DE1593461B2

DE1593461B2 - Verfahren zur Herstellung von Carbonsäuren durch mikrobiologische Oxydation eines Kohlenwasserstoffes

Info

Publication number: DE1593461B2
Application number: DE1593461A
Authority: DE
Inventors: Arthur Earl Drexel Hill Humphrey; Richard Laverne Wilmington Raymond
Original assignee: Sun Research and Development Co
Current assignee: Sun Research and Development Co
Priority date: 1965-12-08
Filing date: 1966-11-11
Publication date: 1975-05-07
Also published as: US3419469A; FR1503381A; JPS5132714B1; NL6617111A; DE1593461A1; BE690898A; GB1111310A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Carbonsäuren durch mikrobiologische Oxydation eines Kohlenwasserstoffes, die in Gegenwart eines kohlenwasserstoffverbrauchendenMikrporganismus im Gemisch mit einer wäßrigen Nährsalzlösung für den Mikroorganismus durchgeführt wird.

Die mikrobiologische Oxydation von Kohlenwasserstoffen mit Hilfe von Mikroorganismen, die zur Bildung von Carbonsäuren als Produkte befähigt sind, ist bereits mehrfach beschrieben worden. Ein neuerer Überblick über dieses Gebiet findet sich in dem Lehrbuch »Advances in Enzymology«, Bd. 27, S. 469 bis 546 (Interscience Publishers, 1965). Viele Mikroorganismen sind befähigt, Kohlenwasserstoffe als Kohlenstoffquelle auszunutzen, und manche dieser Mikroorganismen wandeln den Kohlenwasserstoff nicht in Zellmaterial oder in Kohlendioxyd und Wasser um, sondern in Stoffwechselzwischenprodukte, die sich in dem Fermentierungsgemisch ansammeln. Verschiedene Arten von oxydierten, sauerstoffhaltigen Kohlenwasserstoffprodukten wurden bei solchen Fermentierungsreaktionen erzeugt. Carbonsäuren reichern sich oft als Folge der mikrobiologischen Einwirkung an. Zu Mikroorganismen, die hierzu befähigt sind, gehören Bakterien, Hefen, Schimmelpilze und Actinomyzeten (Strahlenpilze). Arten, zu denen gewöhnlich Kohlenwasserstoff verbrauchende Microorganismen gehören, die befähigt sind, Umwandlungsprodukte mit Carboxylgruppen zu bilden, sind Micrococcus, Corynebakterium, Nocardia, Pseudomonas, Mycobacterium, Streptomyces, Aspergillus und Acetobacter.

Zahlreiche verschiedene Kohlenwasserstoffe können durch mikrobiologische Einwirkung von solche Organismen oxydiert werden, wobei man Carbonsäureum-Wandlungsprodukte erhält. Dies gilt für Paraffine, die von Methan bis zu Wachsen reichen, für Olefine mit stark streuendem Molekulargewicht bis zu Alkylnaphthenen und auch für Aromaten einschließlich Benzol, Alkylbenzole, Naphthalin, Alkylnaphthaline, Anthracen, Phenanthren u. dgl. Einige wenige typische Beispiele von Kohlenwasserstoffoxydationen, die so durchgeführt wurden, daß man Carbonsäuren erhielt, sind folgende: Benzoesäure oder Phenylessigsäure aus n-Alkylbenzolen, die eine gerade oder ungerade Anzahl Kohlenstoffatome in der Alkylgruppe besitzen (Davis und Raymond, USA.-Patentschrift 30 57 784); Cyclohexanessigsäure aus n-Butylcyclohexan; Muconsäure aus Benzol; Salicylsäure aus Naphthalin (B r i 11 a u d, USA.-Patentschrift 3183 169); Methylnaphthoesäuren aus Dimethylnaphthalinen; Hydroxynaphthoesäuren aus Anthracen und Phenanthren; Adipin- und Pimelinsäuren aus Decalin und Methylhexansäuren aus 2-Methylhexan. Zahlreiche andere Oxydationen, die zu Carbonsäureprodukten aus Kohlenwasserstoffen führen, sind in dem obenerwähnten Lehrbuch und in den dort angegebenen Vorveröffentlichungen beschrieben.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, bei der mikrobiologischen Oxydation von Kohlenwasserstoffen in Gegenwart eines kohlenwasserstoffverbrauchenden Mikroorganismus die Ausbeute an Carbonsäuren zu verbessern und die Gewinnung des Endprodukts zu erleichtern.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Carbonsäuren durch mikrobiologische Oxydation eines Kohlenwasserstoffes mit Luft in wäßriger Nährsalzdispersion, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Oxydation in Gegenwart eines Anionaustauschharzes durchführt, nach beendeter Oxydation das Anionaustauschharz von dem Oxydationsgemisch abtrennt, aus ihm und gegebenenfalls zusätzlich aus der verbleibenden Flüssigkeit die restlichen Carbonsäuren in an sich bekannter Weise gewinnt.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird durch die Gegenwart eines Anionenaustauscherharzes überraschenderweise eine deutliche Verbesserung bei der Bildung der Carbonsäuren darstellenden Umwandlungsprodukte erreicht. Erfindungsgemäß werden daher oxydierte, sauerstoffhaltige Kohlenwasserstoff-Umwandlungsprodukte mit einer oder mehreren Carboxylgruppen im Molekül in besserer Ausbeute erhalten. Das erzielte Produkt hat mindestens 1 Carboxylgruppe und kann, muß aber nicht, andere sauerstoffhaltige Gruppen aufweisen, wie Hydroxyl-, Keto-, Aldehydgruppen u. dgl. Die als Produkt gebildete Carbonsäure unterliegt bei ihrer Bildung dem Ionenaustausch und wird an das Harz gebunden. Dann wird das Ionenaustauscherharz von dem Fermentationsmedium abgetrennt, und die als Umwandlungsprodukt erhaltene Carbonsäure wird aus dem Harz isoliert. Vorzugsweise wird auch die geringere Menge des Produkts, die gewöhnlich in Lösung in dem Medium verbleibt, ebenfalls isoliert. Die Gegenwart des Anionenaustauscherharzes während der fermentativen Einwirkung führt zu einer deutlich stärkeren Produktion des Carbonsäure-Umwandlungsproduktes durch die Mikroorganismen, als wenn dies auf andere Weise erhalten würde.

Ionenaustauscherharze sind bisher schon zusammen mit Fermentierungsverfahren angewendet worden, doch gewöhnlich als Mittel zum Abtrennen von Produkten aus der Brühe, nachdem die Fermentierung beendigt war. Die meisten Vorschläge für die Verwendung von Ionenaustauscherharzen auf dem Fermentierungsgebiet betreffen die Isolierung von Antibiotica aus Fermenlierungsflüssigkeiten. Eine Diskussion von mikrobiologischen Anwendungsmöglichkeiten solcher Harze und eine Liste von Literaturstellen, die sich damit beschäftigen, findet sich in einem Aufsatz in

3 4

»Bacteriological Reviews«, Bd. 24, S. 251 bis 260 (I960). und andere lösliche Verunreinigungen zu entfernen;

Auch in der USA.-Patentschrift 30 00 792 ist die die OH-Gruppen können durch andere Anionen, wie

Verwendung von Ionenaustauscherharzen bei Fer- Phosphat oder Chlorid, ersetzt sein, durch Behandlung

mentierungsmischungen während der Fermentierung des Harzes mit einer wäßrigen Lösung, die eine ent-

für die Bildung bestimmter Antibiotica beschrieben. 5 sprechende Konzentration eines solchen anderen

Diese Patentschrift zeigt, daß trotz einer Abnahme der Anions enthält, Obwohl ein solches Ersetzen der

Gesamtproduktion der gewünschten Antibiotica das OH-Gruppen nicht notwendig ist, kann es in manchen

Isolieren der Antibiotica aus den Harzen in größerem Fällen vorteilhaft sein. Vor seiner Anwendung ist es

Umfang (25 %) erfolgt, als wenn das Harz nur verwen- häufig auch erwünscht, das Harz mit Hilfe eines ge-

det wird, nachdem die Flüssigkeit ausgenutzt worden io eigneten Verfahrens zu sterilisieren, z.B., indem man es

ist. auf 130°C nach üblichem Sterilisierungsverfahren er-

AIs allgemeine Regel wurde bisher angesehen, daß hitzt.

die Ionenaustauscherharze eine schädliche Wirkung Fermentierungen von Kohlenwasserstoffen in Überauf das Wachstum von Mikroorganismen besitzen einstimmung mit der Erfindung können aerob auf be- und infolgedessen während der Fermentierung nicht 15 kannte Weise mit der Ausnahme durchgeführt werden, anwesend sein sollten. Dies wird z. B. in dem Lehr- daß ein Anionaustauscherharz mit der Flüssigkeit in buch von C a 1 m ο η und Kressmanmit dem Titel Berührung steht, solange die Fermentierungsreaktion »Ion Exchangers in Organic and Biochemistry« (Inter- voranschreitet. Die Menge des verwendeten Harzes science Publishers, Inc., 1957) angegeben, in dem auf^ kann stark schwanken und hängt von Faktoren, wie Seite 620 die hemmende Wirkung von Ionenaustau-' 20 seiner Ionenaustauschkapazität, dem zugeführten Kohscherharzen auf Mikroben angegeben ist. In gleicher lenwasserstoff und dem zur Bewirkung der Umwand-Weise wird in »Ion Exchange and Its Application« (Soc. lung verwendeten besonderen Mikroorganismus ab. of Chem. Ind., London, 1955) auf die sterilisierende Als allgemeine Regel sollte die Menge des Harzes wenig-Wirkung von Anionaustauscherharzen bei Mikro- stens die theoretisch benötigte sein, die zum Absorbieorganismen hingewiesen, wobei eine solche Wirkung 25 ren des größten Teiles des anfallenden Carbonsäurenicht nur der physikalischen Anziehungskraft der Produktes notwendig ist. Gewöhnlich haben handels-Zellen durch das Harz zugeschrieben wird, sondern übliche Anionaustauscherharze eine Austauschkapaauch seiner Fähigkeit, diese zu zerstören. Eine weitere zität im Bereich von 1 bis 2 Milliäquivalenten des Illustration dieser allgemeinen Auffassung findet man Carbonsäure-Umwandlungsproduktes pro Gramm in »Dissertation Abstracts«, Bd. 16, S. 1697 (1956), die 30 Harz, und ein Überschuß des Harzes über den aus der einen Auszug aus einer Doktorarbeit mit dem Titel bekannten Austauscherkapazität berechneten Wert »Studies of the Antimicrobial Properties of Ion Ex- wird verwendet. Ein beträchtlicher Überschuß ist nicht change Resins« enthält. schädlich mit der Ausnahme, daß große überschüssige Auf Grund des oben referierten beispielhaft ange- Mengen die Handhabungs- und Verfahrensprobleme gebenen Standes der Technik konnte man erwarten, 35 erhöhen. Typische Mengen Harz zur Verwendung bei daß die Gegenwart eines Ionenaustauscherharzes wäh- dem Verfahren liegen gewöhnlich im Bereich von 20 rend der Fermentierung von Kohlenwasserstoffen bis 200 g pro Liter Nährmedium,
schädlich sein würde, wenn man die Bildung eines Das bei dem Verfahren verwendete Nährmedium Kohlenwasserstoff - Carbonsäure - Umwandlungspro- sollte Quellen für verfügbaren Stickstoff, Phosphor, duktes wünscht. Die Anmelderin hat aber nun gefun- 40 Schwefel und Magnesium enthalten; es kann auch verden, daß im Gegenteil Mikroorganismen, die zur BiI- schiedene Spurenelemente und Vitamine, die Üblicherdung dieser Arten von Produkten befähigt sind, weise verwendet werden oder durch die besonderen tatsächlich mehr davon produzieren, vorausgesetzt, angewendeten Mikroorganismen erforderlich werden, ] daß das verwendete Ionenaustauscherharz ein Anion- enthalten. Mineralsalze, die üblicherweise zum Zuführt austauscher ist. Dieser Verbesserung wird im allgemei- 45 ren solcher Elemente bei biologischen Fermentierungs-.i nen erreicht, wenn Kohlenwasserstoffe irgendeines verfahren angewendet werden, können benutzt werden. ΐ Typs biologisch unter Bildung von sauerstoffhaltigen Beispiele für geeignete Stickstoffquellen sind Ammo-Kohlenwasserstoffen oxydiert werden, die wenigstens niumsalze, wie (NH₄)₂SO₄ oder NH₄Cl, Nitratsalze, eine Carboxylgruppe pro Molekül enthalten. wie NH₄NO₃ oder NaNO₃, Harnstoff, Sojabohnen-Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Ver- 50 mehl und andere organische Stickstoffquellen. Die fol-

fahrens kann entweder ein schwaches Anionaustau- gende Tabelle erläutert eine geeignete Mineralsalz-' scherharz oder ein starkes Anionaustauscherharz ver- mischung, die sich für die Zwecke der Erfindung _r wendet werden. Verschiedene typische Anionaustau- eignet.

' scherharze stehen im Handel zur Verfügung, und jedes Konzentration

. dieser Harze, das genügend Reinheit besitzt, kann ver- 55 ^ε' ²

j wendet werden. Diese Harze bestehen im allgemeinen w rn ^

aus einer Styrol-Divinylbenzol-Matrix, an der sich nni ür\ ^'*

, basische, stickstoffhaltige Gruppen befinden, die im CaCIg-2H₂O 0,01

, Falle der schwach basischen Austauscher Aminogrup- MnSO₄ · H₂O 0,02

I^I pen sind und quaternäre Ammoniumgruppen im Falle 60 FeSO₄ · 7H₂O 0,005

j des stark basischen Typs. Vorzugsweise werden für die Na₂HPO₄ 3,0

. Zwecke der Erfindung schwache Anionaustauscher- KH₂PO₄ 2,0

. harze verwendet. Die im Handel verfügbaren Harze Harnstoff 2,0

Ϊ besitzen gewöhnlich Hydroxylgruppen,wenn dasAnion

, mit diesen stickstoffhaltigen Gruppen assoziiert ist. 65 Diese Mineralsalzmischung besitzt normalerweise

_r Vor der Anwendung bei dem erfindungsgemäßen Ver- einen pH-Wert von etwa 7,1. Wenn man die Fermen-

.j fahren sollte das Harz gründlich mit Wasser gewaschen tierung bei einem pH-Wert unterhalb 7 durchführen

j werden, um jeden Überschuß an basischem Stickstoff möchte, kann die Menge an KH₂PO₄ im Verhältnis zu

5 . 6

Na₂HPO₄ erhöht werden, um den pH-Wert auf einen gehalten werden. Beispielsweise kann sich das Ionengeringeren Wert zu bringen. austauscherharz innerhalb des Fermentierungsgefäßes Die Fermentierung kann absatzweise oder konti- in einer Kammer befinden, die durch eine Membran nuierlich durchgeführt werden, indem man entweder bzw. ein Gitter gebildet ist, durch welches die gerührte, Wachstumsbedingungen oder Nicht-Wachstumsbedin- 5 Zellen enthaltende Flüssigkeit fließt und mit dem Harz gungen einhält. Bei einem Weg zur Durchführung der in Berührung kommt. Das Harz kann auch in einer Erfindung wird eine Mischung von Nährmedium und Zone außerhalb des Belüftungsgefäßes angeordnet sterilisiertem Anionenaustauscherharz in einem Fer- sein, und die zu fermentierende, zellenenthaltende mentierungsgefäß hergestellt, das mit Mitteln zum Ruh- Mischung kann kontinuierlich vor und zurück zwischen ren und zum Belüften versehen ist. Die Mischung wird io den beiden Gefäßen im Kreislauf geführt werden, mit dem ausgewählten Kohlenwasserstoff verbrauchen- Irgendeine andere geeignete Weise zur Durchführung den Mikroorganismus geimpft, und die Fermentierung der Fermentierung kann angewendet werden, vorausgewird dann eingeleitet, indem man den Kohlenwasser- setzt, daß die zellenenthaltende Brühe zum Entfernen stoff zugibt, während man Fermentierungsbedingun- des Carbonsäure-Umwandlungsproduktes kontinuiergen einhält. Im allgemeinen wird eine Temperatur von 15 Hch das Anionenaustauscherharz berührt, wenn die 20 bis 40° C angewendet, und der pH-Wert wird im Be- Fermentierung voranschreitet.

reich von 4 bis 9, gewöhnlich von 6 bis 8, gehalten. Wie oben erwähnt, kann entweder ein schwach ba-Der Kohlenwasserstoff kann kontinuierlich oder ab- sisches oder ein stark basisches Anionenaustauschersatzweise zugegeben werden, während die Mischung harz für die vorliegenden Zwecke verwendet werden. Es gründlich gerührt und belüftet wird. Vorzugsweise 20 ist jedoch gewöhnlich vorzuziehen, schwache Auswird der Kohlenwasserstoff im Verlauf der Fermentie- tauscherharze zu verwenden, da höhere Ausbeuten des rung laufend und nicht auf einmal zugegeben. Der gewünschten Carbonsäureproduktes oft erhalten wer-Ausgangskohlenwasserstoff kann am Beginn der Fer- den, wenn man so verfährt. Nach dem Fermentieren mentierung zugegeben werden, oder man kann die kann das Isolieren des Produktes von dem Harz da-Zellen zunächst auf irgendeinem Substrat wachsen 25 durch erfolgen, daß man es mit einer wäßrigen Lölassen und den Kohlenwasserstoff später zu geeigneten sung einer Säure wie Salzsäure, Phosphorsäure, Amei-Zeitpunkten während der Fermentierung zufügen. sensäure oder Essigsäure in Berührung bringt. In Wenn die Fermentierung zu dem gewünschten Carbon- manchen Fällen kann das Carbonsäureprodukt in säure-Umwandlungsprodukt vorangeschritten ist, un- Wasser unlöslich, jedoch in einem Alkohol löslich sein, terliegt letzteres bei seiner Bildung dem Ionenaustausch 30 wobei in diesem Fall Methanol oder Äthanol zur Her- und wird an das Harz gebunden, mit Ausnahme einer stellung des säureverdrängenden Mediums dienen kleinen Menge des Produktes, das gewöhnlich in der kann. Als alternatives Verfahren kann jede Form eines Flüssigkeit im Gleichgewicht mit der Harzphase gelöst Anionaustauscherharzes mit Hilfe von Ätznatron oder bleibt. Die Zugabe von Kohlenwasserstoff wird vor- anderem Alkalihydroxyd regeneriert werden. Wenn zugsweise fortgesetzt, bis die maximale Anreicherung 35 dies geschieht, wird das Produkt in Form seiner Alkalides Carbonsäureproduktes erfolgt ist. Das Anionaus- salze und nicht als freie Carbonsäure erhalten,
tausch^rharz wird von der Flüssigkeit z. B. durch Besonders interessante Anwendungsmöglichkeiten Filtriersn abgetrennt, und danach wird das Carbon- für die Verwendung von Anionaustauscherharzen nach säure-Umwandlungsprodukt von dem Harz durch Be- dem erfindungsgemäßen Verfahren bestehen in der Umhandlung mit einer wäßrigen Lösung von Alkali oder 4° Wandlung verschiedener aromatischer Kohlenwasser-Säure abgesondert. Falls erwünscht, kann die kleinere stoffe in sauerstoffhaltige Säureprodukte von techni-Menge an Carbonsäureprodukt, die in der Flüssigkeit ■ schem Interesse. Die folgenden aromatischen Kohlenzurückbleibt, auch abfiltriert oder aus den Zellen ab- Wasserstoffumwandlungen sind von besonderem Intez>ntrifugiert werden oder durch Ansäuern der über- resse:

stehenden Anteile und anschließend;s Extrahieren mit 45 (1) Umwandlung von methylsubstituierten Benzo-

Hilfe eines geeigneten Lösungsmittels, wie Äther, ent- len in methylsubstituierte Muconsäuren durch beson-

fernt werden. dere Stämme von Nocardia, wie diese in der gleichzei-

Die Erfindung kann auch durchgeführt werden, tig eingereichten Patentanmeldung mit dem Titel

ohne daß das Anionenaustauscherharz mit der gesam- »Verfahren zur mikrobiologischen Oxydation von

ten Fermentierungsflüssigkeit vermischt wird, wie dies 5° Alkylbenzolen« DT-OS 15 93 460 beschrieben ist. Ein

oben beschrieben ist. Tatsächlich kann das Rühren der Beispiel ist die Bildung von oc,«'-Dimethylmuconsäure

Flüssigkeit mit dem betreffenden darin dispergierten (im folgenden als DMMA bezeichnet) aus p-Xylol

Harz nachteilig sein, weil es eine Zerkleinerung des mit Hilfe eines Stammes von Nocardia coral-

Harzes in so feine Teilchen verursacht, daß sie zur er- 1 i η a, eine Kultur, die bei dem American Type CuI-

• neuten Verwendung bei dem Verfahren ungeeignet 55 ture Collection, Washington D. C, unter der Nummer

sind. Da die Kosten des Harzes einen wesentlichen Teil ATCC 19 070 hinterlegt ist. Die Umwandlung läßt

der Gesamtkosten des Verfahrens ausmachen, ist es sich durch die folgende Gleichung erläutern:
sehr erwünscht, daß das Harz in einer zur erneuten

Verwendung geeigneten Form isoliert werden kann. j ³ S^{1 3}

Die im Handel verfügbaren Harze variieren beträcht- 60 I I

lieh hinsichtlich ihrer Beständigkeit unter Rührbe- \ I COOH

dingungen, die bei Fermentierungsverfahren angewen- | "*" |

det werden, so daß manche Harze befriedigend bei dem X/ \/

oben beschriebenen Verfahren verwendet werden kön- j j

nen, während sich andere als ungeeignet erweisen. Um 65 ^^ ^,^

die Möglichkeit der Zerkleinerung des Harzes zu ver- ^{3 3}

meiden, kann es innerhalb des Fermentierungssystems p-Xylol α,α'-Dimethylmuconsäure

an einer von dem Rührwerk abgesonderten Stelle (DMMA)

Ergänzungsblatt zur Auslegeschrift 15 93 461

IntCl.²: C 07 C 51-20

Bekanntmachungstag: 7. Mai 1975

(2) Umwandlung von methylsubstituierten Benzolen in 2,3-Dihydroxybenzoesäuren und Alkylbenzoesäuren mit Hilfe von anderen Stämmen von Nocardia, wie dies ebenfalls in der obenerwähnten DT-OS beschrieben ist. Ein Beispiel hierfür ist die Umwandlung von p-Xylol nach der folgenden Gleichung. Mit Hilfe eines Stammes von Nocardia salmonicolor, nach dem American Type Culture Collection als ATCC Nr. 19 149 angegeben oder mit einem anderen Stamm von Nocardia corallina, ATCCNr. 19 147.

COOH

ir^0H

;'—OH

CH₃

2,3-Dihydroxy-

p-toluylsäure

(DHPT)

CH₃

p-Toluylsäure (PTA)

(Diese speziellen Säureprodukte werden der Einfachheit halber im folgenden als DHPT bzw. PTA bezeichnet.)

(3) Umwandlung von Naphthalin in Salicylsäure unter Verwendung beispielsweise von Corynebakterium renale ATCC Nr. 15 075, wie dies in der USA.-Patentschrift 3183169 beschrieben ist und durch die folgende Gleichung sich darstellen läßt:

/N₁-COOH

^: Loh

SA/

Naphthalin

(4) Umwandlung von Dimethylnaphthalinen in Methylcarboxynaphthaline mit Hilfe beispielsweise von Streptomyces achromogenes ATCC Nr. 15 077, wie dies in der US-PS 33 40 159 von D ο u r ο s und Raymond vom 18. September 1963 beschrieben ist. Eine Gleichung, die diese Reaktion erläutert, ist folgende:

H₃C—·

-CH³

H₃C

COOH

2,6-Dimethylnaphthalin

6-Methyl-2-naphthoesäure

Eine analoge Umwandlung ist die Überführung von 2-Methylnaphthalin in 2-Naphthoesäure durch Pseudomonas aeruginoea (vgl/ »Oxygenases« von H a y a i s h i, S. 266, Academic Press, 1962).
(5) Umwandlung von Anthracen und Phenanthren mit Hilfe von Pseudomonas aeruginosa in Hydroxynaphthoesäuren (»Oxygenases«, S. 267 und 268).

Die obige Aufzählung stellt lediglich eine Erläuterung von Umwandlungen dar, für die das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft angewendet werden kann. Es könnten noch viele andere spezielle Kohlenwasserstoffumwandlungen angegeben werden, bei denen die Verwendung eines Anionaustauscherharzes während der Fermentierung eine deutliche Erhöhung der Ausbeute des gewünschten Carbonsäureproduktes bewirkt.

Die Art des Anfangswachstums der Mikroorganismen und die Zeit, die erforderlich ist, um die Kohlenwasserstoffumwandlung zu bewirken, um eine maximale Ausbeute des gewünschten Produktes zu erzielen, kann stark variieren in Abhängigkeit von dem betreffenden Mikroorganismus und dem Ausgangskohlenwasserstoff. Wenn beispielsweise die obenerwähnten Nocardia-Stämme unter Wachstumsbedingungen zur Umwandlung von p-Xylol verwendet werden, ist es im allgemeinen erwünscht, das Wachstum unter Verwendung von n-Hexadecan oder Fettöl als Substrat zu beginnen und das Wachstum 12 bis 36 Stunden lang zuzulassen, bevor das p-Xylol zugegeben wird. Während dieser Zeit braucht das Anionaustauscherharz nicht anwesend zu sein, doch kann es anwesend sein, da es das Wachstum nicht hindert, vorausgesetzt, daß es von geeigneter Reinheit ist. Nach dieser Anfangswachstumsperiode wird das p-Xylol kontinuierlich oder intermittierend vorzugsweise mit etwa der Geschwindigkeit zugegeben, mit der es verbraucht wird, und vorzugsweise im Gemisch mit einer kleineren Menge von n-Hexadecan, um das Wachstum zu unterstützen. Das Anionaustauscherharz kann unmittelbar nach der Zugabe des p-Xylols oder etwas später zugegeben werden, wenn die Menge des Produktes nennenswert wird. Das gesamte Harz kann auf einmal zugegeben werden, oder es kann in zunehmenden Mengen im Verlauf der Fermentierung zugefügt werden. Bei Umwandlungen dieser Art werden gewöhnlich maximale Ausbeuten an DMMA, DHPT oder PTA in 4 bis 6 Tagen nach Beginn der p-Xylol-Zugabe erhalten.

WennNocardiaorganismenunterNicht-Wachstumsbedingungen für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden, werden die gewachsenen Zellen, wie oben beschrieben, von der Flüssigkeit abzentri-

fugiert und mit Phosphatpufferlösung gewaschen, dann erneut in einer Phosphatpufferlösung suspendiert. Typischerweise wird die Suspension bei z. B. 30° C gehalten, und das p-XyloI, gemischt mit einer kleinen Menge n-Hexadecan, wird periodisch oder kontinuierlich zugegeben,· während" die Mischung belüftet und gerührt wird. Die Zugabe des Substrates wird fortgesetzt, bis die Fermentierung eine optimale Ausbeute des gewünschten Säureproduktes ergeben hat. ·.-■..·- ■ ■> Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung. Zur Durchführung dieser Beispiele eignet sich eine Nährsalzlösung, deren Zusammensetzung vorstehend angegeben wurde.

Beispiel 1

Eine Gruppe von vier Schüttelkolbenansätzen wurde durchgeführt, wobei in jedem p-XyJol mit Hilfe von Nocardia corallina ATCC Nr. 19 147 ausgesetzt wurde. Dieser Mikroorganismus gibt als Produkte aus p-Xylol sowohl die Hydroxy-p-toluylsäure (DHPT) als auch p-Toluylsäure (PTA). Er wächst gut auf n-Hexadecan, und infolgedessen wurde Paraffin für das Anfangswachstum der Zellen und als Substrat während der Umwandlungsreaktion verwendet. Ein Ansatz diente als Kontrollversuch, bei dem kein Austauscherharz verwendet wurde. Bei den anderen drei Ansätzen wurde ein schwach basisches handelsübliches Handelsaustauscherharz in wechselnden Meng'en verwendet, wie^rdies in der folgenden Tabelle angegeben ist. Das Harz war in der Phosphatform, nachdem es ausgewaschen und mit einer Lösung von KH₂PO₄ und Na₂HPO₄, enthaltend etwa 5 Milliäquivalente Phosphationen, dem Ionenaustausch unterworfen wurde. Das Harz wurde auch durch Wärmebehandlung sterilisiert. Bei dem Verfahren dieser Ansätze erfolgte das Impfen von 100 ml Nährsalzlösung in einem 500-ml-Schüttelkolben mit den Organismen, worauf der Kolben bei 30° C geschüttelt und periodisch mit kleinen Mengen n-Hexadecan für das Zellenwachstum im Verlauf von 6 Tagen versetzt wurde. Dann wurden täglich Anteile von p-Xylol zugegeben, so wie es verbraucht wurde, wobei die Zugaben in Form von 0,2-ml-Anteilen einer 90: 10-Mischung von p-Xylol: n-Hexadecan erfolgten. Bei den drei Ansätzen wurde der Anionenaustauscher verwendet, wobei ungefähr die Hälfte bei der ersten Zugabe von p-Xylol (d.h. am 6.Tag) und der Rest am 11.Tag zugegeben wurde. Alle Ansätze ließ man insgesamt 14 Tage lang laufen. Die Produkte wurden dann aufgearbeitet und analysiert. Dies erfolgte durch Abdekantieren der Gärflüssigkeit von dem Harz, Abfiltrieren der Zellen von der Flüssigkeit und Isolieren der Carbonsäure aus der Flüssigkeit und dem Harz in Form von Methanollösungen. Die filtrierte Flüssigkeit wurde mit HCl angesäuert und mit Äthyläther ausgezogen; der Äther wurde verdampft, der Rückstand in Methanol gelöst und die entstandene Lösung durch UV-Spektroskopie analysiert. Das Harz wurde mit einer 5%igen HCl-Lösung in Methanol behandelt, um die Produkte daraus zu verdrängen; die Lösung des methanolischen Reaktionsproduktes wurde in gleicher Weise analysiert. Die Tabelle I zeigt die Konzentration von DHPT und PTA in der endgültigen Mischung für jeden Ansatz in Gramm pro Liter der gesamten Mischung.

Tabelle I

Umwandlung von p-Xylol mit ATCC Nr. 19 147

Ansatz Nr.	1	Menge an Harz g/l	Carbonsäureprodukte	_	Vo PTA
'■	_lo (Kontroll	Mischung	insgesamt %DHPT
versuch)	0	0,1
2			21
3		•	18	79
4	21	3,8	22	82
45	4,5		78
90	5,5

Aus den Ergebnissen kann man sehen, daß die Verwendung des Anionaustauscherharzes während der Fermentierung eine deutliche Verbesserung ver-

ao ursacht. Wenn kein Harz verwendet wird, wurden nur sehr wenig Carbonsäureprodukte erhalten. Die Gegenwart von Harz verursacht eine deutliche Zunahme der Mengen an DHPT und PTA. Die Ausbeuten dieser Säuren werden verbessert, wenn die Menge des Harzes erhöht wird.

Beispiel 2

Eine andere Gruppe von Ansätzen wurde im wesentlichen in der gleichen Weise unter Verwendung der gleichen Bedingungen, wie in den vorhergehenden Beispielen, durchgeführt, mit der Abweichung, daß als Mikroorganismus Nocardia salmonicolor ATCC Nr. 19 149 verwendet wurde. Wiederum wurden sowohl DHPT als auch PTA produziert, und die Ergebnisse, bestimmt durch UV-Spektroskopie, sind in der Tabelle II zusammengestellt.

Tabellen

Umwandlung von p-Xylol mit ATCC Nr. 19 149

Ansatz Nr.

Menge an
Harz g/l
Mischung

Carbonsäureprodukte
insgesamt Vo DHPT VoPTA

5	0	0,1	—	—
(Kontroll
versuch)
6	21	2,0	25	75
7	45	3,0	20	80
8	90	5,3	28	72

Man kann sehen, daß die Ergebnisse mit diesem Mikroorganismus ungefähr die gleichen sind wie mit dem Stamm Nocardia corallina des ersten Beispiels.

Eeispiel 3

Drei Schüttelkolben-Vergleichsansätze wurden zum Überführen von p-Xylol mit Hilfe von Nocardia corallina ATCC Nr. 19 070 durchgeführt; dieser Organismus ist zur Umwandlung von p-Xylol in DMMA befähigt. Ein Ansatz war ein Vergleichsversuch ohne Harz, während die beiden anderen

Bei allen drei Ansätzen konnte als einzige Carbonsäure in dem Produkt nur DMMA nachgewiesen werden. Die Ergebnisse zeigen erneut die Tatsache, daß die Gegenwart des Anionaustauschers während der Fermentierung deutlich die Ausbeute erhöht. Die Werte zeigen, daß durch das schwach basische Harz eine stärkere Verbesserung der Ausbeute als durch das stärker basische Material bewirkt wird. "

Beispiel 4

Mehrere Schüttelkolbenversuche wurden durchgeführt, um die Wirkung eines Anionaustauscherharzes vom schwach basischen Typ bei der Umwandlung von Naphthalin in Salicylsäure mit Hilfe von Corynebacterium n. sp. zu zeigen. Ein Ansatz war ein Ver- ¹S gleichsversuch, und bei den anderen beiden Ansätzen wurden verschiedene Mengen Anionaustauscher verwendet. Bei jedem Ansatz wurden 100 ml der gleichen Nährsalzlösung verwendet, zu der* 0,01 °/o Hefeextrakt gegeben wurde. Ferner wurde etwa 1 g Naphthalin am Anfang zugegeben. Bei Ansatz 13 wurden etwa 20 g/l Harz nach 24 Stunden und weitere 20 g/l nach 72 Stunden zugefügt, während bei Ansatz 14 zweimal die gesamte Menge Harz in Anteilen von 20 g/l anfangs und von 20 g/l nach *5 24 Stunden und 40 g/l nach 72 Stunden zugegeben wurde. Die Kolben wurden bei 30° C gehalten und etwa 7 Tage geschüttelt. Als einziges Produkt wurde Salicylsäure erhalten; deren Gesamtausbeute, bestimmt durch UV-Analyse, ist in der Tabelle IV angegeben.

sich als wichtigste Carbonsäure angereichert hatte. PTA hatte sich bei diesen Ansätzen ebenfalls in kleineren Mengen gebildet, doch konnte dessen Gehalt nicht bestimmt werden. Als Anionaustauscherharze wurden schwach basische Typen verwendet, nämlich zwei verschiedene, im Handel verfügbare Produkte (mit »A« und »B« bezeichnet), von denen jeder durch Ionenaustausch in die Chloridform und auch in die Phosphatform überführt worden war. Die Ergebnisse sind in der Tabelle V zusammengestellt.

Tabelle V

Umwandlung von p-Xylol mit ATCC Nr. 19071

An	Verwendetes Harz	DMMA-Ausbeute,	im Harz	insgesamt
satz		g/l Mischung
Nr.		in der
		Flüssig	5,9	9,4
		keit	5,2	6,8
15	Harz A — Chlorid	3,5	0,2	1,9
16	Harz A—Phosphat	1,6	0,5	1,8
17	Harz B — Chlorid	1,7
18	Harz B—Phosphat	1,3

Tabelle IV

Umwandlung von Naphthalin mit Corynebacterium n. sp.

Ansatz Nr. Menge des ver- Gesamtausbeute an

wendeten Harzes Salicylsäure

g/l g/l

12 keine
(Kontrollversuch)

13 40

14 80

1,5

4,1
5,7

35

40

45

Die Ergebnisse demonstrieren erneut die Wirksamkeit von Anionaustauscherharzen bei der Erhöhung der Ausbeute eines Carbonsäureprodukts bei der Kohlenwasserstoff-Fermentierung.

Beispiel 5

Ein Ansatz wurde in einem 40-1-Fermentierungsgefäß ohne Ionenaustauscherharz durchgeführt, zur Umwandlung von p-Xylol mit Hilfe von Nocardia corallina durch ATCC Nr. 19 071, der eine Mutante des in Beispiel 3 verwendeten Stammes ist. Nach Ablauf von 24 Stunden hatte sich etwas DMMA angesammelt, jedoch nur in einer Menge von 0,5 g/l; die Umwandlung wurde unterbrochen. Verschiedene Proben (100 ml) der Flüssigkeit wurden dann in Schüttelkolben überführt, zu denen verschiedene Anionaustauscherharze in einer Menge von 30 g/l gegeben wurden. Die Mischungen wurden kontinuierlich bei 30⁰C geschüttelt, und kleine Anteile einer 90: 10-Mischung von p-Xylol wurden von Zeit zu Zeit in dem Maße zugegeben, wie die Fermentierung voranschritt. Nach Ablauf von 45 Stunden wurde die Brühe gewonnen und auf DMMA analysiert, die Diese Ergebnisse zeigen, daß die durch Verwendung eines Anionaustauscherharzes erzielte Ausbeuteverbesserung in Abhängigkeit von dem betreffenden Harz schwanken kann, daß jedoch in jedem Fall eine wesentliche Verbesserung erzielt werden kann. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren konnten Zellen, die nur 0,5 g/l DMMA gebildet hatten und deren Produktion aufgehört hatte, dazu veranlaßt werden, beträchtlich mehr DMMA durch die Gegenwart der Harze zu produzieren, als dies ursprünglich erfolgte. Beide Formen an Harz A führten zu einer bemerkenswerten (13- bis 19fach) Steigerung der Bildung dieser Dicarbonsäure.

Beispiel 6

Dieses Beispiel erläutert die Anwendung der Erfindung auf die Bildung p-Toluylsäure (PTA) in hoher Ausbeute aus p-Xylol. Der Mikroorganismus war Nocardia corallina ATCC Nr. 19 147, ein Stamm, der im Beispiel 1 verwendet wurde. Jedoch wurden unter den Bedingungen des vorliegenden Ansatzes nur Spurenmengen an DHPT gebildet. Die Fermentierung erfolgte in einem 2800-ml-Fernbach-Rührkolben unter Verwendung von 500 ml Nährsalzlösung und bei einer Temperatur von 30⁰C. Nach dem Impfen der Mischung wurde n-Hexadecan (2 ml; in Anteilen) für das Wachstum des Mikroorganismus während der ersten 3 Tage verwendet. Dann wurde mit der Zufuhr von p-Xylol-Anteilen, gemischt mit einer kleinen Menge n-Hexadecan, begonnen. Die Mengen waren 9 ml einer 75 : 25-Mischung, während der 3- bis 5-Tage-Periode und 35 ml einer 90:10-Mischung während der 5- bis 13-Tage-Periode. Die Zufuhr der 90: 10-Mischung wurde bis zum 18. Tag fortgesetzt; die Ansammlung von PTA dauerte ohne Anzeichen eines Abfalles der mikrobiologischen Aktivität an. Am 9. und 11. Tag wurde schwach basisches Anionaustauscherharz in Phosphatform in Mengen von 10 bzw. 50 g/I zugegeben. Proben der Flüssigkeit wurden in Abständen während der Fermentierung entnommen, und der gesamte Gehalt an PTA, ermittelt durch UV-Analyse, ist in der Tabelle VI angegeben.

Tabelle VI

Umwandlung von p-Xylol mit ATCC Nr. 19 147 (Ansatz Nr. 19)

Tage seit Menge an vorhan- PTA-Ausbeute

Versuchsbeginn denem Harz, g/l g/l Mischung

10

60

0,2 0,3 1,0

9,2 13,6 15,0 24,2

Fall 0,2% Pepton und 0,1 °/o Fleischbrühextrakt, und sein pH-Wert wurde auf etwa 6,5 gehalten. Nach dem Impfen ließ man den Organismus auf n-Hexadecan 36 Stunden lang wachsen, und danach wurde p-Xylol in kleinen Mengen von Zeit zu Zeit zugegeben, solange die Mischung gerührt und bei 3O⁰C belüftet wurde. Jeder Ansatz wurde insgesamt 120 Stunden lang durchgeführt, und es wurden insgesamt 24 ml p-Xylol verwendet. Die Arten unc" die Mengen der Produkte einschließlich derjenigen die an dem Anionaustauscherharz absorbiert waren und diejenigen, die in der Flüssigkeit enthalter waren, wurden dann bestimmt. Die Ergebnisse sine in der Tabelle VII zusammengestellt.

Die in der Tabelle zusammengefaßten Ergebnisse zeigen nur einen niederen Wert für die PTA-Bildung an, bis das Anionaustauscherharz zugegeben wurde. Nach dessen Zugabe stellte sich eine hohe Geschwindigkeit der PTA-Ansammlung ein, und es zeigte sich eine bemerkenswert gute Ausbeute.

B e i s ρ i e 1 7

Zwei Ansätze wurden in Fermentierungsrührgefäßen unter Verwendung von Nocardia corallina ATCC Nr. 19 070 durchgeführt. Bei einem Ansatz (Ansatz Nr. 21) wurde eine Mischung von 480 ml eines schwach basischen Aniönaustauscherharzes (48 g/l) und genügend Nährsalzlösung verwendet, so daß sich ein gesamtes Volumen von 3000 ml ergab. Der andere Ansatz (Ansatz Nr. 20) war ein Kontrollversuch unter Verwendung von 3000 ml Nährsalzlösung ohne Harz. Das Medium enthielt in jedem

Tabelle VII

Umwandlung von p-Xylol mit ATCC Nr. 19070

Produkt

Menge des Reaktionsprodukts, g/l
ohne Harz mit Harz

(Ansatz Nr. 20) (Ansatz Nr. 21)

DMMA	0,2	12,2
DHPT	0	0,7
PTA	0	1,0
DMC*)	0	0,5

*) S.ö-Dimethylcatechin.

Die Ergebnisse zeigen eine starke Verbesserui der Menge an Reaktionsprodukt, besonders ί DMMA als Ergebnis der Verwendung des Anio· austauschers.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Carbonsäuren durch mikrobiologische Oxydation eines Kohlen-Wasserstoffes mit Luft in wäßriger Nährsalzdispersion, dadurch gekennzeichnet, daß man die Oxydation in Gegenwart eines Anionaustauscherharzes durchführt, nach beendeter Oxydation das Anionaustauschharz von dem Oxydationsgemisch abtrennt, aus ihm und gegebenenfalls zusätzlich aus der verbleibenden Flüssigkeit die restlichen Carbonsäuren in an sich bekannter Weise gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Anionaustauscherharz ein schwach basisches Anionaustauscherharz verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Anionaustauscherharz in einer Menge von 20 bis 200 g pro Liter Nährmedium verwendet.