DE1593461C3 - Verfahren zur Herstellung von Carbonsäuren durch mikrobiologische Oxydation eines Kohlenwasserstoffes - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Carbonsäuren durch mikrobiologische Oxydation eines KohlenwasserstoffesInfo
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Description
3 4
»Bacteriological Reviews«, Bd. 24, S. 251 bis 260 (I960). und andere lösliche Verunreinigungen zu entfernen;
Auch in der USA.-Patentschrift 30 00 792 ist die die OH-Gruppen können durch andere Anionen, wie
Verwendung von Ionenaustauscherharzen bei Fer- Phosphat oder Chlorid, ersetzt sein, durch Behandlung
mentierungsmischungen während der Fermentierung des Harzes mit einer wäßrigen Lösung, die eine ent-
für die Bildung bestimmter Antibiotica beschrieben. 5 sprechende Konzentration eines solchen anderen
Diese Patentschrift zeigt, daß trotz einer Abnahme der Anions enthält, Obwohl ein solches Ersetzen der
Gesamtproduktion der gewünschten Antibiotica das OH-Gruppen nicht notwendig ist, kann es in manchen
Isolieren der Antibiotica aus den Harzen in größerem Fällen vorteilhaft sein. Vor seiner Anwendung ist es
Umfang (25 %) erfolgt, als wenn das Harz nur verwen- häufig auch erwünscht, das Harz mit Hilfe eines ge-
det wird, nachdem die Flüssigkeit ausgenutzt worden io eigneten Verfahrens zu sterilisieren, z. B., indem man es
ist. auf 1300C nach üblichem Sterilisierungsverfahren er-
AIs allgemeine Regel wurde bisher angesehen, daß hitzt.
die Ionenaustauscherharze eine schädliche Wirkung Fermentierungen von Kohlenwasserstoffen in Überauf
das Wachstum von Mikroorganismen besitzen einstimmung mit der Erfindung können aerob auf be-
und infolgedessen während der Fermentierung nicht 15 kannte Weise mit der Ausnahme durchgeführt werden,
anwesend sein sollten. Dies wird z. B. in dem Lehr- daß ein Anionaustauscherharz mit der Flüssigkeit in
buch von C a 1 m ο η und Kressmanmit dem Titel Berührung steht, solange die Fermentierungsreaktion
»Ion Exchangers in Organic and Biochemistry« (Inter- voranschreitet. Die Menge des verwendeten Harzes
science Publishers, Inc., 1957) angegeben, in dem auf# kann stark schwanken und hängt von Faktoren, wie
Seite 620 die hemmende Wirkung von Ionenausiau-' 20 seiner Ionenaustauschkapazität, dem zugeführten Kohscherharzen
auf Mikroben angegeben ist. In gleicher Ienwasserstoff und dem zur Bewirkung der Umwand-Weise
wird in »Ion Exchange and Its Application« (Soc. lung verwendeten besonderen Mikroorganismus ab.
of Chem. Ind., London, 1955) auf die sterilisierende Als allgemeine Regel sollte die Menge des Harzes wenig-Wirkung
von Anionaustauscherharzen bei Mikro- stens die theoretisch benötigte sein, die zum Absorbieorganismen
hingewiesen, wobei eine solche Wirkung 25 ren des größten Teiles des anfallenden Carbonsäurenicht
nur der physikalischen Anziehungskraft der Produktes notwendig ist. Gewöhnlich haben handels-Zellen
durch das Harz zugeschrieben wird, sondern übliche Anionaustauscherharze eine Austauschkapaauch
seiner Fähigkeit, diese zu zerstören. Eine weitere zität im Bereich von 1 bis 2 Milliäquivalenten des
Illustration dieser allgemeinen Auffassung findet man Carbonsäure-Umwandlungsproduktes pro Gramm
in »Dissertation Abstracts«, Bd. 16, S. 1697 (1956), die 30 Harz, und ein Überschuß des Harzes über den aus der
einen Auszug aus einer Doktorarbeit mit dem Titel bekannten Austauscherkapazität berechneten Wert
»Studies of the Antimicrobial Properties of Ion Ex- wird verwendet. Ein beträchtlicher Überschuß ist nicht
change Resins« enthält. schädlich mit der Ausnahme, daß große überschüssige Auf Grund des oben referierten beispielhaft ange- Mengen die Handhabungs- und Verfahrensprobleme
gebenen Standes der Technik konnte man erwarten, 35 erhöhen. Typische Mengen Harz zur Verwendung bei
daß die Gegenwart eines Ionenaustauscherharzes wäh- dem Verfahren liegen gewöhnlich im Bereich von 20
! rend der Fermentierung von Kohlenwasserstoffen bis 200 g pro Liter Nährmedium.
schädlich sein würde, wenn man die Bildung eines Das bei dem Verfahren verwendete Nährmedium Kohlenwasserstoff - Carbonsäure - Umwandlungspro- sollte Quellen für verfügbaren Stickstoff, Phosphor, duktes wünscht. Die Anmelderin hat aber nun gefun- 40 Schwefel und Magnesium enthalten; es kann auch verden, daß im Gegenteil Mikroorganismen, die zur BiI- schiedene Spurenelemente und Vitamine, die üblicherdung dieser Arten von Produkten befähigt sind, weise verwendet werden oder durch die besonderen ' tatsächlich mehr davon produzieren, vorausgesetzt, angewendeten Mikroorganismen erforderlich werden, j daß das verwendete Ionenaustauscherharz ein Anion- enthalten. Mineralsalze, die üblicherweise zum Zufüh-J austauscher ist. Dieser Verbesserung wird im allgemei- 45 ren solcher Elemente bei biologischen Fermentierungs-,, nen erreicht, wenn Kohlenwasserstoffe irgendeines verfahren angewendet werden, können benutzt werden. [ Typs biologisch unter Bildung von sauerstoffhaltigen Beispiele für geeignete Stickstoffquellen sind Ammo-Kohlenwasserstoffen oxydiert werden, die wenigstens niumsalze, wie (NH4)2SO4 oder NH4Cl, Nitratsalze, eine Carboxylgruppe pro Molekül enthalten. wie NH4NO3 oder NaNO3, Harnstoff, Sojabohnen-Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Ver- 5° mehl und andere organische Stickstoffquellen. Die fol-' fahrens kann entweder ein schwaches Anionaustau- gende Tabelle erläutert eine geeignete Mineralsalz-' scherharz oder ein starkes Anionaustauscherharz ver- mischung, die sich für die Zwecke der Erfindung , wendet werden. Verschiedene typische Anionaustau- eignet.
schädlich sein würde, wenn man die Bildung eines Das bei dem Verfahren verwendete Nährmedium Kohlenwasserstoff - Carbonsäure - Umwandlungspro- sollte Quellen für verfügbaren Stickstoff, Phosphor, duktes wünscht. Die Anmelderin hat aber nun gefun- 40 Schwefel und Magnesium enthalten; es kann auch verden, daß im Gegenteil Mikroorganismen, die zur BiI- schiedene Spurenelemente und Vitamine, die üblicherdung dieser Arten von Produkten befähigt sind, weise verwendet werden oder durch die besonderen ' tatsächlich mehr davon produzieren, vorausgesetzt, angewendeten Mikroorganismen erforderlich werden, j daß das verwendete Ionenaustauscherharz ein Anion- enthalten. Mineralsalze, die üblicherweise zum Zufüh-J austauscher ist. Dieser Verbesserung wird im allgemei- 45 ren solcher Elemente bei biologischen Fermentierungs-,, nen erreicht, wenn Kohlenwasserstoffe irgendeines verfahren angewendet werden, können benutzt werden. [ Typs biologisch unter Bildung von sauerstoffhaltigen Beispiele für geeignete Stickstoffquellen sind Ammo-Kohlenwasserstoffen oxydiert werden, die wenigstens niumsalze, wie (NH4)2SO4 oder NH4Cl, Nitratsalze, eine Carboxylgruppe pro Molekül enthalten. wie NH4NO3 oder NaNO3, Harnstoff, Sojabohnen-Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Ver- 5° mehl und andere organische Stickstoffquellen. Die fol-' fahrens kann entweder ein schwaches Anionaustau- gende Tabelle erläutert eine geeignete Mineralsalz-' scherharz oder ein starkes Anionaustauscherharz ver- mischung, die sich für die Zwecke der Erfindung , wendet werden. Verschiedene typische Anionaustau- eignet.
\ scherharze stehen im Handel zur Verfügung, und jedes Konzentration
. dieser Harze, das genügend Reinheit besitzt, kann ver- 55 g/l H2O
Y wendet werden. Diese Harze bestehen im allgemeinen μ rn
aus einer Styrol-Divinylbenzol-Matrix, an der sich r π oü'r»
, basische, stickstoffhaltige Gruppen befinden, die im ςη uη
, Falle der schwach basischen Austauscher Aminogrup- MnSO4 · H2O 0,02
' pen sind und quaternäre Ammoniumgruppen im Falle 60 FeSO4 · 7 H2O 0,005
. des stark basischen Typs. Vorzugsweise werden für die ι? η η *
^
. Zwecke der Erfindung schwache Anionaustauscher- KH2PO4 2,0
. harze verwendet. Die im Handel verfügbaren Harze Harnstoff 2,0
besitzen gewöhnlich Hydroxylgruppen, wenn das Anion
α mit diesen stickstoffhaltigen Gruppen assoziiert ist. 65 Diese Mineralsalzmischung besitzt normalerweise
r Vor der Anwendung bei dem erfindungsgemäßen Ver- einen pH-Wert von etwa 7,1. Wenn man die Fermen-
fahren sollte das Harz gründlich mit Wasser gewaschen tierung bei einem pH-Wert unterhalb 7 durchführen
.J werden, um jeden Überschuß an basischem Stickstoff möchte, kann die Menge an KH2PO4 im Verhältnis zu
5 6
Na2HPO4 erhöht werden, um den pH-Wert auf einen gehalten werden. Beispielsweise kann sich das Ionengeringeren
Wert zu bringen. austauscherharz innerhalb des Fermentierungsgefäßes
Die Fermentierung kann absatzweise oder konti- in einer Kammer befinden, die durch eine Membran
nuierlich durchgeführt werden, indem man entweder bzw. ein Gitter gebildet ist, durch welches die gerührte,
Wachstumsbedingungen oder Nicht-Wachstumsbedin- 5 Zellen enthaltende Flüssigkeit fließt und mit dem Harz
gungen einhält. Bei einem Weg zur Durchführung der in Berührung kommt. Das Harz kann auch in einer
Erfindung wird eine Mischung von Nährmedium und Zone außerhalb des Belüftungsgefäßes angeordnet
sterilisiertem Anionenaustauscherharz in einem Fer- sein, und die zu fermentierende, zellenenthaltende
mentierungsgefäß hergestellt, das mit Mitteln zum Ruh- Mischung kann kontinuierlich vor und zurück zwischen
ren und zum Belüften versehen ist. Die Mischung wird io den beiden Gefäßen im Kreislauf geführt werden,
mit dem ausgewählten Kohlenwasserstoff verbrauchen- Irgendeine andere geeignete Weise zur Durchführung
den Mikroorganismus geimpft, und die Fermentierung der Fermentierung kann angewendet werden, vorausgewird
dann eingeleitet, indem man den Kohlenwasser- setzt, daß die zellenenthaltende Brühe zum Entfernen
stoff zugibt, während man Fermentierungsbedingun- des Carbonsäure-Umwandlungsproduktes kontinuiergen
einhält. Im allgemeinen wird eine Temperatur von 15 Hch das Anionenaustauscherharz berührt, wenn die
20 bis 40°C angewendet, und der pH-Wert wird im Be- Fermentierung voranschreitet.
reich von 4 bis 9, gewöhnlich von 6 bis 8, gehalten. Wie oben erwähnt, kann entweder ein schwach ba-Der
Kohlenwasserstoff kann kontinuierlich oder ab- sisches oder ein stark basisches Anionenaustauschersatzweise
zugegeben werden, während die Mischung harz für die vorliegenden Zwecke verwendet werden. Es
gründlich gerührt und belüftet wird. Vorzugsweise 20 ist jedoch gewöhnlich vorzuziehen, schwache Auswird
der Kohlenwasserstoff im Verlauf der Fermentie- tauscherharze zu verwenden, da höhere Ausbeuten des
rung laufend und nicht auf einmal zugegeben. Der gewünschten Carbonsäureproduktes oft erhalten wer-Ausgangskohlenwasserstoff
kann am Beginn der Fer- den, wenn man so verfährt. Nach dem Fermentieren
mentierung zugegeben werden, oder man kann die kann das Isolieren des Produktes von dem Harz da-Zellen
zunächst auf irgendeinem Substrat wachsen 25 durch erfolgen, daß man es mit einer wäßrigen Lölassen
und den Kohlenwasserstoff später zu geeigneten sung einer Säure wie Salzsäure, Phosphorsäure, Amei-Zeitpunkten
während der Fermentierung zufügen. sensäure oder Essigsäure in Berührung bringt. In
Wenn die Fermentierung zu dem gewünschten Carbon- manchen Fällen kann das Carbonsäureprodukt in
säure-Umwandlungsprodukt vorangeschritten ist, un- Wasser unlöslich, jedoch in einem Alkohol löslich sein,
terliegt letzteres bei seiner Bildung dem Ionenaustausch 3° wobei in diesem Fall Methanol oder Äthanol zur Her-
und wird an das Harz gebunden, mit Ausnahme einer stellung des säureverdrängenden Mediums dienen
kleinen Menge des Produktes, das gewöhnlich in der kann. Als alternatives Verfahren kann jede Form eines
Flüssigkeit im Gleichgewicht mit der Harzphase gelöst Anionaustauscherharzes mit Hilfe von Ätznatron oder
bleibt. Die Zugabe von Kohlenwasserstoff wird vor- anderem Alkalihydroxyd regeneriert werden. Wenn
zugsweise fortgesetzt, bis die maximale Anreicherung 35 dies geschieht, wird das Produkt in Form seiner Alkalides
Carbonsäureproduktes erfolgt ist. Das Anionaus- salze und nicht als freie Carbonsäure erhalten.
tausch;rharz wird von der Flüssigkeit z. B. durch Besonders interessante Anwendungsmöglichkeiten Filtrieren abgetrennt, und danach wird das Carbon- für die Verwendung von Anionaustauscherharzen nach säure-Umwandlungsprodukt von dem Harz durch Be- dem erfindungsgemäßen Verfahren bestehen in der Umhandlung mit einer wäßrigen Lösung von Alkali oder 40 Wandlung verschiedener aromatischer Kohlenwasser-Säure abgesondert. Falls erwünscht, kann die kleinere stoffe in sauerstoffhaltige Säureprodukte von techni-Menge an Carbonsäureprodukt, die in der Flüssigkeit schem Interesse. Die folgenden aromatischen Kohlenzurückbleibt, auch abfiltriert oder aus den Zellen ab- Wasserstoffumwandlungen sind von besonderem Intez^ntrifugiert werden oder durch Ansäuern der über- resse:
tausch;rharz wird von der Flüssigkeit z. B. durch Besonders interessante Anwendungsmöglichkeiten Filtrieren abgetrennt, und danach wird das Carbon- für die Verwendung von Anionaustauscherharzen nach säure-Umwandlungsprodukt von dem Harz durch Be- dem erfindungsgemäßen Verfahren bestehen in der Umhandlung mit einer wäßrigen Lösung von Alkali oder 40 Wandlung verschiedener aromatischer Kohlenwasser-Säure abgesondert. Falls erwünscht, kann die kleinere stoffe in sauerstoffhaltige Säureprodukte von techni-Menge an Carbonsäureprodukt, die in der Flüssigkeit schem Interesse. Die folgenden aromatischen Kohlenzurückbleibt, auch abfiltriert oder aus den Zellen ab- Wasserstoffumwandlungen sind von besonderem Intez^ntrifugiert werden oder durch Ansäuern der über- resse:
stehenden Anteile und anschließendes Extrahieren mit 45 (1) Umwandlung von methylsubstituierten Benzo-
Hilfe eines geeigneten Lösungsmittels, wie Äther, ent- len in methylsubstituierte Muconsäuren durch beson-
fernt werden. dere Stämme von Nocardia, wie diese in der gleichzei-
Die Erfindung kann auch durchgeführt werden, tig eingereichten Patentanmeldung mit dem Titel
ohne daß das Anionenaustauscherharz mit der gesam- »Verfahren zur mikrobiologischen Oxydation von
ten Fermentierungsflüssigkeit vermischt wird, wie dies 5° Alkylbenzolen« DT-OS 15 93 460 beschrieben ist. Ein
oben beschrieben ist. Tatsächlich kann das Rühren der Beispiel ist die Bildung von α,α'-Dimethylmuconsäure
Flüssigkeit mit dem betreffenden darin dispergierten (im folgenden als DMMA bezeichnet) aus p-Xylol
Harz nachteilig sein, weil es eine Zerkleinerung des mit Hilfe eines Stammes von Nocardiacoral-
Harzes in so feine Teilchen verursacht, daß sie zur er- 1 i η a, eine Kultur, die bei dem American Type CuI-
• neuten Verwendung bei dem Verfahren ungeeignet 55 ture Collection, Washington D. C, unter der Nummer
sind. Da die Kosten des Harzes einen wesentlichen Teil ATCC 19 070 hinterlegt ist. Die Umwandlung läßt
der Gesamtkosten des Verfahrens ausmachen, ist es sich durch die folgende Gleichung erläutern:
sehr erwünscht, daß das Harz in einer zur erneuten
sehr erwünscht, daß das Harz in einer zur erneuten
Verwendung geeigneten Form isoliert werden kann. a 3
Die im Handel verfügbaren Harze variieren beträcht- 60
lieh hinsichtlich ihrer Beständigkeit unter Rührbe- ^ \ (^ ^1COOH
dingungen, die bei Fermentierungsverfahren angewen- | ] * |
det werden, so daß manche Harze befriedigend bei dem
oben beschriebenen Verfahren verwendet werden können, während sich andere als ungeeignet erweisen. Um 65
die Möglichkeit der Zerkleinerung des Harzes zu vermeiden, kann es innerhalb des Fermentierungssystems p-Xylol «,«'-Dimethylmuconsäure
an einer von dem Rührwerk abgesonderten Stelle (DMMA)
dingungen, die bei Fermentierungsverfahren angewen- | ] * |
det werden, so daß manche Harze befriedigend bei dem
oben beschriebenen Verfahren verwendet werden können, während sich andere als ungeeignet erweisen. Um 65
die Möglichkeit der Zerkleinerung des Harzes zu vermeiden, kann es innerhalb des Fermentierungssystems p-Xylol «,«'-Dimethylmuconsäure
an einer von dem Rührwerk abgesonderten Stelle (DMMA)
Ergänzungsblatt zur Auslegeschrift 15 93
Int.Cl.2: C 07 C 51-20
Bekanntmachungstag: 7. Mai 1975
(2) Umwandlung von methylsubstituierten Benzolen in 2,3-Dihydroxybenzoesäuren und Alkylbenzoesäuren
mit Hilfe von anderen Stämmen von Nocardia, wie dies ebenfalls in der obenerwähnten
DT-OS beschrieben ist. Ein Beispiel hierfür ist die Umwandlung von p-Xylol nach der folgenden Gleichung.
Mit Hilfe eines Stammes von Nocardia salmonicolor, nach dem American Type Culture
Collection als ATCC Nr. 19 149 angegeben oder mit einem anderen Stamm von Nocardia corallina,
ATCCNr. 19147.
COOH
COOH
CH3
2,3-Dihydroxy-
p-toluylsäure
(DHPT)
p-Toluylsäure (PTA)
(Diese speziellen Säureprodukte werden der Einfachheit halber im folgenden als DHPT bzw. PTA
bezeichnet.)
(3) Umwandlung von Naphthalin in Salicylsäure unter Verwendung beispielsweise von Corynebakterium
renale ATCC Nr. 15 075, wie dies in der USA.-Patentschrift 3183169 beschrieben ist und
durch die folgende Gleichung sich darstellen läßt:
/N1-COOH
N/
OH
Naphthalin
(4) Umwandlung von Dimethylnaphthalinen in Methylcarboxynaphthaline mit Hilfe beispielsweise
von Streptomyces achromogenes ATCC Nr. 15 077, wie dies in der US-PS 33 40 159 von D ο u r ο s und
Raymond vom 18. September 1963 beschrieben
ist. Eine Gleichung, die diese Reaktion erläutert, ist folgende:
H3C-
H3C
COOH
2,6-Dimethylnaphthalin
6-Methyl-2-naphthoesäure
Eine analoge Umwandlung ist die Überführung von 2-Methylnaphthalin in 2-Naphthoesäure durch
Pseudomonas aeruginoea (vgl. »Oxygenases« von H a y a i s h i, S. 266, Academic Press, 1962).
(5) Umwandlung von Anthracen und Phenanthren mit Hilfe von Pseudomonas aeruginosa in
Hydroxynaphthoesäuren (»Oxygenases«, S. 267 und 268).
Die obige Aufzählung stellt lediglich eine Erläuterung
von Umwandlungen dar, für die das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft angewendet werden
kann. Es könnten noch viele andere spezielle Kohlenwasserstoffumwandlungen angegeben werden,
bei denen die Verwendung eines Anionaustauscherharzes während der Fermentierung eine deutliche
Erhöhung der Ausbeute des gewünschten Carbonsäureproduktes bewirkt.
Die Art des Anfangswachstums der Mikroorganismen und die Zeit, die erforderlich ist, um die
Kohlenwasserstoffumwandlung zu bewirken, um eine maximale Ausbeute des gewünschten Produktes
zu erzielen, kann stark variieren in Abhängigkeit von dem betreffenden Mikroorganismus und dem
Ausgangskohlenwasserstoff. Wenn beispielsweise die obenerwähnten Nocardia-Stämme unter Wachstumsbedingungen zur Umwandlung von p-Xylol verwendet
werden, ist es im allgemeinen erwünscht, das Wachstum unter Verwendung von n-Hexadecan oder
Fettöl als Substrat zu beginnen und das Wachstum 12 bis 36 Stunden lang zuzulassen, bevor das
p-Xylol zugegeben wird. Während dieser Zeit braucht das Anionaustauscherharz nicht anwesend zu sein,
doch kann es anwesend sein, da es das Wachstum nicht hindert, vorausgesetzt, daß es von geeigneter
Reinheit ist. Nach dieser Anfangswachstumsperiode wird das p-Xylol kontinuierlich oder intermittierend
vorzugsweise mit etwa der Geschwindigkeit zugegeben, mit der es verbraucht wird, und vorzugsweise
im Gemisch mit einer kleineren Menge von n-Hexadecan, um das Wachstum zu unterstützen. Das Anionaustauscherharz
kann unmittelbar nach der Zugabe des p-Xylols oder etwas später zugegeben werden,
wenn die Menge des Produktes nennenswert wird. Das gesamte Harz kann auf einmal zugegeben
werden, oder es kann in zunehmenden Mengen im Verlauf der Fermentierung zugefügt werden. Bei
Umwandlungen dieser Art werden gewöhnlich maximale Ausbeuten an DMMA, DHPT oder PTA in
4 bis 6 Tagen nach Beginn der p-Xylol-Zugabe erhalten.
WennNocardiaorganismen unter Nicht-Wachstumsbedingungen für das erfindungsgemäße Verfahren
verwendet werden, werden die gewachsenen Zellen, wie oben beschrieben, von der Flüssigkeit abzentri-
fugiert und mit Phosphatpufferlösung gewaschen, dann erneut in einer Phosphatpufferlösung suspendiert.
Typischerweise wird die Suspension bei z. B. 30° C gehalten, und das p-Xylol, gemischt mit einer
kleinen Menge n-Hexadecan, wird periodisch oder kontinuierlich zugegeben,- während die Mischung belüftet
und gerührt wird. Die Zugabe des Substrates wird fortgesetzt, bis die Fermentierung eine optimale
Ausbeute des gewünschten Säureproduktes ergeben hat. '··.;·,;· ■ *
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung. Zur Durchführung dieser Beispiele
eignet sich eine Nährsalzlösung, deren Zusammensetzung vorstehend angegeben wurde.
Eine Gruppe von vier Schüttelkolbenansätzen wurde durchgeführt, wobei in jedem p-XyJoI mit
Hilfe von Nocardia corallina ATCC Nr. 19 1*47 ausgesetzt
wurde. Dieser Mikroorganismus gibt als Produkte aus p-Xylol sowohl die Hydroxy-p-toluylsäure
(DHPT) als auch p-Toluylsäure (PTA). Er wächst gut auf n-Hexadecan, und infolgedessen wurde
Paraffin für das Anfangswachstum der Zellen und als Substrat während der Umwandlungsreaktion verwendet.
Ein Ansatz diente als Kontrollversuch, bei dem kein Austauscherharz verwendet wurde. Bei
den anderen drei Ansätzen wurde ein schwach basisches handelsübliches Handelsaustauscheriiarz in
wechselnden Mengen verwendet, wierdies in der folgenden
Tabelle angegeben ist. Das Harz war in der Phosphatform, nachdem es ausgewaschen und mit
einer Lösung von KH2PO4 und Na2HPO4, enthaltend
etwa 5 Milliäquivalente Phosphationen, dem Ionenaustausch unterworfen wurde. Das Harz wurde
auch durch Wärmebehandlung sterilisiert. Bei dem Verfahren dieser Ansätze erfolgte das Impfen von
100 ml Nährsalzlösung in einem 500-ml-Schüttelkolben
mit den Organismen, worauf der Kolben bei 30° C geschüttelt und periodisch mit kleinen Mengen
n-Hexadecan für das Zellenwachstum im Verlauf von 6 Tagen versetzt wurde. Dann wurden täglich
Anteile von p-Xylol zugegeben, so wie es verbraucht wurde, wobei die Zugaben in Form
von 0,2-ml-Anteilen einer 90: 10-Mischung von
p-Xylol: n-Hexadecan erfolgten. Bei den drei Ansätzen wurde der Anionenaustauscher verwendet,
wobei ungefähr die Hälfte bei der ersten Zugabe von p-Xylol (d.h. am 6. Tag) und der Rest am 11. Tag
zugegeben wurde. Alle Ansätze ließ man insgesamt 14 Tage lang laufen. Die Produkte wurden dann
aufgearbeitet und analysiert. Dies erfolgte durch Abdekantieren der Gärflüssigkeit von dem Harz, Abfiltrieren
der Zellen von der Flüssigkeit und Isolieren der Carbonsäure aus der Flüssigkeit und dem
Harz in Form von Methanollösungen. Die filtrierte Flüssigkeit wurde mit HCl angesäuert und mit
Äthyläther ausgezogen; der Äther wurde verdampft, der Rückstand in Methanol gelöst und die entstandene
Lösung durch UV-Spektroskopie analysiert. Das Harz wurde mit einer 5%igen HCl-Lösung in
Methanol behandelt, um die Produkte daraus zu verdrängen; die Lösung des methanolischen Reaktionsproduktes
wurde in gleicher Weise analysiert. Die Tabelle I zeigt die Konzentration von DHPT
und PTA in der endgültigen Mischung für jeden Ansatz in Gramm pro Liter der gesamten Mischung.
Umwandlung von p-Xylol mit ATCC Nr. 19 147
Ansatz Nr. | Menge an Harz g/l |
Carbonsäureprodukte | 21 | °/o PTA |
Mischung | insgesamt % DHPT | 18 | ||
1 | 0 | 0,1 | 22 | |
(Kontroll | ||||
versuch) | 79 | |||
2 | 21 | 3,8 | 82 | |
3 | 45 | 4,5 | 78 | |
4 | 90 | 5,5 | ||
Ansatz Nr. | 45 | 5 | Menge an Harz g/l |
Carbonsäureprodukte | _ | Vo PTA |
(Kontroll | Mischung | insgesamt "/oDHPT | ||||
versuch) | 0 | 0,1 | ||||
50 6 | 25 | |||||
7 | 20 | 75 | ||||
8 | 21 | 2,0 | 28 | 80 | ||
45 | 3,0 | 72 | ||||
90 | 5,3 |
Aus den Ergebnissen kann man sehen, daß die Verwendung des Anionaustauscherharzes während
der Fermentierung eine deutliche Verbesserung verursacht. Wenn kein Harz verwendet wird, wurden
nur sehr wenig Carbonsäureprodukte erhalten. Die Gegenwart von Harz verursacht eine deutliche Zunahme
der Mengen an DHPT und PTA. Die Ausbeuten dieser Säuren werden verbessert, wenn die
Menge des Harzes erhöht wird.
Eine andere Gruppe von Ansätzen wurde im wesentlichen in der gleichen Weise unter Verwendung
der gleichen Bedingungen, wie in den vorhergehenden Beispielen, durchgeführt, mit der Abweichung,
daß als Mikroorganismus Nocardia salmonicolor ATCC Nr. 19 149 verwendet wurde. Wiederum wurden
sowohl DHPT als auch PTA produziert, und die Ergebnisse, bestimmt durch UV-Spektroskopie,
sind in der Tabelle II zusammengestellt.
Umwandlung von p-Xylol mit ATCC Nr. 19 149
Man kann sehen, daß die Ergebnisse mit diesem Mikroorganismus ungefähr die gleichen sind wie
mit dem Stamm Nocardia corallina des ersten Beispiels.
Eeispiel 3
Drei Schüttelkolben-Vergleichsansätze wurden zum Überführen von p-Xylol mit Hilfe von Nocardia
corallina ATCC Nr. 19 070 durchgeführt; dieser Organismus ist zur Umwandlung von p-Xylol in
DMMA befähigt. Ein Ansatz war ein Vergleichsversuch ohne Harz, während die beiden anderen
Bei allen drei Ansätzen konnte als einzige Carbonsäure in dem Produkt nur DMMA nachgewiesen
werden. Die Ergebnisse zeigen erneut die Tatsache, daß die Gegenwart des Anionaustauschers während
der Fermentierung deutlich die Ausbeute erhöht. Die Werte zeigen, daß durch das schwach basische
Harz eine stärkere Verbesserung der Ausbeute als durch das stärker basische Material bewirkt wird. "
Mehrere Schüttelkolbenversuche wurden durchgeführt, um die Wirkung eines Anionaustauscherharzes
vom schwach basischen Typ bei der Umwandlung von Naphthalin in Salicylsäure mit Hilfe von Corynebacterium
n. sp. zu zeigen. Ein Ansatz war ein Ver- *5
gleichsversuch, und bei den anderen beiden Ansätzen wurden verschiedene Mengen Anionaustauscher
verwendet. Bei jedem Ansatz wurden 100 ml der gleichen Nährsalzlösung verwendet, zu der'
0,01% Hefeextrakt gegeben wurde. Ferner wurde etwa 1 g Naphthalin am Anfang zugegeben. Bei Ansatz
13 wurden etwa 20 g/l Harz nach 24 Stunden und weitere 20 g/l nach 72 Stunden zugefügt, während
bei Ansatz 14 zweimal die gesamte Menge Harz in Anteilen von 20 g/l anfangs und von 20 g/l nach *5
24 Stunden und 40 g/l nach 72 Stunden zugegeben wurde. Die Kolben wurden bei 30° C gehalten und
etwa 7 Tage geschüttelt. Als einziges Produkt wurde Salicylsäure erhalten; deren Gesamtausbeute, bestimmt
durch UV-Analyse, ist in der Tabelle IV angegeben.
sich als wichtigste Carbonsäure angereichert hatte. PTA hatte sich bei diesen Ansätzen ebenfalls in
kleineren Mengen gebildet, doch konnte dessen Gehalt nicht bestimmt werden. Als Anionaustauscherharze
wurden schwach basische Typen verwendet, nämlich zwei verschiedene, im Handel verfügbare
Produkte (mit »A« und »B« bezeichnet), von denen jeder durch Ionenaustausch in die Chloridform und
auch in die Phosphatform überführt worden war. Die Ergebnisse sind in der Tabelle V zusammengestellt.
Umwandlung von p-Xylol mit ATCC Nr. 19071
An | Verwendetes Harz | DMMA-Ausbeute, | im Harz | insgesamt |
satz | g/I Mischung | |||
Nr. | in der Flüssig keit |
5,9 | 9,4 | |
3,5 | 5,2 | 6,8 | ||
15 | Harz A — Chlorid | 1,6 | 0,2 | 1,9 |
16 | Harz A—Phosphat | 1,7 | 0,5 | 1,8 |
17 | Harz B —Chlorid | 1,3 | ||
18 | Harz B—Phosphat |
Umwandlung von Naphthalin mit Corynebacterium n. sp.
Ansatz Nr. | Menge des ver | Gesamtausbeute an |
wendeten Harzes | Salicylsäure | |
g/i | g/l | |
12 | keine | 1,5 |
(Kontrollversuch) | ||
13 | 40 | 4,1 |
14 | 80 | 5,7 |
35
40
45
Die Ergebnisse demonstrieren erneut die Wirksamkeit von Anionaustauscherharzen bei der Erhöhung
der Ausbeute eines Carbonsäureprodukts bei der Kohlenwasserstoff-Fennentierung.
Ein Ansatz wurde in einem 40-1-Fermentierungsgefäß ohne Ionenaustauscherharz durchgeführt, zur
Umwandlung von p-Xylol mit Hilfe von Nocardia corallina durch ATCC Nr. 19 071, der eine Mutante
des in Beispiel 3 verwendeten Stammes ist. Nach Ablauf von 24 Stunden hatte sich etwas DMMA angesammelt,
jedoch nur in einer Menge von 0,5 g/l; die Umwandlung wurde unterbrochen. Verschiedene
Proben (100 ml) der Flüssigkeit wurden dann in Schüttelkolben überführt, zu denen verschiedene Anionaustauscherharze
in einer Menge von 30 g/l gegeben wurden. Die Mischungen wurden kontinuierlich bei 3O0C geschüttelt, und kleine Anteile einer
90: 10-Mischung von p-Xylol wurden von Zeit zu Zeit in dem Maße zugegeben, wie die Fermentierung
voranschritt. Nach Ablauf von 45 Stunden wurde die Brühe gewonnen und auf DMMA analysiert, die
Diese Ergebnisse zeigen, daß die durch Verwendung eines Anionaustauscherharzes erzielte Ausbeuteverbesserung
in Abhängigkeit von dem betreffenden Harz schwanken kann, daß jedoch in jedem Fall eine wesentliche Verbesserung erzielt werden
kann. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren konnten Zellen, die nur 0,5 g/l DMMA gebildet hatten
und deren Produktion aufgehört hatte, dazu veranlaßt werden, beträchtlich mehr DMMA durch die
Gegenwart der Harze zu produzieren, als dies ursprünglich erfolgte. Beide Formen an Harz A führten
zu einer bemerkenswerten (13- bis 19fach) Steigerung der Bildung dieser Dicarbonsäure.
Dieses Beispiel erläutert die Anwendung der Erfindung auf die Bildung p-Toluylsäure (PTA) in
hoher Ausbeute aus p-Xylol. Der Mikroorganismus war Nocardia corallina ATCC Nr. 19 147, ein Stamm,
der im Beispiel 1 verwendet wurde. Jedoch wurden unter den Bedingungen des vorliegenden Ansatzes
nur Spurenmengen an DHPT gebildet. Die Fermentierung erfolgte in einem 2800-ml-Fernbach-Rührkolben
unter Verwendung von 500 ml Nährsalzlösung und bei einer Temperatur von 300C. Nach
dem Impfen der Mischung wurde n-Hexadecan (2 ml; in Anteilen) für das Wachstum des Mikroorganismus
während der ersten 3 Tage verwendet. Dann wurde mit der Zufuhr von p-Xylol-Anteilen,
gemischt mit einer kleinen Menge n-Hexadecan, begonnen. Die Mengen waren 9 ml einer 75:25-Mischung,
während der 3- bis 5-Tage-Periode und 35 ml einer 90 :10-Mischung während der 5- bis 13-Tage-Periode.
Die Zufuhr der 90: 10-Mischung wurde bis zum 18. Tag fortgesetzt; die Ansammlung
von PTA dauerte ohne Anzeichen eines Abfalles der mikrobiologischen Aktivität an. Am 9. und 11. Tag
wurde schwach basisches Anionaustauscherharz in Phosphatform in Mengen von 10 bzw. 50 g/l zugegeben.
Proben der Flüssigkeit wurden in Abständen während der Fermentierung entnommen, und der
gesamte Gehalt an PTA, ermittelt durch UV-Analyse, ist in der Tabelle VI angegeben.
Umwandlung von p-Xylol mit ATCC Nr. 19 147
(Ansatz Nr. 19)
Tage seit Menge an vorhan- PTA-Äusbeute
Versuchsbeginn denem Harz, g/l g/l Mischung
10
60
60
60
60
60
0,2 0,3 1,0
9,2 13,6 15,0 24,2
Fall 0,2% Pepton und 0,1% Fleischbrühexlrakt, und sein pH-Wert wurde auf etwa 6,5 gehalten. Nach
dem Impfen ließ man den Organismus auf n-Hexadecan 36 Stunden lang wachsen, und danach wurde
p-Xylol in kleinen Mengen von Zeit zu Zeit zugegeben,
solange die Mischung gerührt und bei 300C
belüftet wurde. Jeder Ansatz wurde insgesamt 120 Stunden lang durchgeführt, und es wurden insgesamt
24 ml p-Xylol \'crwendet. Die Arten und die Mengen der Produkte einschließlich derjenigen
die an dem Anionaustauscherharz absorbiert waren und diejenigen, die in der Flüssigkeit enthalter
waren, wurden dann bestimmt. Die Ergebnisse sin< in der Tabelle VII zusammengestellt.
Die in der Tabelle zusammengefaßten Ergebnisse zeigen nur einen niederen Wert für die PTA-Bildung
an, bis das Anionaustauscherharz zugegeben wurde. Nach dessen Zugabe stellte sich eine hohe Geschwindigkeit
der PTA-Ansammlung ein, und es zeigte sich
eine bemerkenswert gute Ausbeute.
B e i s ρ i e 1 7
Zwei Ansätze wurden in Fermentierungsrührgefäßen unter Verwendung von Nocardia corallina
ATCC Nr. 19 070 durchgeführt. Bei einem Ansatz (Ansatz Nr. 21) wurde eine Mischung von 480 ml
eines schwach basischen Aniönaustauscherharzes (48 g/l) und genügend Nährsalzlösung verwendet, so
daß sich ein gesamtes Volumen von 3000 ml ergab. Der andere Ansatz (Ansatz Nr. 20) war ein Kontrollversuch
unter Verwendung von 3000 ml Nährsalzlösung ohne Harz. Das Medium enthielt in jedem
Umwandlung von p-Xylol mit ATCC Nr. 19 070
Produkt | Menge des Reaktionsprodukts, g/l | mit Harz |
ohne Harz | (Ansatz Nr. 21) | |
(Ansatz Nr. 20) | 12,2 | |
DMMA | 0,2 | 0,7 |
DHPT | 0 | 1,0 |
PTA | 0 | 0,5 |
DMC*) | 0 | |
*) S.ö-Dimethylcatechin. |
Die Ergebnisse zeigen eine starke Verbessert» der Menge an Reaktionsprodukt, besonders ί
DMMA als Ergebnis der Verwendung des Anio austauschers.
Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung von Carbonsäuren (Davis und Raymond, USA.-Patentschrift
durch mikrobiologische Oxydation eines Kohlen- 5 30 57 784); Cyclohexanessigsäure aus n-Butylcyclowasserstoffes
mit Luft in wäßriger Nährsalzdisper- hexan; Muconsäure aus Benzol; Salicylsäure aus
sion, dadurch gekennzeichnet, daß Naphthalin (B ri I laud, USA.-Patentschrift
man die Oxydation in Gegenwart eines Anion- 31 83 169); Methylnaphthoesäuren aus Dimcthylaustauscherharzes
durchführt, nach beendeter Oxy- naphthalinen; Hydroxynaphthoesäuren aus Anthracen
dation das Anionaustauschharz von dem Oxyda- io und Phenanthren; Adipin- und Pimelinsäuren aus
tionsgemisch abtrennt, aus ihm und gegebenen- Decalin und Methylhexansäiiren aus 2-Methylhexan.
falls zusätzlich aus der verbleibenden Flüssigkeit Zahlreiche andere Oxydationen, die zu Carbonsäuredie
restlichen Carbonsäuren in an sich bekannter produkten aus Kohlenwasserstoffen führen, sind in
Weise gewinnt. dem obenerwähnten Lehrbuch und in den dort ange-
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- 15 «ebenen Vorveröffentlichungen beschrieben,
zeichnet, daß man als Anionaustauscherharz ein Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, bei der schwach basisches Anionaustauscherharz verwcn- mikrobiologischen Oxydation von Kohlenwasserstoffen det. in Gegenwart eines kohlenwasserstofferbraucliendcn
zeichnet, daß man als Anionaustauscherharz ein Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, bei der schwach basisches Anionaustauscherharz verwcn- mikrobiologischen Oxydation von Kohlenwasserstoffen det. in Gegenwart eines kohlenwasserstofferbraucliendcn
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch Mikroorganismus die Ausbeute an Carbonsäuren zu
gekennzeichnet, daß man das Anionaustauscher- 20 verbessern und die Gewinnung des Endprodukts zu
harz in einer Menge von 20 bis 200 g pro Liter erleichtern.
Nährmedium verwendet. Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur
Herstellung von Carbonsäuren durch mikrobiologi-
sehe Oxydation eines Kohlenwasserstoffes mit Luft in
25 wäßriger Nährsalzdispersion, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß man die Oxydation in Gegenwart eines
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung Anionausiauschharzes durchführt, nach beendeter
von Carbonsäuren durch mikrobiologische Oxydation Oxydation das Anionaustauschharz von dem Oxydaeines
Kohlenwasserstoffes, die in Gegenwart eines tionsgemisch abtrennt, aus ihm und gegebenenfalls
kohlenwasserstoffverbrauchenden Mikroorganismus im 30 zusätzlich aus der verbleibenden Flüssigkeil die rest-Gemisch
mit einer wäßrigen Nährsalzlösung für den liehen Carbonsäuren in an sich bekannter Weise geMikroorganismus
durchgeführt wird. winnt.
Die mikrobiologische Oxydation von Kohlenwasser- Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird
stoffen mit Hilfe von Mikroorganismen, die zur BiI- durch die Gegenwart eines Anionenaustauscherharzes
dung von Carbonsäuren als Produkte befähigt sind, 35 überraschenderweise eine deutliche Verbesserung bei
ist bereits mehrfach beschrieben worden. Ein neuerer der Bildung der Carbonsäuren darstellenden Umwand-Überblick
über dieses Gebiet findet sich in dem lungsprodukte erreicht. Erfindungsgemäß werden da-Lehrbuch
»Advances in Enzymology«, Bd. 27, S. 469 her oxydierte, sauerstoffhaltige Kohlenwasscrstoffbis
546 (Interscience Publishers, 1965). Viele Mikro- Umwandlungsprodukte mit einer oder mehreren Carorganismen
sind befähigt, Kohlenwasserstoffe als 4° boxylgruppen im Molekül in besserer Ausbeute erhal-Kohlenstoffquelle
auszunutzen, und manche dieser ten. Das erzielte Produkt hat mindestens 1 Carboxyl-Mikroorganismen
wandeln den Kohlenwasserstoff gruppe und kann, muß aber nicht, andere sauerstoffnicht
in Zellmaterial oder in Kohlendioxyd und Wasser haltige Gruppen aufweisen, wie Hydroxyl-, Keto-, Alum,
sondern in Stoffwechselzwischenprodukte, die sich dehydgruppen 11. dgl. Die als Produkt gebildete Carin
dem Fermentierungsgemisch ansammeln. Verschie- 45 bonsäure unterliegt bei ihrer Bildung dem Ionenausdene
Arten von oxydierten, sauerstoffhaltigen Kohlen- tausch und wird an das Harz gebunden. Dann wird das
Wasserstoffprodukten wurden bei solchen Fermcntie- Ionenaustauscherharz von dem Fermentationsmedium
rungsreaktionen erzeugt. Carbonsäuren reichern sich abgetrennt, und die als Umwandlungsprodukt erhaloft
als Folge der mikrobiologischen Einwirkung an. tene Carbonsäure wird aus dem Harz isoliert. Vorzugs-Zu
Mikroorganismen, die hierzu befähigt sind, gehören 5° weise wird auch die geringere Menge des Produkts,
Bakterien, Hefen, Schimmelpilze und Actinomyzeten die gewöhnlich in Lösung in dem Medium verbleibt,
(Strahlenpilze). Arten, zu denen gewöhnlich Kohlen- ebenfalls isoliert. Die Gegenwart des Anionenauswasserstoff
verbrauchende Microorganismen gehören, tauscherharzes während der fermentativen Einwirkung
die befähigt sind, Umwandlungsprodukte mit Car- führt zu einer deutlich stärkeren Produktion des Carboxylgruppen
zu bilden, sind Micrococcus, Coryne- 55 bonsäure-Umwandlungsproduktes durch die Mikrobakterium,
Nocardia, Pseudomonas, Mycobacterium, Organismen, als wenn dies auf andere Weise erhalten
Streptomyces, Aspergillus und Acetobacter. würde.·
Zahlreiche verschiedene Kohlenwasserstoffe können Ionenaustauscherharze sind bisher schon zusammen
durch mikrobiologische Einwirkung von solche Orga- mit Fermentierungsverfahren angewendet worden,
nismen oxydiert werden, wobei man Carbonsäureum- 60 doch gewöhnlich als Mittel zum Abtrennen von Prowandlungsprodukte
erhält. Dies gilt für Paraffine, die dukten aus der Brühe, nachdem die Fermentierung bevon
Methan bis zu Wachsen reichen, für Olefine mit endigt war. Die meisten Vorschläge für die Verwenstark
streuendem Molekulargewicht bis zu Alkyl- dung von Ionenaustauscherharzen auf dem Fermcnnaphthenen
und auch für Aromaten einschließlich tierungsgebiet betreffen die Isolierung von Antibiotica
Benzol, Alkylbenzole, Naphthalin, Alkylnaphthaline, 65 aus Fermentierungsflüssigkeiten. Eine Diskussion von
Anthracen, Phenanthren u. dgl. Einige wenige typische mikrobiologischen Anwendimgsmöglichkeiten solcher
Beispiele von Kohlenwasserstoffoxydationen, die so Harze und eine Liste von Literaturstellen, die sich
durclmeführt wurden, daß man Carbonsäuren erhielt, damit beschäftigen, findet sich in einem Aufsatz in
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US51254365 | 1965-12-08 | ||
US512543A US3419469A (en) | 1965-12-08 | 1965-12-08 | Production of carboxylic acids by microbiological oxidation of hydrocarbons |
DES0106937 | 1966-11-11 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE1593461A1 DE1593461A1 (de) | 1970-07-16 |
DE1593461B2 DE1593461B2 (de) | 1975-05-07 |
DE1593461C3 true DE1593461C3 (de) | 1976-01-22 |
Family
ID=
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