DE2317841A1

DE2317841A1 - Verfahren zur umwandlung von in kohlenwasserstoffgemischen enthaltenen geradkettigen kohlenwasserstoffen in proteinmaterialien bzw. zu ihrer entfernung aus den gemischen

Info

Publication number: DE2317841A1
Application number: DE19732317841
Authority: DE
Inventors: Du Chaffaut Jean Amaudric; Claude Raymond Magnoux
Original assignee: BP PLC
Current assignee: BP PLC
Priority date: 1972-04-12
Filing date: 1973-04-10
Publication date: 1973-10-25
Also published as: NL7304977A; FR2180013A1; FR2180013B1; JPS497484A; SU484696A3; IT983026B; GB1421155A; BE798150A

Description

PATENTANWÄLTE 2 3 | 7 Q 4 1

G Vörc KRHSLE2 DR.-ING. SCHÖNWALD DR.-ING. TH. MEYER DR.FUES DIPL-CHEM. ALEK VON KREISLER DIPL.-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLDPSCH DIPL-ING. SELTlNG

5 KÖLN 1, DEICHMANNHAUS

Köln, den 9- April I973 Kl/Ax

The British Petroleum Company Limited., Britannic House, Moor Lane, London EC2Y 9BU (England).

Y2rfä!}r5i}_5yE_yn]wandlung_von_in_Kohlenwasserstoffg:emi sehen entha.ltenen_geradkettigen_Kohlenwasserstoffen in Protein- -

aus den Gemischen

Die Erfindung "betrifft Verbesserungen von Fermentationsverfahren zur Umwandlung von in Kohlenwasserstoffemischen enthaltenen geradkettigen Kohlenwasserstoffen in Proteinmaterialien ο Die Erfindung ist insbesondere auf ein Fermentationsverfahren der vorstehend genannten Art unter Verwendung eines neuen Mikroorganismusstammes gerichtet«

Gegenstand der Erfindung ist ein kontinuierliches nicht-aseptisches Verfahren zur Herstellung von einzelligem Protein durch Züchtung des neuen Mikroorganismus in Gegenwart eines als Kohlenstoffquelle dienenden Kohlenwasserstoffgemisches, das geradkettige Kohlenwasserstoffe enthält. Das.Verfahren kann gegebenenfalls "zur Reinigung von Kohlenwasserstoffgemischen durch selektive Entfernung von geradkettigen Kohlenwasserstoffen aus diesen Gemischen angewandt werden.

In den letzten Jahren wurde für die Herstellung von einzelligem Protein eine Anzahl von Verfahren vorgeschlagen, bei denen eine Kohlenwasserstoffe verwertende Hefe auf einem Kohlenwasserstoffsubstrat in Gegenwart eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases gezüchtet

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wird» Diese Verfahren können chargenweise oder kontinuierlich durchgeführt werden. Zahlreiche Stämme von Kohlenwasserstoffe verwertenden Mikroorganismen wurden als geeignet für die Verwendung bei diesen Verfahren genannt.

Der nunmehr verfügbare neue Mikroorganismus ist ein Kohlenwasserstoffe verwertender Stamm der Hefe Candida tropicalis. Dieser Mikroorganismus ist beim Centraal Bureau voor Schimmelcultures, DeIft, Holland, hinterlegt worden, wo ihm die CB.S₀-Nummer 6373 zugeordnet wurde. Der neue Mikroorganismus eignet sich besonders für nichtaseptische kontinuierliche technische Verfahren zur Großherstellung von Protein unter Verwendung eines geradkettige Kohlenwasserstoffe enthaltenden Kohlenwasserstoffgemisches als Kohlenstoffquelle. Der neue Mikroorganismus bleibt der dominierende Mikroorganismus bei nicht- aseptischem kontinuierlichem Betrieb über lange Zeiträume. Ferner ist er auf Grund seiner guten Wachstumsgeschwindigkeit und seines hohen Ausbeutefaktors für die technische Großherstellung geeignet.

Die Erfindung umfaßt demgemäß die Umwandlung von in Kohlenwasserstoffgemischen enthaltenen geradkettigen Kohlenwasserstoffen in Proteinmaterialien nach einem Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den neuen Mikroorganismus Candida tropicalis, Stamm CBS Nr. 6373* in einem Kulturmedium, das ein wässriges Nährmedium enthält, in Gegenwart eines geradkettige Kohlenwasserstoffe mit wenigstens 10 C-Atomen im Molekül enthaltenden Kohlenwasserstoffgemisches und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases züchtet.

Gemäß einem weiteren Merkmal ist die Erfindung auf die Reinigung von Kohlenwasserstoffgcmischen durch Entfernung der geradkettigen Kohlenwasserstoffe aus den Gemischen nach einem Verfahren gerichtet, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Candida tropicalis Stamm CBS Nr.6373 in

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einem Kulturmedium, das ein wässriges Nährmedium enthält, in Gegenwart eines geradkettige Kohlenwasserstoffe mit wenigstens 10 C-Atomen im Molekül enthaltenden Kohlenwasserstoffgemisches und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases züchtet, das Kulturmedium gewinnt und anschließend vom gewonnenen Kulturmedium eine Kohlenwasserstoff fraktion abtrennt, aus der die geradkettigen Kohlenwasserstoffe entfernt worden sind.

Pur den großtechnischen Betrieb ist die kontinuierliche und vorzugsweise nicht-aseptische Durchführung des Verfahrens am zweckmäßigsten.

Als Kohlenwasserstoffgemische eignen sich Erdölfraktionen, die geradkettige Kohlenwasserstoffe enthalten. Insbesondere wird Gasöl als Kohlenwasserstoff bevorzugt. Typische Gasöle enthalten etwa 10 bis 25$ geradkettige Kohlenwasserstoffe in Mischung mit etwa 35 bis 50$ verzweigten Kohlenwasserstoffen und etwa A0$ aromatischen Verbindungen. Die Kettenlänge der geradkettigen Kohlenwasserstoffe in Gasölen liegt gewöhnlich im Bereich von C.q bis C,q. Das Verfahren eignet sich besonders gut für die Herstellung eines Proteinmaterials in Form von Hefe einerseits und von entwachstem und entparaffiniertem Gasöl andererseits. ;

Das Verfahren kann unter Anwendung beliebiger bekannter Kultivierungstechniken durchgeführt werden. Ein grund- ^: legendes Verfahren wird beispielsweise in der britischen Patentschrift 1 017 584 der Anmelderin beschrieben. Die ' Arbeitstemperatur kann im Bereich von 25° bis 37°C liegen. Bevorzugt wird eine Temperatur im Bereich von etwa 28 bis 35⁰C. Der p_H~Wert während der Kultivierung kann im Bereich von 3 bis 6 liegen und liegt vorzugsweise im · i Bereich von 4,0 bis 5,5. Am zweckmäßigsten wird das Ver- ,

fahren in zwei Stufen auf die in der britischen Patent- ; schrift 1 241 957 der Anmelderin beschriebene Weise durchgeführt, wobei Kulturmedium aus einer ersten Kulti-

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vierungsstufe mit Wasser verdünnt und anschließend einer zweiten Kultivierungsstufe zugeführt wird« Der p^-Wert des Kulturmediums in der ersten Kultivierungsstufe kann im Bereich von 4 "bis 5 liegen, und der p^-Wert des Kulturmediums in der zweiten Kultivierungsstufe "beträgt vorzugsweise etwa 5,5.

Das Verfahren kann besonders vorteilhaft in einem Fermenter mit Luftförderung (air lift) durchgeführt werden. Bei Anwendung des Zweistufenverfahrens werden zwei solcher Behälter in Serie betrieben.

Der neue Mikroorganismus hat die typischen Merkmale von Candida tropicalis, die von Lodder in "The yeasts, a taxonomic study", 2.Auflage 1970, Seite 991-993, "beschrieben werden, läßt sich jedoch von der Typspezies durch die nachstehend genannten Merkmale unterscheiden,,

1) Morphologie auf festem Medium

Der neue Mikroorganismus Candida tropicalis CBS-Nr.6373 wurde 2 Tage bei einer Temperatur von 3O⁰C auf einem Medium auf Glucosebasis der folgenden Zusammensetzung gezüchtet: Hefeextrakt 2 g/l, Glucose 10 g/l, Pepton 5 g/l, Agar 20 g/l, entsalztes V/asser 1000 ml.

Zum Vergleich wurden zwei bekannte Stämme von Candida tropicalis, nämlich CBS-Nr. 6320 und 644 unter den gleichen Bedingungen gezüchtet. Die erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 1 genannt.

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Tabelle 1

Mikroorganismus
Candida tropicalis

Aussehen des Oberflächenwachstums

Neuer Mikroorganismus Stamm CBS 6373

Stamm CBS 644

Stamm CBS 6320

glatt und dünn; weißlich cremefarben

matt, sehr faltig, fein gewellt, dick, gelb-cremefarben

rauher als CBS 644, gewellt, dick, gelb-cremefarben

Bei Züchtung des neuen Mikroorganismus in Petrischalen auf Sabourand-Agar wurde kein Pseudomycel beobachtet. Mehr als 80$ der Kolonien waren glatt oder leiöht faltig. Weniger als 205b waren faltig.

2) Morphologie in flüssigem Medium

Der neue Mikroorganismus wurde in Monod-Röhrchen in einem flüssigen Medium auf Glucosebasis (Medium 1) der folgenden Zusammensetzung gezüchtet: Glucose 10 g/l, Difco Bacto Pepton 5 g/l, Difco-Hefeextrakt 2 g/l, entsalztes Wasser 1000 .g. Zum Vergleich wurden die Stämme CBS 644 und 6320 unter den gleichen Bedingungen gezüchtet. Die Zellen der drei Stämme waren kurz-oval bis oval und gelegentlich nahezu kugelförmig. Die beobachtete Verteilung der Zellgrößen ist nachstehend in Tabelle 2 genannt.

Tabelle 2

Mikroorganismus	Zellgröße	5	(u) und	-Verteilung	10	(56)
Candida tropicalis	5 χ 5 Ju		'x 10 a	> 5xl0/u		χ 10 a
Neuer Mikroorganis
mus
Stamm CBS 6373	Null		22	12		66 '
Stamm CBS 644	4		24	24		48
Stamm CBS 6320	2	18	80	O I

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Die drei Mikroorganismen wurden- unter den gleichen Bedingungen, wie vorstehend beschrieben, gezüchtet mit der Ausnahme, daß ein flüssiges Medium auf Gasölbasis (Medium 11) der folgenden Zusammensetzung verwendet wurde: Gasöl 100 g/l, Phosphorsäure 1,84 g, Kaliumchlorid 1,16 g, Magnesiumhydroxyd 0,078 g, Mangansulfat (MnSO^.H₂O) 0,024 g, Bisen(ll)sulfatheptahydrat 0,080 g, Kupfer(Il)-sulfatpentahydrat 0,004 g, Zinksulfatheptahydrat 0,158 g, Schwefelsäure 1,8 g, Fould-Springer-Hefeextrakt 0,15 g, Leitungswasser 1000 ml. Die Zellen der Stämme hatten die in Tabelle 3 genannte Morphologie und Verteilung der Zellgrößen.

Tabelle 3 :

Mikroorga	Morpholo	Zellgröße	5x10	(u)und -	>5x10	verteilung (fi)
nismus	gie
Candida				L
tropicalis		^5x5/i
!Teuer Ki kr ο-	kurz-oval		54		0
Organismus	bis oval,
Stamm CBS	gelegent
6373	lich fast kugelför	38	84		0
	mig
Stamm			36		52
CBS 6320	oval .	8
Stamm
CBS 644	Pseudo-	10
	mycei
	förmige
	Zellen

10x10 u



8
-

8

2

Die Morphologie der Zellen blieb unverändert, wenn sie mehr als 15 Tage in belüfteten Kolben unter Rühren kultiviert wurden. Insbesondere hatte der Stamm CBS 644 nach dieser Zeit mehr als 529& Pseudomycel.

Die Vermehrung des neuen Mikroorganismus erfolgt nur durch Knospen. Eine Knospe pro Zelle.

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3) Biochemische Versuche ^ ·

a) Fermentation :

Glucose +; Galactose +; Saccharose +; Maltose +;

Melizitose +; Trehalose +; Lactose -; Melibiose -; '.

Raffinose -; Cellobiose -; Inulin -„

"b) Assimilation ;

Glucose +; Galactose +; Saccharose +; Maltose +j

Melizitose +; Trehalose +; Xylose +j Stärke +; ; α-Methylglycosid +; Sorbose +; L-Arabinose +;

Äthanol +; D-Mamitol +; Ribitol +; Acetat +; Succi-

nat +; Lactat +; Citrat +; Pyruvat +> Lactose -; ;

Melibiose -; Raffinose -; Cellobiose -j Inulin -; ^;

D-Ribose -; Rhamnose -; D-Arabinose -; Salicin -; ;

Galactit -; Erythrit -. j

c) Assimilation von Nitrat usw.
Kaliumnitrat -; Gelatine -; Harnstoff +.

d) Assimilation von Paraffinen
n-Hexadecan +; η-Paraffine aus Gasöl +.

e) Vitaminbedarf

Wachstum auf dem Medium ohne Vitamine +; Thiamin
stimuliert das Wachstum bei einer Konzentration von

4 mg/1.

f) Einfluß der Temperatur

Maximale Wachstumstemperatur 40 C
Optimale Wachstumstemperatur 32°C
Lagertemperatur __ 15 bis 25 C

g) Maximale Wachstumsrate auf Gasöl 0,35

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter
erläutert.

Beispiel 1 Chargenbetrieb

Der neue Mikroorganismus CBS Nr.6373 wurde in einem zylindrischen Fermenter mit einem Arbeitsvolumen von 1 1

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gezüchtet. Das Gefäß wurde mit einem röhrenförmigen Verteiler belüftet und mit einem Propellerrührer "bewegt. Das Medium hatte die folgende Zusammensetzung:

H₃PO₄. 1,84 g/l

KCl 1,16 "

Mg(OH)₂ 0,078 »

MnSO₄-H₂O 0,024 "

PeSO₄.7H₂O 0,080 "

ZnSO₄.7H₂O 0,158 "

-SH₂O 0,0004 g/l

Hefeextrakt 0,015 "

Leitungswasser 1000 ml

Der PjT-Wert betrug 4,5. Die einzige Kohlenstoff quelle war ein Gasöl mit folgenden Kennzahlen: Herkunft Irak-* Rohöl; spezifisches Gewicht 0,865, Fließpunkt +10, n-Paraffingehalt 18 Gew»-^, Pro Liter Medium wurden 115 ml Gasöl zugesetzt. Die Fermentation wurde begonnen, indem pro Liter 1 g einer auf Gasöl (100 g + Medium 21) gezüchteten Kultur des neuen Mikroorganismus zugesetzt wurde.

Dem Kulturmedium wurde Luft in einer Menge von 400 V/V/Std, zugeführt. Die Temperatur wurde bei 52⁰C und der ρττ-Υ/ert durch Zusatz von Ammoniumhydroxyd, das gleichzeitig als Stickstoffquelle diente, bei 4,5 gehalten.

Die Fermentation wurde nach 15 Stunden abgebrochene Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 genannt. Zum Vergleich wurden die Stämme Candida tropi'calis CES 6320 und CBS unter den gleichen Bedingungen gezüchtet. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 4 genannt.

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Mikroorganismus
Candida
tropicalis

Trägheitsphase, Std.

Tabelle 4

Exponential- Wachsphase, Stdο tumsrate
(u max)

(Std."¹)

Biomasse nach 15 Std. (g Trockengewicht/l)

Neuer Mikroorganismus
Stamm CBS
6373 Null

CBS 6320
CBS 644

1-1,5 13

0
0

0,3

0
O

10,0

'4,7 2,6

Die Ergebnisse zeigen, daß der neue Mikroorganismus den bekannten Stämmen, die bei der Erzeugung von Mikroorganismusmassen unter Verwendung eines G-asöls als Kohlenstoffquelle erprobt wurden, überlegen ist. Die überlegene Wachstumsrate des neuen Mikroorganismus ist ein Merkmal, das zu seiner überlegenen Leistung bei der kontinuierlichen Fermentation beiträgt.

Beiapiel 2

Kontinuierlicher nicht-aseptischer Betrieb Einstufige Kultivierung

Der neue Mikroorganismus CBS Nr.6373 wurde kontinuierlich in einem Fermenter gezüchtet, der in der gleichen Weise ausgebildet war, wie vorstehend für die Chargenkultur beschrieben. Das Medium, die Belüftung, die Temperatur und das Rühren waren mit den vorstehend beschriebenen Bedingungen identisch. Der Permenter wurde aseptisch betrieben. Die Verdünnungsrate betrug 0,2« Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 genannt. Zum Vergleich wurden Candida tropicalis, Stämme CBS 6320 und 644, unter den gleichen Bedingungen gezüchtet. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 5 genannt»

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Tabelle

Mikroorganismus
Candida
tropicalis

Anlaufzeit in
Stunden
(d.h.
Zeit bi3
zum Erreichen
praktisch
gleicher
Biomasse)

Gesamte Biomasse am Ende der Anlauf zeit (Trokkengew. in g)

Erzeugte Biomasse, g Trockengewicht/l nach kontinuierlicher Fermentation in Stdo

24

48

72

Neuer Mikroorganismus
Stamm
CBS 6373 10

CBS 6320 21
CBS 644 37

8,1 7,5

7,6

1,2

12,2	11,9
1,4	ausge spült
ausge spült	ausge spült

Der den neuen Mikroorganismus enthaltende Fermenter wurde 717 Stunden betrieben, worauf die Fermentation abgebrochen wurde. Die durchschnittliche Produktion betrug 11,9 g/l pro Stunde während des gesamten Versuchs. Der Fermenter wurde nicht aseptisch betrieben.

Beispiel 3

Kontinuierliche nicht-aseptische zweistufige Kultivierung

Der neue Mikroorganismus CBS Nr₀6373 wurde in einem kontinuierlich betriebenen ersten Fermenter mit einem Arbeitsvolumen von 6,6 m in einem v/ässrigen Nährmedium der folgenden Zusammensetzung gezüchtet:

H₃PO₄ 1,84 g

KCl 1,16g

Mg(OH)₂ 0,078 g

0,024 g 0,080 g

FeSO, -TH₉O

5Άη0

0,0004 g

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₄. 7H₂O 0,158 g

Hefeextrakt 0,015 g

H₂SO₄ 1,8 g

Leitungswasser 1000 ml

Als Kohlenstoffquelle wurde ein Gasöl aus Irak-Rohöl mit folgenden Kennzahlen verwendet:

Spezifisches Gewicht 0,865

Fließpunkt +10

Siedebereich 300-380⁰C

n-Paraffingehalt 18 Gew.-^

Pro Liter wässriges Nährmedium wurden 150 1 dieses Gasöls zugemiacht. Das Gemisch wurde dem Fermenter in einer Menge von 1650 l/Stunde zugeführt. Der Fermenter wurde "bei 30°C und durch kontinuierliche Zugabe von gasförmigem Ammoniak bei p„ 4,2 gehalten. Luft wurde durch Wirbelbelüftung in einer Menge von 120 V/V/Std. zugeführt.

Die Gesamtmenge des kontinuierlich abgezogenen Produktstroms, d.h. 1650 l/Stunde, wurde einem zweiten Fermenter F2 mit einem Arbeitsvolumen von 1.2,6 m zugeführt. Diesem Produktetrom von 1650 l/Stunde wurden pro Stunde 2500 1 Frischwasser zugesetzt. Das Gemisch wurde dem zweiten Fermenter zugeführt, der bei 30⁰C gehalten wurde. Luft wurde durch Wirbelbelüftung in einer Menge von 80 V/Y/Std, zugeführt. Der Fermenter arbeitete kontinuierlich mit einer Verdünnungsrate von 0,33 V/V/Std. Die Fermenter wurden nicht aseptisch betrieben..

Ein Produktionsstrom von 4150 1/Std. (der pro Liter 8 g Hefe (Trockengewicht) enthielt) wurde kontinuierlich aus dem zweiten Fermenter ausgetragen und dekantiert. Die Hefe wurde dann vom ausgebrauchten Medium abgetrennt und zur Entfernung restlicher Kohlenwasserstoffe mit Isopropanol gewaschen.

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Claims

Patentanspruch

Verfahren zur Umwandlung von in Kohlenwasserstoffgemischen enthaltenen geradkettigen Kohlenwasserstoffen in Proteinmaterial und/oder zur Reinigung des Kohlenwasserstoffgemisches durch Entfernung von geradkettigen Kohlenwasserstoffen aus dem Gemisch, wobei man vorzugsweise kontinuierlich und nicht-aseptisch einen geradkettige Kohlenwasserstoffe verwertenden Mikroorganismus in einem Kulturmedium züchtet, das ein wässriges Nährmedium, ein geradkettige Kohlenwasserstoffe mit wenigstens 10 C-Atomen im Molekül enthaltendes Kohlenwasserstoffgemisch, vorzugsweise ein Gasöl, und ein freien Sauerstoff enthaltendes Gas enthält, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Candida tropicalis, Stamm CBS Nr.6373 verwendet wird.

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