DE1923021A1

DE1923021A1 - Verfahren zur Abtrennung und Reinigung von Mikroorganismen aus einer Fermentationsmasse

Info

Publication number: DE1923021A1
Application number: DE19691923021
Authority: DE
Inventors: Claude Gatellier; Georges Glikmans
Original assignee: IFP Energies Nouvelles IFPEN
Current assignee: IFP Energies Nouvelles IFPEN
Priority date: 1968-05-10
Filing date: 1969-05-06
Publication date: 1969-11-20
Also published as: US3625832A; BE732067A; FR1591574A; BR6908662D0; GB1207656A; NL6907115A; SE353919B; IT1047877B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung und Reinigung von Mikroorganismen und insbesondere von Hefe aus einer Fermentationsmasse} dieses Verfahren dient zur Isolierung der Gesamtheit der Mikroorganismen und insbesondere derjenigen Produkte, die in einer Mikroorganismenkultur in Anwesenheit von Sauerstoff in einem Milieu bzw. Medium entwickelt wurden, das neben den Mikroorganismen einen oder mehrere Kohlenwasserstoffe (im allgemeinen eine Kohlenwasserstoff-Fraktion) und ein wässriges Nährmedium mit einem Gehalt an mineralischen Salzen und organischen Substanzen, beispielsweise Vitaminen, die zum Wachstum dieser Mikroorganismen nötig sind, enthält.

Es ist bekannt, dass das Kulturmilieu, das vom Fermentator, d.h. vom Gefäss, in dem diese Kultur sich entwickelte, abgezogen

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wird, aus einer mehr oder weniger verdickten Emulsion besteht, die die Mikroorganismen, zum Beispiel die Hefe, ferner nicht verbrauchte Kohlenwasserstoffe (in Form einer Kohlenwasserstoff-Fhase oder in an den Wänden der Hefeteilchen adsorbiertem Zustand), sowie eine gewisse Menge an wässrigem mineralischen Milieu enthält. Durch eine konservative Zentrifugierung ist es im allgemeinen unmöglich, die Hefeteilchen völlig abzutrennen, ohne dass diese 'durch eine gewisse Kohlenwasserstoff menge verunreinigt bleiben.

Um die Hefeteilchen, die man solchermassen durch Zentrifugierung erhalten hat, zu reinigen, wurden bislang ergänzende Behandlungen vorgeschlagen, wie beispielsweise eine Reihe von Waschungen mit Wasser, das ein die Oberflächenspannung herabsetzendes Mittel (Netzmittel) enthältjanschliessend wurde sodann im allgemeinen mit reinem Wasser nachgewaschen· Dabei war, worauf besonders hinzuweisen ist, nach jeder Waschung eine Zentrifugierung der Hefeteilchen notwendig.

Aber selbst wenn man diese Waschoperationen mehrmals hintereinander durchführt, musste festgestellt werden, dass die solchermassen behandelten Hefeteilchen immer noch nicht genügend gereinigt waren.

Man hat daher ferner vorgeschlagen, die solchermassen gewaschenen und abzentrifugierten Hefeteilchen mit Lösungsmitteln, wie leichten gesättigten Kohlenwasserstoffen, wie beispielsweise mit Hexan, ferner mit aromatischen Kohlenwasserstoffen, wie beispielsweise mit Benzol, aus s er dem mit Äthern, Alkoholen, wie Isopropanol und Äthanol oder auch mit Gemischen dieser Lösungsmittel, in Berührung zu bringen.

Jedoch ist eine Folge solcher Wasch- und Zentrifugierungs-Operationen nicht nur langwierig und kostspielig, sondern es ist darüber hinaus der ersielte Reinigungsgrad der solcher- massen behandelten Hefeteilchen weit davon entfernt, völlig

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befriedigend zu sein.

Vorliegender Erfindung liegt nun die überraschende Erkenntnis zugrunde, dass man eine wirksame Abtrennung und gleichzeitige Reinigung der Hefeteilchen dadurch bewirken kann, dass man die oben beschriebene Ausgaigsemulsion (Komposition aus Mikroorganismen, Wasser und Kohlenwisserstoffen) mit

a) zumindest einem Dialkylketon, das zumindest vier Kohlenstoffatome enthält, wie beispielsweise Methyläthylketon, Diäthylketon, Methylisobutylketon, Propyläthylketon und

b) zumindest einem anderen Lösungsmittel aus der Gruppe Aceton, % Äthanol, Propanol, Isopropanol und Tertiärbutanol,

in Berührung bringt.

Man kann dieses Inberührungbringen der Ausgangs emulsion mit den oben definierten Lösungsmittels! in jedem geeigneten Behälter, vorzugsweise unter gleichzeitigem heftigem Rühren, durchführen.

Die vorliegende Erfindung beruht ebenfalls auf der überraschenden Erkenntnis, dass nach der Beendigung dieses Rührvorgangs sehr rasch eine übereinanderanordnung von drei Phasen stattfindet,

und zwar in der Reihenfolge kleiner werdender Dichte: Λ

1) Eine wässrige Aufschlämmung der Mikroorganismen, zum Beispiel der Hefeteilchen,

2) eine flüssige Zwischenschicht, die reich ist an Wasser und an Lösungsmittel der Gruppe b) und

3) eine flüssige Schicht, die reich ist an Lösungsmitteln der Gruppe a) und an rückständigen Kohlenwasserstoffen.

Es ist festzustellen, dass die wässrige Aufschlämmung der Hefeteilchen, die pastenartig ist und die also am unteren Teil

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des Behälters angeordnet ist, sich nicht in Kontakt mit der leichten Phase befindet, die die rückständigen Kohlenwasserstoffe enthält.

Vorzugsweise bringt man die aus dem Fermentationsreaktor ausfliessende Masse bzw. Flüssigkeit zunächst in eine Schale zur Aufbewahrung, die als sogenannte Ruhezone dient, in welcher eine erste Trennung in zwei Lagen stattfindet, wobei sich eine Lage aus der oben beschriebenen Emulsion, die den oder die rückständigen Kohlenwasserstoffe, die Hefeteilchen und einen Teil des wässrigen mineralischen Milieus enthält und die andere Lage hauptsächlich aus wässrigem' mineralischen Milieu zusammensetzt.

Wenn nach der Entstehung der Mikroorganismenkultur ein grosser Anteil an Kohlenwasserstoffen übriggeblieben ist, die sich am Stoffwechsel nicht beteiligt haben (dies ist insbesondere der Fall, wenn man als Kohlenwasserstoff-Substrat Gasöl verwendet wo die verzehrbaren Kohlenwasserstoffe, d. h. die linearen Paraffine j nur in geringerer Anzahl vorhanden sind), können sich drei Lagen (Phasen) bilden, nämlich eine Kohlenwasserstofflage, eine wässrige Lage und die Emulsion, die sowohl Wasser als auch eine wesentliche Menge an rückständigen Kohlenwasserstoffen enthält.

Während man dann die wässrige Lage vorteilhafterweise wieder in das Fermentationsgefäss zurückgibt, unterwirft man die isolierte Emulsion der erfindungsgemässen Behandlung.

Es ist wichtig, zu betonen, dass diese Trennung in drei Phasen nur dann festzustellen ist, wenn man ein Gemisch der oben definierten Lösungsmittel einsetzt.

Es ist ferner festzustellen, dass man bei Verwendung eines Gemisches, das eines der unter a) definierten Lösungsmittel nicht enthält, beispielsweise bei Verwendung eines Gemisches Aceton-Isopropanol, die Entstehung der drei oben definierten

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- Blatt 5 Phasen nicht stattfindet.

Die !Temperatur, bei der man den Kontakt des Lösungsmittelgemisches mit der Emulsion durchführt, liegt vorzugsweise zwischen 20 und 4-5° 0 und insbesondere etwa bei 30°0, ohne dass diese Angaben in irgendeiner Weise begrenzend sein sollen. Der pH-Wert der Emulsion wird vorzugsweise durch irgendein geeignetes Mittel vorzugsweise auf einen Wert zwischen 2 und 8 eingestellt.

Bei dem erfindungsgemässen Verfahren stellt es einen besonderen Portschritt dar, dass die Abtrennung der Hefeteilchen aus der Fermentationsmasse bewirkt wird, ohne dass eine Zentrifugierung ^ notwendig ist, was eine beträchtliche Kostenersparnis bedeutet. ™ Es ist ferner von Wichtigkeit und fortschrittlich, dass mit der Abtrennung eine Waschoperation der Mikroorganismen mit den Lösungsmitteln einhergeht, die für die Abtrennung verwendet werden, wobei eine Befreiung der Mikroorganismen zumindest vom grösseren Teil wenn nicht von der Gesamtheit der Kohlenwasserstoffe und organischen Nebenprodukteader Fermentation, wie der Fettsäuren, der Fettalkohole und der Ester erreichbar ist.

Von den nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltenen drei Phasen ausgehend, kann man also beispielsweise durch einfaches Abgiessen die schwere Phase der Hefeteilchen isolieren.

Die beiden anderen Phasen lassen sich gleichfalls leicht voneinander trennen, wobei man nach der Eliminierung, beispielsweise durch Abdestillation der rückständigen Kohlenwasserstoffe der leichtesten Phase (3) und des Wassers der Zwischenphase (2), das oder die Lösungsmittel der Gruppe a) und das oder die Lösungsmittel der Gruppe b) mit Vorteil der Verwendung bei einer neuen Trenn- und Reinigungsoperation von Hefeteilchen zuführt. Es ist hier zu betonen, dass man das erfindungsgemässe Verfahren auf verschiedene Art und Weise durchführen kann. Man kann beispielsweise die Emulsion entweder zunächst mit einem Lösungsmittel der Gruppe a) und sodann mit einem solchen der Gruppe b)

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oder auch direkt mit einem vorgebildeten Gemisch aus a) und b) zusammenbringen.

Wenn man dies wünscht, kann man die nach dem erfindungsgemässen Verfahren nach dem Dekantieren erhaltene pastenförmige Aufschlämmung der Hefeteilchen anschliessend in Kontakt mit einem Lösungsmittel oder einem Lösungsmittelgemisch der Art, wie es bei der vorangegangenen Behandlungstechnik angewendet wurde, bringen.

Nach einer bevorzugten Aus führungs form bringt man die erf indungsgemäss gewonnene Hefeteilchen-Aufschlämmung bzw. Hefeteilchenpaste bzw. Hefeteilchenbrei mit einem Gemisch der Lösungsmittel in Kontakt, die gleich sind mit denjenigen, die man bei der Abtrennung der Hefeteilchen aus der Fermentationsmasse verwendet hat.

Es ist zu betonen, dass das erfindungsgemässe Abtrennverfahren nicht nur auf Emulsionen anwendbar ist, die Kohlenwasserstoffe und Hefeteilchen enthalten, sondern mit dem gleichen Erfolg auch bei Emulsionen, die andere Mikroorganismen enthalten, wie beispielsweise Schimmelpilze oder Bakterien.

An allen Stellen dieser Offenbarung, an denen der Ausdruck "Hefeteilchen" oder "Hefe" erscheint, kann also auch der Ausdruck "Bakterien" oder "Schimmelpilze" stehen.

Zu dem erfindungsgemäss anzuwendenden Gemisch der Lösungsmittel a) + b) kann man im allgemeinen in kleinen Mengen ein ergänzendes Lösungsmittel, beispielsweise einen chlorierten Kohlenwasserstoff, hinzufügen.

Die Gesamtmenge an Lösungsmitteln der Gruppen a) und b), die man mit der Emulsion, die von der Hefekultur stammt, in Berührung bringt und insbesondere das Verhältnis der Lösungsmittel der Gruppen a) und b) hängt von der Menge der in der jeweilig

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vorliegenden Emulsion vorhandenen Henge an wässriger Phase und an Kohlenwasserstoffphase ab.

Im allgemeinen verwendet man einen leichten Überschuss an Lösungsmittel des Typs a) im Verhältnis zu demjenigen bzw. denjenigen des Typs b); min"verwendet beispielsweise ein Gewichtsverhältnie:

Lösungsmittel des Typs a)
Lösungsmittel des Typs b)

das zwischen 1 und 8 und insbesondere zwischen 1,5 und 5i ohne

dass diese Werte begrenzend sein sollen, liegt. Λ

Im allgemeinen verwendet man 1 bis 10 Volumteile und vorzugsweise 2 bis 5 Volumteile des Gemisches der Lösungsmittel a) und b) pro Volumteil der die Mikroorganismen enthaltenden Emulsion.

Das erfindungsgemässe Abtrenn- und Reinigungsverfahren kann sowohl kontinuierlich als auch diskontinuierlich ausgeführt werden.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist vor allem dann angezeigt, wenn die Mikroorganismen und insbesondere die Hefe auf einem Kohlenwasserstoff-Substrat kultiviert wurde, das einen relativ niedrigen Prozentgehalt an linearen Paraffinen, beispielsweise I in der Grössenordnung von 5 bis 69 Gew.-%, aufweist.

Es ist bekannt, dass das Wachstum der Hefe vom Gehalt der einzelnen Chargen an normalen Paraffinen abhängt.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist daher beispielsweise mit Vorteil zur Behandlung einer aus einem Fermentator stammenden Emulsion geeignet, der beispielsweise mit einem paraffinhaltigen Gasöl, das grössenordnungsmässig 10 % Paraffine enthält, gespeist wurde.

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Selbstverständlich lässt sich das erfindungsgemässe Verfahren gleichfalls dann anwenden, wenn die Mikroorganismen auf kohlenwasserstoff halt igen Chargen kultiviert wurden, die bezüglich der normalen Paraffine noch konzentrierter sind.

Die in den Mikroorganismen-Kulturen herrschenden genauen Bedingungen sind an sich bekannt. In einer Hefekultur arbeitet man beispielsweise bei einer Temperatur von 20 bis 40⁰O und einem pH-Wert von vorzugsweise etwa 3 bis 5, wobei man für einen guten Kontakt zwischen Sauerstoff, den Hefeteilchen, sowie der Kohlenwasserstoffphase und der wässrigen Phase Sorge trägt.

Das wässrige Medium enthält im allgemeinen einen Stickstoff- und Phosphor-Spender, beispielsweise (KH₂.),PO^,, ferner Wachstumsfaktoren, d.h. beispielsweise Verbindungen vom Typ des Vitamins B, Spurenelemente und essentielle Ionen, wie K⁺, Mg⁺ und SO^ . Die essentiellen Ionen hängen von der jeweiligen Art bzw. dem Stamm der Mikroorganismenkultur ab.

Die folgenden Beispiele 1 bis 4 dienen zur Erläuterung des Erfindungsgegenstandes. Die Beispiele IA und 4A sind Vergleichsbeispiele und fallen nicht in den Umfang vorliegender Erfindung.

Beispiel 1;

Man kultiviert kontinuierlich in einem Fermentator Hefe des Stammes Candida Lipolytica in Anwesenheit eines Kohlenstoffspenders, der aus Gasöl besteht, das 11 % lineare paraffinische Kohlenwasserstoffe enthält, sowie in Anwesenheit einer wässrigen Nährphase, deren Zusammensetzung weiter unten angegeben ist.

Die Luft wird in fein verteilter Form am Boden des Fermentators eingeblasen.

Der pH-Wert des Milieus wird bei etwa 4 und die Temperatur bei etwa 27°C gehalten.

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Aus der folgenden Zusammenstellung ist die Zusammensetzung des wässrigen Nährmilieus zu entnehmen· Es besteht aus:

Diammoniumphosphat 2,2 g

Kaliumchlorid 1,1 g

Magnesiumsulfat 0,9 g

Leitungswasser (enthält

Spurenelemente) 320 g

Hefeextrakt (Wachstums«

faktoren) 0,03 6

destilliertes Wasser 1000 g

Die aus dem Fermentator ausfliessende Flüssigkeit wird in ein Dekantiergefäss gegeben, wo sich eine erste Trennung zwischen ^ der wässrigen Phase, deren Anteile wieder in den Fermentator zurückgeschickt werden, in eine nicht verbrauchte Gasöl-Phase und in eine Hefe-Emulsion oder Hefe-Auf schlämmung, die im wesentlichen aus Wasser (einschliesslich der Mineralsalze) zu 90 Gew,-%, aus Hefe zu 5 Gew.-% und aus rückständigen Kohlenwasserstoffen zu 5 Gew.-% zusammengesetzt iit_s abspielt.

Ein Volumteil dieser Hefeaufschlämmung wird sodann mit 2 Volumteilen eines Flüssigkeitsgemisches in Berührung gebracht, das sich seinerseits aus 4- Volumteilen Methyläthylketon und einem Volumteil Aceton zusammensetzt (das Gewichtsverhältnis Methyläthylketon/Aceton beträgt etwa Vl)· i

Man beobachtet eine Absetzung in drei Phasen, nämlich im unteren Bereich in eine wässrige Phase, die die Hefe enthält, in eine mittlere Phase, die im wesentlichen aus Aceton.und Wasser besteht und in eine leichte, obenauf schwimmende Phase, die im wesentlichen aus Methyläthylketon und zurückgebliebenen Kohlenwasserstoffen bestehtc

Die schwere wässrige Phase lässt sich leicht abziehen; die in ihr enthaltene Hefe ist frei von zurückgebliebenen Kohlen-

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Wasserstoffen und frei von Nebenprodukten der Art der Fettsäuren. Man kann diese isolierte und gereinigte Hefe trocknen und lange Zeit aufbewahren, ohne dass sie einen ranzigen Geschmack annimmt·

pie beiden anderen Phasen werden der Destillation unterworfen; das Aceton und das Methylethylketon, das sie enthalten, werden von neuem verwendet.

Beispiel IA;

Es werden die Verfahrensbedingungen des Beispiels. 1 wiederholt; man bringt die Hefeauf schlämmung mit 2 Volumteilen einer Mischung zusammen, die ihrerseits aus einem Teil Aceton und vier Teilen Isopropanol besteht.

Es ist keinerlei Phasenbildung, wie in Beispiel 1 beschrieben, festzustellen; es findet lediglich eine Vergrösserung des Gesamtvolumens der Emulsion statt.

Man ist also gezwungen, die Emulsion zu zentrifugieren. Darüber hinaus enthalten die solchermassen isolierten Hefeteilchen nachteiligerweise noch 1,2 ?6. an rückständigen Kohlenwasserstoffen.

Die gleiche Operation wurde ebenfalls stets ohne Erfolg durchgeführt, indem man die anteiligen Mengen von Aceton und Isopropanol variierte.

Beispiele 2 und 5:

Man wiederholt das Verfahren des Beispiels 1 mit folgenden Abänderungen:

- man verwendet ein Gemisch aus Methylisobutylketon und Äthanol (Beispiel 2) .

- man verwendet ein Gemisch aus Methyläthylketon und Propanol (Beispiel 5)·

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Alle anderen Verfahrensbedingungen, insbesondere die Mengen der Lösungsmittel, blieben im Vergleich zu Beispiel 1 unverändert.

Man erreichte eine Trennung der Emulsion in drei Phasen, wobei man dann die Hefe praktisch frei von Kohlenwasserstoffen und Nebenprodukten isolieren, konnte.

Beispiel 4·:

Man wiederholte die Verfahrensbedingungen des Beispiels 1 mit folgenden Abänderungen:

Die im Verlauf der Kultivierung verwendete Kohlenstoffquelle war durch Deparaffinierung eines Schmieröls erhalten worden. % Diese Charge enthielt 90 % an linearen Paraffinen. Das wässrige Nährmedium war nicht geändert worden.

Durch Dekantierung erhielt man aus dem Fermentator eine Emulsion, die aus 90 Gew.-# Wasser, 9»5 Gew.-# Hefeteilchen und 0,5 Gew.-# rückständigen Kohlenwasserstoffen besteht.

Ein Volumanteil dieser Emulsion wurde mit 5 Volumanteilen eines Gemisches in Berührung gebracht, das eich seinerseits aus 1,5 Gewichtsteilen Methylathylketon und einem Gewichtsteil an Aceton zusammensetzt.

Ebenso wie in Beispiel 1 bildeten sich hierbei drei Phasen.

Aus der schwersten Phase wurde die Hefe abgezogen, die praktisch frei war von verbliebenen Kohlenwasserstoffen und frei von Nebenprodukten.

Beispiel 4A;

Man wiederholte die Verfahrensbedingungen des Beispiels 4, wobei jedoch jeweils das Gemisch Methylathylketon + Aceton durch

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den gleichen Volumanteil an Gemisch Hexan + Äthanol ersetzt wurde.

Das Gewichtsverhältnis Hexan/Äthanol betrug 1,5» was einem Volumverhältnis Hexan/Äthanol von 65/35 entspricht.

Bei diesen Verfahrensbedingungen wurde keine Entstehung von drei Phasen, sondern lediglich eine Vermehrung des Gesamtvolumens der Emulsion festgestellt. Ebenso wie in Beispiel IA ist man gezwungen, die Emulsion zu zentrifugieren, um die Hefeteilchen zu isolieren; diese enthielten nach dem Zentrifugieren noch 0,2 % an verbliebenen Kohlenwasserstoffen.

-^-/Patentansprüche:

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Claims

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P a te ntansprüche

1·) Verfahren zur Abtrennung und Reinigung von Mikroorganismen und insbesondere von Hefeteilchen aus einer Fermentationsmasse, die ausser den Mikroorganismen zumindest einen Kohlenwasserstoff und Wasser mit einem Gehalt an Mineralsalzen enthält, dadurch gekennzeichnet, dass man die Fermentationsmasse mit

a) zumindest einem Dialkylketon mit zumindest 4 Kohlenstoffatomen und

b) zumindest mit einem Lösungsmittel der Gruppe Aceton, Äthanol, Propanol, Isopropanol und Tertiärbutanol

in Berührung bringt, wobei drei getrennte Phasen entstehen und man aus der schwersten wässrigen Phase, die man von den beiden anderen Phasen abtrennt, die gereinigte Hefe isoliert.

2·) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Fermentationsmasse zunächst derart dekantiert, dass man zumindest eine wässrige Phase und zumindest eine die Hefeteilchen enthaltende Emulsion erhält und dass, man die letztere in Kontakt mit dem Lösungsmittel * der Gruppen a) und b) bringt.

3.) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die Fermentationsmasse mit einem vorgebildeten Gemisch aus den Lösungsmitteln der Gruppen a) und b) in Berührung bringt.

4.) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, dass das Dialkylketon aus der Gruppe Methylethylketon/Me thylisobutylketon, Diäthylketon und

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- Blatt 14 Propyläthylketon besteht.

5·) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man 1 bis 10 Volumteile der Mischung der Lösungsmittel a) und b) pro Volumteil Fermentationsmasse verwendet.

6.) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewichtsverhältnis Lösungsmittel der Gruppe a) : Lösungsmittel der Gruppe b) im Augenblick des Inberührungbringens mit der Fermentationsmasse 1 bis 8 beträgt.

7.) Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, dass man 2 bis 5 Volumteile der Mischung aus den Lösungsmitteln a) und b) pro Volumteil Fermentationsmasse einsetzt.

8.) Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewichtsverhältnis Lösungsmittel der Gruppe a) : Lö— ^v sungsmittel der Gruppe b) im Augenblick des Kontakts mit der Fermentationsmasse 1,5 bis 5 beträgt.

9.) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel der Gruppe a) aus Methylethylketon und das Lösungsmittel der Gruppe b) aus Aceton besteht.

10.) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass man die Fermentationsmasse gleichzeitig mit einem chlorierten Kohlenwasserstoff in Berührung bringt·

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