abgetrennt.

Nach einer der möglichen Methoden zur Aufarbeitung des Produkts wird zuerst der größere Teil der geschlossenen wäßrigen Phase abgetrennt. Dies geschieht vorzugsweise durch Zentrifugieren oder Dekantieren. Die abgetrennte wäßrige Phase enthält gewöhnlich in höherer Konzentration Ionen von Stoffen, die keine Nährstoffe sind und im Kreislaufstrom toleriert werden können. Wenn dies der Pail ist, kann nur ein Teil der gewonnenen wäßrigen Phase im Kreislauf geführt werden. So ist es gewöhnlich möglich, etwa 9*6 Gew.-# der im Produkt vorhandenen wäßrigen Phase abzutrennen, wovon auf der gleichen prozentualen Basis etwa 20 Gew.-% verworfen werden. Dem Kreislaufstrom werden ergänzende Mengen der notwendigen Nährstoffe zugesetzt, worauf er in den Permenter zurückgeführt wird. Die ergänzenden Stoffe können dem Fermenter gegebenenfalls als getrennter Strom zugeführt werden.

Durch Zentrifugieren des aus dem Fermettter abgezogenen Produkts (vorzugsweise nach Dekantierung in der beschriebenen Weise) werden drei Fraktionen gewonnen, nämlich (in der Reihenfolge zunehmender Dichte):

1. Eine ölphase, die Zellen des Mikroorganismus enthält.

2. Eine wäßrige Phase, die Spuren von Öl und Mikroorganismus enthalt.

5. Bin« aus dem Mikroorganismus zusammen mit wäßriger PtUa* bestehende Mikroorganismus-^MCreme^H, an deren Zellen Öl haftet.

Die Fraktion (3) wird dann mit einem wäßrigen Nährmediu» ge* mischt« das die gleiche Qder eine andere Zusammensetzung wie das in der Wachstumsphase verwendete wäßrige Nährmedium haben

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kann, und wird in Mischung mit einem Gas gehalten, das freien Sauerstoff enthält, wodurch die Menge des Kohlenwasserstoffs, der den Mikroorganismus verunreinigt, verringert oder dieser Kohlenwasserstoff entfernt wird. Auch hier wird vorzugsweise der größere Teil der geschlossenen wäßrigen Phase unter Kreislauf führung eines Teils der zurückgewonnenen wäßrigen Phase abgetrennt, wie vorstehend beschrieben. Die Rückführung kann nach Wunsch entweder zur Kultivierungsstufe oder zur Reinigungsstufe erfolgen.

Durch Zentrifugieren des aus dem Fermenter abgezogenen Produkts, vorzugsweise nach Abtrennung des größeren Teils der wäßrigen Phase durch Dekantieren, werden

I. eine wäßrige Phase, die Spuren des Mikroorganismus enthält, und

II. eine Mikroorganismus-Creme

erhalten· In dieser Stufe wird der Wasseranteil in der Creme des Mikroorganismus verringert. Falls gewünscht, kann der Wasseranteil auf einen sehr niedrigen Wert verringert werden, Jedoch ist es normalerweise vorzuziehen, den Wasseranteil nur auf eine solche Höhe zu erniedrigen, daß die nächste Stufe (d.h. die Lösungsmittelextraktion) einwandfrei durchgeführt werden kann.

Die in der letzten Stufe erhaltene Creme oder Paste, die noch etwas Wasser enthält, wird dann der Lösungsmittelextraktion unterworfen, die kontinuierlich oder in Form von aufeinanderfolgenden Waschen mit dem Lösungsmittel und anschließende Phasentrennung vorgenommen werden kann. Die Extraktion wird zweckmäßig in einem feststehenden Behälter, der mit Paddelrührern versehen ist, die vorzugsweise mit weniger als 10 UpM rotieren, oder in einem Gefäß durchgeführt, das um eine horizontale Achse rotiert. Wenn die Lösungsmittelextraktion kon-

tinuierlich durchgeführt wird, wird der Extrakt kontinuierlich

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abgezogen und kontinuierlich oder chargenweise bei Normaldruck oder vermindertem Druck destilliert, während das Lösungsmittel kontinuierlich in den Extraktor zurückgeführt wird. Unter die-'sen Bedingungen kann die Hefe kontinuierlich oder chargenweise eingeführt und abgezogen werden.

Die Lösungsmittelextraktion wird vorzugsweise vorgenommen, während das Lösungsmittel dem Extraktor in periodisch schwankender Geschwindigkeit zugeführt wird, wodurch der Flüssigkeitsstrom stoßweise pulsiert. Die pulsierenden Stöße der durch den Peststoff strömenden Flüssigkeit bringen Schwingungen und begrenzte Verschiebungen jedes' Feststoffkorns relativ zu seinen Nachbarn hervor, und dies ist einer mechanischen Bewegung der Gesamtmasse gleichvrertig. Aus diesem Grund werden alle zu extrahierenden Produkte schneller und vollständiger extrahiert.

Zweckmäßig wird in der Zuführungsleitung des Flüssigkeitsstroms eine Vorrichtung angeordnet, die eine pulsierende Strömung erzeugt, wobei die Amplitude und die Frequenz experimentell in jedem besonderen Fall auf den günstigsten Wert eingestellt werden. Diese Stöße werden nach beliebigen bekannten Verfahren erzeugt. Vorzugsweise wird eine Kolbenpumpe verwendet, deren Ventile entfernt worden sind. Die Zahl der Stöße beträgt vorzugsweise 1 bis βθ/Min. Die Durchführung des Verfahrens unter der Einwirkung der Strömungsstöße ist ausführlicher in der britischen Patentanmeldung 223V63 beschrieben.

Geeignete Lösungsmittel für das Verfahren gemäß der Erfindung wurden bereits genannt. Gegebenenfalls kann eine erste Extraktionsstufe unter Verwendung eines polaren Lösungsmittels, z.B. eines alkoholischen Lösungsmittels, wie Äthanol oder Isopropanol, vorgenommen werden, und der teilweise gereinigte Mikroorganismus kann dann in einer zweiten Extraktionsstufe weiterbehandelt werden, in der ein Kohlenwasserstoff. z.B. n-Hexan

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oder eine leichte Platforming-Fraktion oder Benzol, als Lösungsmittel verwendet wird. In der zweiten Stufe wird vorzugsweise als Lösungsmittel ein Gemisch einer größeren Menge eines Kohlenwasserstoffs mit einer geringeren Menge eines polaren Lösungsmittels verwendet. Vorzugsweise wird das azeotrope Gemisch aus Hexan mit Isopropanol oder Äthanol gebraucht. Gegebenenfalls kann in beiden Extraktionsstufen kontinuierlich gearbeitet werden.

Es wird angenommen, daß bei Verwendung eines Gemisches aus Kohlenwasserstoff und polarem Lösungsmittel die Aufgabe oder eine der Aufgaben des polaren Lösungsmittels darin besteht, die Bindung des zu extrahierenden Materials (auch die Bindung von Kohlenwasserstoff^ die als solche in polaren Lösungsmitteln nicht löslich sind) zu schwächen.

Wenn eine einzige Wäsche in der ersten Stufe zur Anwendung kommt, sollte die verwendete Äthanol- oder Isopropanolmenge das 1,5- bis 3-fache des Wasservolumens betragen, das in der Creme oder Paste des Mikroorganismus vorhanden ist. Gegebenenfalls können jedoch auch zwei Wäschen mit Äthanol oder Isopropanol vorgenommen werden, wobei in der ersten Wäsche das Lösungsmittel das gleiche Volumen hat wie das Wasser in der Creme oder Paste und in der zweiten Wäsche eine kleinere Äthanol- oder Isopropanolmenge, z_oB. die Hälfte der in der ersten Wäsche verwendeten Menge gebraucht wird.

Zwischen den Wäschen jeder Stufe oder Unterstufe wird die Creme oder Paste entwässert, z.B. durch Filtration, und ein Teil des restlichen Lösungsmittels wird dann vorzugsweise durch Vakuumfiltration entfernt. In der zweiten Stufe entspricht die Lösungsmittelmenge, die in der (oder jeder) Wäsche verwendet wird, gewöhnlich dem 2- bis 20-fachen Volumen des erhaltenen trockenen Mikroorganismus.

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Durch Verwendung eines Gemisches aus Kohlenwasserstoff und polarem Lösungsmittel als Lösungsmittel in der zweiten Extraktionsstufe kann die Zusammensetzung des Lösungsmittels der zweiten Stufe, das in jedem Fall polares Lösungsmittel aus der ersten Extraktionsstufe aufnimmt^ stabilisiert werden. Eine Anreicherun-g an polarem Lösungsmittel kann im Laufe einer Destillationsstufe vermieden werden, in der das Lösungsmittel der zweiten Stufe durch Abnahme von getrennten Strömen zurückgewonnen wird, die aus a) polarem Lösungsmittel zur Rückführung zur ersten Extraktionsstufe und b) einem Gemisch von Kohlenwasserstoff und polarem Lösungsmittel zur Rückführung zur zweiten Stufen bestehen. Zweckmäßig wird der in der zweiten Extraktionsstufe erhaltene Extrakt in einer Destillationsstufe in a) ein Kopfprodukt, das aus einem Gemisch von Kohlenwasserstoff, polarem Lösungsmittel und Wasser besteht und in die zweite Extraktionsstufe zurückgeführt wird, und b) eine Bodenfraktion getrennt, die polares Lösungsmittel, Wasser und die extrahierten Materialien enthält. Diese Fraktion wird vorzugsweise mit dem in der ersten Extraktionsstufe erhaltenen Extrakt gemischt, bevor dieser in die Destillation eingeführt wird, wodurch alle durch Lösungsmittelextraktion zurückgewonnenen Verunreinigungen als Bodenprodukt in dieser Destillationsstufe anfallen. Zweckmäßig wird Äthanol oder Iso-..propanol als polares Lösungsmittel verwendet. Das Lösungsmittel der zweiten Stufe ist zweckmäßig ein azeotropes Gemisch.

Die letzte Stufe, die zur Entfernung des Lösungsmittels angewendet wird, ist vorzugsweise eine Verdampfung, die zweckmäßig unter vermindertem Druck und zweckmäßig in einem Inertgasstrom, z.B. Stickstoff oder überhitztem Dampf, durchgeführt wird.

Eine Hefe, die ganz oder teilweise von ihren Lipiden und den verunreinigenden Kohlenwasserstoffen nach einer der vorstehend beschriebenen Methoden befreit worden ist, stellt ein wertvolles industrielles Produkt für die menschliche Ernährung dar.

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Der Lipidextrakt, der durch Abdampfen des Lösungsmittels gewonnen worden ist, ist ebenfalls ein neues industrielles Produkt, das entweder als solches oder als Ausgangsmaterial für die Abtrennung seiner Sterole, Fettsäuren (entweder vor oder nach Verseifung) oder seiner anderen Bestandteile verwendet kann.

Die Hefe kann abschließend unter Bedingungen, die ihrer anschließenden Verwendung als Nahrungsmittel angepaßt sind, getrocknet werden. Das Verfahren kann kontinuierlich oder char- λ genweise durchgeführt werden. Wenn kontinuierlich gearbeitet wird, ist es gewöhnlich notwendig, getrennte Permenter oder getrennte Zonen im gleichen Fermenter für die Durchführung der Kultivierungs- und Reinigungsstufen vorzusehen.

Weitere Maßnahmen, die zur Erzielung eines gereinigten Mikroorganismus oder eines davon stammenden Produkts oder zur Verbesserung des Verfahrens hinsichtlich der Bildung der nicht aufgespaltenen Kohlenwasserstofffraktion ergriffen werden können, sind in den folgenden Patentschriften und Patentanmeldungen beschrieben. Die Anwendung aller dieser Maßnahmen ist im Rahmen des Verfahrens gemäß der Erfindung möglich.

•Bevorzugte Verfahren zur Züchtung der Mikroorganismen und zur Produktsabscheidung sind in den britischen Patentschriften 914.567, 914.568 und 1,017.584 sowie in den folgenden deutschen Patentanmeldungen beschrieben:

B 74.85I IVa/6a B 85.074 IVa/6a

B 78.776 IVa/6a B 85.075 IVa/6a

B 79.52I IVa/6b B 87.7I3 IVa/6a

B 85.070 IVa/6a B 89.462 IVd/23b

B 85.07I IVa/6a B 91.002 IVd/23b

B 85.072 IVd/23b B 9I.OO3 IVd/23b B 85.073 IVd/23b

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Beispiel 1

Candida lipolytica wurde.in einem 12 m -Fermenter kontinuierlich in einem Kulturmedium gezüchtet, das bei seiner Zuführung zum Fermenter, die in einer Menge von 2400 l/Std. erfolgte, die folgende Zusammensetzung hatte:

BÖ,

('NH₄J₂HPO₄ 2,0

KCl 1,15

MgSO₄·7Η₂0 0,65

MnSO₄*4HgO 0,06

FeSO₄.7H₂O " 0,124

ZnSO₄·7Η₂0 ' ' 0,306

Hefeextrakt ' 0,030

Leitungswasser zur Auffüllung auf 1000 ml

Als Kohlenwasserstoff wurde dem Fermenter ein schweres Irak-Gasöl zugeführt, das 12 % η-Paraffine enthielt und folgende Kennzahlen hattei

Siedeanfang	217 c
5 # übergegangen	284°C
50 % übergegangen	343°C
95 % übergegangen	377⁰C
'Siedeende	385°C

Das Gasöl wurde dem Fermenter in einer Menge von 120 g pro Liter Gasöl plus zugeführtem wäßrigem Medium zugeführt. Der pH-Wert im Fermenter wurde durch kontinuierliche Zugabe von wäßrigem Ammoniak bei 4 gehalten. Die Temperatur im Fermenter wurde bei 30⁰C gehalten. Luft wurde in einer Menge von 60 V/V/ Std. zugeführt.

Das Produkt der Fermentation wurde kontinuierlich abgezogen und dekantiert, wobei stündlich 800 1 Hefecreme (mit 25 g Hefe/ Liter) erhalten wurden. Die Creme wurde mit Frischwasser in ei-

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ner Menge von 1600 l/Std. verdünnt und pro Liter kräftig mit 0,5 g eines nicht ionogenen oberflächenaktiven Mittels (Produkt der Kondensation von Äthylenoxyd mit einem Gemisch von Laurinalkohol und Myristinalkohol mit einer Äthylenoxydkette von durchschnittlich 8,5 Einheiten/Molekül) gemischt. Das oberflächenaktive Mittel ist unter der Bezeichnung NI 29 im Handel. Das Gemisch wurde mit einer Zentrifuge (Sharpies DG 2 Autojector) zentrifugiert, wobei die folgenden drei Phasen erhalten wurden:

Hefecreme ^

restliches Gasöl ™

wäßrige Phase.

Die auf diese Weise erhaltene Hefecreme wurde mit Frischwasser gemischt_r dem, bezogen auf sein Volumen, 10 % des gleichen Kulturmediums, wie es im Fermenter verwendet wurde, zugesetzt worden war. Das Gemisch wurde kontinuierlich in ein Gefäß eingeführt, in dem die Verweilzeit J> Stunden betrug, während Luft in einer Menge von 10 V/V/Std. zugeführt wurde. Das Produkt dieser Stufe wurde in einer einfachen Zentrifuge (Alfa-Laval QX) zentrifugiert. Die auf diese Weise erhaltene Hefepaste wurde in einer Trommel bei einer Temperatur von 14O°C getrocknet. Die Hefe wurde mit η-Hexan extrahiert, wo- { bei das Lösungsmittel in einer Menge von 2 1 pro kg der in dem Hefeprodukt vorhandenen Hefe (gerechnet als Trockenhefe) verwendet wurde. Die Lösungsmittelextraktion wurde fünfmal wiederholt, wobei ein von Kohlenwasserstoffen im wesentlichen freies Hefeprodukt erhalten wurde.

Claims

1) Verfahren zur Kultivierung und Reinigung von Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß ein Kohlenwasserstoffe verbrauchender Mikroorganismus in Gegenwart eines mindestens zum Teil aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen bestehenden Kohlenwasserstoffausgangsmaterials, eines wäßrigen Nährmediums und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases kultiviert und dann zur Verringerung der Menge des den Mikroorganismus verunreinigenden Kohlenwasserstoffs in einer Reinigungsstufe in Gegenwart eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases in Abwesenheit einer weiteren Kohlenstoff quelle in einem wäßrigen Nährmedium gehalten wird, daß danach eine den Mikroorganismus enthaltende Fraktion einer Trennungsbehandlung unterworfen und daß dann die den Mikroorganismus enthaltende Fraktion einer Lösungsmittelextraktion unterworfen wird.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus ein paraffinicehe Kohlenwasserstoffe verbrauchender Mikroorganismus verwendet wird.

3) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus eine Hefe verwendet wird.

4) Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß als Hefe Candida lipolytica verwendet wird.

3' Verfahren na.cn Anspruch 3* dadurch gekennzeichnet, daß als Hefe Candida tropicalis verwendet wird.

6) Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch geken??^·?lehnet, daß die Trennungsbehandlung mindestens zum TsIl in Form einer Dekantierung durchgeführt wird.

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7) Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wasseranteil der den Mikroorganismus enthaltenden, aus der Trennungsbehandlung erhaltenen Fraktion durch Trocknen vor der Lösungsmittelextraktion verringert wird.

8) Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet* daß eine Mikroorganismen-Paste der Löstmgsmittelextraktion unterworfen wird.

9) Verfahren nach «Inem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein trockner Mikroorganismus der Lösungsmittelextraktion unterworfen wird.

10) Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösungsmittelextraktion mit Hilfe eines ein polares Lösungsmittel enthaltenden Lösungsmittels durchgeführt wird.

11) Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß als polares Lösungsmittel ein Alkohol verwendet wird.

12) Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß als % polares Lösungsmittel Isopropanol verwendet wird.

13) Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß eine azeotrope Mischung aus Kohlenwasserstoff und polarem Lösungsmittel verwendet wird.

Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis I3, dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlenwasserstoffausgangsmaterial eine Mischung aus geradkettigen und anderen Kohlenwasserstoffen eingesetzt und von dem Mikroorganismus eine Kohlenwasserstoff fraktion mit mindestens teilweise verringertem Anteil an geradkettigen Kohlenwasserstoffen abgetrennt wird.

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15) Mikroorganismenhaltiges Produkt, erhältlich nach Ansprüchen 1 bis 14.

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