DE1642602A1 - Verfahren zur Gewinnung von Mikroorganismen - Google Patents

Verfahren zur Gewinnung von Mikroorganismen

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DE1642602A1 DE19681642602 DE1642602A DE1642602A1 DE 1642602 A1 DE1642602 A1 DE 1642602A1 DE 19681642602 DE19681642602 DE 19681642602 DE 1642602 A DE1642602 A DE 1642602A DE 1642602 A1 DE1642602 A1 DE 1642602A1
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Bonavita Jean Baptiste
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    • C10G32/00—Refining of hydrocarbon oils by electric or magnetic means, by irradiation, or by using microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Description

PATENTANWÄLTE -\ 642602
DR.-ING. VON KREISLER DR.-ING. SCHONWALD DR.-1 NG. TH. MEYER DR. FUES
KÖLN 1, DEICHMANNHAUS
Köln, den 11o3«>1968 Ru/Ax/Hz
The British Petroleum Company Limited,
Britannic House, Moor Lane, London, E.C.2 (England)
Verfahren zur Gewinnung von Mikroorganismen
Die Erfindung betrifft die Gewinnung von Mikroorganismen nach einem Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Gemisch, das aus einem Mikroorganismus und einer wässrigen Phase besteht oder diese Bestandteile enthält, einer Behandlung unterwirft, durch die der pH-Wert der wässrigen Phase gesenkt wird, aus dem behandelten Gemisch durch eine Phasentrennung die wässrige Phase teilweise entfernt, das restliche Gemisch mit einem Verdünnungsmittel behandelt, das eine wasserlösliche sauerstoffhaltige organische Verbindung ist, deren spezifisches Gewicht unter 1 liegt, und hierdurch das spezifische Gewicht der wässrigen Phase senkt und anschließend das behandelte restliche Gemisch zentrifugiert und hierbei eine Fraktion gewinnt, die den Mikroorganismus in erhöhter Konzentration enthält.
Das Verfahren wird zweckmäßig zur Behandlung einer Brühe verwendet, die bei der aeroben Kultivierung eines Mikroorganismus auf einem Kohlenwasserstoffsubstrat erhalten wird. Die Brühe kann ein Material sein, das bei der Kultivierung eines Mikroorganismus auf einem Substrat anfällt, das vollständig assimilierbar ist, z.B. auf einem aus Uormalparaffinen bestehenden Substrat. Das Substrat kann auch ein Gemisch sein, das abbaubare Kohlenwasserstoffe und nicht abbaubare
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Kohlenwasserstoffe enthält, z.B. eine Erdölfraktion, beispielsweise Leuchtpetroleum (Kerosin) oder Gasöl. Die gewonnene Kulturbrühe kann also Spuren oder wesentliche Anteile an Kohlenwasserstoffen enthalten, die nicht abgebaut oder assimiliert worden sind.
Wenn das Verfahren gemäß der Erfindung zur Behandlung einer Brühe angewendet wird, hat dieses Material zu Beginn den PjT-Wert, der in der Stufe der Kultivierung des Mikroorganismus angewendet wird» In einer ersten Behandlungsstufe wird der Pjj-Wert der Brühe gesenkt, wie eingangs erwähnt· Vorzugsweise wird der pH-Wert des Gemisches, das aus dem Mikroorganismus und der wässrigen Phase besteht oder diese Bestandteile enthält, in der ersten Behändlungsstufe auf weniger als 4, gewöhnlich auf etwa 2,5 gesenkte
Die ρττ-Einstellung wird zweckmäßig durch Zusatz einer konzentrierten Mineralsäure oder einer wässrigen Lösung einer Mineralsäure, z.B. Phosphorsäure, Schwefelsäure oder Salzsäure 9 vorgenommen. Durch die Korrektur des Pg-Wertes wird eine Koagulierung des Mikroorganismus verursacht, und die anschließende Phasentrennung läßt sich wirksamer durchführen, als dies ohne ρττ-Korrektur der Fall wäre.
Die der Phasentrennung dienende Behandlung des Gemisches nach der PjT-Werteinstellung wird vorzugsweise durch Dekantieren vorgenommen. Wenn das behandelte Material eine Fermentationsbrühe ist, werden vorzugsweise 50 bis 90 Gewe-# des wässrigen Materials als untere Phase entfernt. Das verbleibende Material, das frei von Kohlenwasserstoffen sein, eine Spur von Kohlenwasserstoffen oder einen wesentlichen Anteil an Kohlenwasserstoff enthalten kann, wird mit dem Verdünnungsmittel behandelt.
Als Verdünnungsmittel wird vorzugsweise ein Alkohol, z.B. Äthanol, n-Propanol, Isopropanol oder n-Butanol, 2-Butanol, oder ein Keton, z.B. Aceton, verwendet. Das spezifische Gewicht des Verdünnungsmittels liegt unter 1, vorzugsweise im
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Bereich, von 0,770 bis 0,800. Das Verdünnungsmittel wird dem zu behandelnden Gemisch im Gewichtsverhältnis von 0,5:1 bis 2:1 zugesetzt. Das mit dem Verdünnungsmittel behandelte Gemisch wird zentrifugiert, vorzugsweise bei 8000 bis 10000 g«,
Unter den hier gebrauchten. Ausdruck "Mikroorganismus" fallen auch Gemische von Mikroorganismen. Als Mikroorganismen, die auf die hier beschriebene Weise kultiviert werden, kommen Hefen, Pilze oder Bakterien in Frage.
Die in dieser Beschreibung genannten Bakterien sind nach dem System eingestuft, das in "ÜJergey's Manual of Determinative Bacteriology" von ReS. Breed, E.G.Do Murray und HOE«Smith (1957)» 7ο Auflage, herausgegeben von Williams and Wilkins (Baltimore, USA), besehrieben ist. Die Hefen sind nach "The Yeasts - a Taxonomic Study" von Lodder und Kreger-van Ri;j, herausgegeben von North Holland-Publishing Company (Amsterdam 1952), eingestuft.
Bei Verwendung einer Hefe gehört diese vorzugsweise zur Familie Cryptococcaceae, insbesondere zur Unterfamilie Cryptococeoideae. Gegebenenfalls können auch beispielsweise ascosporogene Hefen der Unterfamilie Saccharomycoideae verwendet werden. Bevorzugte Gattungen der Unterfamilie Cryptococcoideae sind Torulopsis (auch als Torula bekannt), Candida und Myeoderma. Bevorzugte Hefespasies sind nachstehend aufgeführt. Besonders bevorzugt ist die Verwendung der Stämme, deren Hinterlegungsnummern angegeben sindo Die mit "CBS" gekennzeichneten Stämme sind beim Centraal Bureau vor Sehimmelculture, Baarn, Holland, un€ die mit INHA gekennzeichneten Stämme beim Institut National de la Recherche Agronomique, Paris, Frankreich, hinterlegte
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Candida lipolytica Candida pulcherrima Candida utilis Candida utilis, Variati major Candida tropicalis Candida arborea Torulopsis colliculosa Hansenula anomala Oidium lactis Neurospora sitophila Mycoderma cancoillote
Bevorzugter Stamm CBS 599 CBS 610 CBS 890 CBS 841 CBS 2317
CBS 133 CBS 110
INEA: STV
Von den vorstehend genannten Hefestämmen wird Candida lipolytica besonders bevorzugt.
Gegebenenfalls können Pilze als Mikroorganismen verwendet werden. Ein geeigneter Stamm ist Penicillium expansum.
Wie bereits erwähnt, kommen auch Bakterien als Mikroorganismen in frage. Diese Bakterien gehören zweckmäßig zu den Ordnungen Pseudomonadales, Bubacteriales und Actinomycetales. Die verwendeten Bakterien gehören vorzugsweise zu den Familien Corynebacteriaceae, Micrococcaceae, Achromobacteraceae, Actinomycetaceae, Rhizobiaceae, Bacillaceae und Pseudomonadaceae. Bevorzugte Spezies sind Bacillus megaterium, Bacillus subtilis und Pseudomonas aeruginosa. Weitere geeignete Stämme sind:
Mycobacterium Rhodochrous Bacillus amylobacter Pseudomonas natriegens Arthrobacter sp. Micrococeus sp. Corynebacterium sp. Pseudomonas syringae
Xanthomons begoniae Plavobacterium devorans Acetobacter spe
Actinomyces sp.
Nocardia opaca
Hocardia erythropolis.
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Das Verfahren gemäß der Erfindung ist von besonderem Wert, wenn es zur Gewinnung von kleinen Mikroorganismen, z.B. solchen, deren Hauptdimension kleiner ist als 3 Ai, vorzugsweise kleiner als 2/U, angewendet wird»
Im allgemeinen ist es nicht notwendig, eine Wasserwäsche an irgendeiner Stelle in der Behandlungsfolge bis zur oben genannten Zentrifugierung vorzunehmeno
Ϊ erpie ichs— olgeriaen/Versuche und Beispiele
erläutert. Die Versuche wurden nicht nach der erfindungsgemäßen Arbeitsweise durchgeführt und werden lediglich zum Vergleich beschriebene
Beispiel 1
Ein wässriges mineralisches Medium der nachstehend genannten Zusammensetzung wurde in einer Menge von 2,8 1 in einen mit Rührer versehenen 3 l-Permenter gegeben:
KH2PO4
Na2HPO4 3
Harnstoff 2
MnS04o7H20 0,02
Na2SO4 0,1
CaOl2 0,01
MgSO4.7H2O 0,21
PeSO4^H2O 0,005
Hefeextrakt 0,05
In den Fermenter wurden als Impfmaterial 1,5 g Nocardia erythropolie in 200 ml des wässrigen Nahrmediums der vorstehenden Zusammensetzung gegeben. Als Kohlenstoffquelle diente ein Gasöl mit folgenden Kennzahlen:
Spezifisches Gewicht bei 15,60C 0,865
Trübungepunkt ν18°C
Stookpunkt +160C
Schwefel 0,90 Gew.-£
Normalparaffin· 15 Gew.-36.
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Die Kultivierung wurde chargenweise 161 Stunden unter folgenden Bedingungen durchgeführt;
Bührgeschwindigkeit 1500 TJpM
Belüftung 50 V/V/Stunde
PH-Wert - 7 Temperatur 300Co
Die Pg-Werteinsteilung erfolgte durch. Zusatz von wässrigem 0,2 n-Ammoniako
Das Mikroorganismusprodukt wurde wie folgt gewonnen: Die aus dem Fermenter erhaltene Brühe wurde bei 250C unter Zusatz von 5 η-Schwefelsäure kräftig gerührt, bis der p^-Wert auf 2,5 gefallen war. Hierbei fand eine Trennung in zwei Flüssigphasen statt, von denen die obere ein Volumen von 400 ml hatte und den Mikroorganismus und restlichen Kohlenwasserstoff enthielt. Diese obere Phase wurde durch Dekantieren abgetrennt, mit 400 ml Äthanol gerührt und bei 10000 g zentrifugiert.
Eine aus der Zentrifuge gewonnene Paste, die den Mikroorganismus enthielt, wurde mit dem vierfachen Volumen Äthanol verdünnt und erneut bei 10000 g zentrifugiert. Das Produkt wurde getrocknet. Hierbei wurden 53 g trockener Mikroorganismus, der frei von Kohlenwasserstoffen und Äthanol war, erhalten.
Versuch 1
Der in Beispiel 1 beschriebene Versuch wurde bis zu der Phase wiederholt, bei der gemäß Beispiel 1 Äthanol zugesetzt wurde. Im vorliegenden Fall wurde die Zentrifugierung bei 10000 g ohne Zusatz von Äthanol vorgenommen. Eine Phasentrennung fand nicht statt.
Beispiel 2
In einen mit Rührer versehenen 20 l-lermenter wurden 16 1 des in Beispiel 1 beschriebenen wässrigen mineralischen Mediums gegeben. Dann wurden in den Fermenter als Impfmaterial 6 g Nocardia erythropolis in 800 ml des oben beschriebenen
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wässrigen Nährmediums eingeführt. Als Kohlenstoffquelle wurde ein Gasöl mit folgenden Kennzahlen verwendet: Spezifisches Gewicht bei 15t6°C 0,865
Trübungspunkt ' +180C
Stockpunkt +160O
Schwefel 0,90 Gewo-#
Normalparaffine 15 Gew.-$.
Die Kultivierung wurde chargenweise 60 Stunden unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
Etihrge s chwind igke it - 1500 IJpM
Belüftung 50 V/V/Stunde
PH-Wert - ψ
Temperatur 280O·
Die powert einst ellung wurde durch Zusatz von wässrigem 0,2 n-Ammoniak vorgenommen,,
Das Mikroorganismusprodukt wurde wie folgt gewonnen: Die aus dem Fermenter erhaltene Brühe wurde "bei 300C unter Zusatz von konzentrierter Schwefelsäure kräftig gsührt, bis der powert auf 2,5 gefallen waro Hierbei fand eine Trennung in zwei Flüssigphasen statt, von denen die obere ein Volumen von 4 1 hatte und den Mikroorganismus und restlichen Kohlenwasserstoff enthielte Die obere Phase wurde durch Dekantieren abgetrennt, mit 4 1 Äthanol verrührt und bei 10000 g zentrifugiert O
Eine aus der Zentrifuge erhaltene Paste, die den Mikroorganismus enthielt, wurde mit dem vierfachen Volumen Äthanol verdünnt und erneut bei 10000 g zentrifugiert. Das Produkt wurde getrocknet. Hierbei wurden 150 g trockener Mikroorganismus erhalten, der frei von Kohlenwasserstoff und Äthanol war«
Versuch 2
Der in Beispiel 2 beschriebene Versuch wurde bis zu dem Punkt wiederholt, bei dem gemäß Beispiel 2 Äthanol zugesetzt wurde. Im vorliegenden Fall wurde die Zentrifugierung bei 10000 g
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ohne Äthanolzusatz vorgenommen. Eine Phasentrennung fand nicht statt.
Beispiel 3
In einen mit Rührer versehenen 3 1 - Fermenter wurden 2,8 eines wässrigen mineralischen Mediums der folgenden Zusammensetzung gegeben:
Gramm/Liter (NH4)2 SO4 5 ■
KH2 PO4 2,38
K2H PO4 5,65
MgSO4ο7H2O
CuBO4.5H2O 0,0064
FeSO4.7H2O 0,0011
MnCl2.4H2O 0,0079
ZnSO4O7H2O 0,0015
CaCl2 0,0025
In den Fermenter wurden als Impfmaterial 1,2 g eines von einer Bodenprobe isolierten Bakteriengemisches in 200 ml eines wässrigen Nährmediums der oben genannten Zusammensetzung gegeben. Als Kohlenstoffquelle diente ein n-Paraffingemisch, das aus einer Erdöl-Kerosinfraktion durch Extraktion mit einem Molekularsieb erhalten worden war und folgende Zusammensetzung hatte:
Kormalparaffine:
C-Zahl 9 10 11 12 13 14 15 --# Spur 5,0 29,9 34,7 27 3,3 Spur
Die Kultivierung wurde chargenweise 40 Stunden unter folgen den Bedingungen durchgeführt»
Rührgeschwindigkeit 1500 UpM
Belüftung 50 V/V/Stunde
PH-Wert 7,2
Temperatur 280C
Die pjj-Werteinstellung wurde durch Zusatz von wässrigem 0,2 η-Ammoniak vorgenommen.
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Das Mikroorganismusprodukt wurde wie folgt gewonnen: Die aus dem IFermenter in fünf aufeinanderfolgenden Chargen erhaltene Brühe wurde gemischt und bei 250O unter Zusatz von 5 n-Schwefölsäure kräftig gerührt, "bis der p^-Wert auf 2,5 gefallen war« Hierbei fand eine Trennung in zwei Phasen statt, von denen die obere ein Volumen von 1800 ml hatte und den Mikroorganismus und restlichen Kohlenwasserstoff enthielt, Diese obere Phase wurde durch Dekantieren abgetrennt, mit 1800 ml Äthanol verrührt und bei 10000 g zentrifugiert.
Eine aus der Zentrifuge erhaltene Paste, die den Mikroorganismus enthielt, wurde mit dem vierfachen Volumen Äthanol verdünnt und erneut bei 10000 g zentrifugiert. Das Produkt wurde getrocknet. Hierbei wurden 90 g trockener Mikroorganismus erhalten, der frei von Kohlenwasserstoff und Äthanol
Versuch 3
Der in Beispiel 1 beschriebene Versuch wurde bis zu dem Punkt wiederholt, bei dem gemäß Beispiel 1 Äthanol augesetzt wurde0 Im vorliegenden Pail wurde die Zentrifugierung bei 10000 g ohne Zusatz von Äthanol vorgenommen. Eine Phasentrennung fand nicht statt.
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Claims (1)

1642bO2
m IQ -
Patentansprüche
1.) Verfahren zur Gewinnung von Mikroorganismen aus einer wässrigen Mischung, dadurch gekennzeichnet, dass man den p„-Wert der Mikroorganismen und eine wässrige Phase enthaltenden oder aus diesen bestehenden Mischung s&ritä; die so behandelte Mischung einer Phasentrennung unterwirft und dabei einen Teil der wässrigen Phase abtrennt, dann die verbleibende Mischung mit einem wasserlöslichen, sauerstoffhaltigen organischen Verdünnungsmittel mit einem unter 1 liegenden spezifischen Gewicht versetzt, wobei das spezifische Gewicht der wässrigen Phase verringert wird, und anschliessend die Mischung unter Gewinnung einer Fraktion mit einem erhöhten Gehalt an Mikroorganismen zentrifugiert.
2.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Mischung, die den Mikroorganismus und die wässrige Phase enthält oder aus diesem besteht und deren pH-Wert vermindert wird, ein durch aerobe Kultivierung eines Mikroorganismus auf einem Kohlenwasserstoffsubstrat gewonnenes Produkt verwendet wird·
3.) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Kohlenwasserstoffsubstrat für die Kultivierung eine Petroleumfraktion verwendet wird,
4.) Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Kohlenwasserstoffsubstrat ein Gasöl verwendet wird.
5.) Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus ein n-Paraffine verbrauchender Mikroorganismus verwendet wird.
109820/0011 BADOR1GINAl
6.) Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus eine Hefe ist.
7») Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine Hefe der Familie Cryptococcaceae verwendet wird.
8.) Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine Hefe der Unterfamilie Gryptococcoideae verwendet wird.
9.) Vorfahren nach Anspruch^1 dadurch gekennzeichnet, dass eine Hefe der Gattung Torulopsis verwendet wird.
lo.) Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass eine Hefe der Gattung Candida verwendet wird.
11.) Verfahren nach Anspruch lo, dadurch gekennzeichnet, dass als Hefe Candida lipolytica verwendet wird.
22.) Verfahren nach Anspruch lo, dadurch gekennzeichnet, dass als Hefe Candida tropicalis verwendet wird*
13.) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5* dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus® ein Bakterlum verwendet wird,
I1!*) Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass ein zu Norcardla gehörender Mikroorganismus verwendet wird.
15.) Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus ein Stamm von Norcardia erythropolis verwendet wird.
109820/0011 BADORiGiNAL
16.) Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der p„-Wert der wässrigen Phase unter pH = 4 gesenkt wird.
17.) Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Ρττ-Wert der wässrigen Phase durch Zugabe einer Mineralsäure gesenkt wird.
18.) Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Phasentrennung der die wässrige Phase mit vermindertem pH-Wert enthaltenden Mischung durch «Dekantieren durchgeführt wird.
19«) Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Verdünnungsmittel ein Alkohol verwendet wird.
2o.) Verfahren nach Anspruch I9, dadurch gekennzeichnet, dass als Alkohol Äthanol, Propanol, Isopropanol oder ein Butanol verwendet wird.
I?
21.) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass als Verdünnungsmittel ein Keton verwendet wird.
109820/0011
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